PSICOLOGA FISIOLGICA

TEMA 2. MTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE INVESTIGACIN

Cari Blanco Rodrguez
Caso: Julio 1982. Consulta de Neurologa. Llegan jvenes (de 20 a 30 aos) con sntomas de parlisis, habla inteligible, salivacin constante, ojos siempre abiertos,
mirada fija en los casos ms graves. En comn, todos eran consumidores de una droga nueva, un opiode sinttico relacionado con la petidina (Demerol). Esta droga estaba contaminada con un producto qumico que daa las neuronas dopaminrgicas y provoca los sntomas neurolgicos. Al ser stos parecidos a los del Parkinson, se trat a los pacientes con l-dopa (levodopa), y stos mejoraron; pero la mejora fue temporal (el frmaco dej de ser eficaz) El trasplante de neuronas fetales, mtodo neuroquirrgico experimental para tratar el Parkinson, ha resultado hasta cierto punto prometedor. Los sntomas de esta enfermedad o a los efectos txicos del MPTP, se deben a la falta de dopamina en el ncleo caudado y en el putamen. No se puede inducir el desarrollo de nuevas neuronas dopaminrgicas en el encfalo, pero si injertar neuronas secretoras de dopamina en dicha zona; si sobreviven y secretan dopamina, tal vez remitan los sntomas. Las neuronas implantadas deben estar indemnes, ser resistentes y no desencadenar reaccin inmunitaria; siendo lo ms razonable obtenerlas de fetos humanos abortados (o en un futuro de cultivos de hemocitoblastos clulas madre- estimulados para convertirse en neuronas secretoras de dopamina). Uno de los afectados se someti a este trasplante. Antes de la intervencin se le inyect l-dopa radioactiva (precursora de dopamina). Posteriormente, con un equipo de TEP se obtuvieron datos de los positrones que emita, en formas de partculas radioactivas. Semanas ms tarde, con un instrumento estereotxico se le inyectaron al paciente neuronas dopaminrgicas extradas de la sustancia negra de varios fetos abortados, Elel ncleo caudado y el putamen. La operacin fue un xito, el paciente recuper gran parte del control motor. Un ao ms tarde se le volvi a inyectar l-dopa en radiactiva y comprobaron que las clulas haban sobrevivido y estaban segregando dopamina. Lamentablemente, los efectos teraputicos del transplante suelen ser temporales, y con el tiempo, es frecuente que existan graves efectos colaterales.

El estudio de la Fisiologa de la Conducta implica muchas disciplinas (Fisiologa, Neuroanatoma, Bioqumica, Psicologa, Endocrinologa e Histologa). Llevar a cabo un proyecto de investigacin en Neurociencia comportamental requiere dominar muchas tcnicas experimentales. Los investigadores disponen de una enorme y sorprendente variedad de mtodos de investigacin; de los que vamos a ver los ms utilizados e importantes.

1. ABLACIN EXPERIMENTAL
Ablacin experimental: Extirpacin o destruccin de una parte del encfalo de un animal de laboratorio. Se supone que las funciones que ya no pueden realizarse son las que dicha regin controlaba previamente. En la mayora de los casos esta tcnica no implica extraer el tejido cerebral; se destruye y se deja en su sitio. La ablacin experimental es el ms antiguo de los mtodos utilizados en Neurociencia y se utiliza frecuentemente en nuestros das.

 EVALUACIN DE LOS EFECTOS COMPORTAMENTALES DEL DAO CEREBRAL

Estudio de lesin: Experimento en el que se daa una parte del encfalo y despus se observa la conducta del animal. Sinnimo de ablacin experimental. Se fundamenta en que la funcin de un rea cerebral puede deducirse basndose en las conductas que el animal no puede realizar tras de destruir dicha rea. El objetivo es saber cuales son las funciones que cumplen las diferentes regiones cerebrales, y luego entender como se combinan estas funciones para dar lugar a determinadas conductas. La distincin entre funcin cerebral y conducta es importante. Los circuitos que hay en el encfalo realizan funciones, no conductas. Ninguna regin cerebral o circuito neural es el nico responsable de una conducta: cada regin desempea una o ms funciones, que contribuye a la ejecucin de la conducta (ej, el acto de leer implica funciones que requieren controlar los movimientos oculares, enfocar la lente, comprender el significado de las palabras) La tarea del investigador es comprender cuales son las funciones que se necesitan para llevar a cabo una conducta especfica, y determinar cuales son los circuitos de neuronas cerebrales responsables de cada una de esas funciones La interpretacin de los datos de los estudios de lesin es complicada debido a que todas las regiones del cerebro estn conectadas entre s. (ej, sabemos que la lesin de una estructura X altera una determinada conducta; no podemos concluir forzosamente que los circuitos neuronales localizados en dicha estructura cumplen una funcin esencial en esa conducta, ya que puede darse el caso que la funcin que nos interesa la realicen circuitos neurales que se localizan en otra parte del encfalo y que la lesin de la estructura X tan solo interfiera en el normal funcionamiento de los circuitos neurales de la estructura Y).

REALIZACIN DE LESIONES CEREBRALES

Destruir una parte del encfalo situada justo debajo del crneo es fcil: se anestesia al animal, incisin en el cuero cabelludo, se extrae una parte del crneo y se corta la duramadre, dejando al descubierto la corteza. Luego, se puede utilizar un dispositivo de succin para aspirar el tejido cerebral, y para extirparlo se sita una pipeta de vidrio sobre la superficie del encfalo y se succiona el tejido con una bomba de vaco unida a la pipeta. Cuando queremos destruir zonas ms profundas (lesiones cerebrales de regiones subcorticales), por lo general se hace pasar una corriente elctrica a travs de un electrodo de acero inoxidable que, salvo en la punta, est cubierto por un barniz aislante elctrico. Se gua el electrodo siguiendo un mtodo estereotxico de modo que su extremo llegue al lugar adecuado. Luego se recurre a un instrumento para producir la lesin que produce una corriente de radiofrecuencias (RF) corriente alterna de frecuencia muy elevada-. Al pasarla corriente a travs del tejido cerebral, produce una alta temperatura que destruye las clulas cercanas a la punta del electrodo, incluyendo los somas neurales y los axones de las neuronas que atraviesan la regin. Un mtodo ms selectivo de lesin es inyectar a travs de una cnula un aminocido (Aa) excitador como el cido clnico (estimula los receptores glutamatrgicos) que destruye las neuronas estimulndolas hasta destruirlas. A este tipo de lesiones se les llama excitotxicas. Lesin excitotxica: Lesin cerebral producida por la lesin en el cerebro de un aminocido excitador. El Aa destruye los somas celulares vecinos, pero no los alrededores. Esta selectividad permite determinar si los efectos comportamentales de la destruccin se deben a la muerte de las neuronas que all se localizan o a la lesin de los axones que pasan cerca.

Existen mtodos ms especficos para marcar y lesionar neuronas. Bilogos moleculares han ideado procedimientos para incorporar sustancias qumicas txicas a los anticuerpos (Ac), los cuales al unirse a determinadas protenas que se encuentran solo en ciertos tipos de neuronas del cerebro, hacen que las sustancias qumicas txicas destruyan las clulas a las que estn unidas las protenas. En lesiones subcorticales mediante corriente de RF a travs de un electrodo o por infusin de una sustancia qumica con una cnula, siempre se causan daos adicionales en el encfalo. Por ello no debemos limitarnos a comparar la conducta de los animales lesionados con la de animales de referencia sanos. La causa de alguna de las alteraciones comportamentales puede ser por un dao fortuito de una regin cerebral situada por encima de la lesin. Para evitar esta situacin se produce una lesin falsa, en la que a los animales de referencia se les hace el mismo proceso quirrgico que al animal de estudio excepto activar el dispositivo de lesin e iniciar la infusin. Si la conducta de los animales con lesin cerebral es diferente a la de los animales de referencia con lesin falsa, se concluye que las lesiones son la causa de las alteraciones comportamentales (la lesin falsa tiene la misma finalidad que un tratamiento placebo en estudios farmacolgicos). Lesin falsa: Procedimiento placebo que reproduce todas las etapas para producir una lesin cerebral, excepto la que en realidad la provoca. La mayora de las veces se producen lesiones permanentes, pero a veces resulta provechoso impedir temporalmente la actividad de una determinada regin del encfalo. Para ello, lo ms sencillo es inyectar un anestsico local o un frmaco llamado muscimol en el lugar adecuado del encfalo. El anestsico bloquea los potenciales de accin en los axones que entran o salen de esa regin y es eficaz para producir una lesin temporal (lesin reversible). El muscimol, que estimula los receptores GABA (principal neurotransmisor inhibidor en el encfalo), inactiva una regin del encfalo al inhibir las neuronas all localizadas.

