FACULDADE DE AMERICANA CURSO DE BIOMEDICINA

RELATRIO DE ESTGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MICROBIOLOGIA CLNICA

AMERICANA 2013

FACULDADE DE AMERICANA CURSO DE BIOMEDICINA

RELATRIO DE ESTGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MICROBIOLOGIA CLNICA

Professor Marcelo Dias Ferreira Neves Aluno: Helder Alves Falco RA: 10000339 8 perodo

AMERICANA 2013

Sumrio

1. INTRODUO A Microbiologia Clnica um ramo caracterizado pela preveno, diagnstico e tratamento de doenas infecciosas. Alm disso, este campo de estudos visa vrias aplicaes clnicas de micrbios para a melhoria da sade. Existem quatro tipos de micro-organismos que causam doenas infecciosas, so estes:

bactrias, fungos, parasitas e vrus. (Llewellyn, 2005). No ramo da microbiologia so estudas as caractersticas de patgenos, os seus modos de transmisso, os mecanismos de infeco e crescimento. Utilizando esta informao, um tratamento pode ser concebido. As anlises microbiolgicas muitas vezes servem como um apoio para os mdicos, proporcionando a identificao de patgenos e sugerindo opes de tratamento. Outras tarefas podem incluir a identificao de potenciais riscos de sade para a comunidade ou monitorar a evoluo de potencialmente virulentas ou cepas resistentes de micrbios, educando a comunidade e ajudar na concepo das prticas de sade. Eles tambm podem ajudar a prevenir ou controlar epidemias e surtos de doenas. Nem todos os microbiologistas estudam as patologias microbianas, mas algumas espcies comuns de estudo, no patognicas para determinar se as suas propriedades podem ser utilizadas para desenvolver antibiticos ou por outros mtodos de tratamento. (Morello, 2006). Embora epidemiologia seja o estudo dos padres, as causas e os efeitos da sade e doena condicionais em populaes, a microbiologia clnica se concentra principalmente na presena e crescimento de infeces microbianas em indivduos, os seus efeitos sobre o organismo humano e os mtodos de tratamento destas infeces. (Llewellyn, 2005).

2. TCNICAS DE COLETA URINOCULTURA A cultura de urina um teste para encontrar e identificar os germes (geralmente bactrias) que podem estar causando a infeco do trato urinrio (ITU). A urina na bexiga normalmente esterilizada por isso no contm qualquer bactria ou outros organismos, tais como fungos. Mas bactrias podem entrar na uretra e causar uma infeco. (Chernecky, 2008). Uma amostra de urina mantida sob condies que permitem que as bactrias e outros microrganismos crescer. Se alguns organismos crescem, o teste negativo. Se os organismos crescem em nmeros suficientemente grandes para indicar uma infeco, a cultura positivo. O tipo de organismos que causam a infeco so identificados com um microscpio ou por anlises qumicas. (Fischbach, 2009). Infeces do trato urinrio so mais comuns em mulheres e meninas do que nos homens. Este pode ser, em parte, porque a uretra feminina mais curta e mais prxima do nus, o qual permite que as bactrias dos intestinos possam entrar em contacto mais facilmente com a uretra. Os homens tambm tm uma substncia antibacteriana na sua prstata, que reduz o seu risco. (Pagana, 2010). Se a cultura de urina positiva, outros testes podem ser feitos para ajudar a escolher qual antibitico vai fazer o melhor trabalho tratar a infeco. Isto chamado o teste de sensibilidade. (Chernecky, 2008). A cultura de urina pode ser feita para: Encontrar a causa de uma infeco do trato urinrio (ITU), tomar decises sobre o melhor tratamento para a UTI e descobrir se o tratamento para a UTI funcionou. (Pagana, 2010). O paciente ser solicitado para coletar uma amostra. A primeira urina do dia preferida porque os nveis bacterianos sero maiores. (Fischbach, 2009). Geralmente so dadas as seguintes instrues para a coleta do paciente que ajudam a proteger a amostra de urina a partir de germes que se encontram normalmente no pnis ou da vagina: (Pagana, 2010).

-Lave as mos antes de coletar a urina. -Se o recipiente de coleta tem uma tampa, retire-o com cuidado. -Limpar a rea em torno de seu pnis ou vagina. -Um homem deve retrair o prepcio, se presente, e limpar a pice de seu pnis completamente com lenos medicamentosos. -A mulher deve abrir as dobras de pele ao redor da vagina com uma mo e use a outra mo para limpar a rea ao redor da vagina e da uretra bem com lenos medicamentosos. Ela deve limpar a rea da frente para trs para evitar a propagao de bactrias na vagina, que normalmente encontrado em torno do nus. -Comece a urinar no vaso sanitrio ou mictrio. A mulher deve continuar mantendo distante as dobras de pele ao redor da vagina, enquanto ela est urinando. -Aps a urina fluiu por alguns segundos, coloque o recipiente de coleta e colete cerca de 60 ml de urina sem parar o fluxo. -No toque na borda do recipiente para a sua rea genital. -No deixe papel higinico, cabelo, fezes ou sangue menstrual na amostra de urina. A cultura de urina um teste para detectar e identificar organismos (geralmente bactrias) que podem estar causando a infeco do trato urinrio (ITU) . Resultados da cultura de urina geralmente esto prontos em 1 a 3 dias. Alguns organismos levam mais tempo para crescer em cultura, por esta razo, os resultados podem no estar disponveis para vrios dias. (Chernecky, 2008).

Cultura de urina Normal: Sem bactrias ou outros microorganismos (tais como fungos ) crescem na cultura. O resultado da cultura negativo.

Anormal: Os organismos (geralmente bactrias) crescem na cultura. O resultado

 positivo cultura. Uma contagem de 100.000 ou mais bactrias por mililitro (ml) de urina pode ser causada por uma infeco. Uma contagem de 100 a 100 mil poderia ser causado por uma infeco ou por contaminao da amostra (voc pode precisar de uma cultura de urina de repetio). Se a contagem for 100 ou menos, a infeco improvvel, no entanto, uma contagem de 100 ou menos tambm pode ser visto se voc j est tomando antibiticos. Se os resultados dos testes so positivos, teste de sensibilidade pode ser feito para ajudar a tomar decises sobre o tratamento. (Fischbach, 2009).

