Analyse Bacteriologique Des Denrees Alimentaires

ANALYSE BACTRIOLOGIQUE DES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI
DJAMAL
DIFFERENTES METHODES DANALYSE
ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES ALIMENTS:
Buts de lanalyse? Paramtres recherchs? Dnombrement des micro-organismes? Dfinition des germes recherchs?
Buts de lanalyse?
Rechercher et dnombrer les micro-organismes:
Qualit marchande
Germes qui provoquent laltration de laliment. Saveur, odeur
Qualit hyginique Germes potentiellement pathognes qui provoquent l'intoxication alimentaire.
3 groupes de germes recherchs:

Germes capables d altrer la qualit marchande de l aliment.
Moisissures et Pseudomonas
Germes potentiellement pathognes pour le consommateur.

Salmonella ,Listria
Tmoins de contamination fcale.

Coliformes
Dnombrement des micro-organismes?
Interprtation des rsultats

Plan 2 classes
2 plans sont dsigns

Plan 3 classes
pour faire lanalyse bactriologique des aliments?
Rfrentiels
Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF EN ISO 6887-1 relative la suspension mre et dilutions dcimales;1.rgle gnrale. Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF ISO 7218 :rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
La prise dessai:
A - cas de produit solide (exemple:
fromage, viande.). B -cas de produit liquide (exemple: lait pasteuris, jus..).
A- Cas de produit solide.

Peser dans un sachet strile 3 25 gr du produit analyser aseptiquement.
25 gr
La 1re pese servira au contrle bactriologique. La seconde servira la recherche des Salmonella. La troisime servira la recherche de Listria.
BALANCE
a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:

Verser le TSE dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon de TSE.
BROYEUR
DE TYPE
STOMACHER
225 ml
TSE
(suspension mre) 10
b- La prise dessai pour la recherche des Salmonella et des Listria.

Verser lEau Peptone Tamponne(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listria) dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans les flacons respectives.
BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml 225 ml
Eau Peptone tamponne
Bouillon Fraser
B Cas de produit liquide:

a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:
Faire un mlange de 3 5 units du produit analyser.
Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris
+1
Suspension mre
b- La prise dessai pour les recherches des Salmonella et des Listria.

Prlever 225 ml de la Suspension mre.
5
ml
25 ml
25 ml
+1
FRASER
Eau pepton peptone tamponn tamponne
Listria
Salmonella
PRPARATION DES DILUTIONS DCIMALES

a - cas de produit solide. b - cas de produit liquide.
a - Cas de produit solide:

Introduire 1 ml de la suspension 10 dans 9 ml de TSE. Mlanger,puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE.
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml de TSE
10
10
10
Suspension mre
b - Cas de produit liquide:

Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE. Mlanger,puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE,mlanger, puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10.
1 ml 1 ml
10
1 ml
9 ml de TSE
10
1 ml
9 ml de TSE
10
+1
suspension Solution mre mre
PARAMETRES RECHERCHES
Recherche et dnombrement des microorganismes totaux (Flore msophile). Recherche et dnombrement des levures et moisissures. Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et EscherichiaColi. Recherche et dnombrement des Anarobies Sulfito Rducteurs 37 C. Recherche et dnombrement de Clostridium Perfringens 46 C. Recherche et dnombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles. Recherche de Listria.
JOUR DES TARVAUX PRATIQUES
er 1
AZIZI
DJAMAL
RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL
Dfinition de la Flore Msophile Arobie Totale
Dfinition:
La Flore Msophile Arobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d'valuer le nombre d'UFC (Unit Formant une Colonie) prsentes dans un produit. Ce dnombrement se fait 30 C ce qui permet de dnombrer trois grands types de flore : la flore thermophile, temprature optimale de croissance 45 C; la flore msophile, temprature optimale de croissance entre 20 C et 40 C; la flore psychrophile, temprature optimale de croissance 20 C.
Rfrentiels
Norme NF 08 051 relative au dnombrement des micro organismes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF V 08 002:Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Milieu utilis:
Glose PCA
(Plate Count Agar)
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions.

1 ml
ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10
10
10
Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.
Couler la glose PCA 15 ml refroidie 45 C. Mlanger et laisser solidifier.

A PC
PC A
10
10
10
Couler une deuxime couche de glose blanche 5 ml. Laisser solidifier.

SE GELO HE C N BLA
GE O L SE BLAN CHE
10
10
10
Incuber les boites couvercle en bas 72 3h 30 C.
Incuber 72h 30C
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL
Dfinition des coliformes totaux:
Dfinition :
Les coliformes totaux sont des bactries en forme de btonnet arobies ou anarobies facultatives possdant lenzyme - galactosidase permettant lhydrolyse du lactose 35 C avec production de gaz Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella et Serratia
coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux
Dfinition:
Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44 C
Dfinition d Escherichia coli
Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44 C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects
Milieu utilis:
VRBL:
glose au cristal
Violet et au Rouge neutre Bilie Lactose

(autres que les produits laitiers)
DESOXYCHOLATE 1
(pour les produits laitiers)
AZIZI
DJAMAL
Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30 C. Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016). Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Rfrentiels
Norme NF V 08-051:dnombrement des coliformes par comptage des colonies,mthode de routine. Norme NF V 08-017:dnombrement des coliformes fcaux et dEschrichia Coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016). Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08-102:rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats:cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Inoculer 2 sries de boites avec 1 ml des diffrentes dilutions.

