AGRADECIMIENTOS:

INSTITUTO DEL CNCER (SOLCA) CUENCA Departamento de Patologa Dr. Jorge Ugalde Dra. Roco Murillo Subdepartamento de Biologa Molecular

AGRADECIMIENTOS:
UNIVERSIDAD DE CUENCA Laboratorio de Biologa Molecular Lcda. Lourdes Viansaca

MTODOS DE AMPLIFICACIN

MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LAS DIANAS

TCNICAS ISOTRMICA S AMT AANBS ADH

MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SONDA

MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SEALES DNA RAMIFICA DO ENSAYO DE CAPTURA DE HBRIDOS

PCR

RCL

TECNOLOGA INVASORA/ENZI MA DE ROTURA GRCL

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA)

Es una tecnologa de amplificacin que permite mediante procesos in vitro mediados por enzimas generar copia ilimitadas de un segmento determinado de DNA

Tcnica de gran sensibilidad y especificidad

Esperanza en el tratamiento

Era de los Diagnsticos Moleculares

Hito en la Biotecnologa

OBJETIVOS
GENERALES: ESPECFICOS:

Conocer el procedimiento a seguir para efectuar la PCR.

Identificar la secuencia de acontecimientos requeridos para este fin. Integrar la teora con la prctica. Valorar su utilidad.

CONOCIMIENTOS PREVIOS
DNA
Qu es? Forma
Configuracin Espacial Configuracin ptica

Estructura
Nucletidos

Funciones
Replicacin Almacenaje Expresin Variacin

REPLICACIN

HISTORIA

1953
Watson y Crick

Aos 80s
Kary Mullis

PCR

REACTIVOS, MATERIALES, EQUIPOS

REACTIVOS
Primers u Oligonucletidos Iniciadores 0,5-1M por c/100L

Muestra de DNA

DNA Polimerasa (Taq)

dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP 20-200M Concentraciones equimolares de los 4

Catalizadores MgCl2

Buffer o Tapn

MATERIALES
Tubos de Eppendorf Puntas con filtro

Micropipetas

Gradillas

Rotuladores

EQUIPOS

Vrtex

Centrfuga

Termobloque

Cuantificador de DNA

Campana

Termociclador

Cubeta de Electroforesis

Fotodocumentador

DESARROLLO

ETAPAS
PREPCR
Recepcin de la muestra Procesamiento de la muestra Purificacin de la muestra Extraccin del DNA Cuantificacin del DNA

PCR

Preparacin del coctel Ciclos

POSTPCR

Tincin de la muestra Siembra Corrida electrofortica Revelado

PRE-PCR
RECEPCIN DE LA MUESTRA PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Purificacin de la muestra

Extraccin del DNA

Cuantificacin del DNA

FUENTES DE ADN
Enfermedades Infecciosas Patologas Oncolgicas Patologas Hereditarias Caractersticas propias Muestras de tejido Biopsias del tumor L.A. vellosidades corinicas + ADN leucocitario de padres genticas Clulas nucleadas (sangre perifrica)

PCR
PREPARACIN DE CCTEL CICLOS

PROTOCOLO TRMICO (30-50 CICLOS)

DESNATURALIZACIN

ALINEAMIENTO

REACCIN DE EXTENSIN

CICLO [2n (1+e)n]

CALOR
Desnaturalizacin

FRO
Acoplamiento o Anillamiento

CALOR
Extensin

Amplificacin en Progresin Geomtrica

CUIDADOS DE LA PCR
Lugar propio Instrumental exclusivo, estril
(lavado con H2O destilada)

Reactivos apropiados Conservacin: -20C > concentracin que la requerida para la reaccin. Uso de guantes por el manipulador

POST-PCR
ELECTROFORESIS Separacin en placa por tamao y carga elctrica. REVELADO:
Radioautografa
Bromuro de etidio

Fluorescencia
Lmpara de luz UV

PCR PCR Clsica RT-PCR PCRTI PCR Anidada PCR Mltiple qPCR PCR en Tiempo Real PCR in situ

Revelado
ptico por Fluorescencia TERF Guas Moleculares

PCR TRANSCRIPATASA INVERSA (PCR-TI)

RNA

TI Termolbil (VMATI)Thermus Thermophilus

DNAc

DNA Polimerasa Termoestable (Taq Polimerasa)

PCR ANIDADA (>sensibilidad y especificidad)

2 pares de cebadores y 2 rondas de PCR. DESVENTAJAS: Contaminacin en transferencia. SUSTIUDA: Hibridacin del DNA con sonda.