CORPROCULTURA Uma cultura de fezes feita para identificar bactrias ou vrus que podem causar uma infeco. Apesar de mais de 50 tipos diferentes de bactrias normalmente vivem nos intestinos, um grande nmero de bactrias, vrus, anormais fungos ou

parasitas podem crescer nos intestinos e causar infeces e doenas. (Chernecky, 2008). Para uma cultura de fezes, uma amostra de fezes recolhida num recipiente limpo e colocado sob condies que permitem que as bactrias ou outros organismos para crescer. O tipo de infeco identificada observando-se o aparecimento de crescimento, atravs da realizao de testes qumicos na amostra de fezes, e olhando para a amostra atravs de um microscpio. (Fischbach, 2009). Dependendo da suspeita do teste, o paciente s precisa coletar uma amostra de fezes, ou pode precisar de vrias amostras de fezes durante um perodo de dias. (Chernecky, 2008). A cultura de fezes feito para: Encontrar a causa dos sintomas, tais como diarreia grave ou sanguinolenta, um aumento da quantidade de gases, nuseas, vmitos, perda de apetite, inchao, dor abdominal e clicas e febre; Localizar e identificar certos tipos de bactrias, vrus, fungos ou parasitas que causam infeces

ou

doenas,

tais

como intoxicao

alimentar,

inflamao

do

intestino

(colite), clera e febre tifide; Identificar uma pessoa que no pode ter qualquer sintoma de doena, mas que carrega bactrias que podem se espalhar a infeco para outras pessoas. Isto chamado uma pessoa transportadora. Uma pessoa que portadora e que lida com alimentos possam infectar outras pessoas; Descobrir se o tratamento para uma infeco tem sido eficaz. (Fischbach, 2009). O paciente poder ter que recolher mais de uma amostra. necessrio que siga o mesmo procedimento para cada amostra. (Pagana, 2010). -Urinar antes de coletar as fezes para que voc no obter qualquer urina na amostra de fezes. No urinar durante a passagem das fezes. -Coloque as luvas antes de manusear suas fezes. Fezes podem conter material que espalha a infeco. Lave as mos depois de remover as luvas. -Passar fezes (mas nenhuma urina) para um recipiente seco. Voc pode ser dado uma bacia de plstico que pode ser colocado sob o assento do vaso para recolher as fezes. -Fezes slidas ou lquidas podem ser coletadas. -No coletar a amostra do vaso sanitrio. -No misture papel higinico, gua ou sabo com a amostra. Uma cultura de fezes feita para identificar bactrias, vrus, fungos ou parasitas que podem causar uma infeco. Fezes resultados dos testes de cultura costumam levar de 2 a 3 dias. (Chernecky, 2008). Cultura de fezes Normal: No bactrias causadoras de doenas (patognicos), vrus, fungos ou parasitas esto presentes ou crescer na cultura. As bactrias (tais como Salmonella , Shigella, Campylobacter, certos tipos Anormal: de Escherichia coli [E. coli], ou Yersinia enterocolitica)crescem na

cultura. Fungos ou parasitas, como Giardia lamblia so encontrados.

Se as bactrias so encontradas na cultura, teste de sensibilidade pode ser feito para ajudar a escolher o melhor tratamento. (Fischbach, 2009).

HEMOCULTURA Uma hemocultura um teste para descobrir uma infeco no sangue. O sangue normalmente, no tm quaisquer bactrias ou fungos nele. A cultura de sangue pode mostrar o que bactrias ou fungos esto no sangue. (Pagana, 2010). Uma infeco bacteriana no sangue, chamado bacteremia, pode ser grave, porque o sangue pode espalhar as bactrias em qualquer parte do corpo. A infeco do sangue na maioria das vezes ocorre com outras infeces graves, como aquelas que afetam os pulmes, rins, intestino, vescula biliar, ou vlvulas cardiacas. (Chernecky, 2008). Uma infeco de sangue podem tambm desenvolver-se quando o sistema imunolgici est baixo. Isso pode ocorrer em crianas e idosos, por questo de patologias (como cncer ou AIDS ) ou de medicamentos

(como corticides ou quimioterapia) que mudam a forma como o seu corpo pode combater infeces. (Fischbach, 2009). Para testar para uma infeco no sangue, uma amostra de sangue recolhido e colocado num recipiente com substncias especiais que permitem que as bactrias ou os fungos a crescer. O tipo de bactria ou fungo que cresce verificado com testes qumicos e visto para a cultura sob um microscpio. Duas ou trs amostras de sangue de diferentes veias so muitas vezes tomadas para se certificar de uma bactria ou fungo no est perdida. Se nenhuma bactria ou fungo cresce, a cultura de sangue chamado de negativo. Uma cultura de sangue feito frequentemente, quando uma pessoa tem uma febre porque este o momento em que as bactrias ou fungos mais provvel de se espalhar para o sangue. (Chernecky, 2008). A hemocultura feita para: Encontrar uma infeco bacteriana que se espalhou para o sangue, tais como a meningite, osteomielite, pneumonia, uma infeco do rim, ou septicemia. A cultura tambm pode mostrar que tipo de bactria est causando a

infeco; Encontrar uma infeco por fungos, tais como levedura, no sangue; Endocardite, que uma infeco de bactrias que vivem nas vlvulas do corao; Encontrar os melhores antibiticos para combater as bactrias ou fungos. Isto chamado o teste de sensibilidade; Encontrar a causa de uma febre inexplicvel ou choque ou de uma pessoa tornar-se extremamente doente. (Chernecky, 2008). O sangue ser coletado por um profissional de sade, que ir seguir o seguinte procedimento: (Pagana, 2010). -Enrole um elstico em torno do brao para parar o fluxo de sangue. Isso faz com que as veias abaixo da banda maior, de modo que mais fcil de inserir uma agulha na veia. -Limpe o local a agulha cuidadosamente com lcool ou iodo para a pele de bactrias no vo ficar na amostra de sangue. -Coloque a agulha na veia. Pode ser necessria mais de uma picada de agulha. -Anexe um tubo para a agulha para ench-lo com sangue. -Retire a banda de seu brao quando o sangue coletado o suficiente. -Coloque uma almofada ou bola de algodo gaze sobre o local da agulha quando a agulha removida. O sangue muitas vezes coletado de dois ou trs locais diferentes do corpo. Ou elas podem ser coletadas em dois momentos diferentes de algumas horas de intervalo. (Fischbach, 2009). Uma cultura de sangue um teste para descobrir uma infeco no sangue. A maioria das bactrias pode ser visto na cultura em 2 a 3 dias, mas alguns tipos podem ter 10 ou mais dias para aparecer. Fungo pode levar at 30 dias para aparecer na cultura. (Chernecky, 2008).