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10 10
10 10
10 10
Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.
Couler une couche de glose de dsoxycholatee 1 ou VRBL 15 ml, refroidie la temprature 451 C. Mlanger et laisser solidifier.
Y- E OX AT S L DE O
CH 1
DE C SO H OL XYAT 1 E
Couler une 2me couche de glose blanche ou de dsoxycholatee 1 ou de VRBL 4ml. Laisser solidifier.
glose blanche
glose blanche
Incuber une srie de boites 24-48 h 37 C pour la recherche des coliformes totaux. Incuber lautre srie 44 C pour la recherche des coliformes thermo tolrants et Escherichia coli.
Co4-48 lif o h rm es 37C tot aux
2 4Co lifo 4 8h rm es 4 4 fc C au x
RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Milieu utilis:
Glose Baird Parker
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
DEFINITION:
microorganismes de forme sphrique cooci Gram positif halophiles c'est--dire cultivent en prsence de 5 % de NaCl possdent une catalase
(se multiplier dans des salaisons, ou en surface de poissons sals.
Certaines espces psychrotrophes se dveloppent sur des aliments rfrigrs Certaines espces osmophiles se multiplient dans des produits sucrs exemple laits concentrs sucrs). .
Rfrentiels
Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S.aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos de Baird Parker. Norme NF V 08 057 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37 C 1: technique avec confirmation des c olonies. Norme NF V 08 057 2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37 C 2: technique sans confirmation des c olonies. Norme NF ISO 6888 -2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S.aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos au plasma de lapin et au fibrinogne. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Prparation du milieu Baird Parker:

Ajouter au milieu de base Baird Parker 15 ml de la solution jaune duf au tellurite de potassium
15 ml
de
JAUNE
DOEUF
TELLERUTE de POTASSIUM
au
Glose BAIRD PARKER
Couler la glose dans des boites de ptri et conserver +4 C.
Inoculer les boites avec 0,1 ml des diffrentes dilutions

1
ml
ml
ml
0,1 ml
0,1 ml
0,1 ml
10
10
10
taler les gouttes laide dune pipette rteau
10
10
10
Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h 2 37 C
Incuber 48h 2 37C 1re lecture 24h 2
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
les levures et les moisissures

Ce sont des champignons
les levures:
la forme unicellulaire est prdominante la forme la plus frquente est ovalaire ou sphrique
les moisissures:
Sont des micro-organismes filamenteux qui sont dissmins par lmission de spores
Rfrentiels
Norme XP V 08 059 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C. Norme NF ISO 7954 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Milieu utilis:
Sabouraud au Chloramphnicol
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Ensemencer les boites comme lindique le schma.

1
ml
0,2 ml
1
ml
0,2 ml 0,2 ml
TEMOIN DILUANT
ml
0,2 ml
TEMOIN MILIEU
ml
10
10
10
Ne pas ensemencer la boite tmoin
taler les gouttes laide dune pipette rteau.
Tmoin diluant
10
10
10
Incuber les boites de Sabouraud au Chloramphnicol couvercle en haut 5 jours 25 C.
Incuber 3 5 jours 25C Lecture tous les jours.
RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37 C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

Rfrentiels
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine. Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Milieu utilis:
Glose Viande Foie
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Chauffer 100C pendant 5;puis refroidir rapidement leau de robinet :

10- 10-
15 mn 75 C 10 mn 80 C
100C
Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:
10-
10-
10-
10-
Couler 15 ml de la glose VF additionne d1ampoule de Sulfite de Na et 1 ampoule dAlun de Fe:
10-
10-
10-
10-
Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier.
10-
10-
10-
10-
Incuber 48 h 37 C
RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

SALMONELLA
Entrobactrie Bacilles Gram ngatif, Mobile (ciliature pritriche), Aro-anarobie facultatif, Oxydase Fermentative du glucose, Lactose
flagelles
Responsable de toxi-infection alimentaire
Rfrentiels
Norme NF V 08 6- 052 relative la mthode de routine pour la recherche des Salmonella. Norme EN 12824 relative la recherche des Salmonella. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
A- Cas de produit solide.

Peser dans un sachet strile 25 gr du produit analyser aseptiquement.
25 gr
BALANCE
Verser lEau Peptone Tamponne dans le sachet strile contenant 25 gr de produit Broyer laliment. Verser le contenu dans le flacon dE.P. Tamponne.
Eau Pepton Peptone tamponn tamponne
flacon de 225 ml
B - Cas de produit liquide.