CIRUGA ETEREOTXICA
Ciruga estereotxica: ciruga cerebral que utiliza instrumental estereotxico para situar un electrodo o cnula en una posicin especfica del encfalo. Stereotaxis significa disposicin slida y se refiere a la capacidad de localizar objetos en el espacio. El aparato estereotxico consta de un soporte que inmoviliza la cabeza del animal y un brazo que desplaza el electrodo o cnula en los tres ejes espaciales a lo largo de distancias cuantificables. Para ello es necesario conocer el atlas estereotxico. No existen dos encfalos iguales en una misma especie pero existen semejanzas para predecir la localizacin de una estructura cerebral concreta respecto a las caractersticas externas de la cabeza. El crneo se compone de huesos que crecen juntos y forman suturas (puntos de unin). En los recin nacidos hay un punto blando donde se unen las suturas sagital y coronal, llamado fontanela. Cuando esta abertura se cierra, la unin se denomina bregma. Bregma: unin de las suturas sagital y coronal del crneo. Se suele utilizar como punto de referencia en ciruga estereotxica. de esquemas de secciones del encfalo de un determinado animal, con medidas que proporcionan coordenadas para la ciruga estereotxica. Incluye fotografas o esquemas que corresponden a secciones frontales, tomadas a diferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Cada pgina del atlas estereotxico est identificada conforme a la distancia de la seccin anterior o posterior respecto al bregma, y la cuadrcula de cada pgina indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la parte superior del crneo y lateral a la lnea media

Atlas estereotxico: Recopilacin

Localizando una estructura neural (que no se puede ver en el animal de experimentacin) en una de las pginas del atlas estereotxico, se puede determinar su localizacin respecto al bregma (que s se puede ver). Hay que tener en cuenta que debido a la edad, y variaciones en la cepa de los animales, la localizacin que proporcionan los atlas es solo aproximada, por lo que siempre hay que probar con una nueva serie de coordenadas, seccionar y teir el encfalo, comprobar la localizacin exacta de la lesin, corregir los valores y volver a intentarlo.

Instrumento estereotxico
Dispositivo que permite a un cirujano situar un electrodo o con el objetivo de la lesin sealizado. una cnula en una parte concreta del encfalo. Funciona siguiendo unos principios sencillos. Incluye un soporte para la cabeza que mantiene el crneo del animal en la ubicacin adecuada, un soporte para el electrodo y un mecanismo de graduacin por el que se mueve este ltimo soporte en distancias ponderadas a lo largo de los tres ejes espaciales: anterior-posterior, dorsal-ventral y lateral-medial. Se utilizan diferentes tipos de soportes de cabeza segn la especie. Una vez obtenido las coordenadas estereotxicas a partir de un atlas estereotxico, se anestesia al animal, se le coloca el instrumento y se hace una incisin en el cuero cabelludo. Se localiza el bregma, se marcan los nmeros apropiados en el Aparato y ciruga estereotxica en una rata y un humano. aparato de estereotaxia, se taladra el crneo y se introduce el dispositivo en el encfalo hasta las coordenadas correctas. Esta ciruga no solo tiene un fin lesivo. Los electrodos en el encfalo pueden destruir o estimular neuronas; adems se pueden inyectar frmacos que estimulen neuronas o bloqueen receptores especficos. Tambin se pueden implantar cnulas o electrodos permanentes. Los neurocirujanos, en ocasiones efectan lesiones subcorticales por ejemplo, para reducir los sntomas del Parkinson-. Para ello se valen de mltiples puntos de referencia y verifican la localizacin del electrodo (u otro dispositivo) insertado en el encfalo mediante RM o registrando las actividades de las neuronas en esta regin antes de producir la lesin cerebral.
Encfalo y crneo de una rata, as como su atlas estereotxico,

 MTODOS HISTOLGICOS
Despus de la lesin cerebral y posterior observacin de la conducta, hay que seccionar y teir el tejido cerebral para localizar el lugar de la lesin con el microscopio. A menudo, las lesiones cerebrales yerran su objetivo, por lo que hay que verificar la localizacin exacta del dao cerebral despus de examinar el comportamiento del animal. Para ello es necesario mediante mtodos histolgicos, seccionar, teir y examinar el encfalo

Fijacin y obtencin de cortes histolgicos

Para estudiar el tejido como era en el momento de la muerte del organismo, se han de destruir las enzimas autolticas, o de lo contrario stas convertirn al tejido en una masa deforme. Para evitar la descomposicin del tejido por la accin de las bacterias o mohos. Por ello se sumerge el tejido neural en un fijador. El ms utilizado es el formol (solucin acuosa del gas formaldehdo), que detiene la autolisis, endurece el tejido y elimina los microorganismos que pudieran destruirlo. Antes de fijar el encfalo, se suele perfundir (se extrae la sangre y se sustituye por otro lquido, tal como una solucin salina o un fijador); al no contener sangre el encfalo del animal, se obtienen mejores resultados histolgicos. El animal cuyo encfalo va a ser estudiado se sacrifica humanitariamente mediante una sobredosis de anestsico general. Una vez fijado, se secciona con un micrtomo en delgadas lminas y se tien diversas estructuras celulares para examinar su estructura. Las secciones (cortes de tejido cerebral) que se preparan para estudiarlas al microscopio ptico suelen tener un espesor de 10 a 80 m, y para el microscopio electrnico menos de 1 m. Un micrtomo consta de tres partes (cuchilla, plataforma para el tejido y mecanismo para que avance la cuchilla). La plataforma suele incluir un accesorio que congela el encfalo, dndole dureza para poder cortarlo mejor. Una vez cortadas, las secciones se montan sobre un porta objetos de vidrio, el cual se sumerge en diversas soluciones qumicas para su tincin. Por ltimo, las secciones teidas se cubren con una pequea cantidad de lquido transparente (medio de montaje) y se le coloca una lmina de cristal (cubreobjetos) sobre ellas. El medio de preparacin mantiene fijo el cubreobjetos.

Tincin
Al microscopio una seccin cerebral sin teir muestra los contornos de algunas masas celulares grandes y los fascculos de fibras ms destacados, pero no los detalles ms finos. Por ello, la neuroanatoma microscpica requiere tinciones histolgicas especficas. Para verificar una lesin cerebral se utiliza una de las ms simples: la tincin de los somas celulares. Franz Nissl (neurlogo alemn), a finales del siglo pasado descubri el azul de metileno, con el que se poda teir los somas celulares del tejido cerebral. El material que capta el tinte (sustancia de Nissl) est formado por ARN; ADN y protenas asociadas localizadas en el ncleo y dispersas en forma de grnulos, por el citoplasma. Adems del azul de metileno, existen ms tintes con el mismo propsito, el ms utilizado es el violeta de cresilo. * Los tintes no se desarrollaron con fines histolgicos, en principio se fabricaron para teir telas. El descubrimiento de las tinciones de somas celulares hizo posible identificar masas nucleares en el encfalo. La tincin no tie selectivamente los somas celulares neuronales: todas las clulas, ya sean neuronas o neuroglia, se tien por igual. El investigador debe determinar cual es cual, en funcin de su tamao, forma y localizacin. Los fascculos de fibra tienen un aspecto ms claro porque no absorben el tinte.

Microscopia electrnica
El microscopio ptico tiene escasa capacidad de resolucin espacial para apreciar pequeos detalles, ya que, debido a la propia naturaleza de la luz, una magnificacin o aumento mayor de aproximadamente 1.500 no aade ningn detalle. Para estructuras anatmicas pequeas como las vesculas sinpticas y detalles de orgnulos celulares se necesita un microscopio electrnico de transmisin. Hace pasar un haz de electrones enfocado de un lado a otro de una lmina fina del tejido a examinar y el haz de electrones proyecta una imagen del tejido en una pantalla fluorescente, que puede fotografiarse o escanearse mediante un ordenador. Las microfotografas electrnicas aportan informacin sobre detalles estructurales del orden de unas pocas decenas de nanmetros. Un microscpico electrnico de barrido proporciona menos amplificacin que el electrnico de transmisin estndar, el cual transmite el haz de electrones a travs del tejido. . En cambio, muestra los objetos en tres dimensiones. Para ello, el microscopio explora el tejido mediante un haz de electrones que se desplaza, un detector recibe la informacin del haz y un ordenador produce una imagen tridimensional muy detallada.