PCR MLTIPLE
Co-amplificacin en mismo tubo. REQUERIMIENTOS: un

Cebadores con temperaturas de amplificacin semejantes. Ausencia de complementariedad entre los cebadores.

VENTAJA: Determinacin de mltiples dianas en una reaccin. DESVENTAJA: Baja sensibilidad.

PCR CUANTITATIVA
DETERMINANTES Eficiencia de la Amplificacin PCR COMPETITIVO (PCRc ) Co-amplificacin de secuencias diferentes en el mismo tubo que compartan los cebadores. COMPETIDORES:
Tamao similar Composicin de bases igual a la diana

Preparacin de la muestra Procedimientos de purificacin del cido nucleico Presencia de inhibidores Actuacin del termociclador

CLCULO:
Yc=Ic(1+e)n Yt=It(1+e)n Yc/Yt=Ic/It

PCR EN TIEMPO REAL

Amplificacin y deteccin de DNA simultnea en el mismo tubo. REQUERIMIENTOS (REVELADO PTICO POR FLUORESCENCIA):
Termocicladores de precisin ptica Colorantes fluorescentes que se unen al DNA de doble hebra Sondas de hibridacin (especificidad)

PCR EN TIEMPO REAL

REQUERIMIENTOS [REVELADO POR TRANSFERENCIA DE REQUERIMIENTOS (REVELADO POR RESONANCIA DE GUAS FLUORESCENCIA MOLECULARES) (TERF)]
2 sondas por c/cadena de DNA: 3: donador y 5: aceptador [proporcional a la magnitud del producto (Y)] Sondas marcadas con fluorforos en forma de horquilla.

PCR EN TIEMPO REAL

VENTAJAS:
Reduccin del tiempo para la entrega de resultados. Menor contaminacin (se obvia el procesamiento Post-PCR) Aplicacin cuantitativa.

VENTAJAS, DESVENTAJAS Y UTILIDAD

VENTAJAS DE LA PCR
A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

DESVENTAJAS DE LA PCR
Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb.

Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.
La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro.

UTILIDAD
INGENIERA GENTICA Clonacin Tecnologas de DNA recombinate Anlisis y cuantificacin de la expresin gentica (RNAm) DIAGNSTICO MOLECULAR: Gentica Inmunologa Microbiologa Oncologa TERAPIA GNICO-MOLECULAR Proyecto Genoma Humano Deteccin de mutaciones Dx. Prenatal y preimplantacin MEDICINA LEGAL ARQUEOLOGA

UTILIDAD EN INMUNOLOGA

Determinacin de mutaciones: HLA

UTILIDAD EN MICROBIOLOGA
Diagnstico etiolgico y epidemiolgico (gold estndar)

Genotipificacin: Virulencia Resistencia a frmacos Mutaciones Epidemiologa: VIH, VHB, VHC, Citomegalovirus, Virus de Epstein Barr, VPH.

BIBLIOGRAFA:

Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunologa de Kuby. VI Edicin. Editorial Mc GrawHill. Mxico D.F.-Mxico. 2007. Lodish, H. et all. Biologa Celular y Molecular. 5ta. Edicin. Editorial Panamericana. Buenos Aires - Argentina. 2011. Redondo, O. Conceptos generales de Biologa Molecular. Extraccin de DNA y Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Hospital Universitario de Guadalajara. [Actualizado 25 Abr 2007. Accesado 20 May 2013] Disponible en: http://www.aebm.org/jornadas/guadalajara/EXTRACCI%D3N%20DE%20DNA%20Y%20PC R.pdf Regueiro J., Lpez C., Gonzlez S., Martnez E. Inmunologa. IV Edicin Revisada. Ed. Mdica Panamericana. Madrid - Espaa. 2012. Rojas, W., Anaya J., Aristizbal B., Cano L., Gmez L., Lopera D. Inmunologa de Rojas. XV Edicin. Corporacin para la Torres, A.; Baca, B. Reaccin en Cadena de la Polimerasa. Centro de Investigaciones Microbiolgicas. Instituto de Ciencias. Universidad de Puebla. . [Accesado 20 May 2013] Disponible en: http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf