162

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGA GENMICA

ANLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
ASOCIADAS A TAPETES HIPERSALINOS DE LA LAGUNA
ROSADA DE UAYMITUN, YUCATN, MXICO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGA GENMICA

PRESENTA:

B. M. SALVADOR ELAS CASTELL GONZLEZ

REYNOSA, TAMPS DIEMBRE DEL 2010



ANLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS
ASOCIADAS A TAPETES HIPERSALINOS DE LA LAGUNA
ROSADA DE UAYMITUN, YUCATN, MXICO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGA GENMICA

PRESENTA:

B. M. SALVADOR ELAS CASTELL GONZLEZ

REYNOSA, TAMPS DICIEMBRE DEL 2010


CARTA DE CESION DE DERECHOS

ACTA DE REVISIN DE TESIS

El presente trabajo que lleva por ttulo Anlisis de las comunidades
microbianas asociadas a tapetes hipersalinos de la laguna rosada de
Uaymitun, Yucatn, Mxico, se realiz en el laboratorio de Laboratorio de
Biotecnologa Industrial del Centro de Biotecnologa Genmica del Instituto
Politcnico Nacional, en conjunto con el Laboratorio de Biotecnologa de la
Facultad de Ingeniera Qumica de la Universidad Autnoma de Yucatn, bajo la
direccin del Dr. Jos Alberto Narvez Zapata y del Dr. Rafael Antonio Rojas
Herrera, y fue financiado por los Proyectos: "Desarrollo de procesos
metodolgicos para la evaluacin de la microdiversidad eucariotica y
procaritica de diferentes sistemas ambientales" (Proyectos SIP 20091080 y
20100700) y "Estudio de la composicin taxonmica y dinmica poblacional de
la comunidad bacteriana de una laguna costera" (Proyecto 89253, Apoyo
Complementario 2008 y SISTPROY: FIQI-2009-0001).

i

INDICE

SECCIN Pgina

DEDICATORIA .............................................................................................. iv

AGRADECIMIENTOS ................................................................................... v

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... v

LISTA DE CUADROS ................................................................................. viii

LISTA DE SMBOLOS Y NOMENCLATURA ............................................. x

RESUMEN ...................................................................................................... xi

ABSTRACT ................................................................................................... xii

1 INTRODUCCIN ........................................................................................ 1

2 ANTECEDENTES ........................................................................................ 4

2.1 Ecosistemas hipersalinos .................................................................................. 4
2.2 Produccin microbiana en ambientes hipersalinos ........................................... 5
2.3 Tapetes microbianos ......................................................................................... 8
2.3.1 Definicin y primeros estudios............................................................... 8
2.3.2 Dinmica fisicoqumica en los tapetes microbianos ............................ 10
2.3.3 Diversidad en los tapetes microbianos ................................................. 11
2.4 Estudios metagenmicos ................................................................................. 13
2.4.1 Identificacin de genomas especficos en un metagenoma .................. 14
2.5 Anlisis de la restriccion de las amplificaciones del ADNr (ARDRA) .......... 14
2.6 Anlisis cualitativo de los diferentes genomas presentes en un sistema
ambiental .............................................................................................................. 15
2.7 Anlisis semicuantitativo de la biodiversidad ................................................. 16

3 JUSTIFICACIN ........................................................................................ 19

4 HIPTESIS ................................................................................................. 20

5 OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 20

5.1 Objetivos especficos ...................................................................................... 20

6 MATERIAL Y METODOS ........................................................................ 21

ii

6.1 Diseo experimental ....................................................................................... 21
6.2 Zona de colecta ............................................................................................... 22
6.3 Colecta de muestras ........................................................................................ 23
6.4 Separacin de capas ........................................................................................ 24
6.5 Anlisis de los factores fisicoqumicos macro y micro ambientales ............... 25
6.6 Pretratamiento de muestras ............................................................................. 25
6.7 Tincin de muestras para microscopia ptica ................................................. 26
6.7.1 Tincin con azul de bromofenol ........................................................... 26
6.7.2 Hibridacin con naranja de acridina ..................................................... 26
6.8 Fijacin de muestra para microscopia electrnica .......................................... 26
6.9 Extraccin de ADN metagenmico por mtodo de slica ............................... 27
6.10 Determinacin de la integridad del ADN por electroforesis ......................... 28
6.11 Cuantificacin del ADN Metagenmico ....................................................... 28
6.12 Amplificacin por PCR de la regin ribosomal ............................................ 28
6.13 Purificacin de los productos de PCR ........................................................... 29
6.14 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) ....................... 30
6.15 Clonacin y construccin de amplicotecas ................................................... 31
6.16 Conservacin de las Amplicotecas ............................................................... 31
6.17 Seleccin de clonas representativas y mtodo de anlisis de la
restriccion de las amplificaciones del ADNr (ARDRA) ............................ 32
6.17.1 Tamizaje de la biblioteca metagenmica ........................................... 32
6.17.2 Extraccin de ADN plasmdico (ADNp) ........................................... 32
6.17.3 Digestin enzimtica de las muestras ................................................. 33
6.17.4 Secuenciacin de clonas representativas ............................................ 33
6.18 Caracterizacin de las clonas seleccionadas en el Ribosomal DataBase
Proyect (RDP) ............................................................................................. 33
6.19 Anlisis de la filogenia molecular ................................................................. 33
6.20 Estadstica descriptiva e ndices ecolgicos .................................................. 34

7.RESULTADOS ........................................................................................... 35

7.1 Proceso de formacin de tapetes microbianos ................................................ 35
7.1.1 eterminacin de tapetes maduros y muestreo ..................................... 355
7.2 Fisicoqumicos .............................................................................................. 377
7.3 Tipologa microscpica de tapetes microbianos hipersalinos ....................... 388
7.3.1 Fraccin eucarionte ............................................................................ 388
7.3.2 Fraccin procarionte ........................................................................... 388
7.3.3 Tinciones .............................................................................................. 39
7..3.4 Microscopia electrnica ...................................................................... 40
7.4 Caracterizacin metagenmica de los tapetes microbianos hipersalinos ...... 422
7.4.1 Tratamiento con EDTA y extraccin del ADN metagenmico ......... 422
7.4.2 Amplificacin por PCR de la regin ribosomal. ................................ 422
7.4.3 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) ............. 433
7.4.4 Amplicotecas ........................................................................................ 43
7.4.5 Analisis de la Restriccion de las Amplificaciones del ADNr
(ARDRA) ...................................................................................................... 45
7.4.6 Secuenciacin de clonas representativas ............................................ 466
7.4.7 Caracterizacin de las secuencias mediante Ribosomal DataBase
Proyect (RDP) ................................................................................... 477
7.5 Ecologa molecular ....................................................................................... 477
7.6 Filogenia molecular ...................................................................................... 611
iii

7.6.1 Filogenia de Archaea ......................................................................... 622
7.6.2 Filogenia de Bacteria ......................................................................... 633
7.6.3 Filogenia de phylla persistentes ......................................................... 644
7.6.3.1 Bacteroidetes ......................................................................... 644
7.6.3.2 Firmicutes ............................................................................. 655
7.6.3.3 Proteobacteria ...................................................................... 666

8 DISCUSIN ....................................................................................................... 677

9 CONCLUSIONES ............................................................................................... 74

10 RECOMENDACIONES ........................................................................... 76

11 REFERENCIAS CITADAS ...................................................................... 77

12 APNDICE 1. PROTOCOLOS DE PCR ................................................. 92

13 APNDICE 2. FORMULAS EMPLEADAS PARA EL NALISIS
ECOLGICO ................................................................................................. 93

12 APNDICE 3. DIVERSIDAD TOTAL .................................................... 94

13 APNDICE 4. ARCHIVO FOTOGRFICO ......................................... 102

14 APNDICE 5. RBOLES FILOGENTICOS EN EXTENSO ............ 111

GLOSARIO .................................................................................................. 114

iv

DEDICATORIA

A mi familia que siempre ha confiado en que hara algo extraordinario de mi vida y que
espero esto sea una pequea prueba que sus esfuerzos no quedaran en vano.

Un Lamento Por Gaia

v

AGRADECIMIENTOS

A todos los Investigadores que me apoyaron y creyeron en m durante el desarrollo de
este proyecto, por no encontrarse dentro de los rubros generales del rea.

A la naturaleza y su evolucin que me brindaron de ese hbitat tan misterioso y fabuloso
que a manera de microcosmos me sirvi de materia prima para el desarrollo del presente
documento.

Al Dr. Jos Narvez y al Dr. Rafael Rojas, por soportar mi necedad de aplicar mis
nmeros en donde no haban sido aplicados.

Especialmente a mis padres Grisel y Omar, a mis hermanos Scarlett y Alejandro por
soportar m cada vez ms intolerable carcter en bsqueda del conocimiento.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT), al Programa Institucional
de Formacin de Investigadores (PIFI), a Santander ECOES por el apoyo para el
sustento y movilidad necesaria para la realizacin y culminacin del proyecto.

vi

LISTA DE FIGURAS
Figura Pgina

1 Diversidad y Dinamica Fisicoquimica en tapetes microbianos hipersalinos . 10

2 Diagrama general de la metodologa empleada ............................................. 21

3 Ubicacin de la zona de colecta. .................................................................... 22

4 Caracteristicas Macroscopicas de tapates microbianos hipersalinos
maduros .......................................................................................................... 24

5 Ciclo de formacin y de degradacin de tapetes hipersalinos en la Laguna
Rosada de Uaymitn, Yucatn. ...................................................................... 36

6 Tapete microbiano hipersalino con sus diferentes capas ............................... 36

7 Grfico de dispersin para los datos fisicoqumicos macroambientales ........ 37

8 Contaminacin exgena en las observaciones al microscopio ptico ............ 38

9 Observaciones al microscopio ptico de frotis de tapetes microbianos ......... 39

10 Observaciones al microscopio de tinciones realizadas a la muestra .............. 39

11 Observaciones en MEB de tapetes microbianos hipersalinos ........................ 40

12 Observaciones en MEB de la estructura de la matriz en tapetes
microbianos hipersalinos ................................................................................ 41

13 Diversidad morfolgica de tapetes microbianos hipersalinos mediante
MEB ............................................................................................................... 41

14 Extraccin de ADN metagenmico, de tapetes microbianos hipersalinos,
de la Laguna Rosada de Uaymtun, Yucatn ................................................. 42

15 Amplificaciones mediante tcnica de PCR para los iniciadores gc338F y
518R para Bacteria. ........................................................................................ 43

16 DGGE de tapetes microbianos hipersalinos ................................................... 44

17 Patrones de restriccin (EcoR1) para las amplicotecas de Bacteria ............... 46

18 Grfico de barras para el nmero de secuencias distintas, para cada uno
de los muestreos y totales para cada uno de los juegos de iniciadores .......... 48

vii

19 Grfico de la curva de rarefaccin para Archaea, Bacteria y total, del
esfuerzo de muestreo vs nmero de representantes para Clase, Orden,
Familia y Gnero . .......................................................................................... 48

20 Grfico porcentual de distribucin de frecuencias totales por phyllum. ........ 51

21 rbol filogentico para Archaea .................................................................... 62

22 rbol filogentico para Bacteria .................................................................... 63

23 rbol filogentico para Bacteroidetes ............................................................ 64

24 rbol filogentico para Firmicutes ................................................................ 65

25 rbol filogentico para Proteobacteria ......................................................... 66

26 Diagrama de conjuntos poblacionales para la similitud de grupos ................ 69

27 Esquema de la dinmica de cambio poblacional en relacin con los
fisicoqumicos, en la Laguna Rosada de Uaymtun, Yucatn ........................ 72

viii

LISTA DE CUADROS

Cuadro Pagina

1 Parmetros fisicoqumicos macroambientales y microambientales
asociados a la capa fototrfica de tapetes microbianos hipersalinos en las
diferentes pocas de muestreo. ....................................................................... 37

2 Anlisis binominal de capas del DGGE por capa. ......................................... 43

3 Anlisis binominal del desarrollo de la capa superior verde azulada del
DGGE por poca de muestreo. ....................................................................... 44

4 Tasa de transformacin y eficiencia de las amplicotecas. .............................. 45

5 Reacciones de digestin con EcoR1 por genoteca. ........................................ 46

6 Nmero de haplotipos obtenidos medainte digestin con EcoR I ................. 46

7 Nmero de representantes para cada uno de los niveles taxonmicos .......... 47

8 Frecuencias encontrados para cada uno de los phyllum, por muestreo y
total. ................................................................................................................ 49

9 Anlisis de persistencia, dinmica e intercambio de poblaciones. ................. 50

10 Grupos persistentes segn datos generados de las Amplicotecas .................. 52

11 Anlisis de diversidad y frecuencias para los rangos taxonmicos
mayores a partir de las secuencias de las amplicotecas por poca de
muestreo. ........................................................................................................ 53

12 Anlisis binominal para los rangos taxonmicos mayores por poca de
muestreo mediante Cuadro de ausencia presencia a partir de las
secuencias de las amplicotecas. ...................................................................... 54

13 Cuadro de anlisis de densidad taxonmica para cada uno de los
muestreos segn dominio y totales. ................................................................ 55

14 Anlisis de correlacin de Pearson de los Fisicoqumicos vs la diversidad
encontrada mediante el DGGE y las Amplicotecas, segn dominio. ............. 56

15 Anlisis de correlacin de Pearson de los Fisicoqumicos vs la densidad
taxonmica encontrada mediante las Amplicotecas, segn dominio. ............ 57

ix

16 Anlisis de diversidad para el DGGE y las Amplicotecas mediante ndice
de Shannon (paramtrico y no paramtrico), y la diversidad alfa. ................. 58

17 ndices ecolgicos para similitud poblacin, uniformidad y distancias
ecolgicas totales. ........................................................................................... 59

ecolgicas para el dominio Bacteria. .............................................................. 60

ecolgicas para el dominio Archaea. .............................................................. 61

x

LISTA DE SMBOLOS Y NOMENCLATURA

pb Pares de base
TA Temperatura Ambiente (25
o
C)
M Molar
g/L Gramos por litro
rpm Revoluciones por minuto
A
260
Absorbancia a 260 nm
NaCl Cloruro de Sodio
EDTA Sal disdica de del cido etilendiaminotetraactico.
SSCP Polimorfismo de Conformacin de Cadena Sencilla.
DGGE Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante
PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa
MEB Microscopia Electrnica de Barrido
ADNr ADN ribosomal
ADNp AND plasmdico
ARDRA Anlisis de la Restriccin de las amplificaciones del ADNr
RDP Ribosomal DataBase Proyect

xi

RESUMEN

Los ambientes hipersalinos, son un tipo de ambiente extremofilo que tiene un alto nivel
de estrs osmtico que genera una presin selectiva muy fuerte. En este tipo de
ambientes, los consorcios microbianos desarrollaron distintos tipos de asociaciones para
su supervivencia. El ms complejo y diverso de este tipo de asociaciones, son los tapetes
microbianos, que son una serie de biopeliculas en tndem, que forman micronichos
estratificados, de acuerdo a los distintos metabolismos de los organismos embebidos en
la biopelcula. El presente estudio tiene la intencin de interpretar las dinmicas de las
comunidades microbianas que se llevan a cabo en estos tapetes microbianos. Este trabajo
fue realizado en una poza salinera de la Laguna Rosada de Uaymitn (Yucatn, Mxico)
mediante tres muestreos: M1 (Mayo-Junio), M2 (Julio-Agosto) y M3 (Septiembre-
Octubre), que abarcan desde el final de la poca de secas hasta la poca de lluvias. Las
muestras se tomaron en el mismo punto para analizar los cambios en las comunidades
microbianas desde dos perspectivas: su estructura mediante tcnicas de microscopia,
clsica y electrnica de barrido, y segundo la diversidad por mtodos moleculares
metagenmicos como fueron el DGGE y el anlisis de Amplicotecas de ADN ribosomal.
La extraccin del ADN metagenmico se realiz utilizando el mtodo de silica. El
anlisis utilizo amplificaciones por PCR de la regin 16s del ADNr, utilizando los
juegos de iniciadores 16SS/16SR y gc338F/PRUN518R para la construccin de las
Amplicotecas y el anlisis por DGGE, respectivamente. Para el anlisis de la fraccin de
Archaea se utilizaron los iniciadores A571F y UA1204R para ambas metodologas
moleculares. Los resultados indican una mayor diversidad por mtodos indirectos
(DGGE) en el muestreo M1, aunque el anlisis de las Amplicotecas indica una mayor
diversidad en el muestreo M3. Estas comunidades microbianas se encuentran en dos
grandes grupos, un grupo de microorganismos ms abundante (Proteobacteria,
Firmicutes y Bacteoidetes) que persiste, y otra poco abundante pero muy diversa que
vara a lo largo de los muestreos. Estas dinmicas se ven significativamente afectadas
por la salinidad para la biodiversidad, y la temperatura para la abundancia. Finalmente,
el anlisis del ndice de Morisita indica que las comunidades son una misma con proceso
de sucesin ecolgica estacional influenciado por el ambiente.
xii

ABSTRACT

Hypersaline environments are a type of extremophile environment that has a high level
of osmotic stress that generates a strong selective pressure. In this environment, the
microbial consortia developed different types of partnerships for their survival. The most
complex and diverse of such associations are the microbial mats, which are a group of
biofilms in tandem, with stratified micro-niches according to the different metabolisms
of the organisms embedded in biofilm. This study aims to interpret the dynamics of
microbial communities which are conducted in these microbial mats. This work was
conducted in a salt pond in the Laguna Rosada Uaymitn (Yucatn, Mexico) by three
samples: M1 (May-June), M2 (July-August) and M3 (September-October), ranging from
the end of the dry season to rainy season. The samples were taken at the same point to
analyze changes in the microbial communities from two perspectives: its structure using
microscopy techniques, classical and electronic scanning and second diversity by
molecular methods were metagenomics as DGGE and analysis library ribosomal DNA.
Metagenomic DNA extraction was performed using the silica method. The analysis uses
PCR amplification of 16S rDNA region using primers games gc338F/PRUN518R
16SS/16SR and construction of libraries and DGGE analysis, respectively. For the
analysis of the fraction of Archaea primers were used for both UA1204R A571F and
molecular methodologies. The results indicate a greater diversity by indirect methods
(DGGE) in a sample M1, although the analysis of the libraries indicates greater diversity
in the M3 sample. These microbial communities found in two groups, one group of
organisms more abundant (Proteobacteria, Firmicutes y Bacteoidetes), that is persistent,
and another one pour abundant but very diverse along various samples. These dynamics
are significantly affected by salinity for the biodiversity, and temperature for prosperity.
Finally, the analysis of Morisita index indicates that the communities are the same, and
have a seasonal process of ecological succession mainly affected by the environmental
changes.

1

1. INTRODUCCIN

Los ecosistemas hipersalinos son ambientes extremos que se encuentran poco estudiados
y generalmente considerados poco diversos y productivos (Fourans et al., 2004).
Recientemente, se han desarrollado diversas metodologas moleculares que permiten
analizar de manera ms extensa las microcomunidades existentes en dichos sistemas, ya
que se incluyen con estas metodologas toda la gama de organismos no cultivables que
no son caracterizados por los mtodos clsicos microbiolgicos, el conjunto de estas
metodologas son llamadas tcnicas metagenmicas (Xu, 2006). Al aplicar estas
metodologas a estos sistemas hipersalinos se ha observado que la diversidad y
complejidad de estos haloambientes es mucho mayor de la que se consideraba (Minz et
al.,1999a; Ley et al., 2006), y este fenmeno se repite en todos los ecosistemas extremos
en los cuales se han realizado este tipo de investigaciones en los ltimos aos. En
Mxico se han realizado estudios en la Laguna Ojo de Liebre en Guerrero Negro, Baja
California Norte (Spear et al., 2003; Ley et al., 2006) y en las pozas minerales de Cuatro
Cinagas, Coahuila (Breitbart et al., 2009); estas investigaciones indican que las
dinmicas microecolgicas, la complejidad de los microhbitats y formacin de
consorcios microbianos y la biodiversidad reportada, son inmensamente mayor con
respecto a las estimaciones generadas mediante estudios preliminares. Dentro de estos
microcomunidades hipersalinas, los sistemas ms complejos parecen ser los llamados
tapetes microbianos (Taton et al., 2003), los cuales son asociaciones microbianas muy
complejas que se encuentran embebidas en matrices de polmeros (biopelculas) que
forman consorcios interdependientes a manera de estratos en tndem (Nbel et al.,
2001), donde se generan micronichos biogeoqumicos en cada uno de estos estratos de
acuerdo al metabolismo de los microorganismos, con una dinmica semicerrada con
intercambio de productos entre capas (Des Marais, 2003), favoreciendo as con este
aislamiento del medio y entre capas, una homeostasis poblacional que permiten la
supervivencia a las condiciones ambientales extremas (Minello et al., 2003; Abed et al.,
2007).
Este tipo de consorcios, son los fsiles ms antiguos conocidos, como es el caso de los
Estromatolitos, que datan de hace 3800 millones de aos, que son consorcios que
2