Microscopio confocal con lser

La microscopia convencional o electrnica de transmisin requiere que el tejido se corte en finas secciones. El microscopio confocal con lser aporta imgenes de lminas de alta resolucin de diversas profundidades de una seccin gruesa de tejido que contiene molculas fluorescentes, mediante la exploracin del tejido con la luz de un rayo lser. Este microscopio permiti ver detalles en el interior de secciones gruesas de tejido o incluso en bloques de tejido en cultivo o en las capas superiores de tejido de un cerebro vivo. Este microscopio requiere que se tian con un tinte fluorescente las clulas o partes de ellas que nos interesen. Este procedimiento se denomina inmunocitoqumica. Ejemplo, marcamos con un tinte fluorescente las neuronas que producen un tipo especfico de pptido. Un lser produce un rayo de luz con una determinada longitud de onda que se refleja en un espejo dicroico (transmite la luz de ciertas longitudes de onda y refleja las de otra). Las lentes del microscopio enfocan la luz lser en una determinada profundidad en el tejido. Esta luz desencadena la fluorescencia en el tejido, que atraviesa las lentes y se transmite a travs del espejo dicroico a una abertura (pinhole). Esta abertura bloquea la luz extraa causada por la dispersin dentro del tejido, y la luz que atraviesa la abertura se mide mediante un detector. Dos espejos mviles hacen que la luz lser explore el tejido, proporcionando a un ordenador la informacin para crear una imagen de una seccin de tejido localizada a una profundidad determinada dentro de la muestra. Si se realizan mltiples exploraciones mientras se mueve la localizacin de la abertura, se puede obtener un cmulo de imgenes de secciones a travs del tejido (puede ser tejido vivo).

 MARCADO DE CONEXIONES NEURALES

Experimento: Nos interesa saber cuales son los mecanismos neurales que controlan la conducta reproductora, y estudiar la fisiologa de la conducta sexual de ratas hembra. A partir de una buena documentacin, se le practica la ciruga estereotxica a dos grupos de ratas hembra. Al grupo experimental se le lesiona el ncleo ventromedial del hipotlamo (HVM), y a las del grupo de referencia se le practica una lesin falsa. Tras la recuperacin, se les empareja con los machos. Las ratas del grupo de referencia responden positivamente al cortejo; las hembras con lesin en el HVM rechazan la copulacin. Mediante tcnicas histolgicas se confirma que el HVM de los animales de experimentacin estaba destruido. Los resultados de este experimento indican que las neuronas del HVM parecen intervenir en las funciones requeridas para la conducta de cpula de las hembras (estas lesiones no afectan a la conducta de apareamiento de los machos). Se pueden estudiar tambin el sistema de estructuras cerebrales que participan en la conducta de apareamiento de las hembras. El HVM no opera solo, recibe aferencias de ciertas estructuras y enva eferencias a otras. La cpula requiere integrar percepciones visuales, tctiles y olfativas, adems de organizar los movimientos en respuesta a los de la pareja. Se necesita que todo el sistema sea activado por las neuronas sexuales. Nos preguntamos entonces cual es la funcin aqu del HVM. Para dar una respuesta hay que conocer ms acerca de las conexiones del HVM con el resto del encfalo (qu estructuras envan su axones al HVM y a que estructuras las enva ste); as se podr investigar la funcin de estas estructuras y el carcter de sus interacciones. Para investigar las conexiones del HVM no podemos utilizar mtodos histolgicos que tien todas las neuronas. Para ello se han desarrollado mtodos de gran precisin que resaltan neuronas especficas.

Marcado de axones eferentes

Para que el HVM afecte a la conducta, las neuronas de este ncleo tienen que enviar axones a zonas del encfalo en las que haya neuronas que medien los movimientos musculares. Probablemente la va no sea directa y las neuronas del HVM afecten a neuronas localizadas en otras estructuras, las cuales a su vez influyan en las de otras estructuras, hasta que las neuronas motoras sean estimuladas. Nuestro objetivo es marcar los axones eferentes de dicha estructura. Mtodo de marcado antergrado: (hacia delante) Mtodo histolgico que marca los axones y botones terminales de neuronas cuyos somas celulares se encuentran en una determinada regin. Es decir, emplea sustancias que son captadas por las dendritas o los somas celulares y las transportan a lo largo del axn hasta los botones terminales. Existen diferentes mtodos para marcar las vas que siguen los axones eferentes. Ej, para descubrir el destino de axones eferentes localizados dentro del HVM, podemos inyectar una minscula cantidad de PHA-L dentro del ncleo. PHA-L: Protena que se encuentra en las judas, utilizada como marcador antergrado. La absorben las dendritas y la transportan atravesando el soma hasta el axn, por donde viajan mediante transporte axoplsmico rpido hasta los botones terminales. En pocos das, las clulas estn repletas de molculas de PHA-L en su totalidad: dendritas, soma, axn y todas sus ramificaciones y los botones terminales.

Luego se sacrifica al animal, se secciona el encfalo y se acoplan las secciones sobre el portaobjetos. Para poder ver las molculas de PHA-L al microscopio, se aplica un mtodo inmunocitoqumico especial. Mtodo inmunocitoqumico: Mtodo histolgico que utiliza anticuerpos (AC) radioactivos o AC ligados a una molcula teida para indicar la existencia de determinadas protenas de pptidos. Los mtodos inmunocitoqumicos sacan provecho de las reacciones inmunitarias. El sistema inmunitario produce Ac en respuesta a los antgenos (Ag). Los Ag son protenas (o pptidos), como las que se encuentran en la superficie de las bacterias o virus. Los Ac (tambin son protenas) son producidos por los leucocitos para destruir microorganismos invasores, o bien se sitan sobre su superficie y, al igual que los receptores de los neurotransmisores se localizan sobre la membrana de las neuronas. Cuando los Ag presentes en la superficie del microorganismo invasor entran en contacto con los Ac que los reconocen, estos desencadenan el ataque de los leucocitos sobre el invasor. Bilogos moleculares han puesto a punto mtodos de produccin de produccin de Ac para cualquier pptido o protena. Las molculas de los Ac estn unidas a distintos tipos de molculas de colorantes, algunos de los cuales reaccionan con otras sustancias y tien el tejido de color marrn, mientras que otros son fluorescentes. Para determinar en que parte del encfalo se localiza el pptido o la protena (el Ag), se sumergen secciones frescas de tejido cerebral en ina solucin que contiene las molculas de Ac/colorante, y los Ac se unen a su Ag. Al microscopio (bajo una luz de una determinada longitud de onda, en el caso de tintes fluorescentes) se pueden ver las partes del encfalo (incluso neuronas individuales) que contienen el Ag. Si seguimos con la funcin del estudio de la funcin del HVM en la conducta sexual de las hembras, tendremos que averiguar cuales son las estructuras que reciben informacin de las neuronas del HVM, entre ellas la sustancia gris periacueductal (SGPA), y ver que sucede cuando se lesiona cada una de ellas. El dao de alguna de ellas igual tambin altera la conducta sexual de las ratas. Se inyecta PHA-L en dichas estructuras y se observa hacia donde se dirigen sus axones. Finalmente se descubrir la va principal que va desde el HVM hasta las neuronas motoras cuya actividad es necesaria para copular.

Marcado de axones aferentes

Debemos tambin saber que ocurre con los circuitos que se encuentran antes del HVM. Interviene de algn modo el HVM en el anlisis de la informacin sensorial (visin, olor o contacto con el macho)? O tal vez los efectos activadores de las hormonas sexuales de la hembra sobre su conducta actan a travs del HVM, o de neuronas cuyos axones establecen sinapsis all. Para averiguar cuales son las regiones del encfalo que forman parte de los componentes de la corriente superior de los circuitos neurales se debe determinar cuales son las aferencias que recibe el HVM sus conexiones aferentes-. Mtodo de marcado retrgrado: (hacia atrs) Mtodo histolgico que marca los somas celulares a los que pertenecen los botones terminales de los axones que establecen sinapsis con las clulas de una determinada regin. Es decir, emplean sustancias que son captadas por los botones terminales y transportadas de vuelta a lo largo de los axones hacia los somas celulares. El mtodo es similar al anterior. Inyectamos en el HVM un apequea cantidad de oro fluorado (tincin que sirve como marcador retrgrado. Lo absorben los botones terminales y lo transportan de forma axoplasmica retrgrada de vuelta al soma celular). Das despus se sacrifica al animal, se secciona su encfalo y mediante una luz con una adecuada longitud de onda (las molculas de oro fluorado emiten fluorescencia) se examina. As se descubre que la amgdala medial es una de las regiones que aportan aferencias al HVM.