Hemocultura Normal: No bactria ou fungo encontrado. Resultados da cultura normais so chamados negativo. Anormal: As bactrias ou fungos crescem na cultura. Os resultados da cultura positiva anormais so chamados.

Se as bactrias encontram-se em cultura, um outro ensaio muitas vezes feito para encontrar o melhor antibitico que vai matar as bactrias. Isso chamado de teste de sensibilidade ou susceptibilidade. Teste de sensibilidade importante para a infeco do sangue tratado corretamente. Isto tambm ajuda a evitar que as bactrias tornar-se resistentes aos antibiticos. (Pagana, 2010). COLETA DE MATERIAL UROGENITAL Para a coleta de material genital, devem ser seguidas algumas instrues. O Laboratrio de Microbiologia pode processar material de trato genital para os seguintes grupos de patologias: uretrites, vaginites e vaginoses, cervicites e endocervicites, prostatites e infeces de glndulas anexas; ulceras e outras leses genitais; material obtido por procedimento cirrgico, incluindo material endometrial, liquido amnitico aspirado de abscessos tubo-ovarianos, etc. (Pagana, 2010). Antes da coleta de material, o mdico devera conhecer os principais patgenos envolvidos no processo infeccioso investigado e a respectiva disponibilidade de recursos diagnsticos, condies de coleta, meios de transporte e adequado preenchimento da solicitao de exames. (Pagana, 2010).

Fonte: Anvisa, 2012

A seleo de materiais genitais bem como sua coleta adequada so fatores importantes na interpretao dessas culturas, uma vez que esses locais possuem uma quantidade grande de microrganismos comensais, as culturas vaginais de rotina no so indicadas pelo motivo exposto e culturas anaerbias so limitadas a certos materiais. (Pagana, 2010). Muitos agentes de infeco genital em mulheres so limitados a certos stios anatmicos, conforme tabela a seguir.

Fonte: Anvisa, 2012

Nos casos de suspeita de infeco por Chlamydia trachomatis devera ser solicitado exame por imunofluorescncia ou por biologia molecular (PCR). Pode ocorrer associao entre infeces por Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoea. (Pagana, 2010).

O material purulento, proveniente da glndula de Bartholin, poder ser obtido diretamente do ducto, apos massagem digital ou colhida atravs de seringa. (Pagana, 2010). A coleta de endomtrio melhor se for realizada por curetagem. Recomenda-se o uso de swabs protegidos para coleta via cervix, para evitar contaminao com a flora vaginal. (ANVISA, 2012). Em casos de DIP (Doena Inflamatria Plvica), o material coletado por tcnica invasiva. (ANVISA, 2012). O liquido peritoneal pode ser coletado por aspirao do fundo de saco vaginal (culdocentese), material retirado diretamente dos ovrios ou trompas e coletado (aspirado com seringa) no ato cirrgico. (Pagana, 2010). Nos casos de suspeita de sfilis, a leso devera sofrer uma abraso cuidadosa com gaze seca ate que um fluido seroso comece a fluir, tomando cuidado para evitar sangramento, o que acarreta interferncia no exame em campo escuro. Apos o acmulo de fluido seroso, colocar uma gota em uma lamina limpa e examinar imediatamente utilizando o microscpio com condensador de campo escuro. (Pagana, 2010). DIU (Dispositivo Intra-Uterino): deve ser removido pelo medico evitando-se contaminao cervical ou vaginal. Coloque todo o DIU dentro de um recipiente estril para ser transportado para o laboratrio. (ANVISA, 2012). Cultura semi quantitativa para Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum podem ser realizadas com kits comercializados. Consultar o laboratrio para maiores informaes. (ANVISA, 2012). Em anlise de infeces por Chlamydia trachomatis no se deve aceitar secreo vaginal para pesquisa de Chlamydia, uma vez que esse microrganismo no pode crescer nas clulas epiteliais escamosas da vagina. A Chlamydia e parasita intracelular obrigatrio do epitlio colunar do cervix. Coleta, Transporte e Conservao de Amostra. (ANVISA, 2012).

-Realizar coleta de material endocervical, raspando-se o endocervix para obter clulas. -O swab devera ser inoculado imediatamente em meio de transporte especial ou preparar as lminas para colorao especial. -Deteco de estreptococos do grupo B em mulheres: culturas cervicais no so aceitveis e no se devem utilizar espculos. Sugere-se coleta com swab do introito vaginal e outro do orifcio ano-retal. Os swabs devem ser colocados em meio de transporte especifico: caldo Todd Hewitt. -Secreo prosttica: poder ser coletada apos massagem digital pelo reto, podendo ser acompanhada de amostras de urina pr e ps-massagem. O material ejaculado tambm poder ser submetido a analise. -Na suspeita de Neisseria gonorrhoeae em mulheres, a cultura e o mtodo de escolha, sendo o material coletado do endocervix. O encaminhamento deve ser feito em meio de transporte ou plaqueado imediatamente em gar seletivo (Thayer- Martin ou similar ou ainda agar chocolate) e mantidos em atmosfera de 5% de CO2. Instrues para coleta de Secreo Vaginal. (ANVISA, 2012). No preparo da paciente recomenda-se: -No estar menstruada. -Evitar ducha e cremes vaginais na vspera da coleta. -Desejvel trs dias de abstinncia sexual. Procedimento: -Inserir um espculo (lubrificado somente por usar agua morna) na vagina. -Retirar o excesso de muco cervical com swab de algodo. - Inserir os swabs indicados, rodar por alguns segundos sobre o fundo do saco, retirar e voltar aos meios indicados: meio de Stuart para bactrias e fungos. Utilizar o caldo Todd-Hewit para pesquisa de S. agalactiae de amostra do introito vaginal.

-Swab seco: realizar as lminas para bacterioscopia da secreo fresca. Coleta Endocervical: -Inserir um especulo na vagina e retirar o excesso de muco cervical com swab de algodo. -Inserir os swabs indicados no canal endocervical ate a ponta do swab no ser mais visvel. -Rodar por alguns segundos, retirar evitando o contato com a parede vaginal, voltar aos meios indicados: -Mycoplasma/Ureaplasma - mergulhar o swab dentro da soluo do tubo fornecido e agitar. Remover o swab e identificar o tubo. Swab do meio de transporte especifico para Chlamydia trachomatis -mergulhar o swab dentro da soluo do tubo fornecido e agitar vigorosamente. Comprimir o swab contra a parede do tubo. Qualquer excesso de muco deve ser retirado da amostra. Remover o swab e identificar o tubo. Swab para inserir no meio de transporte de Stuart para cultura de N. gonorrhoeae. Swab seco: realizar as laminas para bacterioscopia da secreo fresca. Cultura para anaerbios do trato genital feminino: -Descontaminar o canal cervical com swab embebido de PVPI aquoso a 10%. -Coletar amostra do trato genital superior de forma a obter material celular da parede uterina. -Amostras coletadas por laparoscopia, culdocentese ou cirurgia tambm sao apropriadas para cultura de anaerbios. -Cultura de dispositivo intra-uterino (DIU) tem valor estratgico para cultivo anaerbio de Actinomyces sp.

Coleta de secreo uretral: -O sucesso da cultura depende da rapidez na entrega da amostra. -N. gonorrhoeae e uma bactria muito sensvel e pode morrer rapidamente se no for semeada imediatamente apos a coleta. -Desprezar as primeiras gotas da secreo. -Coletar a secreo purulenta, de preferencia pela manha, antes da primeira mico ou ha pelo menos duas horas ou mais, sem ter urinado. -Coletar com ala bacteriolgica descartvel ou swab estril fino. -Colocar a amostra em meio de transporte (Stuart) e realizar as laminas para bacterioscpia da secreo fresca. -Encaminhar imediatamente ao laboratrio. -Em pacientes assintomticos, deve-se coletar a amostra atravs de massagem prosttica ou com pequeno swab inserido alguns centmetros na uretra.

3. TCNICAS DE COLORAO COLORAO DE GRAM A colorao de Gram (ou mtodo de Gram) um mtodo de diferenciao de bactriasde espcies em dois grandes grupos (Gram-positivas e Gram-negativas). O nome vem de seu inventor, Hans Christian Gram. (Bergey, 1994). A colorao de Gram diferencia bactrias pelas propriedades qumicas e fsicas das suas paredes celulares por meio da deteco de peptidoglicano, a qual est presente numa camada espessa nas bactrias Gram-positivas. A resulta Grampositivas com uma cor azul-prpura, enquanto uma bactria Gram-negativa resulta em uma cor rosa-vermelho. (Bergey, 1994). A colorao de Gram quase sempre o primeiro passo para a identificao de um organismo bacteriano. Enquanto a colorao de Gram uma valiosa ferramenta de diagnstico em ambos os ambientes de pesquisa clnica e, nem todas as bactrias podem ser definitivamente classificadas por esta tcnica. Isto d origem a grupos de bactrias Gram-variveis e Gram-indeterminada. (Ryan, 2004). A Colorao Gram pode ser realizada em fluido corporal ou bipsia quando a infeco suspeita. O Gram produz resultados muito mais rapidamente do que a cultura, e especialmente importante quando o diagnstico vai fazer uma diferena importante no tratamento do paciente, exemplos so lquido

cefalorraquidiano para meningite e lquido sinovial para artrite sptica. (Soggard, 2007). Mecanismo de colorao As bactrias gram-positivas tm uma parede celular do tipo de rede de espessura feita de peptidoglicano (50-90% do envelope da clula), e como resultado, so coradas roxo por cristal violeta, enquanto que as bactrias gram-negativas tm uma camada fina (10% de clulas envelope), por isso no reter a mancha prpura e rosa so contra-corados pelo Safranin. Existem quatro etapas bsicas da colorao de Gram: (Preto, 1993)

A aplicao de uma colorao primria (cristal violeta) para um exame de calor fixo de uma cultura bacteriana. Fixao de calor mata algumas bactrias, mas principalmente usado para fixar as bactrias para a corredia de modo que eles no se enxaguar durante o processo de colorao.

A adio de iodo, que se liga ao cristal violeta e prende-lo no celular. Descolorao rpida com lcool ou acetona. Contracolorao com safranina. A fucsina s vezes substitudao por safranina uma vez que expressa mais intensamente manchas bactrias anaerbias, mas menos comumente usado como um contrastante.
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O violeta de cristal (CV) dissocia-se em soluo aquosa para CV + e cloreto (Cl ) ons. Estes ins penetram atravs da parede celular e da membrana celular de clulas com ambas as bactrias Gram-positivas e Gram-negativas. O CV+ interage com os componentes carregados negativamente de clulas bacterianas e clulas coradas roxas. (Llewellyn, 2005). O Iodo interage com CV + e forma grandes complexos de violeta de cristal e iodo, no interior das camadas interna e externa da clula. O iodo muitas vezes referido como um mordente, mas um agente de captao, que impede a remoo do CV-I complexa e, por conseguinte, a cor da clula. (Llewellyn, 2005). Quando um descolorante, como lcool ou acetona adicionado, ele interage com os lpidos da membrana celular. Uma clula Gram-negativa perde a sua membrana exterior de lipopolissacardeo, e a camada de peptidoglicano interior deixada exposta. Os complexos de CV-I foram lavados a partir da clula Gramnegativa, juntamente com a membrana exterior. Em contraste, uma clula Grampositiva desidratada a partir de um tratamento de etanol. Os grandes complexos CV-I ficam presos dentro da clulas Gram-positivas, devido natureza multifacetada de sua peptidoglicosidade. O passo de descolorao crtica e deve ser cronometrado corretamente, o violeta de cristal removido a partir de clulas tanto gram-positivas e negativas se o agente descoloraste deixado por muito tempo (numa questo de segundos). (Beveridge, 1983). Aps a descolorao, as clulas Gram-positivas permanecem roxo, e a clula Gram-negativa perde a sua cor roxa. A sefranina que usada para fazer um contraste