presentaban este tipo de asociacin microbiana, conservando este tipo de arreglo
probablemente a manera mecanismo de resistencia a los cambios ambientales drsticos
de la atmsfera reductora primitiva (Hoeler et al., 2003; Des Marais, 2003; Leuko et al.,
2007). Estos se encontraban formados principalmente por cianobacterias primitivas y
que se proponen como los principales causantes del cambio climtico global hacia una
atmsfera rica en oxgeno mediante algn tipo de fotosntesis primitiva, que
posteriormente condujo a la explosin biolgica existente, a la par de algunos cambios
en los procesos biogeoqumicos (Cloud, 1976; Grotzinger, 1980).
Los actuales tapetes microbianos estn constituidos por descendientes directos de estos
microorganismos primitivos y han mantenido un proceso constante de evolucin, no
solo de sus genomas individuales, sino tambin de las interacciones ecolgicas
existentes entre ellos. Por lo anterior, el estudio de las interacciones existentes entre los
principales grupos de microorganismos es de gran importancia para entender otras
interacciones ecolgicas existentes, su desarrollo y formacin, en otros ambientes
extremofilos y no extremofilos.
Una de las caractersticas ms importante en estos sistemas ambientales es la
variabilidad a la cual se encuentran sometidos. Por ejemplo, a nivel macroambiental en
estos sistemas hipersalinos existen grandes cambios en la disponibilidad de agua dulce;
estos aportes provienen de varias fuentes como los sistemas pluviales, escorrenta,
florecimientos naturales, aporte de las mareas y cambios estacionales temporales y/o
permanentes (Pinckney et al., 1995), provocando variabilidad en la biodiversidad
existente debido a los cambios en los niveles de salinidad (Wenke y Vogt, 1981;
Alexander y Dunton, 2002). Tambin hay evidencia de que la dinmica poblacional
estacional no es la nica que existe en estos ecosistemas, ya que se han observado
variaciones verticales, habiendo diferencias entre los organismos presentes en cada uno
de los estratos en ciclos de 24 horas (Villanueva et al., 2007); esto propone la existencia
de migracin biolgica vertical inducida por factores microambientales como la
radiacin UV, Oxgeno disuelto y la temperatura (Bebout y Garca-Pichel, 1995). Otra
caracterstica interesante es que los fenmenos de distribucin de nichos ecolgicos,
procesos trficos y biogeoqumicos complejos se dan en dimensiones muy pequeas,
comparando los procesos similares, como los que se dan en el medio marino entre la
3

superficie y la zona profunda anaerbica con dinmicas de intercambio que van de unos
cuantos metros hasta varios miles; De esta manera se genera una estratificacin de tres
zonas bien definidas, una xica, otra zona de transicin y finalmente una zona anxica
(Dollhopf et al., 2005), esta zona xica es la que est en contacto con el ambiente
exterior, mediante las otras se distribuyen hacia lo profundo. Estas zonas se forman por
diferentes grupos que establecen las condiciones del microambiente y posteriormente la
migracin de otros grupos que se establecen en las zonas ms favorables para su
supervivencia. Esta distribucin de los microorganismos se distribuye segn su
tolerancia primaria al oxgeno, la luz y la temperatura, siendo primeramente los
organismos fotosintticos como las cianobacterias y algunos hetertrofos aerbicos en el
primer estrato (0-3 mm), sulfobacterias fototrficas y quimiotrficas en el segundo
estrato (2-5mm) y organismos fermentadores, sulfato reductores y metanognicos en el
ltimo estrato (5-10mm) (Minz et al., 1999a, 1999b, Smith et al., 2008). La complejidad
del microhbitat en conjunto con lo reducido de la escala y la reducida fraccin
cultivable, se dificulta el estudio de la microbiodiversidad en estos hbitats y la
evaluacin de los parmetros fisicoqumicos existentes. Actualmente es posible analizar
estos parmetros utilizando microelectrodos capaces de analizar cambios en el pH, O
2

disuelto y potencial redox, en distancias de hasta 200 m (Revsbech y Ward, 1984). Sin
embargo, existen muy pocos estudios acoplando el conjunto de tcnicas metagenmicas
y de microlectrodos en estos ambientes (Bebout y Garcia-Pichel, 1995; Ley et al.,
2006).
Por lo anterior, el presente estudio est enfocado en el estudio de las comunidades
microbianas en tapetes microbianos presentes en pozas salinas de la Laguna Rosada
(Uaymitn, Yucatn), en distintos estadios de maduracin empleando el conjunto de
metodologas metagenmicas para as contribuir al conocimiento sobre los procesos
trficos, biogeoqumicos y productivos en estos ecosistemas hipersalinos.

4

2. ANTECEDENTES

2.1. Ecosistemas hipersalinos

Los ecosistemas hipersalinos se encuentran en ambientes acuticos o cercanos a ellos y
se caracterizan por poseer una salinidad superior a 80 ppm de manera permanente o
estacional. Estn representados principalmente por humedales costeros, pozas
intermareales y algunos otros sistemas de humedal, aunque tambin se han localizado
ambiente hipersalinos en cuerpos de agua donde sus componentes edficos son
principalmente del tipo crstico y calcreo. Las caractersticas fisicoqumicas de estos
ambientes hipersalinos son variables y se encuentran muy relacionados con la aportacin
de agua dulce que modifica las condiciones del medio dndose ciclos estacionales
(Gorlenko et al., 2010). Estos cambios en las condiciones del medio alteran totalmente
el ecosistema, dndose cambios en la biodiversidad (Alexander y Dunton, 2002) y
consecuentemente en las cadenas trficas y los ciclos biogeoqumicos (Herrera-Silveira
et al., 2002), as mismo el aporte de contaminantes son una factor selectivo para la
variabilidad de los componentes de las comunidades (Crdoba-Kreylos et al., 2006).
Tradicionalmente la microbiota de sistemas salinos mediante tcnicas clsicas de cultivo
se clasifican en: ligeramente halfilo con crecimiento optimo a 3% de NaCl, halfilos
moderados a 3-15% y halfilos extremos con 25% para crecimiento optimo y un mnimo
para subsistencia de 12% (Margesin y Schinner, 2001); otro mtodo de estudio es el uso
de medios selectivos, como el medio MRS para aislamiento de bacterias cido lcticas
(Zamudio-Maya et al., 2008) o pruebas bioqumicas buscando generar una respuesta
metablica (Garca, 2007). Entre los primeros trabajos, se encuentra el realizado en la
costa de Alicante, Espaa, donde se aislaron de sedimento algunas bacterias Gram
positivas de los gneros Psudomonas, Bacillus, Alcaligenes y Micrococcus, aunque no
se logr demostrar una correlacin significativa entre la salinidad (50 250 ppm) y la
abundancia de cada uno de los gneros (Quesada et al., 1982). Estas asociaciones
microbianas pueden ser organismos de vida libre, asociadas a partculas y/o sedimentos
o formando biopelculas, ya sean flotadoras, incrustantes o en tapetes microbianos (Da
Silva et al., 2007; Biddle et al., 2008; Da Silva et al., 2008).
5

La variabilidad en la salinidad genera cambios estacionales o puntuales en la
biodiversidad, estos cambios pueden ser por aportes directos de agua dulce como ocurre
en la baha de Hays (Kansas, USA) (Wenke y Vogt, 1981) o estacionales y espaciales
como se observ en la Laguna Salada de Chiprana (Espaa), diagnosticado mediante
cambios en las frecuencias de miembros del gnero Chlorobium (Guerrero et al., 1991).

2.2. Produccin microbiana en ambientes hipersalinos

Generalmente, se ha considerado a los ecosistemas hipersalinos ambientes estriles o
casi estriles con una baja diversidad. Los primeros estudios con fines biotecnolgicos
en estos sistemas fueron dirigidos a analizar la capacidad de retencin de glicerol en
algas hipersalinas (Dunaliella y Asteromonas) bajo condiciones variables de salinidad y
temperatura (Wegmann et al., 1980). Posteriormente se realizaron ensayos de fijacin
de C
14
, en Dunaliella tertiolecta confirmando la relacin entre la salinidad y la
produccin y retencin de glicerol (Goyal et al., 1986). Otros estudios realizados en D.
bardawii y D. salina demostraron la gran capacidad de adaptacin de estos organismos
al stress, mediado por la acumulacin de pigmentos fotoprotectores (Ben-Amotz et al.,
1987; Orset y Young, 2000), estrategia que algunos autores proponen como mecanismo
de control redox (Steinbrenner y Linden, 2003). Estas investigaciones originaron un gran
inters por la produccin de glicerol en estos sistemas hipersalinos a nivel industrial. Por
ejemplo, se analiz la sntesis de glicerol a varias concentraciones de NaCl en D. salina
(Chitlaru y Pick, 1991, Hernndez et al., 2000), mediante adaptaciones subcelulares
(Stoynova-Bakalova y Toncheva-Panova, 2003). Otros estudios ms recientes
investigaron el mecanismo activador de la respuesta al estrs osmtico determinando la
inhibicin de esteroles y glicerol en las clulas mediante cambios en la configuracin de
los lpidos de membrana (Zelazny et al., 1995), o en otros casos la activacin de vas
metablicas distintas de la sntesis de lpidos como respuestas al estrs salino (Azachi et
al., 2002). A nivel molecular se conoce la activacin de ciertos genes involucrados con
la acumulacin de pigmentos bajo condiciones de estrs salino (Sun et al., 1998), como
es el caso del gen des 3-1 que codifica para la -3 cido graso desaturasa que participa
en las modificaciones de cidos grasos de la membrana (Lyukevich et al., 2003).
6

Otra herramienta utilizada es el uso de genes relacionados con la produccin de
metabolitos en alguna etapa significativa como el crecimiento temprano (Estvez et al.,
2000), como en la produccin de metabolitos de importancia industrial como el glicerol
(Nevoigt y Stahl, 1997, Kaka y Dnmez, 2008), carotenos (Steinbrenner y Linden,
2001), xantofilas (Issacson et al., 2002) e isoprenoides (Schwender et al., 2001), entre
otros, mediante la bsqueda de genes que se encuentran relacionados en la biosntesis de
estos productos. Por otro lado, el uso de marcadores moleculares para determinar cepas
hiperproductoras (D. bardawil, D. salina y D. parva), como en la produccin de
carotenos mediante la caracterizacin de los ITS I y II (Olmos-Soto et al., 2002). Este
mismo procedimiento se ha utilizado para la identificacin de bacterias cido lcticas
utilizables en procesos fermentativos (Guan et al., 2003).
La mayora de los representantes procariontes tienen coloraciones purpreas o rojizas,
relacionadas con su metabolismo sulfato reductor y la formacin de bacterioruberinas
(Ollivier et al., 1994; Alinei et al., 2006; Bardavid y Khristo, 2008), que se ha
demostrado son importantes en los sistemas ambientales con baja salinidad y niveles
altos de sulfatos (Smith et al., 2008), debido a esto la mayor abundancia se presenta en
las zonas anxicas y en los estratos inferiores de los tapetes (Elshahed et al., 2004).
Algunos de los primeros estudios fueron puramente descriptivos, encontrando
principalmente miembros de los gneros Halococcus, Halobacterium, y algunas cepas
con caractersticas aprovechables como Volcaniela eurihalina (Quesada et al., 1990),
Roseovarius tolerans (Labrenz et al., 1999) o Halolactibacillus halophilus (Ishikawa et
al., 2005) por nombrar algunos. La primera caracterstica que se estudi a fondo fue el
crecimiento de las cepas en condiciones controladas de salinidad para una posible
aplicacin biotecnolgica (Javor, 1984; Girguis et al., 2005)). Posteriormente, se
realizaron estudios con el metabolismo de los azcares (Oren y Mana, 2003) y del
glicerol (Sher et al., 2004) en Salinibacter ruber, que comparte rutas metablicas con la
Archaea Haloferax volcanii, indicando que las bacterias halfilas presentan un
metabolismo conservado con las Archaeas halfilas de las que provienen (Roberts,
2005). Este estrs haloselectivo ha generado una conservacin de vas metablicas en
halobacterias, con los mismos productos metablicos (Falb et al., 2008). Dentro de estas
Archaeas no cultivables se encuentran representantes oxidantes de amonio, que tienen
7

un papel crucial en las cadenas trficas y en los ciclos biogeoqumicos que involucran la
fijacin de nitrgeno (Cavicchioli, et al., 2006), aunque hay indicios de que existe la
fijacin de nitrgeno mediada por las cianobacterias existentes en el sistema (Charpy et
al., 2010).
Las bacterias anaerbicas del gnero Clostridium han demostrado una buena efectividad
en la degradacin de azcares para la produccin de etanol, cido actico y cido
succnico, entre otros, o la elaboracin de productos de fermentacin por Desulfovibrio
mediante el uso de sulfuros como el tiosulfato como aceptor de electrones (Yaa et al.,
2006).
Es un hecho que para que estas zonas anxicas sean productivas y estables, debe haber
un aporte bidireccional entre las quimioclinas para sustentar el metabolismo de los
sistemas (Tanner et al., 2010), donde exista una estrecha interrelacin entre los grupos,
como el caso de los gneros Dunaliella, Halobacter, Salinibacter y la arqueobacteria
Haloquadratum walsbyi que son necesarias para la colonizacin del ambiente y el
posterior establecimiento del resto de las comunidades (Bardavid et al., 2008).
Otros de los productos obtenidos a partir de cultivos de bacterias hipersalinas son
enzimas hidrolticas (amilasas, proteasas, ADNasas, lipasas, polulasas) que se acumulan
en la matriz extracelular en diversos grupos que incluyen: Salinivibrio, Halomonas,
Chromohalobacter, Bacillus-Salibacillus, Salinococcus y Marinococcus (Snchez-Porro
et al., 2003); esta produccin aumenta conforme la salinidad incrementa, favoreciendo el
metabolismo de las comunidades (Sirov et al., 2006).
Algunos autores proponen a estos microorganismos para la produccin masiva de
metabolitos en sistemas hipersalinos y en algunos casos, la generacin de ecosistemas
hipersalinos artificiales abiertos como granjas productoras (Garca-Gonzlez et al.,
2003). Por otro lado, la capacidad de estos complejos microbianos de asimilar y/o
metabolizar ciertos compuestos o iones metlicos txicos el ambiente, los hace
candidatos idneos para ser utilizados en biodepuracin y biorremediacin de
sedimentos, cuerpos de agua y otros sustratos (Llirs et al., 2003; Lpez-Corts et al.,
2010), como es el caso del gnero Halomonas que recupera el selenio del agua (De
Souza et al., 2001) y tambin degrada algunos compuestos aromticos (Garca et al.,
2005). Tambin se ha observado que los tapetes microbianos se encuentran asociados a
8

la biorremediacin natural de las zonas litorales afectadas por derrames de petrleo
(Martnez-Alonso y Gaju, 2005; Al-Mailem et al., 2010). Actualmente los tapetes
microbianos estn siendo utilizados con xito en la biorremediacin de agua en
estanques de cultivo camarn (Lezama-Cervantes et al., 2010).

2.3. Tapetes microbianos

2.3.1. Definicin y primeros estudios

Los tapetes microbianos, son un consorcio de microorganismos asociados que forman
una matriz de exopolisacridos, donde estas biopelculas se organizan en estratos con
caractersticas distintivas cada uno, generando micronichos fisicoqumicos a manera de
quimioclinas (Fourans et al., 2004), lo que a su vez puede limitar la distribucin de los
organismos embebidos en estos tapetes (Des Marais, 2003), que se forman como
respuesta a la agresividad del medio, teniendo por esto un mayor desarrollo en la poca
de secas (Da Silva et al., 2007).
Los tapetes microbianos son sistemas muy complejos que han evolucionado desde hace
millones de aos, teniendo registros fsiles de los mismos, los estromatolitos, datados en
aprximadamente 3800 millones de aos (Ma) (Cloud, 1976). Se han realizado diversos
estudios en las costas de Canad, describiendo un total de al menos 28 grupos de
estromatolitos y miniestromatolitos provenientes de salinas y aragonita, donde se
presentaron diversos tipos de cianobacterias como Ribularia sp. y Phormidium sp. as
como algas de los gneros Pseudogymnosolen sp., Yelma sp. y Asperia sp. La
abundancia relativa de estos grupos indica que los fsiles ms antiguos estaban
principalmente formados por cianobacterias (3800 Ma) y posteriormente se agregaron
representantes algales, principalmente algas fibrosas o coralinas (2000 Ma) a los
estromatolitos (Hofmann, 1969; 1976; 1977; Hoffman y Jackson, 1987). Analizando las
concentraciones de carbono y minerales asociados a las estructuras no filamentosas de
estos tapetes ancestrales, se encontraron concordancias con los sustratos asociados a
metabolismos bacterianos, indicando una abundancia importante de bacterias, entras las
que figuran candidatos como: Eoastrion simplex, Palaeolyngbya barghoorniana,
9

Eucapsis sp., Eontophysalis belcherensis, Gallionela ferruginata y Archaeotrichion
contortum como las especies dominantes (Awramik et al., 1988), donde la dinmica de
sedimentacin y el proceso de colonizacin de las comunidades microbianas
(Chakrabarti y Shome, 2010) as como el arreglo poblacional que adquieren (Lloyd et
al., 2010), son de gran importancia en el proceso de formacin. Estudios ms recientes
en estromatolitos de la Baha Tiburn, en el oeste de Australia demuestran la presencia
de flagelados de los gneros Euglenidae y Dinoflagellata, aunque no se ha encontrado
ninguna relacin de estos con la formacin o modificacin de los estromatolitos algales
(Al-Qassab et al., 2002). Otros estudios han demostrado variaciones en la abundancia y
diversidad de los organismos presentes, lo que incrementa la riqueza total de especies,
siendo esta menor hacia los estratos inferiores. Lo anterior, probablemente, debido a la
disponibilidad de sales en el sustrato que favorecen preservacin de los tapetes,
mediante la generacin de xidos y otros sedimentos, que son posteriormente
introducidos en el sistema y formando as una cubierta en la pared celular que es la base
para la formacin de los estromatolitos (Grotzinger et al., 1980; Shiba et al. 1991).
Amplificando el dominio sulfito reductasa en bacterias sulforeductoras, se localiza la
presencia de este grupo en los estromatolitos ancestrales, revelando genes ancestrales
Archaeas, como el dominio sulfato reductor relacionado con el gnero Archeoglobus
(Wagner et al., 1998), y el gen phnA (fosfonoacetato hidrolasa) que participa en la
mineralizacin del fosfonoacetato presente en el gnero Vibrionaceae (Gilbert et al.,
2009).
El estudio de los tapetes microbianos ancestrales permite sugerir su participacin en el
cambio de la atmsfera reductora con alto contenido de gases de S
2
y N
2
, a oxignica a
travs del aporte de O
2
como producto de desecho de la fotosntesis primigenia; del
mismo modo las sales asimiladas y acumuladas o transformadas por estos organismos,
colaboraron en el proceso de sedimentacin biomineral, modificando los procesos
biogeoqumicos. Se ha considerado estos mismos conglomerados como el medio ideal
para la colonizacin de otros ambientes, terrestres y extraterrestres por su resistencia
adaptativa (Litchfield, 1998).

10

2.3.2. Dinmica fisicoqumica en los tapetes microbianos

En el parque nacional de Yellowstone (USA) se investig la dinmica fisicoqumica de
los tapetes microbianos a travs de mediciones in situ con microelectrodos, tomando
lecturas de O
2
, pH y fotosntesis del agua intersticial. Estos estudios permitieron
identificar variaciones en los parmetros a manera de micronichos, con variaciones
considerables en una profundidad de tan solo 6 mm (Revsbech y Ward, 1984).

Figura 1. Diversidad y dinmica fisicoqumica en tapetes microbianos hipersalinos. Cianobacterias (CIA),
Bacterias Verdes no sulfurosas (BV), Bacterias Sulfato Reductoras (BSR), Bacterias Prpuras de Sulfurosas
(BPS), Metangenos (MET). Estrato Fototrfico (FOT), Estrato Facultativo (FAC) y Estrato Anxico (ANOX).

Estos quimioestratos tambin se reportaron en tapetes cianobacterianos de ambientes
oxignicos, formados principalmente por organismos del gnero Cloroflexus,
observndose variacin en las concentraciones de los metabolitos acetato y glicolato
acumulndose principalmente en la capa superior fototrfica y disminuyendo en la capa
anoxignica quimiotrfica; al contrario, del lactato y el etanol; en cambio, las
concentraciones de H
2
S y SO
4
, fueron mayores en la capa intermedia, donde se ubican
los organismos sulfatoreductores (Fig. 1) (Frnd y Cohen, 1992; Tanner et al., 2010).
Este sulfoestrato es altamente complejo y diverso, de acuerdo a estudios basados en el
11

anlisis de genes sulforeductores (Minz et al., 1999a) y ribosomales (Minz et al.,
1999b), demostrando que la estratificacin por quimioclinas biogeoqumicas es un factor
limitante en la distribucin de las comunidades bacterianas, de acuerdo a su
metabolismo (Inskeep et al., 2010).
La tasa fotosinttica en los tapetes microbianos est directamente relacionada con la
concentracin de nutrientes y que las fluctuaciones quimiotrficas que se observan en
estos microambientes son similares a los procesos observados en macroambiente, como
los sistemas marinos (Paerl et al., 1993) y lagunares (Valds y Real, 1994).
La rpida adaptacin de los organismos presentes a las variaciones fisicoqumicas, e
incluso a la migracin de los mismos de una capa a otra segn las condiciones
favorables del ambiente tales como radiacin UV (Bebout y Garca-Pichel, 1995),
temperatura y salinidad (Abed et al., 2007), es uno de los principales mecanismos de
supervivencia de estos tapetes microbianos, como se ha podido comprobar en sistemas
microbianos sintticos (Hu et al., 2010).
.
2.3.3. Diversidad en los tapetes microbianos

Los primeros estudios en tapetes microbianos indicaban una presencia importante de
cianobacterias en los estromatolitos (Cloud, 1976), aunque recientemente se ha
encontrado una gran diversidad de otros organismos, principalmente Gram negativos, y
algunos representantes eucariotas (Aguilera et al., 2010). Los organismos dominantes
son del gnero Themicrospira y algunos grupos afines a Thiobacillus como Beggiota,
Hyphomicrobium, Pedomicrobium, Termothrix, Leptothrix y Thiothrix; estos se
encuentran asociados con el mineral todoroquita y las concentraciones de Mn, Fe, Mg,
Ca, K y Ca presentes, que influyen en su distribucin y abundancia, lo que indica que
son organismos quimiotrficos (Jannasch y Wirsen, 1981); la disponibilidad de
nutrientes tambin es un factor importante en la distribucin y estructura de las
poblaciones (Petroff et al., 2010).
Los avances recientes en ingeniera gentica y biologa molecular han permitido
expandir el conocimiento de la diversidad microbiana en estos sistemas ambientales
mediante el estudio de secuencias no codificantes del ARNr, ADN mitocondrial y ADN
12

cloroplstidico (Douglas y Penny, 1999; Braun, 2008). Empleando estas metodologas
fue posible estudiar la diversidad en tapetes microbianos fottrofos, donde los grupos
ms abundantes fueron las cianobacterias (Oscillatoriales y Chroococcales) y las
diatomeas (Bracghysira, Amphora, Navicula, Mastogloia, Entomonesi, Nitzschia y
Gyrosigma), con la presencia de Dunaliella sp., como el nico gnero algal (Nbel et
al., 1999).
En Mxico tambin se han realizado algunos estudios en tapetes microbianos, en los
cuales sobresalen los estudios realizados en Guerrero Negro, (Baja California Norte) y
Cuatro Cinagas (Coahuila). El estudio en Guerrero Negro es importantes por la
cantidad de organismos encontrados con 1336 secuencias nicas, agrupadas en 752
filotipos y siendo Cloroflexi, Proteobacteria y Bacteroidetes los grupos ms abundantes
y al mismo tiempo la baja presencia de Cianobacterium con 2.4% de la abundancia total
(Ley et al., 2006). Estudios posteriores colocan a Lyngbya sp. y Microcoleus
chtonoplastes como gneros dominantes y mediante el anlisis del gen nifH (nitrgeno
reductasa), se revela que las especies principales encargadas de la fijacin del nitrgeno
son Halothece sp., Plectonema boyranum, Azotobacter vinelandii y Desulfovibrio
salexigens, y varias otras de novo (Omoregie et al., 2004). En el caso de Cuatro
Cinagas se ha encontrado una gran diversidad de eucariontes, eubacterias y Archaeas,
analizando varios genes de importancia fisiolgica que en conjunto con la determinacin
de las caractersticas fisicoqumicas se han generado modelos predictivos relacionados
con el metabolismo de lpidos, nucletidos y sntesis de membrana (Breitbart et al.,
2009).
La diversidad observada en las biopelculas ya sea biopelcula sencilla o conformando
un tapete microbiano, se observa una dinmica de intercambio de especies y/o grupos
dando una sucesin ecolgica (Pielou, 1996; Peters et al., 2000) que va probablemente
relacionada con los factores ambientales (Anderson et al., 2009; Berlanga et al., 2010).
En estos procesos de sucesin, hay dos grandes grupos de microorganismos, especies
persistentes que se infiere son el sustento del sistema y especies de intercambio (Arajo
et al., 2000), que probablemente se agregan a las biopelculas a manera de reservorio o
refugio como respuesta al estrs ambiental.
13

2.4. Estudios metagenmicos

El metagenoma se define como la coleccin de genomas provenientes de un sistema
ambiental (Handelsman et al., 1998) en estudios de la microflora de la rizsfera de la
soya, con el fin de identificar organismos microbianos desconocidos con probables
aplicaciones industriales, encontrando que la diversidad de organismos no cultivables
era mayor que el nmero de cepas en cultivos aislados. Las tcnicas moleculares
metagenmicas consisten en la extraccin de los genomas de todos los organismos que
se encuentran en un sistema ambiental (e. g. suelo, flora intestinal, biopelculas) y la
identificacin de los organismos presentes utiliza varios marcadores moleculares
basados en la amplificacin mediante la tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa
(PCR), en secuencias especficas (codificantes y no codificantes). Las secuencias
obtenidas pueden ser preservadas en amplicotecas (Rondon et al., 2000) o pueden ser
separados a travs de geles especiales para su aislamiento y posterior caracterizacin
gentica.
El uso de las tcnicas metagenmicas ha ido en aumento en sistemas ambientales
extremos donde es difcil aislar la microbiota cultivable o en sistemas que tienen una
complejidad muy grande para ser caracterizada por mtodos clsicos. Adicionalmente,
muchos microorganismos cuando se encuentran en asociacin (e.g. biopelculas
microbianas), pueden modificar su morfologa y su fisiologa, perdiendo en algunos
casos todas sus ultraestructuras caractersticas, haciendo difcil y en ocasiones imposible
su aislamiento e identificacin; hasta el momento se desconocen la mayora de las
relaciones fisiolgicas entre microorganismos y su relacin con los cambios
fisicoqumicos que imperan en estos ambientes microbianos.
Estos estudios se han realizado en gran cantidad de ambientes diferentes en todo el
mundo como en las marismas en California (Crdoba-Kreylos et al., 2006), sedimentos
marinos en Per (Biddle et al., 2008), lagunas hipersaladas de Chile (Da Silva et al.,
2008b), las costas del Mediterrneo (Caumette et al., 1994), Shark Bay, Australia
(Papineau et al., 2005), ventilas hidrotermales en el Tibet (Lau et al., 2009) y Tailandia
(Portillo et al., 2009) por nombrar algunos; inclusive en estudios de ecologa arrecifal
14

para la determinacin de factores de patogenicidad en corales, como Porites compressa
(Vega et al., 2008).

2.4.1. Identificacin de genomas especficos en un metagenoma

La obtencin del ADN metagenmico plantea dificultades tcnicas debido a la variedad
de sistemas ambientales y la contaminacin inherente de la muestra. En la actualidad se
han generado algunas tcnicas de extraccin de ADN metagenmico basados en la
precipitacin o purificacin selectiva de los cidos nuclicos presentes. Por ejemplo, el
mtodo de extraccin conjunta de ADN y ARN de alta calidad en algas verdes (La
Claire y Herrin, 1997) o el mtodo de afinidad en slice (Rojas-Herrera et al. 2008).
Una vez obtenido el ADN metagenmico se caracterizan los genomas individuales que
lo componen, para lo que se utiliza una variedad de metodologas moleculares
dependiendo del nivel de resolucin esperado o bien si se prefiere que los datos sean
cuantitativos o cualitativos. En el caso de las amplicotecas se emplea la amplificacin
y/o digestin arbitraria de secuencias no codificantes, usualmente ARN ribosomal, que
tiene una alta especificidad. La tcnica ms comn es el anlisis de restriccin de la
amplificacin del ADN ribosomal o ARDRA por sus siglas en ingles. Esta tcnica
cuando es empleada en amplicotecas permite tambin comparar semicuantitativamente
el porcentaje de haplotipos especficos para cada genoma en el sistema ambiental
(Zhang et al., 2008).

2.5. Anlisis de la restriccin de las amplificaciones del ADNr
(ARDRA)

La tcnica de ARDRA se utiliz originalmente para caracterizar especies y/o cepas
patgenas dentro un mismo gnero como Cryptococcus (Vigalys y Hester, 1990),
Mycobacterium (Vaneechoutte et al., 1993; De Baere et al., 2002), Polimixya (Ward et
al., 1994) y Gardnerella vaginalis (Ingianni et al., 1997), con el fin de realizar un
diagnstico rpido. Tambin se ha realizado la caracterizacin de la flora intestinal
humana (Ingrassia et al., 2001) de pacientes sanos y enfermos para encontrar una huella
15

metagenmica patognica. Otra lnea de investigacin es la caracterizacin de
organismos con aplicaciones biotecnolgicas como el orden Glomales (Redecker et al.,
1997) y el gnero Dunaliella sp. (Olmos et al., 2000). Dentro de las aplicaciones
ambientales se encuentran la determinacin de la biodiversidad en distintos ambientes
(Ventura et al., 2001), estudios filogenticos (Weisburg et al., 1991), as como estudios
de impacto ambiental para detectar variaciones en las especies por causa de la
contaminacin (Smit et al., 1997). Una de las grandes ventajas de este mtodo es la
posibilidad de identificar especies con un alto grado de confianza en comparacin con
otros mtodos como el RAPD, AFLP y RFLP que utilizan el genoma completo para el
anlisis (Jawad et al., 1998; Koeleman et al., 1998), pudiendo resolverse grupos
complejos como el de Arthrospira con tan solo dos segmentos amplificados
(Scheldeman, et al., 1999).
Los resultados microbiolgicos clsicos y los del ARDRA son similares, y denotan una
gran efectividad de esta tcnica molecular para determinar especies (Hall et al., 1999).
Esa tcnica de ARDRA consiste en la amplificacin del ADNr por medio de la PCR y
posteriormente digeridas con una enzima o ms enzimas, dependiendo de la
especificidad esperada, comnmente una de corte moderado y una enzima de corte
constante, esta doble seleccin primero por amplificacin y despus por digestin,
permite descartar filotipos distintos, al resolver el producto de la amplificacin-digestin
en un gel de agarosa o acrilamida. La simplicidad del mtodo permite su aplicacin en
estudios de ecologa como un indicador de las frecuencias de los diferentes genotipos
(Ley et al., 2006), y poder analizar cambios en una misma comunidad como en los
procesos de colonizacin y sucesin ecolgica (Dang y Lowell et al., 2000), o comparar
entre comunidades de distintos ecosistemas (Liu et al., 2003).

2.6. Anlisis cualitativo de los diferentes genomas presentes en un
sistema ambiental

Adems del anlisis ARDRA, es posible utilizar tcnicas de alta resolucin para la
identificacin de secuencias especficas de los diferentes genomas presentes en un
sistema ambiental. Tal es el caso del polimorfismo conformacional de la hebra simple o
16

SSCP y el anlisis del polimorfismo de nucletidos simples o SNP por sus siglas en
ingls; estas tcnicas tienen una sensibilidad de un nucletido en la secuencia,
permitiendo ubicar variaciones de secuencia aun entre organismos de una misma
poblacin (Hayashi, 1991; Sunnucks et al., 2000).
Estas metodologas se han empleado para identificar especies en estudios de ecologa
molecular descriptiva, donde se ha realizado la identificacin de metaespecies
(Donoghue, 1985) y variedades segn el principio de presencia o ausencia de secuencias
distintivas (De Haro, 1999). La caracterizacin molecular empleando las tcnicas
descritas anteriormente permiten tambin obtener la riqueza especfica y las relaciones
evolutivas entre los distintos componentes de los sistemas biolgicos (Kaneko, 1993).
El nuevo enfoque de la ecologa molecular requiere de identificar no solo los
componentes del sistema, si no que trata de comprender mejor los sistemas mediante la
aplicacin de mtodos de ecologa clsica utilizando la abundancia relativa de cada
componte de estos complejos, recurriendo a mtodos que cuantifiquen la frecuencia
especfica para organismo, siendo necesario cuantificar el nmero de representantes de
cada uno en el sistema mediante alguna tcnica molecular aplicable a la metagenmica.

2.7. Anlisis semicuantitativo de la biodiversidad

No hay muchos estudios que interpreten la diversidad metagenmica encontrada en
sistemas ambientales, pero muy pocos han sido aplicados a los datos obtenidos a partir
de tcnicas moleculares. Esto principalmente por el costo de las tcnicas moleculares
para la realizacin del muestreo. Tambin es importante el hecho que las curvas de
rarefaccin (Ley et al., 2006) tienen una pendiente pronunciadas, indicando que el
muestreo es todava incompleto y que falta mucha diversidad por caracterizar.
Algunas de las propuestas para el anlisis de datos de comunidades y poblaciones
metagenmicas, son el uso de Cuadros de ausencia y frecuencia generadas a partir de
datos de pruebas indirectas como el DGGE y el SSCP, a partir de los cuales se pueden
hacer inferencias acerca de la diversidad de la poblacin para comparacin de diferentes
poblaciones. Esto se ha realizado para poder comparar la diversidad diurna y nocturna
(Bench et al., 2007; Villanueva et al., 2007) y para observar la estacionalidad de la
17

diversidad (Helton y Wommack 2009) as como las variaciones verticales que presentan
estas comunidades (Treusch et al., 2009).
Es as que los resultados encontrados por lo limitado del muestreo comnmente se
transforman a un anlisis semicuantitativo, para hacer inferencias de diversidad,
esperando que en un futuro con la proliferacin de las tcnicas moleculares y la
disminucin del costo de estas tcnicas se puedan realizar muestreos ms exhaustivos
para poder cubrir una porcin ms significativa de la comunidad y as poder generar
mejores modelos de las dinmicas poblaciones.
Un grupo de investigadores est realizando estudios del tipo de metapoblaciones
(Gyllenberg y Hanski, 1992; Hanski, 2004) para demostrar estos procesos poblacionales
como la sucesin de especies (Amarasekare y Possingham, 2001), el efecto de la
variabilidad ambiental en estas metapoblaciones (Anderson et al., 2009) y de algn
modo entender las dinmicas que se llevan a cabo analizando estas variaciones de la
presencia de haplotipos dentro de un grupo poblacional (Drechsler y Wissel, 1997;
Bascompte, 2001; Cassagrandi y Gatto, 2002) de acuerdo a las densidades y
abundancias de cada uno (Geritz et al., 2009) y algunos procesos como la migracin
(Gandon y Michakalis, 1999; Hanski y Zhang, 1993), el suicidio evolutivo (Gyllenberg
y Parvinen, 2001) mediante el anlisis con procesos estocsticos (Etienne y Nagelkerke,
2002).
Para el anlisis de las comunidades, se han empleado gran cantidad de propuestas que
consideran principalmente la varianza de los grupos presentes en las comunidades y/o
poblaciones, estos ndices se encuentran bsicamente en dos grupos, los que contemplan
la varianza de la poblacin de manera independiente como el ndice de Shannon (H)
(Chao y Shen, 2003) o el caso del ndice en Alfa () (Duhachek et al., 2005) que
considera la varianza con respecto a la varianza total; En cuanto a los ndices de
similitud poblacional, se basan en dos principios: en el anlisis de las probabilidades
independientes de cada grupo entre las poblaciones como el ndice de Morista-Horn
(M
H
) (Morisita, 1971; Bloom, 1981) o considerando el nmero total de representantes
del muestreo como en el caso del ndice de Canberra que muestra las tendencias
migratorias segn la poblacin con menor varianza (Bloom, 1981); por otro lado los
ndices Beta arrojan ndices que muestran la relacin que existe entre las poblaciones de
18

acuerdo a las diferencias y similitudes entre estas poblaciones como el ndice Jaccard
(CZ
ik
) (Jaccard, 1912; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003) que indica la relacin entre
las especies persistentes y el total; otro ejemplo es el ndice Beta de Whittaker (B
w
)
(Whittaker, 1960; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003) que considera al nmero total de
representantes distintos como el indicativo de la variabilidad; por otro lado el anlisis de
las distancia poblacional (B
c
)(Cody, 1975; Magurran, 1988; Koleff et al., 2003)
considera el nmero total de representantes que no se encuentran en las dos poblaciones.
Ya un anlisis de estos datos transformados considerando a los datos como datos
algebraicos son el ndice de Beta de Routledge (B
r
) (Routledge, 1977; Magurran, 1988;
Koleff et al., 2003) y el ndice Beta vectorial (B
hv
).
Todos estos ndices, son inferencias que en ecologa se utilizan para realizar modelos y
ensayos de las dinmicas poblaciones como son la migracin, la sucesin ecolgica y la
muerte evolutiva.

19

3. JUSTIFICACIN

Los ecosistemas hipersalinos, son ambientes muy diversos aunque poco estudiados (Ley
et al., 2006). Recientemente, con el desarrollado de metodologas metagenmicas es
posible analizar ms profundamente las microcomunidades existentes en dichos sistemas
(Xu, 2006). Dentro de estos sistemas hipersalinos, los sistemas ms antiguos y
complejos son los llamados tapetes microbianos (Taton et al., 2003), los cuales son
asociaciones microbianas formando biopelculas estratificadas (Nbel et al., 2001).
Estas asociaciones microbianas ancestrales (estromatolitos) evolucionaron en este
arreglo, para resistir los cambios ambientales drsticos de la atmsfera primitiva (Des
Marais, 2003; Leuko et al., 2007) y dan origen a los actuales tapetes microbianos que
han mantenido un proceso constante de evolucin individual y poblacional. Por lo
anterior, el estudio de las interacciones existentes entre los principales grupos de
microorganismos es de gran importancia para entender otras interacciones ecolgicas
existentes en otros ambientes, as como su capacidad de resistir la agresividad del medio,
que le permiten sobrevivir y asimilar metales pesados, petrleo, entre otros
contaminantes, colocndolos como candidatos idneos para usarse para biorremediacin
y biodepuracin.
Por todo esto, el presente estudio est enfocado en el anlisis de las comunidades
microbianas en tapetes microbianos presentes en un poza salinera en la Laguna Rosada
(Uaymitn, Yucatn) en 3 estadios diferentes, utilizando el conjunto de metodologas
metagenmicas y fisicoqumicas para as contribuir al conocimiento sobre lo
biodiversidad, procesos trficos y algunas de las dinmicas que se presentan en estos
ambientes complejos

20

4. HIPTESIS

Existen cambios en los perfiles microbianos a travs de distintos muestreos (estadios) en
un mismo tapete microbiano.

5. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar el perfil microbiano y su relacin con los parmetros fisicoqumicos
existentes en diferentes tapetes hipersalinos obtenidos en la Laguna Rosada de
Uaymitn, Yucatn, Mxico.

5.1. Objetivos especficos

1. Determinar las caractersticas significativas (conductividad, pH, etc.) de tapetes
maduros para la seleccin del punto de muestreo.
2. Observar la diversidad microbiana por mtodos de microscopia (ptica y
electrnica).
3. Determinar la diversidad microbiana mediante DGGE.
4. Caracterizar la diversidad microbiana a partir de las amplicotecas (ADNr).
5. Analizar la filogenia molecular de las secuencias obtenidas

21

6. MATERIAL Y METODOS

6.1. Diseo experimental

El anlisis se realiz en dos partes principalmente, una utilizando las metodologas
microscpicas clsicas para observar la biodiversidad y una segunda parte empleando
tcnicas moleculares, para seleccin del rea muestral y bsqueda de secuencias para
anlisis (Fig. 2).

Figura 2. Diagrama general de la metodologa empleada.
.
22

6.2. Zona de colecta

La Laguna Rosada de Uaymitn se localiza en la costa norte del estado de Yucatn, con
una distribucin paralela a la lnea de playa, comenzando al este-sureste cerca de la
ciudad y Puerto de Progreso y prolongndose hacia el este por aprximadamente 26 Km
considerando el cuerpo acufero y la zona de humedal. La zona de muestreo se localiza
en el extremo este de esta la Laguna Rosada en las coordenadas 211856 N y
892059 O, a orillas de la carretera a Telchac Puerto Dzemul. Esta carretera conecta
al norte con la Carretera Federal 27 que va de Chicxulub Telchac Puerto y que viene
de la ciudad y puerto de Progreso y al este-noreste de la zona arqueolgica de Xcamb
(fig. 3).

Figura 3. Ubicacin de la zona de muestreo en la laguna rosada de Uaymitn, Yucatn, Mxico. A, B, C y D,
sucesin de imgenes satelitales para ubicacin de la zona de muestreo, en la laguna rosada de Uaymitn. E
Panormica de la poza salinera, mostrando la zona de colecta.

Esta laguna es un sistema krstico con depresiones paralelas a la costa, sin aporte de
agua dulce por escorrenta de ros superficiales (Herrera-Silveira, et al. 2002), con un
23

importante aporte de agua dulce a travs de los nacimientos provenientes de ros
subterrneos. Esto genera una dinmica entre las masas de agua generando una
variabilidad en la salinidad de manera vertical y horizontal. Estos cambios en la
salinidad, estn regidos por el rgimen de lluvias, marcndose tres temporadas
principales, la de secas (marzo-mayo), lluvias (junio-octubre) y nortes (noviembre-
febrero) (Herrera-Silveira et al. 1998). En algunas partes de la laguna principalmente
hacia el este, es posible encontrar varias pozas salineras artesanales vestigio de la cultura
maya, y algunas actuales que se encuentran en uso por parte de los habitantes de la
regin. El aporte de sedimentos se da de manera constante por una corriente dbil,
proveniente de la Corriente de Yucatn o derrame del Banco de Campeche (Capurro,
2003), con un aumento drstico en la poca de huracanes (agosto-septiembre), por las
fuertes corrientes y mareas (Herrera-Silveira, 2006). Finalmente, las mareas tienen una
influencia significativa en estos ecosistemas de marisma, ya que por sus caractersticas
geomorfolgicas, es difcil el drenaje del agua que aporta la marea alta, favoreciendo la
acumulacin de las sales por evaporacin (Meyer-Arendt, 1987; Ihl et al., 2006).
La flora macroscpica caracterstica son principalmente plantas herbceas como Typha
domingensis, Cladium jamaicense, Eleocharis cellulosa, E. interstincta como especies
dominantes (Rejmankova et al., 1996), mangles y pseudomangles (Rhizophora mangle,
Laguncularia racemosa, Avicennia germinans y Conocarpus erectus) (CONABIO,
2008); as como algunas algas del gnero Dunaliella y otras algas halotolerantes;
tambin algunos pastos marinos como la Ruppia martima en nacimientos subterrneos y
Halodule wrightii para salinidades mayores a 25 ppm (Herrera-Silveira, 2006). Pero el
ms vistoso de los organismos de la zona es el Phoenicopterus ruber (flamingo rosa)
que junto con algunas otras aves migratorias ocupan las lagunas como refugios.

6.3. Colecta de muestras

Se seleccion un punto de muestreo, donde se realizaron 3 muestreos en los meses de
mayo, julio y septiembre, utilizando el estado de maduracin de los tapetes microbianos
y la conformacin del rea de muestreo. Las muestras se tomaron con una esptula
estril (48 h, 80C) en secciones de aprximadamente 10cm x 10cm, para
24

posteriormente colocarlas en recipientes sellados para su transportacin al laboratorio y
conservacin a -80C.
El criterio mediante el cual se seleccion la zona de muestreo se bas en las
caractersticas macroscpicas de un tapete maduro, como son las 3 capas ya
completamente formadas, con la trama superior completamente cerrada, y la
consistencia del tapete (Fig. 4).

Figura 4. Caractersticas Macroscopicas de tapetes microbianos en distinto grado de maduracin. A y B, tapetes
microbianos inmaduros, aunque presentan ya la precipitacin de la biopelcula y comienzan a formar la malla, todava
no se encuentra est completamente cerrada. C, tapete microbiano maduro, con la malla completamente cerrada. D,
Tapete microbiano deshidratado.

6.4. Separacin de capas

Se cortaron tiras de 1 cm de ancho por 5-7 cm de largo, retirando el exceso de sedimento
con agua destilada estril. Posteriormente, las muestras se colocaron en un recipiente a
T. A. con solucin de NaCl (1%) por 5 min, para finalmente introducirlas en un
ultracongelador (-80C) por 30 min para generar un shock trmico. Transcurrido este
25

tiempo se separaron las capas de manera manual, utilizando una esptula de diseccin
estril, cuidando de no romper la capa y finalmente se enjuagaron con agua destilada
estril. Las capas ya separadas se almacenaron en tubos nuevos de 1.5 ml estriles
rotulados a -80
o
C.

6.5. Anlisis de los factores fisicoqumicos macro y micro
ambientales

Los factores fisicoqumicos macroambientales considerados fueron la temperatura
ambiental y la precipitacin obtenidos de la base de datos de CONAGUA (2009). Los
factores microambientales se obtuvieron mediante clculos de extrapolacin; Se tomaron
de 200 a 300 g de muestra, que se macer con cuidado y se transfirieron a un matraz
aforado de 50 ml, y se agreg agua destilada hasta llegar al aforo; considerando el
volumen agregado, se toman las lecturas por triplicado con el multiparametro BIOLINE.
Con los datos de volumen inicial (50 ml Volumen agregado), Volumen final (50 ml) y
la lectura del multiparmetro se calcula el dato de la conductividad y al concentracin de
los radicales de Hidrogenin mediante la frmula de C
1
V
1
= C
2
V
2
.

6.6. Pretratamiento de muestras

Se fraccion la muestra en cantidades de 200-300 g y se transfirieron a tubos de 1.5 mL
estriles y rotulados. El pre-tratamiento de las muestras se realiz agregando 500 L de
EDTA 0.5M, posteriormente se macer ligeramente usando palillos estriles y luego se
mezcl mediante Vortex por 10 seg hasta homogenizar y se dej incubar por 24 h a T A.
Transcurrido este tiempo la muestra se resuspende mediante Vortex por 10 seg y
centrifugacin a 13,000 rpm por 10 min. Se descart el sobrenadante y se repite el
pretratamiento con EDTA 0.1M de 3 a 5 veces (segn el nivel de contaminacin).
El pre-tratamiento para microscopia electrnica se realiz a partir de pequeos cuadros
(10 x 10 mm) en un recipiente y se incubaron de la misma manera que el proceso
anterior, pero con un periodo de 5 a 10 das en la segunda incubacin (EDTA 0.1M).

26

6.7. Tincin de muestras para microscopia ptica

6.7.1. Tincin con azul de bromofenol

A partir de una de las alcuotas pretratadas se realiz un frotis agregando unas gotas de
azul de bromofenol (1:50 azul de bromofenol-etanol 70%, pH 4.6), se incuba (10 min),
enjuaga, se deja secar, y se observ al microscopio ptico.

6.7.2. Hibridacin con Naranja de acridina

A partir de una de las alcuotas pretratadas se realiz un frotis, cubriendo completamente
con una gota de naranja de acridina (1/10000 gr/v), el cual se dej hibridar por 5 minutos
a T A. Posteriormente, el frotis se enjuag con agua destilada y se observ al
microscopio de epifluorescencia marca MOTIC modelo 107M, con el filtro FITC
(excitacin a 502 nm y emisin a 525 nm).

6.8. Fijacin de muestra para microscopia electrnica

Una alcuota de la muestra se fij con glutaraldehdo (2.5%) con amortiguador de
fosfatos (NaH
2
PO
4
-Na
2
HPO
4
, 0.02 M, pH 7.2) por 10 das a 4C. Posteriormente, a la
muestra se le realizaron tres lavados ms con amortiguador de fosfatos (0.2 M) por 30
min a 4C. La deshidratacin se realiz mediante una serie de cambios de etanol en
concentraciones ascendente dividida en dos partes. En la primera parte se utiliz etanol
al 30% y 50% v/v, con dos cambios cada uno, con un intervalo de 30 min entre cada
cambio; para terminar esta primera deshidratacin la muestra se coloc en etanol al 70%
y se almacen a 4C por no menos de una semana. En esta concentracin la muestra se
puede mantener hasta por 6 meses sin que se afecte la calidad de la muestra.
La ltima parte de la deshidratacin se llev a cabo poco antes de realizar la observacin
en el microscopio electrnico de barrido (MEB) modelo JSM6369LV de la compaa
JEOL Electrn Optics Instruments (Tokyo, Japon). Se sustituy el etanol al 70% con la
ltima serie de deshidratacin utilizando etanol al 85%, 96% y absoluto, con dos
27

cambios cada uno con 30 minutos entre cada cambio. (Se recomienda aplicar vaco y
mantener las muestras a 4 C durante el tiempo de deshidratacin).
Se hicieron cortes transversales de 1-2 mm de grosor y secado mediante punto crtico en
CO
2
lquido en el desecador semiautomtico SAMDRI-795 (31 C y 1072 ps), con un
tiempo de purga de 10 min y descompresi a 150 ps/min. Se colocaron los cortes en
bases metlicas con tiras de carbono para la metalizacin que se realiz en un DESK II
de Denton (Scotia, NY, USA), con un bao de oro atomizado (120 A) vertical y en otro
ngulo. Una vez metalizada la muestra se en las bases porta muestra del MEB y su
observacin de 2,000x a 25,000x y un voltaje de 14-17kv.

6.9. Extraccin de ADN metagenmico por mtodo de slica

De acuerdo al protocolo de Rojas-Herrera et al. (2008), se tomaron 200 a 250 g de la
muestra pre-tratada y se colocaron en tubos nuevos, estriles y rotulados de 1.5 ml; se
agrega 1 ml de solucin amortiguadora TEN (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 500mM
NaCl, pH8.0) y se mezcl por 2 min. Posteriormente, el homogenizado es centrifugado a
13,000 rpm por 10 min a T A, se descarta el sobrenadante y se repite el lavado de 3 a 5
veces; Una vez terminado el lavado, la pastilla se resuspende en 1 ml de amortiguador
TEN con 1 L de lisozima (20mg/mL) y se incub por 2h a 37C con agitacin
moderada (300 rpm). Se aaden 100 L de SDS (20%) y mezclado por 5 seg seguido de
3 ciclos de 10 min en hielo y 5 min a 65C. Las muestras se dejaron reposar por 30 min a
temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min. El
sobrenadante se transfiri a un tubo nuevo, se le agregaron 500 L de Acetato de Potasio
(5M) y se dej incubar a 65C por 5 min. Posteriormente, los tubos se colocaron en hielo
por 20 min y centrifugados en fro (4C) por 30 min a 14,000 rpm. El sobrenadante se
transfiri nuevamente a otro tubo nuevo agregndole la suspensin de silica (recin
mezclada en Vortex); el complejo ADN-silica se recuper por centrifugacin a 14,000
rpm por 2 min a T A, desechando el sobrenadante; se lav la pastilla con 1 ml de etanol
frio (70%) y se centrifug a 14,000 rpm por 2 min, desechando el sobrenadante.
Finalmente, el ADN se recupera agregando 50 L de agua bidestilada estril e
incubando a 55C por 5 min y centrifugacin a 14,000 rpm por 5 min a temperatura
28

ambiente; finalmente se recuper el sobrenadante y se mezcl con amortiguador TE
(Tris-HCl 100 mM (pH 8); EDTA-NaOH 100mM (pH 8)) con glicerol (1:5) y se
almacen a -80
o
C.

6.10. Determinacin de la integridad del ADN por electroforesis

Se realiz mediante una electroforesis horizontal en gel de Agarosa-TBE (50 mL de
agarosa al 1% en Amortiguador TBE (40mM TRIS borato al 0.6% y 2mM de EDTA)) y
teido con Bromuro de Etidio (2L/100mL). Se colocaron 3L de muestra y 5 L de
amortiguador de carga (azul de Bromofenol 6x (10% v/v)) por carril. Utilizando el
Marcador Lamda/Hind III, de PROMEGA. La electroforesis se realiz a 60v durante 60
min, con TBE (0.5X) y se resolvi en un Fotodocumentador GenDoc, de BIO-RAD.

6.11. Cuantificacin del ADN Metagenmico

Se toma una alcuota del ADN metagenmico eluido y se lee en el espectrofotmetro
UV a una longitud de onda 260 nm, de acuerdo a la siguiente formula.

6.12. Amplificacin por PCR de la regin ribosomal

Se amplifico la regin 16S ribosomal, utilizando los iniciadores 16SS (5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) y 16SR (5-CGGGAACGTATTCACCG-3)
(Strom et al., 2002) para bacteria y los iniciadores A571F (5-
GCYTAAAGSRICCGTAGC-3) y UA1204R (5-TTMGGGGCATRCIKACCT-3) de
Archaea (Baker et al., 2002). Para la electroforesis del DGGE se utilizaron los
iniciadores de bacteria gc338F (5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3) y PRUN518R
(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) (Muyzer et al., 1993); en el caso de las Archaea, se
utiliz el mismo juego de iniciadores, con una cola rica en CG. Las condiciones
29

generales de mezcla de reaccin fueron, 1x de solucin de amortiguadora (160 mM
(HN
4
)
2
SO
4
, 670mM Tris-HCl (pH 8.8 a 25
o
C) y 0.1% de estabilizador), 0.2M para
cada uno de los iniciadores, 5nm de dNTPs y 30-50 mg/ml de ADN templado; las
condiciones que variaron fueron 3mM de MgCl
2
para los juegos de iniciadores de
Bacteria y 8mM MgCl
2
para los iniciadores de Archaea; Las concentraciones de BSA
(albumina de suero bovino) fueron de 0.5%, y 0.2% respectivamente, para un volumen
final de 25l de reaccin. Los protocolos de amplificacin, consistieron en un ciclo de
desnaturalizacin a 95C por 10 min, 6 ciclos de touch up con un ascenso de 0.5C por
ciclo (3C debajo de la Tm), 25-30 ciclos de amplificacin y una extensin final de 7
min a 72C. Los protocolos especficos se muestran en el cuadro 20 del Apndice 1.
La integridad de los productos de PCR se resolvi en un gel de agarosa al 1% teido con
bromuro de Etidio (2L/100mL), con un tiempo de corrida de 60 min a 70v, utilizando
el Marcado de 100pb de PROMEGA para los fragmentos de menos de 500pb y 1 Kb
tambin de PROMEGA para los fragmentos de ms de 500pb.
Para estandarizar los protocolos de la PCR para Archaea y comprobar la especificidad
del mismo, se realizaron los cultivos de las cepas Haloferax mediterranei ATTC 33500
y Halobacterium salinarum (Halobacterium halobium) ATTC 700922 segn las
condiciones de cultivo del proveedor (ATTC, Manassas, Virginia, USA), y se extrajo el
ADN por el mtodo de silica (Rojas-Herrera et al., 2008).

6.13. Purificacin de los productos de PCR

Se retir con cuidado los excesos de BSA de los productos de PCR y se transfiri este
producto de PCR a una minicolumna SV que se introduce en el tubo colector y se
agregaron 10L de la solucin para ligado a membrana y se deja incubar por 1min, se
centrifug a 13,000 rpm por 1min y se desech el lquido transferido; Posteriormente se
aadieron 500 L de solucin de limpieza de membrana/etanol y se centrifug a 13,000
rpm por 1min, repitiendo este paso con una centrifugacin de 5min; se desech el
lquido transferido y se centrifuga con la tapa abierta a 13,000 rpm por 1 min para
eliminar los residuos de etanol. Finalmente se transfiere la minicolumna SV a un tubo de
centrifuga de 1.5ml y se agreg 50L de agua destilada estril dejando incubar por 1
30

min y posterior centrifugacin a 13,000 rpm por 1 min, se desech la minicolumna SV y
se almacena el DNA eluido a 4C o -20C (protocolo segn estuche comercial Wizard
SV Gel and PCR Clean-Up System de PROMEGA).

6.14. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)

La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante se realiz de acuerdo al protocolo
del fabricante (BIORAD, USA), los reactivos utilizados fueron: Acrilamida/Bis (37.5:1)
al 40% (Acrilamida 38.93g, Bis-acrilamida 1.07g; aforar a 100.ml con H
2
O destilada;
esterilizacin por filtracin (0.45, 4C)), solucin Amortiguadora TAE 50x (Tris base
2M, cido actico glacial 1M, EDTA 50mM; aforar a 1,000ml con H
2
O destilada); Se
prepararon las soluciones de gel desnaturalizante al 8% (200-400pb) (0%-
Acrilamida/Bis 20ml, TAE 50x 2ml, H
2
O 78ml; 100%- Acrilamida/Bis 20ml, TAE 50x
2ml, Formamida desionizada 40ml, Urea 42gr, aforar a 100ml con H
2
O destilada) para
los amplicones de bacteria y al 6% (300-1000pb) (0%-Acrilamida/Bis 15ml, TAE 50x
2ml, H
2
O 83ml; 100%- Acrilamida/Bis 15ml, TAE 50x 2ml, Formamida desionizada
40ml, Urea 42gr, aforar a 100ml con H
2
O destilada) para los amplicones de Archaea y
esterilizados por filtracin (0.45, 4C). Los gradientes de desnaturalizacin fueron de
30 60 % y 40 75% para bacteria y Archaea respectivamente. La limpieza de los
vidrios se realiz mediante lavado con agua destilada y limpieza con isoproponol
cuidando de no dejar pelusas. Se mont el juego de vidrios en la base del DCode
Universal Mutation Detection System de BIORAD, y se dej polimerizar por 1 hora.
Una vez transcurrido el tiempo se enjuagaron con agua destilado teniendo cuidado de no
maltratar los pocillos. Se realiz un etiquetado de los carriles y se realiz una precorrida
(2 horas, 150v, 60C) para retirar los excesos de formamida del gel. Transcurrida la
precorrida, se mezcl el producto de PCR purificado con la solucin amortiguadora de
carga (Azul de bromofenol 0.05gr, Xileno cianol 0.05gr, TAE 1x 10ml) a partes iguales
en tubos de 1.5ml y se realiz la carga de la mezcla en los carriles previamente
etiquetados y se depositaron en rondas de 25L para un total de 100L de mezcla, con
una tiempo de corrida intermedia de 15 min (100v, 60C), una vez agregado toda la
mezcla amplicon-solucin de carga, se lleva a cabo la corrida final por 24 horas a un
31

voltaje constante de 60v y una temperatura de 60C. La tincin se realiza con Syber
Gold (Promega 1:10000, en solucin TAE 0.5x) por 30 min y se realiza un lavado por
10 min en solucin TAE 1x. El gel se resuelve en fotodocumentador GenDoc de BIO-
RAD.

6.15. Clonacin y construccin de Amplicotecas

Se utilizaron los amplicones purificados obtenidos de cada uno de los pares de
iniciadores (16SS y 16SR; A571F y UA1204R) para transformar clulas de E. coli
(JM109), mediante el estuche comercial pGEM-T Easy Vector PROMEGA. Se
tomaron 3L de producto de PCR purificado y se agregaron a la mezcla de ligacin (5l
de solucin de ligacin 2x, 1l de vector, 1l de T4 ADN ligasa) para un volumen final
de 10l y se dej incubar toda la noche a 4C. Transcurrido el tiempo de ligacin se
realiz la transformacin de las clulas de E. coli (JM109) mediante choque trmico,
agregando 2l de la reaccin de ligacin en tubos de 1.5ml donde se transfirieron 50l
de clulas (en etapa log) que se encontraban almacenadas a -80C (5 min de reposo); el
choque trmico se realiza poniendo en hielo la mezcla de transformacin y colocando
rpidamente en una placa trmica por 1 min a exactamente 42C y se regresaron al hielo
por 2 min. Posteriormente fueron transferidas a tubos Falcn de 10 ml con 5 ml de
medio LB y se colocaron en estufa de cultivo con agitacin suave (150 rpm) a 37C por
72 horas; transcurrido este tiempo, las amplicotecas se almacenan en refrigeracin a 4C.

6.16. Conservacin de las Amplicotecas

A las diferentes amplicotecas previamente almacenadas se le agregan 5 ml de glicerol
previamente estril, y se mezclan por inversiones suaves. Una vez homogenizado el
contenido, se toman alcuotas de 1 ml y se transfieren a tubos criognicos (1.8 ml) donde
se guardan en el ultracongelador (-80
o
C).

32

6.17. Seleccin de clonas representativas y mtodo de anlisis de
la restriccin de las amplificacin del ADNr (ARDRA)

6.17.1. Tamizaje de la biblioteca metagenmica

Se sembr 1 mL de clulas transformadas de cada genoteca en cajas Petri con medio de
cultivo LB-Agar/ampicilina con X-Gal y se incubaron por 24 h a 37C. Posteriormente,
se descartaron las clulas no transformadas (colonias azules) de las recombinantes
(colonias blancas) mediante la inactivacin del operon lacZ, segn las especificaciones
del proveedor del estuche comercial. Estas clonas (colonias blancas) seleccionadas se
resembraron en cajas Petri con medio LB-Agar/ampicilina con 8 divisiones concntricas
previamente rotuladas en la parte basal de la caja (cajas maestras), cada divisin ser una
nica clona seleccionada, y se cultivaron nuevamente a 37C por 24 h.

6.17.2. Extraccin de ADN plasmdico (ADNp)

Se tom una pequea cantidad de clulas de cada una de las divisiones de las cajas
maestras y se resuspendieron en tubos nuevos rotulados (1.5 mL) con 50 L de agua
estril. Una vez resuspendidas las colonias se les agreg 300 L de amortiguador TENS
(NaOH, 0.1M; SDS 0.5%; Tris-HCl, 10mM, pH 8.0; EDTA, 1mM, pH 8.0), y se
agitaron en Vortex por 10 seg. Posteriormente, al homogenizado se le aadi 150 L de
Acetato de Sodio cido Actico (3M, pH 5.2) y se agit nuevamente por 10 seg. Se
separaron las fases mediante centrifugacin (4 min, 13,000 rpm) y se transfiri el
sobrenadante a un tubo nuevo previamente rotulado y se aadieron 1,000 L de etanol
absoluto frio. Posteriormente se realizaron dos lavados con etanol frio al 70%, se
descart el sobrenadante y se sec la pastilla a T A. Una vez secas las pastillas, se
resuspende el ADNp en 50 L de agua estril.

33

6.17.3. Digestin enzimtica de las muestras

Para corroborar la correcta transformacin de las clulas, y realizar el ARDRA, el ADN
plasmdico se digiri con las enzima EcoR1 de PROMEGA. La digestin se realiz
para 1g de ADN plasmdico empleando 1L de amortiguador de restriccin (10x), 1U
de la enzima EcoR1 (5U/L) y aforando a un volumen final de 10 L con agua
desmineralizada estril. La solucin se mezcl suavemente por pipeteo y se incub a
37C por 3 h. Posteriormente, el ADNp digerido fue se resolvi en un gel de agarosa al
1.5% teido con bromuro de Etidio (5L/100mL) con 60 min de corrida a 60 v.

6.17.4. Secuenciacin de clonas representativas

A partir del anlisis de ARDRA fueron seleccionadas las clonas que tuvieron distinto
patrn de restriccin. Las clonas seleccionadas fueron un mximo de 60 por biblioteca.
El ADNp se transfiri a tubos de PCR de 250l con una concentracin final de 100ng/l
y un volumen de 50l y finalmente enviados a secuenciacin mediante el servicio
forneo de la compaa Macrogen (Seul, Korea).

6.18. Caracterizacin de las clonas seleccionadas en el
Ribosomal Database Proyect (RDP)

La caracterizacin de secuencias se realiz en la plataforma del Ribosomal Database
Proyect (RDP http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp) mediante la aplicacin CLASSIFIER y
bsqueda de parientes cercanos mediante la aplicacin SEQMATCH de la misma
plataforma (Cole et al., 2008).

6.19. Anlisis de la filogenia molecular

La filogenia molecular se analiz utilizando el software Seaview (Gouy et al., 2010),
empleando el algoritmo muscle y la construccin de los arboles filogenticos se realiz
34

mediante el modelo GTR (Bio Vecinos ms cercanos), con bsqueda por topologa de
rbol ms estable con 5 repeticiones.
Este anlisis se realiz a nivel de Dominio (Archaea y Bacteria) y para los phyllum
representativos Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacter.

6.20. Estadstica descriptiva e ndices ecolgicos

El anlisis estadstico, se realiz mediante una prueba no paramtrica, de las matrices de
ausencia y presencia generadas a partir de las bandas resultantes en el DGGE y los datos
transformados de las secuencias obtenidas de las amplicotecas, por medio de una anlisis
de ausencia presencia para generar matrices binominales. Los ndices utilizados se
muestran en el cuadro 2. Para los anlisis de correlacin de Pearson se utilizaron los
datos obtenidos de las frecuencias, diversidad neta y densidad taxonmica (Nmero de
secuencias distintas/Nmero total de secuencias).
Los ndices ecolgicos analizados para conformar el esquema de la dinmica
poblacional, se encuentra listadas en el cuadro 21 del Apndice 2.

35

7. RESULTADOS

7.1. Proceso de formacin de tapetes microbianos

De acuerdo a las observaciones a lo largo de los diferentes muestreos se estableci el
proceso de formacin y maduracin de los tapetes microbianos en el sitio de estudio.
Este proceso es gradual y est estrechamente relacionado con los cambios ambientales
comenzando este durante la poca de secas, donde la evaporacin del agua y la falta de
aporte de agua dulce genera un aumento gradual en la salinidad, lo que estimula la
formacin de biopelculas flotadoras poco consistentes (floculos), formadas
principalmente de cianobacterias (Da Silva et al., 2008). Al aumentar la salinidad estas
biopelculas flotadoras se van compactando por la deshidratacin y terminan
precipitando. Una vez precipitadas la compactacin contina hasta tener un grosor de
entre 3 y 6 mm, lo que va formando una trama cada vez ms cerrada que finalmente
separa a la biopelcula del medio acuoso hipersalino. Una vez cerrada la trama se
generan condiciones microambientales que favorecen la migracin de microorganismos
facultativos y anaerbicos a la parte inferior. En la parte superior de la biopelcula
generndose dos capas subsecuentes, una inmediata a la capa fototrfica con
condiciones de bajo oxgeno y baja exposicin a la luz y finalmente una capa anaerbica
con casi nula exposicin a la luz. Una vez formado el tapete maduro con sus tres capas
bien formadas, tiene un grosor total de entre 6 y 10 mm. Estos tapetes se mantienen
formados hasta la poca de lluvias el estrs osmtico decrece, permitiendo la
recolonizacin del cuerpo de agua del cual provenan los microorganismos,
degradndose consecuentemente el tapete microbiano (Fig. 5).