Los mtodos antergrado y retrgrado descritos identifican un solo eslabn de una cadena de neuronas (neuronas cuyos axones entran o salen de una regin cerebral determinada), mientras que los mtodos de marcado transneuronal identifican las cadenas de neuronas que establecen conexiones sinpticas (una serie de dos, tres o ms neuronas que forman conexiones sinpticas en serie una con otra). El mtodo de marcado transneuronal retrgrado ms eficaz emplea un virus de la seudorrabia (forma debilitada del virus del herpes del cerdo (originalmente se concibi como vacuna) utilizado para el marcado transneuronal retrgrado. Marca una serie de neuronas que estn interconectadas mediante sinapsis). Para el marcado transneuronal antergrado, se utiliza una variedad del virus del herpes simple, que se inyecta directamente en una regin cerebral, es captado por las neuronas del lugar y las infecta. Luego se extiende a travs de las neuronas infectadas, y finalmente es liberado, contagiando la infeccin a las neuronas con las que establece conexiones sinpticas. Cuanto ms espera el investigador tras inyectar el virus, mayor es la cantidad de neuronas que llegan a infectarse. Despus de sacrificar al animal y seccionado su encfalo, se aplican mtodos inmunocitoqumicos para localizar una protena producida por el virus. La combinacin de estos mtodos permiten descubrir circuitos de neuronas interrelacionadas, contribuyendo a obtener un diagrama de cableado neural del encfalo. Junto con otros mtodos de investigacin se puede tratar de descubrir las funciones de cada uno de los componentes de dicho circuito.
Resultado de los mtodos de marcado. Representacin de una de las aferencias al HVM y una de sus eferencias, puestas de manifiesto por los mtodos de marcado antergrado y retrgrado.

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DEL CEREBRO HUMANO IN VIVO

Investigar las funciones del encfalo en los animales nos lleva a sacar conclusiones sobre la evolucin de varios sistemas neurales. Nuestro inters se centra en las funciones del encfalo humano, pero es evidente que no se le puede pedir a un paciente que se someta a ciruga para investigarlo. A veces, las enfermedades o accidentes daan el encfalo. Si se sabe donde se ha producido la lesin, se puede estudiar la conducta de esas personas e intentar hacer inferencias respecto a las lesiones producidas intencionalmente en animales. El problema es saber dnde se localiza la lesin. Antiguamente se estudiaba la conducta tras una lesin cerebral sin saber exactamente su localizacin (salvo con una autopsia posterior). Esto hizo que el estudio de los efectos comportamentales del dao en regiones especficas del encfalo humano progresara lentamente. Los avances en las tcnicas de rayos X y la tecnologa con ordenadores, nos lleva a concebir mtodos para estudiar la anatoma del cerebro in vivo. Tomografa Axial Computerizada (TAC): Fue el primer mtodo que se ide con dicho fin. Es una tcnica que se sirve de un ordenador para analizar los datos obtenidos mediante una exploracin por rayos X y proporciona una imagen bidimensional de una seccin del cuerpo.

Para la exploracin TAC, se coloca la cabeza del paciente en un amplio cilindro de forma ovalada, que contiene un aparato de rayos X. Enfrente del paciente (al otro lado de la cabeza) hay un detector de rayos X. El haz de rayos pasa a travs de la cabeza y el detector mide la cantidad de radioactividad que se transmite. Este haz explora la cabeza desde todos los ngulos y un ordenador convierte los valores en imgenes del crneo y su contenido. Resonancia Magntica (RM): Tcnica con la que se pueden obtener imgenes precisas del interior del cuerpo. Implica la interaccin entre ondas de radio y un intenso campo magntico. Se parece al TAC pero no utiliza rayos X. En lugar de ello, hace pasar un campo magntico intenso a travs de la cabeza del paciente. Cuando se coloca e cuerpo de un sujeto en un intenso campo magntico, los ncleos de algunos tomos de molculas del organismo rotan siguiendo una determinada alineacin. Si entonces se hace pasar una onda de radiofrecuencia a travs del cuerpo, dichos ncleos emiten ondas de radio. Las diferentes molculas emiten energa a diferentes frecuencias, de modo que el equipo de RM se ajusta para detectar la radiacin procedente de los tomos de hidrgeno. Ya que la concentracin de estos tomos en los distintos tejidos es diferente, el equipo puede utilizar la informacin para elaborar imgenes de secciones del encfalo. A diferencia del TAC cuyas imgenes se limitan a un plano horizontal, las de RM pueden obtenerse tambin en un plano sagital o uno frontal. En la RM se puede distinguir entre las regiones de sustancia gris y blanca, de modo que pueden verse los principales fascculos de fibras (tales como el cuerpo calloso). Pero los fascculos de fibras ms pequeos no pueden verse, salvo con una versin especial de la RM (que incluso puede marcar haces de fibras).

Por encima del cero absoluto, todas las molculas se mueven en direcciones aleatorias debido a la agitacin trmica (a mayor T, mayor movimiento aleatorio). Imgenes Tensoriales de Difusin (ITD): Mtodo de neuroimagen que emplea una RM modificada para poner de manifiesto haces de axones mielnicos en el cerebro humano in vivo. Estas imgenes se benefician del hecho de que el movimiento de las molculas de agua en los fascculos de sustancia blanca no es aleatorio sino que tiende a realizarse en una direccin paralela a la de los axones que constituyen dichos fascculos. La RM utiliza la informacin relativa al movimiento de las molculas de agua para determinar la localizacin y orientacin de los fascculos de axones de la sustancia blanca.

2. REGISTRO Y ESTIMULACIN DE LA ACTIVIDAD NEURAL

Tambin se puede estudiar el encfalo mediante el registro o estimulacin de la actividad de regiones especficas. Las funciones cerebrales implican la actividad de circuitos neuronales, as pues, las diferentes percepciones y respuestas comportamentales implican diferentes pautas de actividad cerebral. Se han elaborado mtodos para registrar estas pautas o para producirlas de forma artificial.

REGISTRO DE LA ACTIVIDAD NEURAL

Los axones producen potenciales de accin y los botones terminales provocan potenciales postsinpticos en la membrana de las clulas con las que establecen sinapsis. Estos fenmenos elctricos pueden registrarse y los cambios en la actividad elctrica de una regin concreta se pueden utilizar para determinar si dicha regin participa en el control de dichas conductas. Por ejemplo, se pueden hacer registros durante la presentacin de un estmulo, toma de decisiones o ejecucin de una actividad motora. Los registros pueden realizarse crnicamente (durante un largo tiempo despus que se haya recuperado el animal de la intervencin) o de forma aguda (durante un corto periodo en el que el animal sigue anestesiado). Estos ltimos, al realizarse bajo anestesia suelen limitarse al estudio de vas sensoriales, y rara vez se acompaan de observaciones comportamentales (son limitadas bajo anestesia).

Registro con microelectrodos

Los agentes qumicos que afectan a las neuronas serotoninrgicas y noradrenrgicas tambin afectan al sueo REM. Si nos planteamos si la actividad de las neuronas serotoninrgicas y noradrenrgicas vara durante las diferentes fases del sueo, registraramos con microelectrodos (electrodo muy fino utilizado generalmente para registrar la actividad de neuronas individuales) la actividad de dichas neuronas. Por lo general, esta tcnica se denomina registro de neuronas individuales o de unidades (registro de la actividad elctrica de una sola neurona o unidad). Como se quiere registrar la actividad de neuronas individuales en un largo perodo de tiempo en animales no anestesiados, se elegirn electrodos que duren ms. Para ello, se puede conseguir un juego de cables muy finos, unidos en un manojo, que estn elctricamente aislados (solo las puntas estn sin recubrir). Los electrodos se implantan en el encfalo de los animales mediante ciruga estereotxica, luego se conectan a unos zcalos de conexin elctrica en miniatura y estos se fijan al crneo del animal con una pasta (cemento dental). Cuando el animal se recupera de la ciruga, ya se le puede conectar al sistema de registro. Estos animales se comportan con normalidad si prestar atencin a los zcalos de conexin elctrica que tienen en la cabeza.

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A veces se fijan dispositivos complejos al crneo del animal cuando se implantan microelectrodos. Estos incluyen mecanismos de tornillos que permiten desplazar el electrodo (o su conjunto) al interior del encfalo, de forma que pueda registrar diferentes partes de este mientras realiza las observaciones. Las seales elctricas que detectan los electrodos son dbiles y tienen que amplificarse. Los amplificadores permiten que estas seales puedan verse en un osciloscopio y almacenarse en la memoria de un ordenador. Lo que se hace es registrar la actividad de las neuronas serotoninrgicas y noradrenrgicas durante diferentes fases del sueo, y con ello se aprecia que la frecuencia de descarga de estas neuronas decae casi hasta cero durante el sueo REM; lo que nos sugiere que tales neuronas tienen un efecto inhibidor sobre dicho tipo de sueo. Es decir, el sueo REM no puede ocurrir hasta que esas neuronas dejan de descargar.