ou fucsina bsica, so aplicadas por ltimo para dar colorao em bactrias gramnegativas de uma cor-de-rosa ou vermelha. (Davies, 1983). Algumas bactrias, aps colorao com a colorao de Gram, produzir um padro de Gram-varivel: uma mistura de clulas de rosa e roxo so

vistos. Osgneros Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium e Propionibacterium tm paredes celulares particularmente sensveis quebra durante a diviso celular, resultando em colorao de Gram-negativa destas clulas Grampositivas. Em culturas de Bacillus, Butyrivibrio e Clostridium, uma diminuio da espessura durante o crescimento peptidoglicano coincide com um aumento no nmero de clulas que Gram-negativas. Alm disso, em todas as bactrias coradas utilizando a colorao de Gram, a idade do a cultura pode influenciar os resultados da colorao. (Beveridge, 1983).

COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN A colorao de Ziehl-Neelsen, foi descrita pela primeira vez por dois mdicos alemes: o bacterilogo Franz de Ziehl (1859-1926) uma colorao e o patologista Friedrich utilizada para

Neelsen (1854-1898). Trata-se identificar cidos rpidos

bacteriolgica

nos organismos,

principalmente de

Micobactrias.

Mycobacterium tuberculosis o mais importante deste grupo porque responsvel pela tuberculose. Outras espcies de Mycobacterium importantes envolvidas em doenas humanas so Mycobacterium leprae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, e os membros do Mycobacterium avium. Micro-organismos cidos como Mycobacterium contm grandes quantidades de substncias lipdicas dentro de suas paredes celulares chamados cidos miclicos. Estes cidos resistem coloraes por mtodos convencionais, tais como uma colorao de Gram. Tambm pode ser utilizado para corar algumas outras bactrias, tais como Nocardia. Os reagentes utilizados so de Ziehl-Neelsen, fucsina, lcool de cido, e azul de metileno.O BAAR ser vermelho brilhante aps a colorao. (Morello, 2006). Uma variao deste mtodo de colorao usada em micologia para corar diferencialmente incrustaes acidorresistentes de certas espcies de fungos do

gnero Russula . tambm til para a identificao de alguns protozorios, ou seja, Cryptosporidium e Isospora . A colorao de Ziehl-Neelsen pode tambm impedir o diagnstico, no caso de paragonimase porque os ovos em um vulo e parasita amostra de expectorao pode ser dissolvida pela colorao, e muitas vezes utilizado nesta situao porque os sinais clnicos e sintomas de paragonimase assemelham aqueles da TB. (Largent, 1977). realizado o seguinte procedimento para a colorao: (Ellis, 1993). 1. Cobrir a lmina com Carbol Fucsina. 2. Segure uma chama sob o slide at vapor aparece, mas no deixar ferver. 3. Deixar se sentar por 3 a 5 minutos, enxaguar com gua da torneira. 4. Cobrir a lmina com cido clordrico a 3% em lcool isoproplico. 5. Deixe descansar 1 minuto, enxaguar com gua da torneira. 6. Cobrir a lmina com azul de metileno. 7. Deixe descansar 1 minuto, enxaguar com gua da torneira. 8. Secar. 9. Analisar sob lente com imerso em leo.

4. MEIOS DE CULTURA EM GAR GAR SANGUE Algumas bactrias so mais exigentes em nutrientes para desenvolver o seu crescimento. Uma forma de estimular o crescimento de bactrias importantes no conceito mdico cultiv-las em um meio contendo sangue desfibrinado (sangue com protenas de coagulao removidas). Agar sangue apresenta um tom vermelho, meio opaco e brilhante. A variedade de nutrientes complexos encontrados no sangue suporta o crescimento da maioria das bactrias. (MacFaddin, 1985). Alm de seu papel fundamental no crescimento de organismos difceis de cultura, o Agar sangue tem uma funo diferencial, as bactrias que crescem em Agar sangue podem ser classificadas, em parte, o que faz com que as clulas vermelhas do sangue fiquem incorporadas no meio. Algumas bactrias

produzem hemolisinas, que so enzimas que destroem as clulas vermelhas do sangue (hemo = sangue, lysin = dividir). Hemolisinas podem destruir as clulas e liberar a hemoglobina no meio. medida que a hemoglobina est exposta aos produtos qumicos no Agar, a sua cor vermelha caracterstica alterada. Este tipo de hemlise, alfa-hemlise, transforma o meio sob o crescimento bacteriano castanhoverde. Outras bactrias so capazes de digerir a hemoglobina liberada medida que destroem as clulas vermelhas do sangue. O resultado desta hemlise completa limpa o meio de acordo com as colnias bacterianas.O meio alterado de opaco para transparente. Outras bactrias deixam glbulos vermelhos essencialmente intocadas. O meio no descolorido ou cancelado pelo crescimento. Tais bactrias so classificadas como gama-hemoltica. (Murray, 1995).

A hemlise determinada por estrias para isolamento em uma placa de Agar sangue. Em situaes clnicas, este tambm pode incluir vrios estoques sobre o Agar para melhorar as verses anaerbicas das enzimas de digerir as clulas sanguneas. Aps incubao durante a noite, o meio inspecionado para sinais indicadores de alfa ou beta-hemlise. Se o meio apresentar descolorao ou escurecimento aps o crescimento, o organismo demonstrou alfa-hemlise. Se o meio foi liberado sob o crescimento, o organismo beta-hemoltico. Nenhuma mudana visvel na cor do meio consiste na gama-hemlise. (Forbes, 1998). O Agar sangue composto por um nutriente que autoclavado e deixado arrefecer at 45-50 C. Depois, 5% de sangue desfibrinado (geralmente a partir de ovelha) adicionado ao meio, e distribudo por placas de Petri. Uma vez que se solidifica, est pronto para ser utilizado. (MacFaddin, 1985).