7.1.1. Determinacin de tapetes maduros y muestreo

Los tapetes maduros aparecen durante los meses de enero mayo, que es la poca de
secas y teniendo el climax del esta poca en abril a junio; es en los inicios de la poca de
lluvias cuando los tapetes maduros se encuentran completamente formados. La
maduracin del tapete se determina haciendo un corte y observando la consistencia de la
36

matriz que lo conforma, la cual no debe deshidratada, ser lo suficientemente consistente
para que no se deforme o desbarate al tomarla con las manos, y finalmente debe tener
sus tres capas bien definidas y diferenciables por sus colores caractersticos. Los colores
en cada capa son: verde azulosa para la capa fototrfica (Ft), marrn rojizo para la
facultativa (Fc) y marrn pardo para la anaerbica (An) (Fig. 6).

Figura 5. Ciclo de formacin y de degradacin de tapetes hipersalinos en la Laguna Rosada de Uaymitn, Yucatn.

Figura 6. Tapete microbiano hipersalino con sus diferentes capas. Ft: Fototrfico; Fc Facultativo;
An: Anaerbico
37

7.2. Parmetros Fisicoqumicos

Todos los parmetros fisicoqumicos mostraron una variabilidad estacional en los meses
de muestreo, con un decremento de los parmetros microambientales de salinidad y el
pH (Cuadro 1) de igual manera para los macroambientales, con un descenso en la
temperatura media y mxima al contrario de la precipitacin (Fig. 7, Cuadro 1).

Figura 7: Grafico de dispersin para los datos fisicoqumicos macroambientales
de Temperatura mxima (
o
C), Temperatura media (
o
C) y Precipitacin (cm
3
)
para la estacin meteorolgica de Chicxulub para el ao 2009 (CONAGUA-
SMN, 2010).

Estos parmetros macroambientales presentan una variacin estacional por dos causas
macroambientales, primero la evaporacin del agua y aumento en la concentracin de
las sales disueltas por consiguiente y despus la precipitacin ya que es el nico tipo de
aporte de aguadulce al sistema.

Cuadro 1. Parmetros fisicoqumicos macroambientales y microambientales asociados a la capa fototrfica
de tapetes microbianos hipersalinos en las diferentes pocas de muestreo.
Muestreo
poca
del ao
Mes de
muestreo
Microambientales Macroambientales
pH
Cond.
(S)
*Temperatura (
o
C) *Prec.
(cm
3
) Max Md
M1 Secas Mayo 8.3 86 37.1 29.5 32.8
M2 Secas-Lluvias Julio 8.1 74 33.9 27.7 84.6
M3 Lluvias Septiembre 8.1 64 35.2 28.9 115.4
Cond. = Conductividad; Max.= Temperatura Mxima; Md= Temperatura media; Prec.= Precipitacin.
*Data tomado del Sistema Meteorolgico Nacional (CONAGUA-SMN, 2010)
38

7.3. Tipologa microscpica de tapetes microbianos hipersalinos

7.3.1. Fraccin eucarionte

En las observaciones realizadas, la fraccin eucarionte fue mnima, encontrando algunos
grupos de microalgas verdes como Dunaliella sp. (Fig. 8A), Bacillariophyceae (Fig. 8B)
y contaminacin ambiental con tejido vegetal (Fig. 8C) y escamas de peces (Fig. 8D).

Figura 8: Contaminacin exgena en las observaciones al microscopio ptico: A) Dunaliella salina en estado de estrs
con acumulacin de pigmentos que le dan esa coloracin rojiza; B) Diatomeas (); C) Tejido vegetal; D) Escama
plecoidea. NOTA: Debido a esta baja presencia de microorganismos de la fraccin eucarionte se excluy su anlisis
molecular posterior.

7.3.2. Fraccin procarionte

Los principales grupos que pueden ser descritos por mtodos microscpicos son
principalmente cianobacterias, de los ordenes oscilatoriales y nostocales (Fig. 9A y 9B).
Tambin hay una gran cantidad de clulas libres y/o formando agregados de 1-5 m.
39

Figura 9: Observaciones al microscopio ptico de frotis de tapetes microbianos: A) Cianobacterias Nostocales; B)
Cianobacterias Oscilatoriales; C) Gran variedad de morfologas como rosarios de cianobacterias, cocos y otros agregados
celulares; D) Conglomerado de bacterias creciendo sobre la superficie de los cristales halinos presentes en el sistema.

7.3.3. Tinciones

Se observa una gran cantidad de exopolisacridos dispersos en el medio y recubriendo
las clulas (Fig. 10A), con alta viabilidad y una gran variedad de morfologas que
pueden estar en vida libre o formando conglomerados (Fig.10B).

Figura 10: Observaciones al microscopio de tinciones realizadas a la muestra: A) Tincin con azul de bromofenol que
muestra los exopolisacridos en la muestra con una Cianobacteria (Nostocales) al centro para comparacin. B)
Tincin epifluorescente con Naranja de Acridina que muestra distintas morfologas, algunos organismos libres y otros
formando agregados, as como la alta viabilidad del sistema.
40

7.3.4. Microscopia Electrnica

Se observa una gran diversidad en las morfologas celulares incluyendo: cocos, bacilos,
vibrios, spiroquetas y bacterias filamentosas asociadas o no a la matriz de
exopolisacridos de la biopelcula aunque la densidad de eucariontes en fue muy baja
(Fig. 13). Las clulas asociadas a estos tapetes han perdido sus ultraestructuras
distintivas (cilios, flagelos y pared celular) y se encuentran en constante crecimiento y
desarrollo como se puede observar en la imagen donde hay unas clulas en divisin (Fig.
11A y 11B). Estas clulas se encuentran en asociados a la matriz, ya sea fijas o
formando parte de la estructura filamentosa del tapete (Fig. 12A) o en algunos caso
embebidas y recubiertas por esta matriz formando complicados arreglos en sus paredes
(Fig. 12B). Esta diversidad microbiana tiene una densidad poblacional alta y en
comparacin con los eucariontes, como se observa en la imagen donde una sola clula
eucarionte se encuentra en medio de un gran nmero de procariotas de muy diversos
grupos (Fig. 13).
Es posible observar la gran relacin de estas comunidades con la matriz de
exopolisacridos que se encuentran en conjunto con las sales del sistema, donde algunos
de los grupos se encuentran completamente embebidos en la matriz de polisacridos
donde se observan sales minerales asociados a la pared celular (Fig. 12A y 12B).

Figura 11. Observaciones en MEB de tapetes microbianos hipersalinos: A) Red de cianobacterias asociadas a la
matriz de exopolisacridos y varios procariotas asociados, mostrando la continuidad del desarrollo celular y la
divisin celular (15,000x); B) Gran abundancia de procariotas fijas a las paredes formadas por las redes cristalinas
con la matriz de exopolisacridos, mostrando la perdida de ultraestructuras distintivas, como cilios y flagelos
(7,000x)

41

Figura 12. Observaciones en MEB de la estructura de la matriz en tapetes microbianos hipersalinos: A) Red de
cianobacterias estrechamente asociadas y con la matriz de exopolisacridos (7,000x); B) Clulas embebidas en la
matriz con complicados arreglos estructurales en la pared (13,000x).

Figura 13. Diversidad morfolgica de tapetes microbianos hipersalinos mediante MEB, mostrando la alta diversidad
de morfologas procariotas presentes en la muestra, y la baja densidad de las clulas eucariontes, con una clula
eucarionte al centro. Imagen tomada a 3,500x y 20kv de potencia.

42

7.4. Caracterizacin metagenmica de tapetes microbianos
hipersalinos

7.4.1. Tratamiento con EDTA y extraccin del ADN
metagenmico

Las extraccin de ADN metagenmico a partir de los estratos de los tapetes microbianos
hipersalinos, teniendo una concentracin de entre 35 g/ml y 97 g/ml con un promedio
de 25% de pureza; sin el tratamiento la concentracin del ADN metagenmica era de
18-45 g/ml, con una pureza era de entre 1-5%.

Figura 14. Extraccin de ADN Metagenmico de tapetes microbianos hipersalinos de la Laguna Rosada de Uaymitn,
Yucatn. M= Marcador; M1: amplificaciones para el mes de mayo-junio; M2: amplificaciones para el mes de julio-
agosto; M3: amplificaciones para el mes de septiembre-octubre

7.4.2. Amplificacin por PCR de la regin ribosomal.

Los amplicones de la fraccin Bacteria tuvieron un tamao de 180 pb (Fig. 15) para las
amplificaciones del DGGE y de 1300 pb para las amplificaciones de las amplicotecas;
las amplificaciones de Archaea tuvieron un tamao de 760 pb para los amplicones del
DGGE y 640-680 pb para amplicotecas. Todas las amplificaciones se realizaron por
triplicado para bacteria y por quintuplicado para Archaea, esto debido a la cantidad de
BSA utilizado, al momento de la purificacin se perda mucho producto de PCR.
43

Figura 15. Amplificaciones de la estandarizacin para el Mg de la tcnica de PCR para los
iniciadores gc338F y 518R para Bacteria. El Magnesio esta en concentraciones milimolar.
C1 y C2 controles positivos de E. Coli.

7.4.3. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
(DGGE)

Se contabilizaron un total de 47 bandas diferentes al resolver los geles desnaturalizantes,
siendo 27 para bacteria y 20 para Archaea (Fig. 16). En el anlisis por estratos, la capa
superior verde azulada fue la ms diversa para los dos juegos de iniciadores con 44
bandas mientras que los estratos inferiores poseen 18 y 17 bandas totales para la capa
intermedia (B) e inferior (C), respectivamente (Cuadro 3). Por lo anterior, se seleccion
la capa superior verde azulada con la mayor diversidad para estudiar el proceso de
desarrollo o maduracin de los tapetes de estudio.
En la capa superior la diversidad microbiana fue mayor para los grupos de Bacteria que
para los grupos de Archaea como lo indican los ndices de Shannon (H) a diferencia de
los estratos intermedios e inferiores donde el grupo de las Archaea presento la mayor
diversidad (Cuadro 2).

Cuadro 2. Anlisis binominal de capas del DGGE por capa.
Capa
Ancho
(mm)
Color
Bandas-DGGE
a
ndice de Shannon
Archaea
b
Bacteria
c
Total Ha Hb Ht
Superior 1.9 0.08
Verde-
azulado
18 0.31 26 0.19 44 0.24 3.16 0.05 4.58 0.03 4.25 0.04
Intermedia 1.8 0.12
Purpura-
rojizo
11 0.51 7 0.45 18 0.49 1.93 0.09 1.23 0.08 1.18 0.05
Inferior 2.1 0.12 Marrn 11 0.51 6 0.42 17 0.49 1.93 0.09 2.81 0.07 0.94 0.05
a
dos replicas
b
gcA571F y UA1204R
c
gc338F y 518R
* El error es estndar.
44

En los resultados del DGGE por muestreo, se trabaj con un total de 26 bandas para
bacteria y 18 para Archaea (Fig. 16), observndose que la mayor diversidad encuentra
en el mes de mayo-junio (en la capa superior verde azulada) para los dos juegos de
iniciadores (gcA571F/UA1204R y gc338F/518R) con decremento en la diversidad a lo
largo de los muestreos, siendo el muestreo de julio-agosto (M2) el menos diverso para la
fraccin Archaea (Cuadro 3).

Cuadro 3. Anlisis binominal del desarrollo de la capa superior verde azulada del DGGE por poca de
muestreo.
poca de
muestreo
Periodo
Bandas-DGGE
a
ndice de Shannon
Archaea
b
Bacteria
c
Total Ha Hb Ht
M1 Mayo-Junio 16 0.32 26 0.19 42 0.21 2.5 0.03 4.7 0.03 5.32 0.00
M2 Julio-Agosto 8 0.51 22 0.40 30 0.47 1.98 0.08 3.97 0.08 4.39 0.05
M3 Septiembre-Octubre 10 0.51 21 0.42 31 0.46 1.8 0.08 3.79 0.07 4.12 0.06
a
dos replicas
b
gcA571F y UA1204R
c
gc338F y 518R

Figura 16. DGGE de tapetes microbianos hipersalinos: A) DGGE de iniciadores universales de Archaea (gcA571F y
UA1204R); B) DGGE de iniciadores universales de Bacteria (gc338F y 518R); Nomenclatura: M1: Capa fototrfica
muestreo de mayo-junio; M1: Capa fototrfica muestreo de julio-agosto; M3: Capa fototrfica muestreo de
septiembre-octubre; B: Capa media facultativa; C: Capa inferior anaerbica.
45

7.4.4. Amplicotecas

Se generaron 6 amplicotecas, 3 para cada juego de iniciadores, una por cada muestreo;
presentando una mejor transformacin las amplicotecas para los iniciadores de Bacteria,
teniendo una tasa de transformacin de 30.13 1.99% para Bacteria y de 20.70 0.77%
para los iniciadores para Archaea. La eficiencia de la transformacin fue de 5.99 x 10
6

1.34 x 10
6
UFC/g ADN para Archaea y 1.13 x 10
7
0.25 x 10
7
UFC/g ADN para
Bacteria (Cuadro 4).

Cuadro 4. Tasa de transformacin y eficiencia de las amplicotecas.
Genoteca poca
UFC
a

Tasa de
transformacin
Eficiencia
(UFC/g ADN)
Positiva
b
Negativa
c
Total
Archaea
M1 82 329 411 19.95% 6.5 x 10
6

M2 58 223 281 20.64% 4.46 x 10
6

M3 85 347 442 21.49% 6.94 x 10
6

Bacteria
M1 252 652 904 27.88% 1.3 x 10
7

M2 188 421 609 30.87% 0.84 x 10
7

M3 289 624 913 31.65% 1.25 x 10
7

UFC: Unidades Formadoras de Colonias
a
cinco replicas
b
UFCs blancas
c
UFCs azules

7.4.5. Anlisis de la restriccin de las amplificacin de ADNr
(ARDRA)

La concentracin de la extraccin del ADNp fue de 29.93 10.23 g/L, con una
pureza del 45.7 9.24% y se realiz la digestin de 906 extracciones de ADNp (Cuadro
5), al resolver las digestiones se observ que el muestreo con mayor nmero de
haplotipos fue M1, con 14 haplotipos para Bacteria y 5 para Archaea (Fig. 17) y un total
de 19 haplotipos visualmente discriminatorios mediante el ARDRA.
46

Figura 17. Patrones de restriccin (EcoR1) para las amplicotecas de Bacteria para M1, con un tamao de inserto de
aprximadamente 1350 pb, mostrando distintos patrones de restriccin de los amplicones de ADNr, resuelto en un gel
de agarosa al 1.2%.

Cuadro 5. Numero de haplotipos obtenidos mediante digestin con EcoR 1.
Amplicoteca poca No de reacciones de digestin Haplotipos
Archaea
M1 82 5
M2 57 4
M3 85 3
Bacteria
M1 240 14
M2 188 11
M3 240 12
Total
M1 322 19
M2 245 16
M3 425 15
Digestiones realizadas con EcoR1 y resueltas en un gel de agarosa al 1.2%

7.4.6. Secuenciacin de clonas representativas

Utilizando estos patrones de restriccin como referencia, se tomaron la mayor cantidad
de haplotipos distintos para cubrir la mayor diversidad posible y se realizaron un total de
321 secuenciaciones (Cuadro 6).

Cuadro 6. Nmero de secuenciaciones por genoteca.
Genoteca poca No de secuencias
Archaea

(A571F, UA1204R)
M1 60
M2 60
M3 60
Subtotal 180
Bacteria
(16SS y 16SR)
M1 60
M2 24
M3 57
Subtotal 141

TOTAL 321
47

7.4.7. Caracterizacin de las secuencias mediante Ribosomal
DataBase Proyect (RDP)

Del servicio requerido de secuenciacin, solo 257 secuencias fueron exitosas (80%),
estas fueron caracterizadas mediante la utilidad taxomatic del Ribosomal DataBase
Proyect, siendo 34 (13.23%) de estas pertenecientes al dominio Archaea y 223 (86.77%)
al dominio Bacteria, con un total de 100 gneros distintos de los cuales 5 gneros estn
indeterminados (Cuadro 7), es importante recalcar que los dos juegos de iniciadores
tuvieron un pequeo porcentaje de inespecifidad (<5%), amplificando regiones del otro
dominio.

7.5. Ecologa Molecular

Las secuencias se encuentran distribuidas en los tres muestreos, teniendo cada uno de los
muestreos secuencias nicas para ese muestreo, donde el muestreo del mes de mayo-
junio presenta la mayor cantidad de secuencias. Distribucin de los phyllums muestra el
mismo comportamiento y un descenso en la cantidad de secuencias (Fig. 18, Cuadro 8).
Al analizar la aparicin de grupos nuevos de acuerdo al esfuerzo de muestreo, se observa
que la pendiente de aparicin de nuevos grupos, tiene todava un valor positivo, lo que
indica que todava hay una tendencia a la aparicin de nuevos grupos, si se aumenta el
esfuerzo de muestreo (Fig. 19).
Cuadro 7. Nmero de representantes para cada uno de los niveles taxonmicos para los tres muestreos del
estrato fototrfico.
Nivel
taxonmico
Nmero de representantes
a

Archaea Bacteria
Total
M1 M2 M3 subtotal M1 M2 M3 subtotal
Dominio - - - - - - - - 2
Reino - - - - - - - - 2
Phyllum 2 2 2 2 11 9 9 16 18
Clase 5 4 4 7 16 12 16 25 32
Orden 6 5 5 10 20 16 24(1)
b
38 (1)
b
48 (1)
b

Familia 7 6 5 12 25 17 31 (1)
b
57 (1)
b
66 (1)
b

Gnero 7 6 5 13 44 (4)
b
27 41 (1)
b
87 (5)
b
100 (5)
b

a
Datos generados a partir de la aplicacin en lnea taxomatic de la plataforma del RDP, Michigan State University, Center for
Microbial Ecology (Cole et al., 2009) http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp
b
Entre parntesis el nmero de secuencias indeterminadas.
48

Figura 18. Grfico de barras para el nmero de secuencias distintas, para cada uno de
los muestreos y totales para cada uno de los juegos de iniciadores

Figura 19. Grfico de la curva de rarefaccin para Archaea, Bacteria y total, del esfuerzo de muestreo vs nmero
de representantes para clase, orden, familia y gnero.
49

Estas curvas de rarefaccin indican que el esfuerzo de muestreo es todava insuficiente y
que la diversidad reportada es no significativa, rangos taxonmicos menores como son
familia y gnero que presentan una pendiente positiva, que va disminuyendo al subir en
los niveles taxonmicos como es el caso de clase y orden.

Cuadro 8. Frecuencias encontradas para cada uno de los phyllum, por muestreo y total.
Phyllum M1 M2 M3 total %
Archaea
Crenarchaeota 6 5 2 13 5.06%
Euryarchaeota 11 6 4 21 8.17%
Subtotal 17 11 6 34 13.23%
Bacteria
Firmicutes 17 34 25 76 29.57%
Proteobacteria 40 12 13 65 25.29%
Bacteroidetes 11 12 23 46 17.90%
Actinobacteria 4 1 2 7 2.72%
Cyanobacteria 6 0 1 7 2.72%
Fusobacteria 1 4 1 6 2.33%
Planctomycetes 5 1 0 6 2.33%
Chloroflexi 1 0 1 2 0.78%
Aquificae 0 1 0 1 0.39%
Chlamydiae 1 0 0 1 0.39%
Chlorobi 0 0 1 1 0.39%
Deferribacteres 1 0 0 1 0.39%
Spirochaetae 0 1 0 1 0.39%
Synergistetes 0 1 0 1 0.39%
Thermodesulfobacteria 0 0 1 1 0.39%
Verrucomicrobia 1 0 0 1 0.39%
Subtotal 88 67 68 223 86.77%
Total 105 78 74 257 100%
El porcentaje es de acuerdo al total de secuencias obtenidas.
Datos generados a partir de la aplicacin en lnea taxomatic de la plataforma del RDP, Michigan State University, Center
for Microbial Ecology (Cole et al., 2009)
El total de la diversidad encontrada se encuentra listada en el cuadro 22 del Apndice 3.

50

Algunos grupos presentan persistencia a lo largo de los tres muestreos, mientras otros
grupos solo pertenecen a dos muestreos o en algunos casos tienen presencia en uno solo
de los muestreos.
Al ir descendiendo en los grupos se observa que entre menor sea el rango, menor es las
persistencia de los grupos y es mayor la presencia de grupos mviles, principalmente a
nivel de gnero, donde 78 de los grupos son nicos, 13 son grupos compartidos por 2
especies y solo 8 grupos son compartidos a lo largo de los tres muestreos (Cuadro 9).

Cuadro 9. Anlisis de persistencia, dinmica e intercambio de poblaciones para todos los muestreos de datos
generados a partir de amplicotecas.

spp
Intervalo
spp acumulado
Rango Dominio M1-M2 M1-M3 M2-M3
spp
12
spp
13
spp
23

DGGE
spp
3
spp
2
spp
1
+ M1 M2 + M1 M3 + M2 M3

Archaea
8 0 10 8 8 0 8 8 2 8 0 2 16 18 10

Bacteria
21 1 4 22 4 0 21 5 0 21 1 0 26 26 22

Total
29 1 14 30 12 0 29 13 2 29 1 2 42 44 32
Amplicotecas

Archaea
2 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 2 2 2
Phyllum Bacteria
5 3 7 8 5 3 11 4 1 9 4 3 14 12 12

Total
7 3 7 10 5 3 13 4 1 11 4 3 16 14 14

Archaea
2 1 2 2 2 1 4 1 0 3 1 1 5 4 4
Clase Bacteria
5 6 12 11 8 4 12 5 6 10 4 9 18 20 19

Total
8 9 15 15 11 6 17 8 7 16 6 10 27 28 26

Archaea
2 2 6 2 4 3 3 3 2 3 2 2 9 8 7
Orden Bacteria
7 8 24 8 13 8 11 10 13 10 6 14 29 34 30

Total
9 10 30 10 17 11 14 13 15 13 8 16 38 42 37

Archaea
2 2 8 3 4 3 2 5 3 3 3 2 10 10 8
Familia Bacteria
6 9 39 7 19 11 10 16 21 10 8 21 37 47 39

Total
8 11 47 10 23 14 12 21 24 13 11 23 47 57 47

Archaea
1 3 9 3 4 3 1 6 4 2 4 3 10 11 9
Gnero Bacteria
7 10 69 10 33 16 9 34 32 12 14 29 59 75 55

Total
8 13 78 13 37 19 10 40 36 14 18 32 69 86 64
spp= grupos superiores a especie; spp
3
= grupos compartidos en los tres muestreos; ssp
2
=grupos compartidos en 2 muestreos;
spp
1
=grupos presentes en un nico muestreo; Intervalos: M1-M2=relacin entre los muestres de mayo-junio/julio-agosto; M1-
M3=relacin entre los muestres de mayo-junio/septiembre-octubre; M2-M3=relacin entre los muestres de julio-
agosto/septiembre/octubre ( + = grupos, M1 grupos nicos para el muestreo mayo-junio para el intervalo; M2 grupos nicos para el
muestreo julio-agosto para el intervalo; M3 grupos nicos para el muestreo septiembre-agosto para el intervalo; spp acumulado= total de
grupos para el intervalo siendo, spp12= M1-M2, spp13= M1-M3 y spp23= M2-M3.
51

En el anlisis global, los phylla ms abundantes son Firmicutes, Proteobacteria y
Bacteroidetes del dominio Bacteria seguidos de Crenarchaeota y Euryarchaeota del
dominio Archaea. Estos phyllum son los representantes con mayor frecuencia,
representando el 85.99% de la diversidad total (Fig. 20).

Figura 20. Grfico porcentual de distribucin de frecuencias totales por phyllum para todos los muestreos
realizados en la Laguna de Uaymitn, Yucatn, Mxico.

Estos grupos con mayor abundancia, junto con los phylla Actinobacteria y Fusobacteria
son los grupos persistentes representando el 91% del muestreo total; Esta persistencia
puede ser en varios niveles, como el orden Actinomycetales o como el caso de las
familias Thermoproteaceae de Archaea y Leptotrichiaceae de Bacteria (Cuadro 10).
52

Cuadro 10. Grupos persistentes segn datos generados de las Amplicotecas.
Rango taxonmico
Phyllum Clase Orden Familia Gnero
Crenarchaeota (13,1)

Thermoprotei (13,3)

Thermoproteales (10,2)

Thermoproteaceae(6,2)
Euryarchaeota (21,6)

Methanopyri (11,1)

Methanopyrales (11,1)

Methanopyraceae (11,1)

Methanopyrus (11)
Actinobacteria (7,2)

Actinobacteria (3,3)

Actinomycetales (3,3)
Bacteroidetes (46,3)

Sphingobacteria (34,1)

Sphingobacteriales (34,2)

Rhodothermaceae (33,3)

Salinibacter (13)

Salisaeta (19)
Firmicutes (76,3)

Clostridia (68,3)

Clostridiales (51,7)

Clostridiaceae (37,7)

Alkaliphilus (8)

Clostridiisalibacter (13)

Incertae sedis XI (2)
Fusobacteria (6,1)

Fusobacteria (6,1)

Fusobacteriales (6,1)

Leptotrichiaceae (6,2)
Proteobacteria (65,4)

Deltaproteobacteria (11,4)

Desulfovibrionales (7,2)

Desulfovibrionaceae (6,1)

Bilophila (6)

Gammaproteobacteria (47,5)

Oceanospirillales (8,1)

Halomonadaceae (8,4)

Halomonas (4)

Vibrionales (35,1)

Vibrionaceae (35,1)

Salinivibrio (35,1)
Grupos que presentan persistencia a distintos niveles taxonmicos, entre parntesis la frecuencia del grupo seguido del
nmero de subgrupos.
53

La diversidad encontrada, fue mayor para el primer muestreo aunque los ndices de
diversidad indican que en la fraccin Archaea, M2 es el ms diverso. Para la diversidad
de Bacteria y total, los ndices de diversidad fueron mayores para el M1 para el nivel del
phyllum, pero para la clase, familia y gnero, los ndices de diversidad fueron mayores
para el M3, esto motivado igualmente por el tamao de muestreo, ya que el muestreo
con mayor esfuerzo de muestreo fue el M1 (Cuadro 11).

Cuadro 11. Anlisis de diversidad y frecuencias para los rangos taxonmicos mayores a partir de las
secuencias de las amplicotecas por poca de muestreo.
Rango
taxonmico
poca de
muestreo
No de representantes ndice de Shannon
Archaea
a
Bacteria
b
Total Ha Hb Ht
Phyllum
M1 17 3.5 88 10.0 105 9.8 0.94 0.09 2.42 0.17 2.82 0.04
M2 11 0.7 67 8.9 78 8.4 0.99 0.03 2.08 0.18 2.51 0.14
M3 6 1.4 68 8.3 74 7.9 0.92 0.10 2.11 0.19 2.42 0.17
Clase
M1 17 2.6 88 7.4 105 6.6 1.98 0.23 2.94 0.15 3.42 0.13
M2 11 1.9 67 6.7 78 6.0 1.79 0.25 2.47 0.15 2.96 0.13
M3 6 0.9 68 4.6 74 4.1 1.60 0.26 3.27 0.15 3.56 0.13
Orden
M1 17 2.2 88 5.5 105 5.0 2.21 0.22 3.29 0.12 3.76 0.11
M2 11 1.4 67 4.4 78 3.9 2.12 0.23 3.07 0.13 3.52 0.11
M3 6 0.7 68 3.0 74 2.7 2.25 0.24 3.87 0.12 4.15 0.11
Familia
M1 17 1.8 88 4.5 105 4.1 2.50 0.20 3.66 0.10 4.11 0.09
M2 11 1.1 67 3.3 78 3.0 2.48 0.22 3.37 0.12 3.83 0.10
M3 6 0.7 68 2.3 74 2.1 2.25 0.23 4.33 0.10 4.57 0.09
Gnero
M1 17 1.8 88 3.4 105 3.2 2.50 0.20 4.29 0.07 4.64 0.03
M2 11 1.1 67 1.7 78 1.6 2.17 0.23 4.26 0.09 4.60 0.03
M3 6 0.7 68 1.4 74 1.3 2.25 0.23 4.86 0.08 5.05 0.03
Los juegos de iniciadores mezclados por grupos, asignacin de acuerdo a datos generados a partir de la aplicacin en lnea
taxomatic de la plataforma del RDP, Michigan State University, Center for Microbial Ecology (Cole et al., 2008).

Estos datos infieren que el muestreo ms diverso es el M1 para en anlisis a nivel de
phyllum y M3 para los dems niveles taxonmicos menores.
Para comparacin de datos con la matriz generada a partir de los DGGE, se transforman
los datos a una Cuadro binominal de ausencia-presencia para los distintos niveles
taxonmicos (Cuadro 12).
54

Cuadro 12. Anlisis binominal para los rangos taxonmicos mayores por poca de muestreo mediante
Cuadro de ausencia presencia a partir de las secuencias de las amplicotecas
Rango
taxonmico
poca de
muestreo
No de representantes ndice de Shannon
Archaea
a
Bacteria
b
Total Ha Hb Ht
Phyllum
M1 2 0.00 11 0.12 13 0.46 0.04 0.00 2.75 0.12 3.01 0.10
M2 2 0.00 9 0.13 11 0.50 0.04 0.00 2.25 0.13 2.54 0.12
M3 2 0.00 9 0.13 11 0.50 0.04 0.00 2.25 0.13 2.54 0.12
Clase
M1 5 0.49 16 0.49 21 0.48 2.01 0.20 2.97 0.09 3.28 0.08
M2 4 0.53 12 0.51 16 0.51 1.60 0.21 2.22 0.09 2.50 0.08
M3 4 0.53 16 0.49 20 0.49 1.60 0.21 2.97 0.09 3.13 0.08
Orden
M1 6 0.52 20 0.51 26 0.50 1.99 0.17 2.76 0.07 3.02 0.06
M2 5 0.53 16 0.50 21 0.50 1.66 0.18 2.20 0.07 2.44 0.06
M3 5 0.53 23 0.49 28 0.50 1.66 0.18 3.17 0.07 3.26 0.06
Familia
M1 7 0.51 25 0.5 32 0.50 2.09 0.15 2.66 0.05 2.93 0.05
M2 6 0.52 17 0.47 23 0.48 1.79 0.16 1.81 0.05 2.11 0.04
M3 5 0.51 31 0.5 36 0.50 1.49 0.15 3.30 0.05 3.30 0.05
Gnero
M1 7 0.52 44 0.50 51 0.50 1.99 0.15 3.04 0.04 3.53 0.03
M2 6 0.52 27 0.47 33 0.48 1.71 0.15 2.00 0.03 2.28 0.03
M3 5 0.51 41 0.50 46 0.50 1.42 0.14 3.04 0.04 3.18 0.03
Los juegos de iniciadores mezclados por grupos, asignacin de acuerdo a datos generados a partir de la aplicacin en lnea
taxomatic de la plataforma del RDP, Michigan State University, Center for Microbial Ecology (Cole et al., 2008).

En el anlisis de los datos transformados, se observa el mismo comportamiento que en
los datos arrojados por el DGGE, donde el M1 es el muestreo con mayor diversidad para
phyllum, clase y gnero, aunque a nivel de orden y familia, el M3 es el ms abundante
de todos para el dominio Bacteria.
Considerando el la densidad taxonmica de acuerdo al muestreo (nmero de secuencias
de grupo diferente por unidad de muestreo) haciendo el anlisis de esta densidad
taxonmica indica que M3 es el muestreo con mayor diversidad en todos los niveles
taxonmicos (Cuadro 13).
Esta conducta de la diversidad para los datos transformados, tambin van en relacin a la
abundancia de los grupos persistentes, pero el M3 presenta el mayor ndice de densidad
taxonmica, aunque M1 es el muestreo con mayor nmero de secuencias diferentes,
55

esto es a razn del tamao de muestreo para los dos grupos, siendo M1 la poca ms
diversa, aunque la pendiente de aparicin de nuevas secuencias de M3 es mayor.

Cuadro 13: Cuadro de anlisis de densidad taxonmica para cada uno de los muestreos
segn dominio y totales.
Rango
taxonmico
poca de
muestreo
Densidad taxonmica
Archaea Bacteria Total
Phyllum
M1
0.12 0.13 0.12
M2
0.18 0.13 0.14
M3
0.33 0.13 0.15
Clase
M1
0.29 0.18 0.20
M2
0.36 0.18 0.21
M3
0.67 0.24 0.27
Orden
M1
0.35 0.23 0.25
M2
0.45 0.24 0.27
M3
0.83 0.34 0.38
Familia
M1
0.41 0.28 0.30
M2
0.55 0.25 0.29
M3
0.83 0.46 0.49
Gnero
M1
0.41 0.50 0.49
M2
0.55 0.40 0.42
M3
0.83 0.60 0.62
Los juegos de iniciadores mezclados por grupos, asignacin de acuerdo a datos generados a partir de la aplicacin
en lnea taxomatic de la plataforma del RDP, Michigan State University, Center for Microbial Ecology (Cole et
al., 2008).

El anlisis de correlacin para la abundancia en relacin con los fisicoqumicos indica en
el caso del DGGE que las poblaciones son positivamente sensibles a los cambios
ambientales como pH y temperatura mxima, y de manera negativa la precipitacin; los
ndices de correlacin ms altos se presentan en la fraccin Bacteria (Cuadro 14).
En el caso de las correlaciones a partir de los datos generados por las Amplicotecas, la
los ndices de correlacin mayores se presentan a nivel de phyllum, y el grupo ms
sensible de todos fueron las Archaea, teniendo valores de 1.00 para el pH y -0.99 para la
precipitacin (Cuadro 14).
56

Cuadro 14: Anlisis de correlacin de Pearson de los Fisicoqumicos vs la diversidad encontrada
mediante el DGGE y las Amplicotecas, segn dominio.
Origen de
data


Conductividad pH
Temperatura
Precipitacin
mxima media
DGGE
Archaea 0.76 0.97 0.99 0.89 -0.81
Bacteria 0.96 0.98 0.82 0.62 -0.98
Total 0.85 1.00 0.94 0.80 -0.90
A
m
p
l
i
c
o
t
e
c
a
s

Phyllum
Archaea NA NA NA NA NA
Bacteria 0.89 1.00 0.91 0.76 -0.93
Total 0.89 1.00 0.91 0.76 -0.93
Clase
Archaea 0.89 1.00 0.91 0.76 -0.93
Bacteria 0.05 0.50 0.81 0.94 -0.15
Total 0.24 0.65 0.90 0.99 -0.33
Orden
Archaea 0.89 1.00 0.91 0.76 -0.93
Bacteria -0.38 0.08 0.48 0.71 0.29
Total -0.23 0.24 0.61 0.82 0.13
Familia
Archaea 1.00 0.87 0.59 0.33 -0.99
Bacteria -0.38 0.08 0.48 0.71 0.29
Total -0.25 0.22 0.59 0.80 0.16
Gnero
Archaea 1.00 0.87 0.59 0.33 -0.99
Bacteria 0.22 0.64 0.89 0.99 -0.31
Total 0.32 0.71 0.94 1.00 -0.41
Media
DGGE
0.86 0.98 0.92 0.77 -0.90
Amplicotecas
0.37 0.63 0.75 0.76 -0.43
Total
0.47 0.69 0.78 0.76 -0.51
El anlisis de los ndices de correlacin indican que los datos del DGGE, al tener ndices de correlacin superiores que expresan
mejor el comportamiento de las poblaciones con respecto a los fisicoqumicos y comportndose de manera similar que los datos de
las Amplicotecas para los phyllum.
En negritas los ndices r
2
ms significativos (>0.80)

En el anlisis general del pH, temperatura media y la temperatura mxima, fueron los
factores ms importantes en la distribucin de las poblaciones y la conductividad fue el
ndice ms bajo con un valor de 0.47.
La relacin de los fisicoqumicos en relacin con la densidad taxonmica, el
comportamiento de los ndices fue distinto, siendo el valor ms alto el de la
conductividad con -0.85, seguido de la precipitacin con una media de 0.81 (Cuadro 15).
Los valores ms bajos son los de temperatura (media y mxima).
57

Cuadro 15: Anlisis de correlacin de Pearson de los fisicoqumicos vs la densidad taxonmica
encontrada mediante las amplicotecas, segn dominio.
Origen
de data


Conductividad pH
Temperatura
Precipitacin
mxima media
Phyllum

Archaea
-0.96 -0.72 -0.38 -0.09 0.93
Bacteria
-0.79 -0.98 -0.98 -0.87 0.84
Total
-0.99 -0.94 -0.73 -0.50 1.00
Clase

Archaea
-0.92 -0.64 -0.28 0.02 0.88
Bacteria
-0.84 -0.50 -0.11 0.19 0.78
Total
-0.90 -0.61 -0.24 0.06 0.86
Orden

Archaea
-0.93 -0.66 -0.30 -0.01 0.89
Bacteria
-0.88 -0.57 -0.19 0.11 0.83
Total
-0.91 -0.62 -0.25 0.05 0.86
Familia

Archaea
-0.97 -0.76 -0.43 -0.14 0.94
Bacteria
-0.76 -0.38 0.02 0.32 0.70
Total
-0.81 -0.46 -0.06 0.23 0.76
Gnero
Archaea
-0.97 -0.76 -0.43 -0.14 0.94
Bacteria
-0.45 0.00 0.40 0.65 0.37
Total
-0.60 -0.17 0.24 0.52 0.52

Media -0.85 -0.59 -0.25 0.03 0.81
De acuerdo a los ndices de correlacin, el factor ms importante es la Precipitacin de manera positiva y la conductividad de
manera negativa.
En negritas los ndices r
2
ms significativos (>0.80)

Los ndices de diversidad de Shannon y el ndice alfa, muestran que la diversidad es
menor cuando se trabaja con la densidad taxonmica, en cambio al considerar la
abundancia diversidad aumenta (Cuadro 16).
Este anlisis de la diversidad alfa tambin al tener ndices similares, que probablemente
sean las mismas poblaciones, que las comunidades son casi homogneas y que presentan
una relacin entre ellas, al comparar las variancias de intercambio de cada uno de los
muestreos con el total.

58

Cuadro 16. Anlisis de diversidad para el DGGE y las amplicotecas mediante ndice de Shannon
(paramtrico y no paramtrico), y la diversidad alfa.

Muestre
o
Shannon H Alfa

Total Bacteria Archaea Total Bacteria Archaea
DGGE
M1 5.32 4.70 2.50 0.96 1.04 0.94
M2 4.39 3.97 1.98 0.76 0.79 0.86
M3 4.12 3.79 1.80 0.77 0.74 0.81
Amplicotecas P NP P NP P NP
Phyllum
M1 2.82 3.01 2.42 2.75 0.94 0.04 0.83 0.83 0.62
M2 2.51 2.54 2.08 2.25 0.99 0.04 0.88 0.88 1.08
M3 2.42 2.54 2.11 2.25 0.92 0.04 0.90 0.90 1.13
Clase
M1 3.42 3.28 2.94 2.97 1.98 2.01 0.81 0.81 0.79
M2 2.96 2.50 2.47 2.22 1.79 1.60 0.84 0.84 0.94
M3 3.56 3.13 3.27 2.97 1.60 1.60 0.93 0.94 1.16
Orden
M1 3.76 3.02 3.29 2.76 2.21 1.99 0.74 0.74 0.71
M2 3.52 2.44 3.07 2.20 2.12 1.66 0.85 0.85 0.94
M3 4.15 3.26 3.87 3.17 2.25 1.66 0.93 0.93 1.16
Familia
M1 4.11 2.93 3.66 2.66 2.50 2.09 0.69 0.69 0.68
M2 3.83 2.11 3.37 1.81 2.48 1.79 0.84 0.84 0.94
M3 4.57 3.30 4.33 3.30 2.25 1.49 0.93 0.93 1.14
Gnero
M1 4.64 3.53 4.29 3.04 2.50 1.99 0.48 0.48 0.69
M2 4.60 2.28 4.26 2.00 2.17 1.71 0.87 0.87 0.91
M3 5.05 3.18 4.86 3.04 2.25 1.42 0.92 0.92 1.01
ndice de Shannon: P= Paramtrico (Frecuencias); NP= No Paramtrico (datos transformados a matriz de
ausencia/presencia).

Estas poblaciones tienen un ncleo persistente que son las formadoras del ecosistema y
otros grupos transitorios, que estn relacionados se agregan o retiran del sistema segn
los cambios medioambientales, esta sucesin indica que M1 da origen a M2 y M2 a M3
por los ndices de similitud poblacional de Morisita (M
H
) y de Camberra, siendo M2 y
M3 prcticamente el mismo grupo poblacional con ligeras variaciones por grupos
agregados en M3 como indica el valor negativo del ndice de Canberra, principalmente
en el anlisis de los datos de las Amplicotecas en relacin con el dominio Bacteria,
indicando que Archaea es un grupo constante dentro de las poblaciones existentes en los
muestreos. Las distancias poblacionales (
c
) aumentan al descender entre los grupos
taxonmicos esto indicando que la persistencia de los grupos mayores de mayor
abundancia es significativa ya que esta distancia es dada por las especies presentes en
solo uno de los muestreos cualquiera que sea el intervalo y el rango (Cuadro 18).
59

El ndice de Jaccard (B
j
) presenta valores cercanos a 1 sealando la persistencia de
todos los grupos mayores, y que infiere una alta variabilidad disminuir los ndices
taxonmicos, ya que es un ndice que considera a los grupos individuales y no su
frecuencia.

Cuadro 17. ndices ecolgicos para similitud poblacin, uniformidad y distancias ecolgicas
totales.
Rango Intervalo
Similitud Poblacional
w c r hv j
MH Canberra
P NP P NP

M1-M2 1.17 6.00 1.00 1.00 0.71 0.88 0.83 0.167 2.270
DGGE
M1-M3 1.21 7.50 1.03 0.77 0.66 0.78 0.79 0.151 2.454

M2-M3 1.05 1.50 1.00 1.00 0.91 0.95 0.95 -0.020 -0.050
Amplicotecas

M1-M2 1.29 4.00 1.10 0.61 0.56 0.70 0.67 0.141 0.042
Phyllum M1-M3 1.16 2.50 1.03 0.96 0.72 0.73 0.78 0.256 0.049

M2-M3 1.24 3.50 1.08 0.07 0.61 0.92 0.67 0.106 0.024

M1-M2 1.36 8.50 1.15 0.28 0.47 0.29 0.54 -0.004 0.185
Clase M1-M3 1.31 7.50 1.12 0.34 0.53 0.25 0.63 -0.217 0.036

M2-M3 1.33 8.00 1.13 0.31 0.50 0.90 0.56 -0.124 -0.150

M1-M2 1.58 14.00 1.35 0.12 0.26 0.57 0.42 0.150 0.093
Orden M1-M3 1.50 14.00 1.28 0.12 0.33 0.35 0.50 -0.040 -0.020

M2-M3 1.48 12.00 1.23 0.17 0.35 0.81 0.52 -0.160 -0.110

M1-M2 1.65 18.50 1.41 0.09 0.21 0.46 0.35 0.183 0.126
Familia M1-M3 1.61 22.50 1.45 0.07 0.21 0.27 0.35 -0.037 -0.034

M2-M3 1.57 17.00 1.30 0.11 0.28 0.76 0.43 -0.201 -0.149

M1-M2 1.68 28.00 1.42 0.06 0.19 0.31 0.32 0.231 0.182
Gnero M1-M3 1.79 38.00 1.64 0.04 0.12 0.17 0.21 0.038 0.037

M2-M3 1.64 25.00 1.39 0.07 0.22 0.67 0.36 -0.180 -0.143
w= ndice Beta para distancia poblacional neta; c= Distancia neta; r= ndice Beta para uniformidad; hv= Distancia
vectorial; Bj= ndice Jaccard de uniformidad; MH=Morisita-Horn para similitud poblacional y Canberra para similitud y
poblaciones variables (P= Paramtrico y NP= No Paramtrico)

Los ndices beta de distancia neta (
w
) indica que las poblaciones ms distantes se
encuentran entre M1 y M3 para los anlisis del DGGE y M1 y M2 para los rangos
mayores, aunque el nivel mximo se localiza entre M1 y M3 para el nivel de gnero, as
mismo para la uniformidad (
r
), estableciendo la uniformidad es alta y que las
60

poblaciones son la misma o muy similares; finalmente la distancia vectorial (
hv
)
establece las distancias reales por la aparicin de los grupos (Cuadro 17).
En el mismo anlisis pero en el dominio bacteria, las distancias son similares a los
anlisis de los totales y se encuentra las mismas concordancias, donde M2 y M3 son los
ms parecidos y el aumento de la distancia entre los grupos al descender hasta gnero
(Cuadro 18)
Ya en el caso de las Archaeas todos los ndices son menores y los ndices indican que la
mayor diversidad sea encuentra entre M1 y M2.