Registro con macroelectrodos

Los macroelectrodos (de mayor tamao que le microelectrodo) los utilizamos cuando queremos registrar la actividad de una regin global (gran cantidad de neuronas) del encfalo. No detectan la actividad de neuronas individuales. Los registros obtenidos representan los potenciales postsinpticos de incluso millones de clulas del rea donde se sita el electrodo. Los electrodos pueden consistir en alambres no afilados insertados en el encfalo, tornillos fijados en el crneo o incluso discos de metal pegados con una pasta especial que conduce la electricidad en el cuero cabelludo de humanos. Los registros, particularmente los tomados del cuero cabelludo, representan la actividad de muchas neuronas, cuyas seales elctricas atraviesan las meninges, el crneo y el cuero cabelludo antes de alcanzar los electrodos. A veces, los neurocirujanos implantan macroelectrodos directamente en el interior del encfalo humano para detectar el origen de una actividad elctrica anmala que origina frecuentes convulsiones. Una vez detectada la fuente, se abre el crneo y se extrae el foco de las convulsiones (en la mayora de los casos tejido cicatrizal producido por un dao cerebral ocurrido aos antes). Habitualmente la actividad elctrica del encfalo se registra mediante electrodos pegados al cuero cabelludo y se muestra en un polgrafo. Los polgrafos contienen un mecanismo que hace avanzar una tira de pape sobre la que escriben una serie de plumillas. stas son bsicamente manecillas de grandes voltmetros que se mueven arriba o abajo en respuesta a la seal elctrica que les envan los amplificadores biolgicos.

Caso: Una seora sufri un ataque cardaco como consecuencia de una arteriosclerosis (endurecimiento de las arterias); un trombo fue lo que provoc el ataque.
Pasado un tiempo tuvo varios ataques isqumicos transitorios con sntomas neurolgicos (entumecimiento del brazo derecho y dificultades para hablar). Mediante un angiograma, se apreci que su arteria cartida izquierda estaba casi obstruida, con lo cual deba someterse a intervencin quirrgica (endoarteriectoma cartida) para eliminar la placa obstructiva y restablecer el aporte sanguneo. En la intervencin se le colocaron electrodos en el cuero cabelludo para ser controlada mediante EEG. Se le practic una incisin en el cuello dejando al descubierto su cartida interna, en el punto donde la cartida comn se divide en interna y externa. Se coloc una cinta de plstico alrededor de la cartida comn, y se pinz para detener el flujo de sangre, pero haba cierta lentitudes las ondas del EEG. As que se opt por utilizar una sonda de derivacin (mediante una incisin por encima y debajo de la obstruccin) para poder trabajar en la arteria lesionada sin para el flujo sanguneo. A continuacin se extirp la masa amarillenta causante del problema, se cerr la incisin y se extrajo la sonda. La mayora de cirujanos prefieren pinzar la arteria ocluida mientras trabajan (el trabajo es ms rpido y las complicaciones menos probables). Dado que hay conexin del aporte sanguneo a cada uno de los hemisferios (mediante arterias comunicantes especiales), se suele poder sellar una de las cartidas durante algunos minutos sin causar dao. Pero a veces el flujo de un lado no es suficiente para abastecer al otro; el nico modo de saberlo es mediante el EEG, ya que si el cerebro no est recibiendo el aporte sanguneo suficiente, en el EEG se ven las caractersticas ondas lentas. Fue lo que sucedi en este caso y debido a ello se opt por hacer una 1 derivacin. Sin ello, la intervencin podra haber causado una apopleja en lugar de prevenirla. La paciente se recuper bien de la intervencin.

Los electroencefalogramas (EEG) o escritos de la electricidad de la cabeza son los registros del potencial elctrico cerebral obtenido mediante electrodos situados sobre el cuero cabelludo. Se pueden utilizar para el diagnstico de la epilepsia o para estudiar las fases del sueo y vigilia, las cuales se asocian con patrones de actividad elctrica caractersticos. Otra aplicacin del EEG es supervisar el estado del encfalo durante intervenciones que, en principio, pueden daarlo.

Magnetoencefalografa
Procedimiento que detecta grupo de neuronas activadas sincrnicamente gracias al campo magntico inducido por su actividad elctrica. Utiliza un conjunto de elementos superconductores de interferencia cuntica o SQUID. Cuando una corriente elctrica fluye a travs de un conductor, induce un campo magntico. Es decir, cuando los potenciales de accin se transmiten a lo largo de los axones o los potenciales postsinpticos se transmiten por las dendritas o se propagan de un lado a otro de la membrana somtica de la neurona, tambin se producen campos magnticos. Estos campos son muy pequeos, pero se han elaborado detectores superconductores (SQUID) capaces de detectar campos magnticos de aproximadamente una milmillonsima parte del tamao del campo magntico de la tierra. La magnetoencefalografa se realiza mediante neuromagnetmetros (instrumentos que contienen varios SQUID dispuestos de manera que un ordenador pueda examinar su emisin y calcular el origen de seales determinadas en el encfalo. Estos equipos pueden utilizarse en la prctica clnica, por ejemplo, para localizar el foco de crisis epilpticas y poder extirparlas quirrgicamente; o bien en experimentos para cuantificar la actividad cerebral regional asociada a la percepcin de diversos estmulos o a la ejecucin de varias conductas o tareas cognitivas.

REGISTRO DE LA ACTIVIDAD METABLICA Y SINPTICA DEL CEREBRO

Si la actividad neural de una regin concreta del cerebro aumenta, el ndice metablico tambin lo hace, en gran medida como consecuencia del mayor funcionamiento de las bombas inicas de la membrana de las clulas. Para estimar el aumento del ndice metablico se inyecta 2-desoxiglucosa (2-DG) radioactiva (azcar que penetra en las clulas junto con la glucosa pero que no se metaboliza) en el torrente circulatorio del animal. Dado que esta sustancia es similar a la glucosa (principal fuente de energa del encfalo) es transportada al interior de las clulas. Las clulas ms activas (consumen ms glucosa) alcanzan la mayor concentracin de 2-DG radioactiva. Como la 2-DG no puede ser metabolizada (la glucosa normal si) queda dentro de la clula. Luego se sacrifica al animal, se extrae su encfalo, se secciona y se prepara para la autorradiografa. Autorradiografa: procedimiento que localiza sustancias radioactivas en una seccin de tejido. La radiacin pone de manifiesto una emulsin fotogrfica o un fragmento de pelcula que recubre el tejido. Podra decirse que es como escribir con la propia radiacin. Sobre un portaobjetos se monta una seccin del encfalo y se lleva a una habitacin oscura, donde se cubre con una emulsin fotogrfica. Semanas despus, se revela la seccin igual que una pelcula fotogrfica. Las molculas de 2-DG radioactiva se ponen de manifiesto como puntos de grnulos plateados, ya que la radioactividad revela la emulsin, tal como lo haran los rayos X o la luz. Las zonas ms activas del encfalo contienen el mayor grado de radioactividad, y esta se manifiesta en la emulsin revelada como puntos oscuros.

Otro mtodo para identificar las regiones activas del encfalo se beneficia del hecho de que cuando las neuronas son estmuladas (por ejemplo, por los botones terminales que establecen sinapsis con ellas) determinados genes del ncleo, a los que se les llama genes de expresin temprana, son activados y se producen protenas especficas. Estas protenas se unen a los cromosomas del ncleo y la presencia de estas protenas nucleares indican que las neuronas acaban de ser activadas. Una de estas protenas nucleares producida durante la activacin neural recibe el nombre de Fos (protena que se produce en el ncleo de una neurona en respuesta a la estimulacin sinptica). Supongamos que queremos utilizar el mtodo Fos para ver que neuronas se activan durante la actividad sexual de una rata hembra. Para ello, se instalan ratas hembras con machos y se les permite aparearse; luego se extrae el encfalo de las ratas, se secciona y se sigue un procedimiento para teir la protena Fos. En la amgdala medial de una rata hembra que acaba de aparearse pueden observarse puntos oscuros, lo que indica la presencia de protena Fos. Parece ser que estas neuronas se han activado debido a la cpula quiz por la estimulacin fsica de los genitales que han tenido las ratas- (si hacemos memoria, cuando se inyect un marcado retrgrado oro fluorado- en el HVM, se encontr que esta regin recibe aferencias de la amgdala medial). La actividad metablica de regiones cerebrales especficas tambin puede estimarse en el cerebro humano utilizando neuroimagen funcional (mtodo computarizado para detectar cambios qumicos o metablicos en regiones concretas del cerebro). Tomografa por emisin de positrones (TEP): Mtodo de neuroimagen funcional que revela la localizacin de un marcador radioactivo en un encfalo vivo. Fue el primer mtodo de neuroimagen inventado. Primero se le inyecta al paciente 2-DG radioactiva (con el tiempo la sustancia se degrada y sale de las clulas. La dosis administrada a los humanos es inocua). Se coloca la cabeza en un aparato similar al TAC, y al descomponerse las molculas radioactivas de 2-DG, emiten partculas subatmicas (positrones), que son detectadas por el equipo de TEP. El ordenador determina cuales son las regiones del encfalo que han absorbido la sustancia radioactiva y crea una imagen de una seccin del encfalo, mostrando el nivel de actividad de diversas regiones de dicha seccin. Un inconveniente es su coste de funcionamiento. Por seguridad, las sustancias radioactivas utilizadas tienen una vida media muy corta se descomponen y pierden su radioactividad rpidamente-. (la vida media de la 2-DG es de 110 minutos y la del agua radioactiva (tambin utilizada para obtener imgenes TEP) es de solo 2 minutos). Teniendo en cuenta su rpida descomposicin, tienen que producirse en el lugar donde se van a utilizar, mediante un acelerador de partculas denominado ciclotrn. Por lo que al coste de la TEP hay que aadirle el del ciclotrn y los salarios del personal que se encarga de l. Otro inconveniente es la relativamente baja resolucin espacial de En la fila superior de estas imgenes de TEP, seccin horizontal, de encfalos humanos las imgenes (la imagen es borrosa). La resolucin temporal tambin pueden verse tras imgenes de una persona en reposo. En la fila inferior, las mismas es baja porque han de obtenerse muestras de los positrones que va personas mientras abran y cerraban el puo derecho. Se observa una elevada absorcin emitiendo el cerebro durante bastante tiempo, lo que implica que de 2-DG radioactiva en las regiones del cerebro encargadas de control del movimiento, lo que indica un alto grado de actividad metablica en dichas reas. Los colores indican probablemente pasen desapercibidos acontecimientos rpidos, diferentes ndices de absorcin. efmeros, que suceden en el cerebro.