GAR SALMONELLA SHIGELLA O gar Salmonella Shigella um meio de cultura altamente seletiva, utilizado em microbiologia, para o isolamento seletivo de Shigellas e Salmonella a partir de amostras ambientais e patolgicas, mesmo que estejam abundantemente

contaminadas. Ele inibi o crescimento de mais bactrias coliformes e de muitas outras bactrias Gram-positivas e bactrias Gram negativas, devido elevada concentrao de sais biliares e citrato de sdio. (Murray, 1995). O gar Salmonella Shigella contm lactose como nica fonte de hidratos de carbono e como corante, o vermelho neutro. O ltimo um corante vermelho que se transforma, quando o pH da soluo diminui para abaixo de 6,8. Isso faz com que as colnias de fermentao de lactose apaream, na placa de cultura, de colorao vermelha. Como fonte de enxofre, no usado o tiossulfato de sdio, isto permite o realce de bactrias produtoras de cido sulfdrico, e como este composto reage com citrato frrico ocorre a produo de um composto enegrecido (sulfureto ferroso). (MacFaddin, 1985).

gar Salmonella Shigella particularmente vlido no isolamento de Salmonella, pois na medida em que conhecida, ela cresce muito bem na presena de sais biliares. (Forbes, 1998). Normalmente a bactria Salmonella so fermentadores de lactose, apresentando colnias incolores. Trata-se ter cuidado, no entanto, para a verificao de existncia de estirpes de Salmonella raras que podem ser resultantes da fermentao da lactose e, por este motivo, pode gerar colnias semelhantes as gerados por Escherichia coli. (Murray, 1995). Salmonella so tambm produtoras de H2S, por esse motivo as colnias em gar SS tm o centro de cor negra. Shigellas capazes de crescer em gar SS dar origem a colnias incolores, mas que no produzem H2S, portanto, desprovido de um centro enegrecido. (Forbes, 1998).

GAR UX

GAR MACCONKEY MacConkey um meio seletivo e diferencial usado para isolar e diferenciar entricos com base na sua capacidade de fermentar lactose. Os sais biliares e violeta cristal inibem o crescimento de organismos gram-positivos. A lactose proporciona uma fonte de hidratos de carbono fermentveis, permitindo a diferenciao. Vermelho neutro

 um indicador de pH que fica vermelha a um pH abaixo de 6,8 e incolor em qualquer pH superior a 6,8. (Forbes, 1998). Organismos que fermentam lactose e, assim, produzem um ambiente cido aparecero rosa por causa de o vermelho virar neutro. Os sais biliares tambm podem precipitar para fora dos meios de comunicao que cercam o crescimento de fermentadores por causa da mudana no pH. No fermentadores iro produzir colnias normalmente de cor ou ocasionalmente incolor. (MacFaddin, 1985).

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GAR SABOURAUD GAR Sabouraud um tipo de agar que contm peptonas. usado para cultivar dermatfitos e outros tipos de fungos. (Forbes, 1998). Ele foi criado por Raymond Sabouraud em 1892. Mais tarde modificado por Chester W. Emmons quando o pH foi levado nvel mais prximo do neutro e a gama de concentrao de dextrose reduzido para suportar o crescimento de outros fungos. O pH

da formulao de 5,6 de agar Sabouraud tradicional inibe o crescimento bacteriano. (MacFaddin, 1985). O baixo Ph do meio resulta em uma situao favorvel para o crescimento dos fungos e uma ligeira inibio das bactrias. Caso se deseje aumentar o crescimento inibitrio das bactrias, recomendado a adio de agentes antimicrobianos como a gentamicina que inibe o crescimento dos micro-organismo gram negativos e o clorafenicol que tem um grande aspecto de ao. (Morello, 2006).

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AGAR MLLER-HINTON O agar Mller-Hinton um meio de crescimento que comumente usado para testes de antibiograma. tambm utilizado para isolar e manter espcies de a Neisseria e Moraxella. (Forbes, 1998). Ela contm tipicamente: Infuso de carne 30,0%; 1,75% de casena hidrolisado; 0,15% amido; 1,7% de agar; pH ajustado para neutro a 25 C. (Forbes, 1998).

Cinco por cento de sangue de carneiro e dinucletido de nicotinamida adenina tambm podem ser adicionados quando o teste feito em susceptibilidade de espcies de Streptococcus. Esse tipo tambm comumente usado para testes de susceptibilidade de Campylobacter. (Morello, 2006). Existem algumas propriedades que o tornam excelente para o uso de antibiticos. Em primeiro lugar, um meio no seletivo, no diferencial. Isto significa que quase todos os organismos plaqueados nele iro crescer. Alm disso, ele contm amido. O amido conhecido para absorver toxinas libertadas a partir de bactrias, de modo que eles no podem interferir com os antibiticos. Em segundo lugar, um gar solto. Isto permite uma melhor difuso dos antibiticos do que a maioria das outras placas. Uma melhor difuso conduz a uma zona verdadeira de inibio. (Morello, 2006).

5. ANTIBIOGRAMA Um antibiograma um teste de laboratrio para a sensibilidade de uma estirpe bacteriana isolada por diferentes antibiticos. Por definio, um teste de sensibilidade in vitro. (Warington, 2008). Na prtica clnica, os antibiticos mais frequentemente prescritos, com base em orientaes gerais e conhecimento sobre a sensibilidade: por exemplo,

complicaes do trato urinrio so infeces podem ser tratadas com a primeira gerao de quinolona, isto porque Escherichia coli o causador mais provvel agente patognico, e conhecido por ser sensvel quinolona no tratamento. (Morello, 2006). No entanto, muitas bactrias so conhecidas por serem resistentes a vrias classes de antibiticos, e o tratamento no to simples. Este especialmente o caso em pacientes vulnerveis, tais como pacientes em cuidados intensivos da

unidade. Quando estes pacientes desenvolvem uma "nosocomial" a pneumonia, as bactrias mais resistentes, como Pseudomonas aeruginosa,esto potencialmente envolvidos. O tratamento , em seguida, geralmente, iniciado com base nos dados de vigilncia sobre os agentes patognicos locais provavelmente envolvidos. Este primeiro tratamento, com base em informaes estatsticas sobre ex-pacientes, e destina-se a um grande grupo de micrbios potencialmente envolvidos, chamado de tratamento emprico. (Warington, 2008). Antes de iniciar o tratamento, o mdico recolher uma amostra a partir de onde a contaminao suspeita: uma amostra de sangue quando as bactrias eventualmente podem ter invadido a corrente sangunea, a expectorao de exemplo, no caso de uma pneumonia, e uma urina de exemplo, no caso de um urinria infeco do trato. Estas amostras so transferidas para o laboratrio, que analisa a amostra sob o microscpio, e faz cultura das bactrias, auxiliando no diagnstico . (Warington, 2008). Uma vez que a cultura estabelecida, h duas maneiras possveis para obter um antibiograma: (Morello, 2006).

Uma forma semi-quantitativa baseado em difuso (mtodo de Kirby-Bauer): pequenos discos contendo diferentes antibiticos, ou discos de papel impregnadas, so deixadas cair em diferentes zonas da cultura sobre uma placa de agar, que

um ambiente rico em nutrientes no qual as bactrias podem crescer. O antibitico ir difundir nas imediaes de cada comprimido, e um disco de lise bacteriana ir tornar-se visvel. Uma vez que a concentrao do antibitico foi a mais elevada no centro, e o menor na extremidade desta zona, o dimetro sugestivo da Concentrao Inibitria Mnima, ou MIC, (converso da o dimetro em milmetros para a MIC, em ug/ml, baseia-se conhecidas de regresso linear de curvas).

Uma forma quantitativa com base na diluio: uma srie de diluio de antibiticos est estabelecido (isto uma srie de tubos de ensaio com concentraes progressivamente mais baixas de substncia antibitica). O ltimo tubo no qual no h bactrias crescem contm o antibitico na concentrao de inibio mnima. Uma vez que o MIC calculada, pode ser comparado com os valores

conhecidos para um dado microrganismo e de antibitico: por exemplo, uma MIC> 0,06 ug / ml pode ser interpretado como um resistente penicilina Streptococcus pneumoniae . Essa informao pode ser til para o clnico, que pode mudar o tratamento emprico, para um tratamento mais sob medida que visa apenas a bactria causadora. (Warington, 2008).

6. PESQUISA DE BACILOS LCOOL-CIDO RESISTENTES (BAAR)

A realizao do diagnstico Micobactrias patognicas (Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae), feito atravs de uma bacterioscopia direta realizando a metodologia de colorao de Ziehl-Neelsen, a qual usa a caracterstica destas bactrias de possurem paredes celulares com um grande teor de lipdeos (cerca de 60%, principalmente de cido miclico), que quando so tratadas pelo corante Fucsina fenicada, adquirem uma colorao vermelha e persistem ao descoramento subsequente por uma soluo de lcool-cido forte (diferenciador). por isto que so conhecidas por Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR). As outras bactrias, que no possuem essas paredes celulares ricas em lipdeos, tm a sua colorao pela Fucsina descorada pela soluo de lcool-cido e coram-se em azul pela colorao de fundo do Azul de metileno (contra-corante). (Cmara, 2010). Aps realizada a colorao de Ziehl-Neelsen, a fucsina fenicada, atuando a quente, realizar a colorao de todas as clulas bacterianas e outras estruturas presentes no esfregao de vermelho (o calor vai derreter os lpidos de membrana, tornando-a permevel). O cido diludo em lcool aplicado vai descorar todas as bactrias, com exceo das cido-lcool resistentes, as quais permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas aps colorao e contraste, com azul de metileno, encontraremos as seguintes bactrias cido-lcool resistentes coradas de vermelho e no cido-lcool resistentes coradas de azul. (Ministrio da Sade, 1994). A leitura deve ser realizada pelo menos em 100 campos microscpios, o que corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, onde est a numerao, at o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente 5 minutos de observao. recomendvel um intervalo de 10 minutos de descanso para cada dez lminas lidas e utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o nmero de bacilos que so encontrados em cada campo microscpio. O resultado deve ser informado em nmero de cruzes segundo as normas do Ministrio da Sade em vigor. (Cmara, 2010).

Fonte: Ministrio da Sade, 1994.

7. PROVAS BIOQUMICAS PARA IDENTIFICAO DE BACILOS GRAMNEGATIVOS As provas bioqumicas tem o objetivo de identificar enterobactrias em gneros ou espcies, atravs de meios de cultura especiais que possibilitam a verificao se existe ou no a presena de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de diversos substratos. As alteraes que ocorrem nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano iro servir como base para sua identificao de acordo com o esquema descrito: A primeira etapa que realizada o plaqueamento seletivo, que a etapa em que a bactria isolada a partir do espcime clnico, onde so usados meios seletivoindicadores como o Agar EMB. A presena existente dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactrias Gram positivas. Na preparao deste meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactrias que so Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, como consequncia, produzem cidos que dissociam este sal, apresentam-se como colnias rosa-avermelhadas com ou sem um centro enegrecido, devido ao azul de metileno, enquanto as no fermentadoras (LAC-) acabam formando colnias transparentes.

Depois de passar pelo plaqueamento seletivo realizada a confirmao bioqumica, que um conjunto de provas bioqumicas que so necessrias para a identificao das colnias que se est suspeitando. Sero utilizados alguns meios, sendo estes citados abaixo. Estes meios somam oito testes que unidos ao da

fermentao da lactose permitem a identificao com fidelidade a grande maioria das enterobactrias isoladas em espcimens clnicos. Meio EPM: o meio EPM apresenta os testes de fermentao e produo de gs a partir de glicose, produo de H2S, hidrlise da uria e desaminao de triptofano. Meio MILi: o Meio MILi contm os testes de motilidade, indol e descarboxilao de lisina. Citrato de Simons: Este teste permite identificar espcies que utilizam citrato como nica fonte de carbono. Cada um desses meios apresenta seu fundamento terico, a partir dele se chega a identificao da bactria. So os seguintes fundamentos analisados: Hdrlise da uria: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uria, formando duas molculas de amnia pela ao da enzima urease (uria 2 NH3 + CO2 + H2O). Motilidade: O teste visa verificar se a bactria mvel ou imvel. Logo pode ajudar na diferenciao de alguns gneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactrias proporcionada pela presena de um ou mais flagelos. As bactrias imveis no possuem flagelos. Produo de indol: Este teste tem como princpio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molcula de triptofano. Pode ajudar na diferenciao de alguns gneros de bactrias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-). Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo capaz de utilizar citrato como uma nica fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactrias citrato positivas crescem usando sais de amnia como fonte de nitrognio, liberando amnia e

conseqentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH o azul de bromotimol, que em meio cido fica amarelo e em meio bsico, azul. Produo de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produo de ons S-2 a partir do metabolismo bacteriano. Produo de gs: Este teste visa determinar a capacidade de produo de gs CO2 a partir da fermentao da glicose. Descarboxilao de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ao da enzima lisina descarboxilase. O procedimento de preparao do teste bioqumico simples, mas exige cautela, nele a colnia tocada com agulha bacteriolgica e so semeados os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Com a finalidade de inocular o meio de citrato a agulha deslizada pelo centro estriando toda a superfcie inclinanda. No meio EPM a agulha introduzida at o fundo do tubo e ao e quando retirada feito um semeio na superfcie do meio enquanto o MILi deve ser semeado por uma picada central at que atinja o fundo do tubo. Aps a preparao dos testes realizada a leitura e interpretao dos meios afim de se fechar o diagnstico. A) Meio EPM: Produo de gs: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo. Produo de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade. Hidrlise da uria: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reao fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou no. Desaminao do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfcie do meio.

B) Meio MILi Motilidade: A bactria mvel cresce alm da linha de picada. A imvel somente nesta linha.

Resultado Positivo (+) Negativo (-)

Cor do meio Crescimento fora do local da picada Crescimento ao redor da picada

Descarboxilao da lisina: Quando a lisina descarboxilada o meio adquire cor prpura acentuada ou discreta. Quando o aminocido no utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio no estiver amarelo.

Produo de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs superfcie do meio e agitar levemente. Quando a bactria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando no produz, o reativo mantm sua cor inalterada. Resultado Positivo (+) Negativo (-) Cor do reagente Rosa Amarelo

C) Meio Citrato de Simmons A utilizao do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfcie do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio no sofre alterao. Resultado Positivo (+) Negativo (-) Cor do meio Azul Verde

As reaes bioqumicas do Enterokit so agrupadas em 3 conjuntos de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um nmero de 3 dgitos, e esse que acaba identificando a espcie bacteriana. Os 3 conjuntos de provas e seus valores so:

Primeiro algarismo (A) Lactose Gs H2S Observaes: 4 2 1

Segundo algarismo(B) Urease LTD Mot 4 2 1

Terceiro algarismo(C) Indol Lisina Citrato 4 2 1

1) Para a interpretao das provas existe na bula do enterokit o item Leitura e Interpretao. 2) Quando a reao da cepa investigada positiva (+), colocado o nmero correspondente. Como exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reao negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores obtidos em cada srie. O valor de A d o primeiro algarismo, o valor de B d o segundo e o valor de C d o terceiro algarismo. Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado bioqumico: Lactose - 0 Gs H2S -0 +1 Urease LTD Mot +4 +2 +1 Indol Lisina Citrato Total:1 -0 -0 +1

Total: 1

Total: 7

Iremos obter o nmero 171 que corresponde na relao bactria Proteus mirabillis ESPCIE BACTERIANA

000 Shigella sonnei - Yersinia pestis - Shigella spp 004 Shigella spp - Yersinia enterocolitica - Escherichia coli 006 Escherichia coli 011 Citrobacter freundii 012 Hafnia alvei

013 Serratia marcescens - Hafnia alvei 014 Escherichia coli 015 Citrobacter diversus 016 Escherichia coli 035 Providencia stuartii - Providencia alcalifaciens 040 Yersinia pseudotuberculosis - Yersinia enterocolitica 044 Yersinia enterocolitica 051 Citrobacter freundii 053 Serratia marcescens 055 Citrobacter diversus 070 Proteus penneri 074 Morganella morganii 075 Providencia stuartii - Providencia rettgerii 111 Citrobacter freundii 112 Salmonella Typhi 113 Salmonella spp 151 Citrobacter freundii 170 Proteus mirabilis - Proteus penneri 171 Proteus mirabilis 174 Proteus vulgaris 175 Proteus vulgaris 202 Hafnia alvei 204 Escherichia coli 206 Escherichia coli 210 Salmonella Paratyphi A - Serratia liquefaciens 211 Citrobacter freundii - Serratia liquefaciens 212 Hafnia alvei - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 213 Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens 214 Escherichia coli 215 Citrobacter diversus 216 Escherichia coli 235 Providencia alcalifaciens 251 Citrobacter freundii 253 Serratia marcescens

255 Citrobacter diversus 270 Proteus penneri 274 Morganella morganii 310 Salmonella Paratyphi A 311 Citrobacter freundii 312 Salmonella Choleraesuis 313 Salmonella Choleraesuis - Salmonella spp 316 Edwardsiella tarda 351 Citrobacter freundii 370 Proteus mirabillis - Proteus penneri 371 Proteus mirabillis 374 Proteus vulgaris 375 Proteus vulgaris 404 Escherichia coli 406 Escherichia coli 410 Serratia liquefaciens 411 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp. 412 Serratia liquefaciens 413 Serratia sp 414 Escherichia coli 415 Citrobacter diversus 416 Escherichia coli 417 Serratia odorifera 443 Klebsiella pneumoniae 447 Klebsiella oxytoca 451 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 455 Citrobacter diversus 511 Citrobacter freundii 551 Citrobacter freundii 604 Escherichia coli 606 Escherichia coli 607 Klebsiella oxytoca 610 Serratia liquefaciens 611 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp

612 Serratia liquefaciens 613 Enterobacter aerogenes - Serratia sp 614 Escherichia coli 615 Citrobacter diversus 616 Escherichia coli 643 Klebsiella pneumoniae 647 Klebsiella oxytoca 651 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae 655 Citrobacter diversus 711 Citrobacter freundii 751 Citrobacter freundii

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