Cuadro 18. ndices ecolgicos para similitud poblacin, uniformidad y distancias ecolgicas para el
dominio Bacteria
Rango Intervalo
Similitud poblacional
w c r hv j
MH Canberra
P NP P NP
Amplicotecas

M1-M2
1.33 4.00 1.13 0.55 0.50 0.68 0.60 0.158 0.058
Phyllum M1-M3
1.19 2.50 1.03 0.95 0.69 0.69 0.74 0.266 0.070

M2-M3
1.28 3.50 1.10 0.65 0.56 0.56 0.59 0.089 0.034

M1-M2
1.35 6.00 1.14 0.41 0.48 0.56 0.50 0.325 0.222
Clase M1-M3
1.31 5.50 1.13 0.43 0.52 0.36 0.62 0.134 0.000

M2-M3
1.39 6.50 1.16 0.36 0.43 0.82 0.48 -0.160 -0.210

M1-M2
1.57 10.50 1.33 0.16 0.28 0.56 0.43 0.160 0.099
Orden M1-M3
1.51 11.50 1.29 0.15 0.32 0.33 0.40 -0.094 -0.045

M2-M3
1.50 10.00 1.23 0.21 0.33 0.80 0.50 -0.225 -0.138

M1-M2
1.68 15.00 1.44 0.11 0.19 0.44 0.32 0.205 0.150
Familia M1-M3
1.65 18.50 1.44 0.08 0.21 0.25 0.35 -0.094 -0.069

M2-M3
1.59 14.50 1.28 0.14 0.26 0.75 0.41 -0.280 -0.206

M1-M2
1.71 24.50 1.44 0.07 0.17 0.28 0.29 0.253 0.209
Gnero M1-M3
1.79 33.00 1.63 0.04 0.12 0.15 0.21 0.016 0.021

M2-M3
1.64 21.50 1.37 0.08 0.22 0.68 0.36 -0.230 -0.180
poblaciones variables (P= Paramtrico y NP= No Paramtrico).

El muestreo indica que M1 es el muestreo ms diverso, aunque los ndices de diversas
arrojan que las poblaciones M2 y M3 son las mismas y que la poblacin M3 es la de
mayor diversidad por ser al mismo tiempo la que ms grupos de presencia nica
contiene (Cuadro 19).
61

Cuadro 19. ndices ecolgicos para similitud poblacin, uniformidad y distancias ecolgicas para el
dominio Archaea.
Rango Intervalo
Similitud poblacional
w c r hv j
MH Canberra
P NP P NP
Amplicotecas

M1-M2
1.00 0.00 1.00 1.00 1.00 0.98 1.00 -0.020 0.000
Phyllum M1-M3
1.00 0.00 1.00 1.00 1.00 1.05 1.00 0.007 0.000

M2-M3
1.00 0.00 1.00 1.00 1.00 0.97 1.00 0.027 0.000

M1-M2
1.43 1.50 1.19 0.83 0.40 0.94 0.98 0.200 -0.240
Clase M1-M3
1.11 0.50 1.00 1.00 0.80 0.90 0.98 0.145 -0.110

M2-M3
1.25 1.00 1.09 0.96 0.60 0.90 0.99 0.024 0.108

M1-M2
1.64 3.50 1.42 0.41 0.22 0.80 0.36 0.114 0.071
Orden M1-M3
1.45 2.50 1.23 0.62 0.38 0.69 0.55 0.103 0.057

M2-M3
1.40 2.00 1.20 0.72 0.43 0.76 0.60 0.045 0.000

M1-M2
1.54 3.50 1.32 0.44 0.30 0.75 0.46 0.090 0.054
Familia M1-M3
1.67 4.00 1.43 0.38 0.20 0.73 0.33 0.206 0.135

M2-M3
1.45 2.50 1.23 0.62 0.38 0.73 0.55 0.123 0.057

M1-M2
1.54 3.50 1.32 0.44 0.30 0.74 0.99 0.099 0.227
Gnero M1-M3
1.83 5.00 1.66 0.29 0.09 0.70 0.98 0.179 0.084

M2-M3
1.64 3.50 1.42 0.41 0.22 0.57 0.96 0.085 -0.070
poblaciones variables (P= Paramtrico y NP= No Paramtrico).

7.6. Filogenia molecular

La filogenia molecular es muy cerrada ya que las secuencias reportadas de ambientes
similares en las bases de datos mundiales son pocas, adems de considerar que la
identidad que presentaban segn el RDP era menor a 0.80 en la mayora de los casos.
La dificultad para realizar la filogenia obligo a usar nicamente secuencias con ms de
400 pb y alineamientos locales mediante el algoritmo muscle.
Las distancias filogenticas son muy pequeas en todos los casos, siendo Archaea, el
dominio con menores distancias (Fig. 21).
Para bacteria la conservacin es menos evidente, pero siguen siendo cortas las distancias
filogenticas (Fig. 22), siendo Proteobacteria el grupo ms distante (Fig. 25). El
62

phyllum Bacteroidetes es el ms conservado dentro del grupo de las bacterias (Fig. 23).
Firmicutes es un grupo muy diverso pero los grupos separan bien (Fig. 24).

7.6.1. Filogenia de Archaea

Figura 21. rbol filogentico para Archaea, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de
tapetes microbianos hipersalinos de la laguna de Uaymitn, Yucatn, Mxico. Con algoritmo Bio Neighbor Joining
con 100 repeticiones.
63

7.6.2. Filogenia de Bacteria

Figura 22. rbol filogentico para Bacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
microbianos hipersalinos de la laguna de Uaymitn, Yucatn, Mxico. Con algoritmo Bio Neighbor Joining con 100
repeticiones.
64

7.6.3. Filogenia de phylla persistentes
7.6.3.1. Bacteroidetes

Figura 23. rbol filogentico para Bacteroidetes, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de

65

7.6.3.2. Firmicutes

Figura 24. rbol filogentico para Firmicutes, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de
66

7.6.3.3. Proteobacteria

Figura 25. rbol filogentico para Proteobacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de
67

8. DISCUSIN

La formacin de los tapetes microbianos hipersalinos es propiciada por las condiciones
adversas extremas del medio ambiente e involucra rearreglos microbianos del tipo
biopelculas estratificadas lo que finalmente le permite a los microorganismos presentes
soportar estas condiciones extremas (Bebout et al., 1995). Estas condiciones ambientales
son bsicamente estacionales favoreciendo un proceso de desarrollo o maduracin en los
tapetes microbianos (Gorlenko et al., 2010). Un tapete maduro es aquel donde la trama
de la biopelcula se encuentra completamente cerrada y donde es posible diferenciar
claramente las diversas capas metablicas que lo constituyen (Fig. 7).
Los cambios ambientales de la Laguna Rosada son estacionales y estn principalmente
regidos por la precipitacin (Junio-Noviembre) y la temperatura; estos son los dos
principales factores que determinan la salinidad del medio mediante, la adicin de agua
dulce al sistema (precipitacin) y a la inversa por la evaporacin del agua del sistema
por el aumento de la temperatura en los meses anteriores a la poca de lluvias (Fig. 7).
La diversidad es muy variada para la microbiota, aunque la fraccin eucarionte
encontrada tambin es relevante aunque poco diversa y es constituida por solo unos
pocos representantes como Artemia franciscana (Torrentera y Dodson, 2004) y/o
algunas microalgas como Dunalliela salina (Fig. 8A), los cuales tienen un papel
importante en estos sistemas ya que interrelacionan con las poblaciones procariotas
(Garca et al., 2008; Bardavid et al., 2008).
En este estudio, los principales representantes procariotas determinables con
metodologa de microscopia son miembros del phyllum Cyanobacteria (Pearl et al.,
2000) de los ordenes Nostocales (Fig. 9A) y Oscillatoriales (Fig. 9B) que se reconocen
como parte importante en la formacin de otros tapetes microbianos (Omoregie et al.,
2004) y con una abundancia significativa en este tipo de sistemas ambientales (Abed et
al., 2007). En esta parte, el pre-tratamiento y la fijacin de la muestra permitieron una
correcta visualizacin, ya que las estructuras celulares no se encontraban colapsadas y
fue posible llevar acabo las pruebas moleculares en la muestra.
Existe una red de exopolisacridos, forma una malla cerrada que se encuentra asociada a
los microcomponentes biticos y abiticos del sistema (Fig. 10A, 11C y 11D)
68

(Rougeaux et al., 2001) y que permite generar condiciones no solo de supervivencia
(Sutherland, 2001), si no tambin condiciones suficientes para mantener una alta
diversidad (Fig. 12) y continuidad de la proliferacin de la microbiota (Fig. 11A y 11B),
dndose as una alta densidad celular (Visscher et al., 1999). Estos exopolisacridos, son
producidos por diversos grupos microbianos, algunos de ellos encontrados en el
muestreo y que ya han sido reportados anteriormente como son: Streptococcaceae
(Vaningelgem et al., 2004), Rhodospirillaceae, Borkholderiaceae, Pseudomonadales
(Vu et al., 2009), Halomonadaceae (Bouchotroch et al., 2000), Vibrionaceae (Mancuso-
Nichols et al., 2005), entre otros. De este modo cada una de las biopelculas de los
diferentes estratos, se asla del medio a travs de esta cerrada malla de exopolisacridos,
que finalmente le sirve entonces como refugio y reservorio para las poblaciones que se
encuentran en el ambiente exterior (Watnick y Kolter, 2000). Esta malla finalmente
ayuda a generar un microambiente homeosttico que permite la supervivencia de los
organismos que no son tolerantes a al ambiente agresivo (Gilbert et al., 2002).
As entonces este microambiente estable posee una dinmica de intercambio con el
medio hipersalino importante segn van cambiando las condiciones ambientales,
teniendo as bsicamente dos tipos de componentes biticos, un grupo persistente
durante toda la formacin del tapete y otro grupo ms dinmico que presenta mucha
movilidad e intercambio con el medio, segn vayan cambiando las condiciones (Etienne
y Heesterbeek, 2000). Los microorganismos involucrados con este grupo persistente son
el sustento y estructura del sistema con caractersticas de tolerancia y desarrollo
similares, mientras el grupo mvil tiene distintos umbrales de tolerancia que es lo que
desarrolla esta dinmica de intercambio dependiendo de la necesidad de resguardo
(Connel y Slatyer, 1977). Estos grupos tienen un equilibrio establecido, que permite
tener una estabilidad en el sistema para que este no colapse y pueda subsistir la
metapoblacin (Gyllenberg y Hanski, 1997).
El anlisis de las poblaciones encontradas durante los muestreos mostr que la mayor
diversidad encontrada por los mtodos no paramtricos fue durante los meses de mayo-
junio (M1) que es el muestreo con mayor salinidad (Abed et al., 2006), mientras que
por los mtodos paramtricos este mismo periodo fue nicamente ms diverso a nivel
del phyllum, observndose la mayor diversidad para los meses de septiembre-octubre
69

(M3) en todos los dems niveles taxonmicos (ndice de Shannon y ndice alfa) (Fig.
26). El ndice de Morisita (Horn) indica que las poblaciones M2 y M3 son bsicamente
la misma, con algunos agregados en M3, sin embargo al aplicar el ndice de Canberra de
distancias poblacionales, la relacin entre M2 y M3 es negativa, lo que indicara que M3
da origen a M2, pero esto es imposible por la poca de muestreo, por lo que entonces
indicara una migracin de algunos grupos taxonmicos entre tapetes microbianos
adyacentes con diferentes niveles de maduracin, pero con un proceso de sucesin
ecolgica claro (Connel y Slatyer, 1977).

Figura 26. Diagrama de conjuntos poblacionales para la similitud de grupos. Al centro, los grupos compartidos,
debajo del cdigo M1, M2 y M3, el ndice de Shannon para ese muestreo.

La relacin entre la poblacin M1 y las poblaciones M2 y M3, est directamente
relacionada con la poca de muestreo, ya que inmediatamente despus del muestreo M1
comenz la poca de lluvias y como se comprob posteriormente en este estudio, la
precipitacin es el factor que afecta de manera ms importante la salinidad del
70

macroambiente y los cambios observados en la diversidad microbiana. De esta manera,
al considerar los ndices de correlacin tenemos que la diversidad encontrada es afectada
negativamente por la precipitacin (-0.51) y afectada positivamente por la temperatura
(0.78). Al considerar la densidad taxonmica entonces la correlacin cambia, siendo el
factor ms importante la conductividad de manera negativa (-0.85) y la precipitacin de
manera positiva (0.81). La combinacin del anlisis de los anteriores resultados permite
sugerir que la conductividad y la precipitacin afectan de manera importante a la
abundancia de cada uno de los grupos, mientras la temperatura es el principal factor para
el aumento de la biodiversidad. Finalmente, el anlisis de los parmetros ecolgicos de
las poblaciones microbianas con relacin a los parmetros fisicoqumicos indica tambin
que las Archaea son el grupo ms vulnerable a los cambios ambientales.
Es importante mencionar que el tamao de muestreo no fue similar en todos los casos y
como lo indica la curva de rarefaccin, donde aparece un gnero nuevo por cada 2.57
secuencias, el esfuerzo de muestreo sigue siendo pequeo y debe aumentarse dada la
amplia diversidad de estos tapetes microbianos (Ley et al., 2006).
La distancia entre estas poblaciones fue mayor para la relacin M1 vs M2 para todos los
niveles, menos para el nivel de gnero, donde la distancia entre M1 y M3 alcanz el
nivel mximo de 38 (c), aunque siempre se presentaron ndices de uniformidad
similares, indicando que aunque la variabilidad es considerable, la similitud entre las
poblaciones es alta.
En el muestreo varios phylla mostraron persistencia como Cranarchaeota,
Euryarchaeota del dominio Archaea y Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes,
Fusbocateria y Proteobacteria del dominio Bacteria, estos phylla ya haban sido
reportados en ambientes similares como los grupos dominantes (Ley et al., 2006). Estos
phyllum representan el 91% del total de los gneros encontradas y el 86% de las
secuencias totales, con porcentajes similares a los encontrados en ambientes similares
(Ley et al., 2006, Abed et al., 2007; Breitbart et al., 2009). Las familias persistentes para
las Archaea son; Thermoproteaceae, Methanopyraceae (Methanopyrus sp.) y para las
bacterias son; Rodothermaceae (Salinibacter sp., Salisaeta sp.), Clostridiaceae
(Alkaliphillus sp., Clostridisalibacter sp.), Leptotrichiaceae, Desulfovibrionace
(Bilophila sp.), Halomonadaceae (Halomonas sp.) y Vibrionace (Salinivibrio sp.) del
71

dominio Bacteria, todos estos halotolerantes moderados, en cambio algunos
representantes de las poblaciones transitorias menos abundantes son halfilos extremos
como los gneros Haloquadratum sp., Halanaerobaculum sp. y Orenia sp. Se ha
documentado que estos gneros utilizan diversos mecanismos fisiolgicos para soportar
los cambios ambientales extremos en este tipo de ambientes que incluyen la produccin
de carotenoides, bacteriorodopsina y cidos grasos (Oren, 2002). Estas poblaciones en
general tambin tienen metabolismos no fotosintticos, del tipo metanognico
(Methanopyrus sp., Methanolinea sp., Methanomicrococcus sp.), sulfognicas
(Sulfolobus sp., Desulfovermiculus sp., Bilophila sp., Aquifex sp.) o reductores de
metales (Ferroglobus sp., Preteoinoborus sp.). La mayora de todos los halfilos son as
mismo termotolerantes, lo que los hace altamente resistentes a las contingencias
ambientales y en conjunto con la gran variedad de metabolismos presentes, es posible la
supervivencia y degradacin de casi cualquier sustrato (Huber y Stetter, 1998). Algunos
gneros como Salinivibrio sp., Halomonas sp. y Marinicoccus sp., tambin presentan
una excelente produccin de enzimas hidrolticas que son de importancia industrial
(Snchez-Porro et al., 2003).
Por todos estos motivos, estos consorcios tipo tapete se consideran con alto potencial
biotecnolgico la produccin de exopolisacridos (Rougenaux et al., 2001; Bouchotroch
et al., 2000) y pigmentos (Guan et al., 2003; Alinei et al., 2006) para uso industrial y su
aplicacin ambiental mediante la biorremediacin de lodos activados (Visscher et al.,
1999), tratamiento de aguas (Hintereger y Streichsbier, 1997), degradacin de
compuestos pesados como petrleo, benceno y fenoles ((Garcia et al., 2005; Martinez-
Alonso et al., 2005), y asimilacin metales pesados (De Souza et al., 2001;) entre otros.
Considerando todos los factores tenemos entonces que la formacin de los tapetes se ve
iniciada como respuesta al aumento de la salinidad en el ambiente por motivo de la
evaporacin y al constante aumento de la temperatura aunado de la falta de aporte de
agua dulce. As entonces se forma un tapete microbiano con un grupo central ms
abundante, que es persistente entre los diferentes muestreos y que funciona como
sustento del sistema. Los microorganismos que constituyen este grupo son
termotolerantes y halotolerantes, con representantes como Methanopyrus sp.,
Alkaliphilus sp., Salinibater sp., Salisaeta sp., Halomonas sp. y Salinivibrio sp. Dentro
72

de los gneros reportados, se ha demostrado que Haloquadratum sp. y Salinibacter sp.
son los gneros con mayor distribucin, y son parte fundamental para el establecimiento
de las comunidades en los sistemas hipersalinos (Bardavid et al., 2006) y que se
mantienen estables aun con los cambios ambientales.
En conjunto con este grupo central hay un grupo de bacterias que tienen umbrales
distintos, algunos de estas solo buscan refugio en el tapete aunque no proliferan de la
misma manera. Esto se evidencia en la poblacin encontrada en M2 donde al disminuir
la salinidad del medio parcialmente, algunos grupos se van aadiendo al tapete como
Orenia sp. y Halanaerobaculum sp. los cuales son halfilos extremos obligados y
probablemente solo estn obteniendo refugio temporal en el tapete a las condiciones
mesohalfilas que se generan en este periodo. Ya para el tercer muestreo con
condiciones poblaciones muy similares a M2 las condiciones hipersalinas decrecen,
comienza la dinmica de las migraciones entre el tapete y el medio, siendo este el
motivo por el cual la mxima diversidad se localiza en M3 y en M1 (Fig. 27).

Figura 27. Esquema de la dinmica de cambio poblacional en relacin con los fisicoqumicos, en la Laguna Rosada de
Uaymitn, Yucatn. M1, muestro de mayo/junio; M2, muestreo de julio/agosto; M3, muestreo de septiembre/octubre.

73

De este modo entonces decimos que al comparar los resultados, es interesante el hecho
que la correlacin segn la abundancia es positiva para la conductividad, pero negativa
en el caso de la densidad taxonmica, este arreglo de datos propone que la temperatura
es el principal que afecta la proliferacin de las poblaciones dentro de los tapetes, pero la
conductividad y la precipitacin que afectan al microambiente y al macroambiente con
el estrs salino, afecta la presencia de grupos dentro del tapete microbiano debido a los
cambios en el ambiente externo. Este aumento de la diversidad en los tapetes al
disminuir el estrs, podra favorecer la migracin de poblaciones, o la activacin de
poblaciones en estado pasivo.

74

9. CONCLUSIONES

1. Los resultados obtenidos indican que los tapetes microbianos de la laguna Rosada
de Uaymitn son un tipo de consorcio altamente diverso y resistente a las
condiciones adversas del medio y generan condiciones propicias para la
proliferacin de un gran nmero de grupos microbianos que son soporte del
sistema o que buscan refugio en este tipo de microhbitat.

2. Estos tapetes se forman por las condiciones fisicoqumicas del medio que est
estrechamente relacionado en dos sentidos:

i. El aumento de la temperatura que afecta directamente la salinidad del
ambiente, lo que finalmente propicia la formacin de los tapetes y la
proliferacin de los grupos halfilos moderados formadores de estos
tapetes.
ii. La precipitacin que afecta la salinidad del medio que es el principal
factor que afecta el aumento de la diversidad.

As de este modo la salinidad y la temperatura afectan de manera directa la
proliferacin de las poblaciones que forman los tapetes microbianos y la
precipitacin inicia las dinmicas de intercambio por el regreso de algunas
poblaciones al medio o la integracin de otras poblaciones al tapete.

3. La diversidad microbiana en el medio es altsima teniendo una tasa de aparicin
de taxas de un gnero por cada 2.57 secuencias, con una curva de rarefaccin con
pendiente positiva para todos los rangos taxonmicos y los dos dominios
procariontes analizados. Las curvas de rarefaccin no tienen tendencia a formar la
asntota por lo cual se recomienda ampliar el esfuerzo de muestreo

4. Los phylla representativos son: Firmicutes, Proteobacteria y Bacteroidetes del
dominio Bacteria y Crenarchaeota y Euryarchaeota del dominio Archaea. Estos
75

phyllum representan el 85.99% de la abundancia total encontrada en el sistema y
que en conjunto con los phylla Actinobacteria y Fusobacteria que tambin son
persistentes suman el 91% de las secuencias totales.