En esta RMf del encfalo humano se muestra un aumento localizado del promedio de la actividad de la actividad neural en varones (izquierda) y mujeres (derecha) mientras discernan si un par de palabras escritas rimaba.

Estas desventajas no se dan en la resonancia magntica funcional (RMf): Mtodo de neuroimagen funcional. Es una modificacin del procedimiento de RM que permite calcular el metabolismo regional en el encfalo, por lo general detectando cambios en el nivel de oxgeno en sangre. Es el mtodo con mejor resolucin temporal y espacial. La actividad cerebral se evala indirectamente al detectar los niveles de oxgeno en los vasos sanguneos del encfalo. El aumento de actividad de una regin del encfalo estimula el aporte sanguneo a dicha regin, lo que eleva el nivel de oxgeno en sangre local. El trmino tcnico para referirse a este tipo de exploracin es BOLD (seal dependiente del nivel de oxgeno en sangre). La RMf tiene una resolucin mayor que la TEP y la exploracin se puede realizar mucho ms rpida, por ello proporciona una informacin ms acerca de la actividad en una regin determinada del cerebro. Pero la exploracin con TEP ofrece algo que la RMf no puede: estima la concentracin de determinadas sustancias qumicas en diversas partes del encfalo.

ESTIMULACIN DE LA ACTIVIDAD NEURAL

A veces lo que queremos es cambiar artificialmente la actividad de ciertas regiones para observar qu efectos tienen esos cambios en la conducta del animal. Ejemplo, las ratas hembra copularn con ratas macho solo si ciertas hormonas sexuales femeninas estn presentes, pero si se extirpan los ovarios de la rata, la prdida de esas hormonas suprimir su conducta sexual. Hemos visto que la lesin del HVM altera esa conducta. Tal vez si se activa el HVM se compensa la falta de hormonas sexuales femeninas y la rata vuelve a copular.

Estimulacin elctrica y qumica

Las neuronas se pueden activar mediante estimulacin elctrica y qumica. La estimulacin elctrica implica solamente pasar una corriente elctrica a travs de un cable insertado en el encfalo. La estimulacin qumica se efecta por lo general inyectando en el encfalo una pequea cantidad de un aminocido (Aa) excitador como el cido canico o el cido glutmico (glutamato). Este ltimo es el principal neurotransmisor excitador que se encuentra en el encfalo. Ambas sustancias estimulan los receptores glutamanrgicos, activando as las neuronas en las que se localizan estos receptores. Mediante un dispositivo permanente en el crneo (cnula gua de metal en el encfalo, sujeta al crneo con cemento), se pueden inyectar sustancias en el encfalo cuando queramos y as poder observar la conducta del animal (con libertad de movimientos) en repetidas ocasiones. Inconveniente: Ms compleja (se requieren cnulas, bombas, soluciones esterilizadas de Aa exvitadores) que la elctrica. Ventaja: Activa los somas celulares pero no los axones. Como solo los somas celulares (y sus dendritas) contienen receptores glutaminrgicos, se puede estar seguro de que la inyeccin de un determinado Aa excitador en una determinada regin del cerebro excita las clulas all localizadas, pero no los axones que casualmente pasan por esa regin. Es decir, los efectos de la estimulacin qumica son ms circunscritos que la elctrica.

El ac. Clnico, que hemos visto antes como una neurotoxina, tambin puede utilizarse para estimular las neuronas (produce lesiones excitotxicas al estimular las neuronas hasta destruirlas. Dosis altas de una solucin concentrada destruyen las neuronas; dosis bajas de una solucin diluida solo las estimula). En el experimento que comentbamos, la estimulacin del HVM sustituye la accin de las hormonas sexuales femeninas. Es decir, quiz las hormonas sexuales femeninas ejerzan sus efectos en dicho ncleo. La estimulacin de una regin especfica del cerebro con electricidad o sustancias qumicas excitadoras afecta a muchos tipos diferentes de neuronas, y no es probable que el resultado sea similar a la actividad cerebral normal, que implica la activacin y la inhibicin coordinada de muchas neuronas diferentes. Lo ideal sera estimular o inhibir los grupos neuronales que nos interesan en una regin dada del cerebro.

Fotoestimulacin
Los ltimos avances estn proporcionando los medios para estimular o inhibir tipos especficos de neuronas en regiones especficas del encfalo. En muchos organismos (incluso unicelulares) han evolucionado protenas fotosensibles. Una de ellas, la rodopsina-canal-2 (ChR2), que se encuentra en las algas verdes, controla un canal inico que, cuando se abre, permite el flujo a travs de ella de iones de sodio, potasio y calcio. Cuando una luz azul incide en el canal inico de ChR2 se abre, y la corriente de iones Na y Ca cargados positivamente despolariza la membrana. Otra protena fotosensible, Natronomonas pharaonis halorhodpsin (NpHR), se encuentra en una bacteria y controla un transportador que ingresa cloruro dentro de la clula cuando es activada por una luz amarilla. Esta entrada de iones cargados negativamente hiperpolariza la membrana. La accin de ambas protenas fotosensibles comienza y termina muy rpidamente cuando se enciende y apaga una luz de longitud de onda apropiada. Se puede introducir ChRH2 y NpHR en neuronas incorporando los genes que las codifican al genoma de virus inocuos. Luego se inyectan los virus en el cerebro, infectan a las neuronas y comienzan a expresarse las protenas, que estn insertadas en la membrana de la clula. Los genes se pueden modificar de manera que las protenas se expresen solo en tipos especficos de neuronas. As, se puede observar los efectos de activar o desactivar tipos especficos de neuronas en una regin concreta del encfalo. Como ChR2 y la NpHR son activadas por la luz, es necesario que la luz penetre en el cerebro. Si las neuronas que expresan estas protenas fotosensibles se localizan en la corteza cerebral, se puede taladrar un pequeo orificio en el crneo y adherir sobre l diodos emisores de luz (DEL). Para activar las protenas fotosensibles en las membranas de neuronas situadas profundamente en el encfalo, se pueden implantar fibras pticas mediante ciruga estereotxica, como si fueran electrodos o cnulas, y la luz se transmite mediante dichas fibras.
Pueden insertarse protenas fotosensibles en membranas neurales mediante virus con modificacin gentica. (a) la luz azul hace que los canals inicos ChR2 despolaricen la membrana y la luz amarilla que los transportadores NpHR la hiperpolaricen. (b) efectos de diferentes longitudes de onda de luz sobre el potencial de membrana al actuar sobre las protenas ChR2 o NpHR. (c) Los pulsos de luz azul (flechas azules) produjeron potenciales de accin; los de luz amarilla, los efectos inhibidores de la hiperpolarizacin.

Actualmente se estudia el posible uso clnico de las protenas fotosensibles. Bi y su equipo utilizaron un virus para insertar genes de ChR2 en las clulas ganglionares de la retina de una cepa de ratones ciegos cuya retina careca de fotorreceptores. Las clulas ganglionares de la retina son neuronas que reciben informacin de los fotorreceptores y transmiten esta informacin por el nervio ptico a los circuitos cerebrales implicados en la visin. Bi encontr que las clulas ganglionares se hacan sensibles a la luz: al estimular la retina con un destello de luz azul se registraban potenciales elctricos en la corteza visual; la retina contiene muchos circuitos neurales que analizan la informacin procedente de los fotorreceptores antes de que sta se enve a travs del nervio ptico a otras partes del cerebro, de modo que el simple hecho de hacer sensibles a la luz a las clulas ganglionares no garantiza que la ceguera causada por la falta de fotorreceptores restaure el diseo de la visin. Sin embargo, administrar selectivamente ChR2 y NpHR a tipos especficos de neuronas de la retina puede llevar finalmente al desarrollo de medios para tratar algunos tipos de ceguera. Otros posibles usos clnicos de las protenas fotosensibles estn relacionados con el tratamiento de enfermedades neurolgicas como el Parkinson.

Estimulacin magntica transcraneal

La actividad neural induce campos magnticos que pueden detectarse mediante mediante magnetoencefalografa. De modo parecido, pueden emplearse campos magnticos para estimular neuronas induciendo corrientes elctricas en el tejido cerebral. La estimulacin magntica transcraneal (EMT): estimulacin de la corteza cerebral mediante campos magnticos, que se producen aplicando pulsos elctricos mediante una bobina electromagntica (generalmente en forma de ocho) situada cerca del crneo (en la parte superior, de modo que el punto de cruce del ocho se localice justo encima de la regin que se quiere estimular). Interfiere en la funcin de la regin cerebral que se estimula. Es decir, induce actividad elctrica en la corteza cerebral humana, que altera temporalmente el funcionamiento de los circuitos neurales que se localizan all. Los efectos de la EMT son muy parecidos a los de la estimulacin directa del encfalo al descubierto. Ej, la estimulacin de una regin especfica de la corteza visual de asociacin altera la capacidad para detectar el movimiento de los estmulos visuales). La EMT, se ha utilizado para trata sntomas de trastornos mentales como la depresin.

3. MTODOS NEUROQUMICOS
A veces, en vez de la actividad metablica de una regin del encfalo, nos interesa la localizacin de neuronas que tengan un tipo especfico de receptores o que produzcan un tipo especfico de neurotransmisores o neuromoduladores; o podramos querer estimar la cantidad de sustancias qumicas que segregan las neuronas de una regin determinada del encfalo en determinadas circunstancias. Pues bien, los mtodos neuroqumicos pueden utilizarse para determinar la localizacin de una enorme variedad de sustancias qumicas en el encfalo. Con ellos se pueden identificar las neuronas que segregan un neurotransmisor o un neuromodulador determinado y aquellas que tienen receptores que responden a la presencia de estas sustancias.

DETECCIN DE NEURONAS QUE PRODUCEN SUSTANCIAS NEUROQUMICAS ESPACFICAS

Si sabemos que una sustancia qumica afecta a la conducta y queremos saber que circuitos neurales son los responsables de los efectos de la sustancia; lo vemos con un ejemplo: ciertos granjeros expuestos a determinados insecticidas (organofosfatos) tenan ensueos particularmente intensos y extraos, e incluso alucinaciones despiertos. Una posible explicacin es que la sustancia estimula los circuitos neurales que controlan la fase REM del sueo (es donde ocurren principalmente los ensueos que no son ms que alucinaciones dormidos-). Los organofosfatos inhiben la acetilcolinesterasa (AChE). Las sustancias que inhiben la AChE son potentes agonistas colinrgicos. Al inhibir la AChE, frenan la rpida destruccin de ACh despus de que haya sido liberada por los botones terminales, y as prolongan el tiempo durante el que se producen potenciales postsinpticos en la sinapsis colinrgicas. Es decir, estas sustancias actan a nivel de las sinapsis colinrgicas. Existen tres mtodos neuroqumicos que podemos utilizar para descubrir el lugar de accin de estas sustancias en el encfalo: Podemos buscar neuronas que contienen acetilcolina, buscar la enzima acetilcolinesterasa (presente en las membranas postsinpticas de las clulas que reciben aferencias sinpticas de las neuronas colinrgicas) o bien, buscar receptores de acetilcolina. Mtodos mediante los que localizamos sustancias neuroqumicas especficas, como los neurotransmisores y los neuromoduladores (ej, la acetilcolina). Existen tres formas: Localizar las sustancias mismas, localizar las enzimas que las sintetizan o localizar el ARN mensajero involucrado en su sntesis. Los pptidos (o las protenas) pueden localizarse directamente por mtodos inmunocitoqumicos (se exponen secciones de tejido cerebral a un Ac para el pptido, asociado a un tinte, y despus se examina al microscopio las secciones utilizando una luz de una determinada longitud de onda). Esto podramos hacerlo con la vasopresina (neurotransmisor peptdico). Pero la acetilcolina no es un pptido, as que no podemos utilizar mtodos inmunocitoqumicos para localizar este neurotransmisor, pero s para localizar la enzima que lo sintetiza. La sntesis de acetilcolina se logra gracias a la enzima colina acetiltransferasa (ChAT). Casi con toda seguridad, las neuronas que contienen esta enzima segregan ACh. Otra tcnica indirecta de localizar una sustancia es la hibridacin in situ: produccin de ARN complementario de un ARNm determinado con el fin de detectar el ARNm. Todos los pptidos y protenas (incluidas todas las enzimas) se sintetizan conforme a la informacin contenida en los cromosomas. Cuando se sintetiza una protena concreta, se copia la informacin necesaria de un cromosoma en un segmento de ARNm, el cal sale del ncleo y se desplaza hasta los ribosomas, donde tiene lugar la sntesis de protenas.

La frmula (estructura qumica) de la protena est codificada en trminos de una secuencia especfica de bases de nucletidos que componen el ARN mensajero. En la mayora de los casos se conoce este cdigo, as que se puede sintetizar un segmento de ARN radioactivo que contiene una secuencia de nucletidos complementaria de la secuencia del ARNm. Las secciones de tejido cerebral se exponen al ARN radioactivo, que se adhiere a las molculas del ARNm apropiado. Despus se utiliza la autorradiografa para poder ver donde se localiza el ARNm y, por deduccin, la de las clulas que producen la protena cuya sntesis inicia el ARN. Como hemos visto, los pptidos y las protenas pueden localizarse directamente, mediante mtodos inmunocitoqumicos: se expone un tejido a un Ac que est unido a una molcula que se hace fluorescente bajo una luz de una determinada longitud de onda. Tambin puede detectarse otras sustancias mediante localizacin inmunocitoqumica de una enzima que se requiere para su sntesis. As mismo, los pptidos y las protenas pueden localizarse por medio del mtodo de hibridacin in situ, el cual revela la presencia de ARN mensajero que dirige su sntesis.

LOCALIZACIN DE RECEPTORES ESPECFICOS

Los neurotransmisores, neuromoduladores y hormonas transfieren sus mensajes a las clulas sobre las que actan unindose a receptores. Procedimientos para localizar los receptores de sustancias neuroqumicas: 1) Autorradiografa: se exponen secciones de tejido cerebral a una solucin que contiene un ligando radioactivo para un receptor especfico. Despus se enjuagan las secciones, quedando nicamente la radioactividad en las molculas del ligando que se ha unido a sus receptores. Luego con mtodos autorradiogrficos se localiza el ligando radioactivo y, por lo tanto, los receptores (ej, se puede baar una seccin del encfalo de una rata con una solucin con morfina radioactiva, que se une a los receptores para los opiodes del encfalo). 2) Inmunocitoqumica: los receptores son protenas y, por lo tanto, se pueden producir Anticuerpos frente a ellos. Se exponen las secciones de tejido cerebral al Ac adecuado (marcado fluorescentemente) y se observan las secciones al microscopio con una luz de una determinada longitud de onda. Es decir, mediante la autorradiografa se pone de manifiesto la distribucin de un ligando radioactivo, al cual se ha expuesto el tejido; mediante la inmunocitoqumica se detecta la presencia de los receptores mismos, que son protenas. Combinando mtodos de tincin se pueden localizar neuronas que tienen un receptor determinado o un pptido determinado y que asimismo establecen conexiones con regiones determinadas del encfalo.

Podemos aplicar el mtodo de localizacin de receptores en el ejemplo que vimos antes: funcin del HVM en la conducta sexual de las ratas hembra. Las lesiones o extirpacin del HVM abolen esta conducta; pero puede activarse estimulando el HVM elctricamente o con Aa excitadores. Esto sugiere que las hormonas sexuales producidas por los ovarios actan sobre las neuronas del HVM. Podramos hacer dos experimentos: Inyectar una pequea cantidad de hormona sexual adecuada en el HVM de ratas hembra cuyos ovarios se han extirpado. Resultado: la hormona reactiva la conducta sexual del animal. Utilizar la autorradiografa para localizar los receptores de la hormona sexual. Para ello se expondran secciones del encfalo de la rata a la hormona radioactiva. Se enjuagaran y se efectuara la autorradiografa. Resultado: encontraramos radioactividad en el HVM. Si se comparan las secciones cerebrales de las ratas macho y hembra, se observa un mayor nmero de receptores hormonales en las hembras. Tambin se podra recurrir a la inmunocitoqumica para localizar los receptores de las hormonas, obteniendo los mismos resultados.