5. Los grupos persistentes tienen potencial biotecnolgico previamente reportado
como son los gneros; Halomonas sp., Methanopyrus sp., Salinivibrio sp., y
Pseudomonas sp., con una gran cantidad de aplicaciones como la produccin de
exopolisacridos, enzimas y pigmentos, y en carcter ambiental la
biorremediacin y biodepuracin de distintos sustratos.

76

10. RECOMENDACIONES

El potencial biotecnolgico de los tapetes microbianos es altsimo, ya que con un mismo
tipo de asociacin se pueden complementar los mecanismos utilizados para cubrir las
necesidades de varios rubros del mbito biotecnolgico como son: la biodepuracin y la
biorremediacin de agua, de lodos y suelos, la produccin de pigmentos,
exopolisacridos y otros productos metablicos.
Se recomienda ampliar el muestreo y tratar de aislar microorganismos, enfocndose
principalmente a aquellos con genes de importancia biotecnologa, as como buscar las
condiciones de estrs ideales para obtener la mayor produccin posible.

77

11. REFERENCIAS CITADAS

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91

12. APNDICE 1.PROTOCOLOS DE PCR

Cuadro 20. Protocolos de PCR para las amplificaciones de DGGE y Amplicotecas.
Bacteria Archaea
Amplicotecas
a
(16SS y 16SR)
DGGE
b
(gc338f y 518R)
Amplicotecas
c
y
DGGE
d
(A571F y UA1204R)
(gcA571F y UA1204R)
T (C) t (seg) T (C) t (seg) T (C) t (seg)
Desnaturalizacin 95 600 95 600 95 600
Touch up (6 ciclos)
(0.5C x ciclo)
95 90 95 30 95 60
56-58.5 90 55-57.5 30 52-54.5 60
72 90 72 30 72 60
Amplificacin
95 90 95 30 95 60
59 90 58 30 55 60
72 90 72 30 72 60
Extensin final 72 540 72 540 72 540
Los ciclos de amplificacin para los protocolos de PCR fueron de 25x para la amplificacin de las Amplicotecas de Bacteria, 30x
para las amplificaciones del DGGE de bacteria y 30x para las amplificaciones de las Amplicotecas y el DGGE de Archaea.

92

13. APNDICE 2. FORMULAS EMPLEADAS PARA EL
ANLISIS ECOLGICO

Cuadro 21. Cuadro de formulas de ndices ecolgicos (anlisis no paramtrico y semiparametrico).
NDICE FORMULA NOMENCLATURA
Diversidad
Alfa
(Duhachek et al., 2005)

p= Nmero de elementos total.
2
T
= Varianza total.
2
i
= Varianza del grupo.
Shannon
(Chao y Shen, 2003)

p
i
= probabilidad de aparicin del
inesimo grupo.
Similitud Poblacional
Morisita-Horn
(Morisita, 1971;
Bloom, 1981)

a
i
= probabilidad del iesimo grupo en
la poblacin a.
b
i
= probabilidad del iesimo grupo en
la poblacin b.
S* = Nmero de especies presentes en
las dos poblaciones.

Canberra
(Bloom, 1981)

Bj
(Jaccard, 1912; Magurran, 1988;
Koleff et al., 2003)

a = Nmero de especies que
pertenecen a las dos poblaciones.
b = Nmero de especies nicas de la
Poblacin 1.
c = Nmero de especies nicas de la
Poblacin 2.
Bw
(Whittaker, 1960; Magurran, 1988;
Koleff et al., 2003)

Bc
(Cody, 1975; Koleff et al., 2003)

Br
(Routledge, 1977; Magurran,
1988; Koleff et al., 2003)

Bhv

Los ndices alfa y de Shannon, infieren la probabilidad de encontrar un grupo nuevo en un muestreo segn el muestreo total e
individual, respectivamente. Los ndices Beta tomados de Magurran (1988) y Koleff et al., (2003) modificados para ausencia y
presencia mediante datos generados por Amplicotecas.

93

14. APENDICE 3. DIVERSIDAD TOTAL

Cuadro 22. Cuadro general de frecuencias para todos los grupos encontrados en los tres muestreos.
Clado
Estado De
Maduracion
T
o
t
a
l

M1 M2 M3 %
Archeae

17 11 6 34 13.23%

Crenarchaeota 6 5 2 13 5.06%

Thermoprotei 6 5 2 13 5.06%

Acidilobales 1 0 1 2 0.78%

Acidilobaceae 0 0 1 1 0.39%

Acidilobus 0 0 1 1 0.39%

Caldisphaeraceae 1 0 0 1 0.39%

Caldisphaera 1 0 0 1 0.39%

Desulfurococcales 0 1 0 1 0.39%

Pyrodictiaceae 0 1 0 1 0.39%

Pyrodictium 0 1 0 1 0.39%

Thermoproteales 5 4 1 10 3.89%

Thermofilaceae 2 2 0 4 1.56%

Thermofilum 2 2 0 4 1.56%

Thermoproteaceae 3 2 1 6 2.33%

Caldivirga 3 2 0 5 1.95%

Thermocladium 0 0 1 1 0.39%

Euryarchaeota 11 6 4 21 8.17%

Archaeoglobi 0 2 1 3 1.17%

Archaeoglobales 0 2 1 3 1.17%

Archaeoglobaceae 0 2 1 3 1.17%

Ferroglobus 0 2 1 3 1.17%

Halobacteria 3 0 0 3 1.17%

Halobacteriales 3 0 0 3 1.17%

Halobacteriaceae 3 0 0 3 1.17%

Haloquadratum 3 0 0 3 1.17%

Methanococci 1 0 0 1 0.39%

Methanococcales 1 0 0 1 0.39%

Methanocaldococcaceae 1 0 0 1 0.39%
94

Methanotorris 1 0 0 1 0.39%

Methanomicrobia 1 0 1 2 0.78%

Methanomicrobiales 1 0 0 1 0.39%

Methanomicrobiales_Incertae_Sedis 1 0 0 1 0.39%

Methanolinea 1 0 0 1 0.39%

Methanosarcinales 0 0 1 1 0.39%

Methanosarcinaceae 0 0 1 1 0.39%

Methanomicrococcus 0 0 1 1 0.39%

Methanopyri 6 3 2 11 4.28%

Methanopyrales 6 3 2 11 4.28%

Methanopyraceae 6 3 2 11 4.28%

Methanopyrus 6 3 2 11 4.28%

Thermoplasmata 0 1 0 1 0.39%

Thermoplasmatales 0 1 0 1 0.39%

Thermoplasmatales_Incertae_Sedis 0 1 0 1 0.39%

Thermogymnomonas 0 1 0 1 0.39%
Bacteria

88 67 68 223 86.77%



Actinomycetales 1 1 1 3 1.17%

Actinomycetaceae 0 0 1 1 0.39%

Varibaculum 0 0 1 1 0.39%

Cellulomonadaceae 0 1 0 1 0.39%

Actinotalea 0 1 0 1 0.39%

Microcococcaceae 1 0 0 1 0.39%

Renibacterium 1 0 0 1 0.39%

Coriobacteridae 3 0 1 4 1.56%

Coriobacteriales 3 0 1 4 1.56%

Coriobactericeae 3 0 1 4 1.56%

Coriobacterium 2 0 1 3 1.17%

Enterorhabdus 1 0 0 1 0.39%

Aquificae

0 1 0 1 0.39%

Aquificae

0 1 0 1 0.39%

Aquificales 0 1 0 1 0.39%
95

Aquificaceae 0 1 0 1 0.39%

Aquifex 0 1 0 1 0.39%

Bacteroidetes 11 12 23 46 17.90%

Bacteroidia 2 0 4 6 2.33%

Bacteroidales 2 0 4 6 2.33%

Bacteroidales_Incertae_Sedis 0 0 1 1 0.39%

Phocaeicola 0 0 1 1 0.39%

Marinifilum 1 0 0 1 0.39%

Marinilabiaceae 0 0 3 3 1.17%

Anaerophaga 0 0 3 3 1.17%

Prevotellaceae 1 0 0 1 0.39%

Hallela 1 0 0 1 0.39%

Flavobacteria 1 0 5 6 2.33%

Flavobacteriales 1 0 5 6 2.33%

Cryomorphaceae 0 0 2 2 0.78%

Crocinitomix 0 0 1 1 0.39%

Fluviicola 0 0 1 1 0.39%

Flavobacteriaceae 1 0 3 4 1.56%

Coenonia 0 0 2 2 0.78%

Kordia 1 0 0 1 0.39%

Zhouia 0 0 1 1 0.39%

Sphingobacteria 8 12 14 34 13.23%

Sphingobacteriales 8 12 14 34 13.23%

Flammeovirgaceae 2 0 0 2 0.78%

Reichenbachiella 1 0 0 1 0.39%

Rhodothermaceae 7 12 14 33 12.84%

Rhodothermus 1 0 0 1 0.39%

Salinibacter 1 5 7 13 5.06%

Salisaeta 5 7 7 19 7.39%

Chlamydiae

1 0 0 1 0.39%

Chlamydiae 1 0 0 1 0.39%

Chlamydiales 1 0 0 1 0.39%

Simkaniaceae 1 0 0 1 0.39%

Simkania 1 0 0 1 0.39%
96

Chlorobi

0 0 1 1 0.39%

Chlorobia 0 0 1 1 0.39%

Chlorobiales 0 0 1 1 0.39%

Chlorobiaceae 0 0 1 1 0.39%

Chloroherpeton 0 0 1 1 0.39%

Chloroflexi

1 0 1 2 0.78%

Dehalococcoidetes 0 0 1 1 0.39%

Dehalogenimonas 0 0 1 1 0.39%

Thermomicrobia 1 0 0 1 0.39%

Sphaerobacterales 1 0 0 1 0.39%

Sphaerobacteraceae 1 0 0 1 0.39%

Sphaerobacter 1 0 0 1 0.39%



Chloroplast 4 0 1 5 1.95%

Bangiophyceae 1 0 0 1 0.39%

Chlorarachniophyceae 3 0 1 4 1.56%


Family Vii 2 0 0 2 0.78%

Gpvii 2 0 0 2 0.78%



Deferribacterales 1 0 0 1 0.39%

Deferribacteraceae 1 0 0 1 0.39%

Calditerrivibrio 1 0 0 1 0.39%

Firmicutes

17 34 25 76 29.57%

Bacilli

0 2 4 6 2.33%

Bacillales 0 2 3 5 1.95%

Bacillaceae 0 2 3 5 1.95%

Alkalibacillus 0 1 0 1 0.39%

Marinibacillus 0 0 1 1 0.39%

Natronobacillus 0 1 1 2 0.78%

Salsuginibacillus 0 0 1 1 0.39%

Lactobacillales 0 0 1 1 0.39%
97

Streptococcaceae 0 0 1 1 0.39%

Lactovum 0 0 1 1 0.39%

Clostridia 17 32 19 68 26.46%

Clostridiales 16 24 11 51 19.84%

Clostridiaceae 10 20 7 37 14.40%

Alkaliphilus 4 3 1 8 3.11%

Caloranaerobacter 0 0 2 2 0.78%

Clostridiisalibacter 1 8 4 13 5.06%

Clostridium 1 7 0 8 3.11%

Geosporobacter 3 1 0 4 1.56%

Natronincola 0 1 0 1 0.39%

Thermotalea 1 0 0 1 0.39%

Clostridiaceae 1 0 2 0 2 0.78%

Anaerobacter 0 2 0 2 0.78%

Incertae Sedis Xi 0 2 1 3 1.17%

Anaerosphaera 0 2 0 2 0.78%

Parvimonas 0 0 1 1 0.39%

Incertae Sedis Xii 2 0 0 2 0.78%

Fusibacter 1 0 0 1 0.39%

Guggenheimella 1 0 0 1 0.39%

Incertae Sedis Xiii 0 0 1 1 0.39%

Anaerovorax 0 0 1 1 0.39%

Incertae Sedis Xiv 2 0 2 4 1.56%

Howardella 1 0 0 1 0.39%

Proteiniborus 1 0 2 3 1.17%

Veillonellaceae 2 0 0 2 0.78%

Allisonella 1 0 0 1 0.39%

Succinispira 1 0 0 1 0.39%

Halanaerobiales 0 8 8 16 6.23%

Halanaerobiaceae 0 0 1 1 0.39%

Halocella 0 0 1 1 0.39%

Halobacteroidaceae 0 8 7 15 5.84%

Halanaerobaculum 0 2 1 3 1.17%

Orenia 0 6 6 12 4.67%
98

Thermoanaerobacterales 1 0 0 1 0.39%

Thermoanaerobacteraceae 1 0 0 1 0.39%

Geiria 1 0 0 1 0.39%

Erysipelotrichi 0 0 2 2 0.78%

Erysipelotrichales 0 0 2 2 0.78%

Erysipelotrychaceae 0 0 2 2 0.78%

Allobaculum 0 0 1 1 0.39%

Bulledia 0 0 1 1 0.39%



Fusobacteriales 1 4 1 6 2.33%

Leptotrichiaceae 1 4 1 6 2.33%

Sneathia 1 0 0 1 0.39%

Streptobacillus 0 4 1 5 1.95%

Planctomycetes 5 1 0 6 2.33%

Planctomycetacia 5 1 0 6 2.33%

Planctomycetales 5 1 0 6 2.33%

Planctomycetaceae 5 1 0 6 2.33%

Gemmata 1 0 0 1 0.39%

Pirellula 0 1 0 1 0.39%

Schlesneria 3 0 0 3 1.17%

Singulisphaera 1 0 0 1 0.39%

Proteobacteria 40 12 13 65 25.29%

Alphaproteobacteria 3 1 0 4 1.56%

Rhizobiales 0 1 0 1 0.39%

Rhodobiaceae 0 1 0 1 0.39%

Anderseniella 0 1 0 1 0.39%

Rhodospirillales 2 0 0 2 0.78%

Rhodospirillaceae 2 0 0 2 0.78%

Rhodovibrio 2 0 0 2 0.78%

Rickettsiales 1 0 0 1 0.39%

Sar11 1 0 0 1 0.39%

Pelagibacter 1 0 0 1 0.39%

Betaproteobacteria 0 0 3 3 1.17%
99

Borkholderiales 0 0 2 2 0.78%

Borkholderiaceae 0 0 2 2 0.78%

Thermothrix 0 0 2 2 0.78%

Neisseriales 0 0 1 1 0.39%

Neisseriaceae 0 0 1 1 0.39%

Stenoxybacter 0 0 1 1 0.39%

Deltaproteobacteria 3 4 4 11 4.28%

Desulfovibrionales 2 3 2 7 2.72%

Desulfohalobiaceae 0 0 1 1 0.39%

Desulfovermiculus 0 0 1 1 0.39%

Desulfovibrionaceae 2 3 1 6 2.33%

Bilophila 2 3 1 6 2.33%

Desulfuromonadales 0 1 1 2 0.78%

Geobacteraceae 0 1 1 2 0.78%

Geothermobacter 0 1 1 2 0.78%

Myxococcales 1 0 0 1 0.39%

Polyangiaceae 1 0 0 1 0.39%

Chondromyces 1 0 0 1 0.39%

Syntrophobacterales 0 0 1 1 0.39%

Syntrophobacteraceae 0 0 1 1 0.39%

Desulfoglaeba 0 0 1 1 0.39%

Gammaproteobacteria 34 7 6 47 18.29%

Cardiobacteriales 0 0 1 1 0.39%

Cardiobacteriaceae 0 0 1 1 0.39%

Dichelobacter 0 0 1 1 0.39%

Oceanospirillales 3 2 3 8 3.11%

Halomonadaceae 3 2 3 8 1.17%

Aidingimonas 0 0 1 1 0.39%

Cobetia 1 0 0 1 0.39%

Modicisalibacter 1 1 0 2 0.78%

Halomonas 1 1 2 4 1.56%

Pseudomonadales 0 0 1 1 0.39%

Moraxellaceae 0 0 1 1 0.39%

Alkanindiges 0 0 1 1 0.39%
100

Thiotrichales 0 2 0 2 0.78%

Piscirickettsiaceae 0 2 0 2 0.78%

Piscirickettsia 0 2 0 2 0.78%

Vibrionales 31 3 1 35 13.62%

Vibrionaceae 31 3 1 35 13.62%

Salinivibrio 31 3 1 35 13.62%

Spirochaetae 0 1 0 1 0.39%

Spirochaetes 0 1 0 1 0.39%

Spirochaetales 0 1 0 1 0.39%

Spirochaeteaceae 0 1 0 1 0.39%

Spirochaeta 0 1 0 1 0.39%

Synergistetes
0 1 0 1 0.39%

Synergistia 0 1 0 1 0.39%

Synergistales 0 1 0 1 0.39%

Synergistaceae 0 1 0 1 0.39%

Pyramidobacter 0 1 0 1 0.39%



Thermodesulfobacteriales 0 0 1 1 0.39%

Thermodesulfobacteriaceae 0 0 1 1 0.39%

Thermodesulfatator 0 0 1 1 0.39%

Verrucomicrobia 1 0 0 1 0.39%

Opitutae

1 0 0 1 0.39%

Puniceicoccales 1 0 0 1 0.39%

Puniceicoccaceae 1 0 0 1 0.39%

Puniceicoccus 1 0 0 1 0.39%

101

15. APNDICE 4. RBOLES FILOGENTICOS EN EXTENSO
(Construido de acuerdo a Gouy et al., 29010, con el programa SeaView)

Figura 28A. rbol filogentico para Archaea, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
repeticiones.
102

Figura 28B. rbol filogentico para Archaea, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
repeticiones.

103

Figura 29A. rbol filogentico para Bacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
repeticiones.

104

Figura 29B. rbol filogentico para Bacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
repeticiones.

105

Figura 29C. rbol filogentico para Bacteria usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de tapetes
repeticiones.

106

Figura 30A. rbol filogentico para Firmicutes, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de

107

Figura 30B. rbol filogentico para Firmicutes, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de

108

Figura 31A. rbol filogentico para Proteobacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de

109

Figura 31B. rbol filogentico para Proteobacteria, usando secuencias obtenidas de amplicotecas metagenmicas de

110

16. APENDICE 5. ARCHIVO FOTOGRFICO

ZONA DE ESTUDIO
A

B

C

D

E

F

G

H

Figura 32. Vista general de la Laguna de Uaymitn, Yucatn, Mxico en el ao 2009. A) Fauna local. B), C) y D)
Vista de la zona de colecta en los Meses de Mayo (M1), Julio (M2) y Septiembre (M3). E), F) y G) Salineras locales.
H) Vista de la Laguna desde la carretera.
111

FORMACIN DE TAPETES MICROBIANOS
A

B

C

D

E

F

G

H

Figura 33. Caractersticas macroscpicas en la formacin de Tapetes microbianos hipersalinos en la Laguna de
Uaymitn, Yucatn, Mxico. A) y B) aumento de la salinidad y formacin de espuma en la superficie. C) Formacin
de biopeliculas flotadoras. D) Precipitacin de la biopelcula. E), F), G) y H) La matriz de exopolisacridos se va
cerrando formando una biopelcula que recubre completamente el sedimento.

112

MICROSCOPIA ELECTRONICA
A

B

C

D

E

F

G

H

Figura 34. Microscopia electrnica de barrido de tapetes microbianos hipersalinos provenientes de la Laguna Rosada
de Uaymitn, Yucatn, Mxico. A) y B) Matriz de exopolisacridos asociada con los componentes biticos del
sistema. C) Alta densidad celular en los tapetes microbianos. D) Red de Cianobacterias. E). F) y G) Crecimiento en
cristales salinos y desarrollo de pared con cristales asociados. H) Clula bacteriana.

113

GLOSARIO

Albmina de Suero Bovina (BSA). protena extrada del suero bovino que participa
como coadyuvante de la PCR capturando los contaminantes, por su capacidad de
hidrolizar con capacidad de unin a agua, Ca
2+
, Na
+
, K
+
, cidos grasos, hormonas,
bilirrubina y medicamentos.
BLAST. Es un programa informtico que emplea un algoritmo heurstico lleva a cabo
un alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o de protenas. El programa
es capaz de comparar una secuencia problema (tambin denominada en la literatura
secuencia query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base
de datos.
Consorcio. Conjunto de microorganismos asociados de distintas especies provenientes
de hbitat especifico con dinmicas similares a las coloniales.
Densidad taxonmica. Es la relacin algebraica que existe entre el nmero de
secuencias obtenidas con respecto al esfuerzo de muestreo (No de secuencias).
Diversidad. ndice biolgico que indica en representa el nmero de organismos
diferentes dentro de un medio dado.
Diversidad molecular: Indicador del nmero de secuencias significativamente distintas
que forman parte pool gentico, ya sea local o metaespecie.
Metagenoma. Coleccin de genomas de un sustrato dado.
Metapoblacion. Conjunto de poblaciones de la misma especie o de especies distintas,
que tienen relaciones tan estrellas que sus dinmicas y su evolucin se dan en grupos.
Oligonucletido. Secuencia de cido nuclico o de una molcula relacionada que sirve
como punto de partida para la replicacin del ADN.
Pares de base. Dos nucletidos opuestos y complementarios en las cadenas de ADN y
ARN que estn conectadas por puentes de hidrgeno.
PCR. Reaccin en Cadena de la Polimerasa. Tcnica de anlisis del genoma mediante
la amplificacin ilimitada de porciones especficas del ADN. Es un mtodo
revolucionario de amplificacin exponencial del ADN por la intervencin de una enzima
termoestable, la Taq polimerasa, inventado por el americano Kary Mullis en 1985.
114

RDP (Ribosomal DataBase Proyect). Plataforma virtual especialista en secuencias
ribosomales.
Secuencia de ADN. Orden de encadenamiento de las bases nitrogenadas de los
nucletidos que constituyen el ADN y que cifra toda la informacin gentica. Cuando es
codificante (exn), define el orden de los aminocidos que forman la protena
correspondiente.
Taq ADN polimerasa. Es una enzima que se extrae de la bacteria Thermus aquaticus
para la replicacin del ADN, es ampliamente utilizada por sus propiedades de
termorresistencia en las reacciones de PCR.
Taxomatic: Aplicacin de la plataforma RDP, que asigna identidad a las secuencias
sometidas mediantes algoritmos euclidianos.

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CENTRO DE BIOTECNOLOGA GENMICA

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