ESTIMACIN DE LAS SUSTANCIAS QUMICAS QUE SEGREGA EL ENCFALO

La cocana, bloquea la reabsorcin de la dopamina, lo que sugiere que la concentracin extracelular de dopamina aumenta en ciertas regiones del encfalo al consumirla. Para estimar la cantidad de dopamina en una regin determinada del encfalo, se utiliza la microdilisis. La estimacin de las secreciones de neurotransmisores y neuromoduladores se puede realizar mediante la microdilisis. Microdilisis: procedimiento para analizar las sustancias qumicas que se hallan en el lquido intersticial gracias a un pequeo tubo hecho con una membrana semipermeable, que se implanta en el encfalo. Mediante la dilisis se separan sustancias con una membrana artificial que es permeable a unas molculas y no a otras. Una sonda de microdilisis consta de una pequea cnula metlica con la que se introduce una solucin en una seccin del tubo de dilisis fragmento de membrana artificial con forma de cilindro, sellada en su parte inferior-. Mediante una segunda cnula metlica se retira la solucin despus de que haya circulado a travs de la bolsa. Para colocar el extremo de la cnula en el lugar que nos interesa, se utiliza ciruga estereotxica. Luego se bombea una solucin similar al lquido extracelular a travs de una de las pequeas cnulas metlicas en el tubo de dilisis, el lquido circula por este y atraviesa la segunda cnula metlica, de la cual se recoge para analizarlo. A medida que el lquido circula por el tubo de dilisis va recogiendo molculas procedentes del lquido extracelular del encfalo, las cuales son impulsadas a travs de la membrana por la fuerza de difusin. Luego se analiza el lquido que ha circulado por tubo de dilisis.

Es un mtodo tan sensible que puede detectar neurotransmisores (y sus productos de degradacin) que han sido liberados por los botones terminales y desde el espacio sinptico se han dispersado en el resto del lquido extracelular. La cantidad de dopamina en el lquido extracelular del ncleo accumbens (en el prosencfalo basal), aumenta al inyectar cocana a la rata; y tambin cuando se inyecta cualquier droga adictiva, e incluso cuando el animal realiza una actividad placentera como comer, beber, tener relaciones sexuales. Todo esto indica que la liberacin de dopamina en el ncleo accumbens juega un papel en el refuerzo. En casos excepcionales (determinacin de sustancias qumicas en el cerebro de personas con una hemorragia cerebral o traumatismo craneoenceflico) se ha utilizado la microdilisis en humanos, pero no con fines de investigacin. Se puede emplear una exploracin con TEP para llevar a cabo observaciones similares en el cerebro humano: se inyecta al sujeto un marcador radioactivo, tal como una droga que se une con un receptor determinado o una sustancia qumica que se incorpora a un neurotransmisor determinado, y posteriormente una exploracin TEP revela la localizacin del marcador en el cerebro. El equipo de TEP, se utiliza para localizar cualquier sustancia radioactiva que emita positrones. Es caro, pero es un medio no lesivo de estudiar sustancias neuroqumicas en cerebros humanos (leer el caso del inicio del tema).

4. MTODOS GENTICOS OK
Toda conducta est determinada por interacciones entre el cerebro y el entorno. Muchas caractersticas comportamentales (talento, variables de personalidad, trastornos mentales) parecen venir de familia, sugiriendo que el factor gentico puede ser importante en el desarrollo de diferencias fisiolgicas que, en ltima instancia son responsables de dichas caractersticas. A veces, la relacin gentica es clara (un gen defectuoso interfiere en el desarrollo cerebral, y una anomala neurolgica provoca alteraciones comportamentales), en otros casos, la relacin entre herencia y conducta es ms sutil, y para evidenciarla han de emplearse mtodos genticos especiales. Dado que los genes dirigen el desarrollo de un organismo, los mtodos genticos son tiles en los estudios de la fisiologa de la conducta.

ESTUDIOS CON GEMELOS

Para evaluar la influencia de la herencia en un rasgo concreto, es eficaz comparar el ndice de concordancia de este rasgo en pares de gemelos monocigticos y dicigticos. Los gemelos monocigticos (univitelinos) tienen un genotipo idntico (sus cromosomas y genes que contienen son iguales). Los gemelos dicigticos (bivitelinos) tienen una semejanza gentica en torno al 50%. Se estudian historias clnicas para identificar pares de gemelos en los que al menos uno de ellos tenga el rasgo (ej, diagnostico de un determinado trastorno mental). Si ambos gemelos lo padecen se dice que son concordantes, si solo uno ha recibido el diagnostico son discordantes. Si un trastorno tiene una base gentica, el porcentaje de gemelos monocigticos que son concordantes en cuanto al diagnostico ser superior al de los dicigticos. (ej, el ndice de concordancia para la esquizofrenia en gemelos es al menos cuatro veces mayor en los monocigticos que en los dicigticos; dato que prueba que la esquizofrenia es un rasgo hereditario). En estudios con gemelos se ha encontrado que los factores genticos influyen en muchas caractersticas individuales (personalidad, obesidad, incidencia de alcoholismo, trastornos mentales).

ESTUDIOS SOBRE ADOPCIN

Es otro mtodo para evaluar el carcter hereditario de un rasgo de comportamiento concreto. Se compara a individuos adoptados durante la infancia con sus padres biolgicos y adoptivos. Los rasgos de comportamiento estn influidos por factores genticos, ambientales y una interaccin entre ambos. Los factores ambientales son tanto de tipo social como biolgico (ej, factores prenatales ambientales: salud de la madre; factores postnatales ambientales: dieta del nio, atencin mdica, entorno social). Si se adopta un nio, los factores genticos estarn asociados a los padres biolgicos, los factores ambientales prenatales con la madre biolgica, y la gran parte de los ambientales postnatales con los padres adoptivos. Estos estudios requieren conocer la identidad de los padres biolgicos y adoptivos para evaluar los rasgos comportamnetales. Si los individuos estudiados se parecen a sus padres biolgicos el rasgo probablemente est influido por factores genticos. Para asegurarse, se han de descartar posibles diferencias en el entorno prenatal de los nios adoptados.

Si los nios se parecen a sus padres adoptivos, se concluye que el rasgo est influido por factores ambientales. Si hay semejanzas con los dos, probablemente el rasgo estar influenciado tanto gentica como ambientalmente.

MUTACIONES DIRIGIDAS
Consisten en la alteracin de un gen gen Knockout (gen suprimido) en el laboratorio y su insercin en los cromosomas de un ratn. Estos genes mutados son defectuosos (no pueden producir una protena que sea funcional). Las mutaciones dirigidas permiten a los neurocientficos estudiar los efectos de la falta de una protena concreta (ej, una enzima, o una protena estructural o un receptor) sobre las caractersticas fisiolgicas y comportamentales de un animal. En ocasiones el objetivo de la mutacin es una enzima que controla una reaccin qumica especfica (ej, la falta de una enzima determinada interfiere en el aprendizaje, lo que sugiere que la enzima es, en parte, responsable de los cambios en la estructura de sinapsis necesarios para el aprendizaje. En otros casos el objetivo de la mutacin es una protena que por s sola desempea una importante funcin en la clula (ej, un tipo concreto de receptor para los opioides interviene en los efectos reforzantes y analgsicos de estos). Los investigadores pueden incluso producir knockouts condicionales que provocan que los genes del animal dejen de expresar un determinado gen cuando se le suministra una determinada droga, lo que permite que el gen objetivo o sobre el que se acta se exprese normalmente durante el desarrollo del animal y posteriormente sea suprimido. Los investigadores pueden asimismo valerse de mtodos de ingeniera gentica para insertar genes en el ADN del ratn, genes que pueden dar lugar a un aumento de la produccin de protenas que se encuentran normalmente en la especie husped o pueden producir protenas completamente nuevas.

OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO
Otro mtodo gentico implica la produccin de molculas que bloquean la produccin de protenas codificadas por determinados genes mediante la inyeccin de oligonucletidos antisentido (o de hebra complementaria). El tipo ms frecuente de oligonucletidos antisentido son cadenas modificadas de ADN o de ARN que se unirn con molculas especficas de ARN mensajero e impiden que produzcan su protena. Una vez bloqueadas las molculas de ARNm, son destruidas por enzimas que hay en la clula. El trmino antisentido se refiere a que los oligonucletidos sintticos contienen una secuencia de bases complementarias a las que contiene un gen determinado o molcula de ARNm (este mtodo se parece al utilizado en la hibridacin in situ).

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