25 ml
1
ml
Prlever 25 ml de la Suspension mre
Introduire dans 225 ml dEau Peptone Tamponne
(+1) +1
Eau
Pepton Peptone tamponn tamponne
tape de pr- enrichissement
Incuber la solution ensemence dEau Peptone Tamponne
INCUBER 16- 20h 37C
me 2
AZIZI
DJAMAL
re 1
Lecture
24h dincubation
Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30 C
AZIZI DJAMAL
Lecture des coliformes totaux

Glose VRBL
Dnombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.
Colonies rouges
Colonies rouges
Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150. Appliquer cette formule:
N
c :
1,1 x d
c 1 + c 2 (c 1 = nombre de colonies de la 1re dilution et c 2 = nombre de colonies de la 2me dilution retenues). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.
= nombre de
coliformes totaux / gr ou ml.
Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:
N=
c D
nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml
D : - taux de dilution de la suspension mre

(produits solide)
- Inverse de la 1re dilution

(produit liquide)
Lecture des coliformes totaux et fcaux

Glose dsoxycholate 1
(produits laitiers)
Exposer la boite sous radiation UV Lecture immdiate dans une chambre noire Dnombrer les colonies fluorescentes
Lampe UV
Dnombrer les colonies rouges fluorescentes qui poussent en masse , noter les dilutions et les tempratures correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.
Colonies fluorescentes
Colonies rouges
N
c :
1,1 x d
c1 + c2 (c = nombre de colonies de la 1 re 1 dilution et c = nombre de colonies de la 2me 2 dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.
= nombre de coliformes totaux
ou coliformes fcaux / gr ou ml
N=
c D
nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml

(produits solide)

(produit liquide)
Recherche et dnombrement dEschrichia Coli
Repiquer 3 5 colonies caractristiques sur le milieu Ure Indole
Coliformes thermotolrants
Ensemencer le milieu Ure Indole.
Incuber le milieu Ure Indole ensemenc 24 h 37 C
UREE
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Lecture des staphylocoques

1re lecture
Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes
Colonies caractristiques (halo) Colonies non caractristiques
rincuber les boites 48 h

Lecture des ASR

re 1
lecture
16h dincubation
Dnombrer les colonies qui poussent en profondeur
1 cm
10- 10-
10-
10-
rincuber 48 h 37 C

tape denrichissement
ENSEMENCER UN BOUILLON SFB: 100 ml

Additionn de 20 disques de slnite
SFB
D/C
Flacon dEau Peptone pr enrichie
Incuber 18 24h 37 C
me 3
AZIZI
DJAMAL
me 2
Lecture
48h dincubation
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30 C
Lecture des coliformes fcaux(E. coli)
Lecture du milieu Ure Indole

KOVACS KOVACS
Production dindole = formation dun anneau rouge.
indole -
indole +
E.Coli: ure Indole +
Lecture et interprtation.
Formule: a = b x A b : Nombre de colonies caractristiques indole + c : Nombre total de colonies caractristiques sur la boite. A :Nombre de colonies caractristiques repiqus. a : Nombre dEscherichia Coli identifis par boite. c
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150. Appliquer cette formule: a
a=
1,1 x d Nombre dEscherichia Coli identifis.
d : le taux de dilution correspondant la 1re dilution retenue.
N = nombre dEscherichia Coli /gr ou

ml.
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Lecture et identification des staphylocoques pathognes

- 2me lecture 48h - tests de confirmation
Colonies caractristiques (halo) Colonies non caractristiques
15 X 150 pour 2 dilutions successives.
Recherche de la catalase puis de la coagulase

COAGULASE
CATALASE
Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie
Apparition de bulles dair.

Observation loeil nu ou au microscope.
Raction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cur cervelle.
BOUILLON COEUR CERVELLE
Incuber 20-24h 37 C

Lecture des ASR

me 2
lecture
48h dincubation
Dnombrer les colonies noires qui poussent en profondeur
1 cm
10- 10-
10-
10-
Dnombrer les colonies caractristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamtre
ASR
colonie
Calcul:
(x1 + x
2
) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2me dilution
C= 2 Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r = 2me = 3me = 4me tube tube tube tube

Recherche des Salmonella

tape disolement
glose hektoen
Isoler par des stries :

Ensemencer une boite de glose Hektoen partir du bouillon SFB
Additionn de 2 disques de slnite
10 ml
Anse de platine
SFB
D/C
SFB D/C
Incuber 18- 24h 37C
18-24 h 37 C
me 4
AZIZI
DJAMAL
me 3
Lecture
72h dincubation
Germes totaux
Germes totaux
Rincuber 30 C
N
c :
1,1 x d
c 1 + c 2 (c 1 = nombre de colonies de la 1re dilution et c 2 = nombre de colonies de la 2me dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.
= nombre de
micro-organismes /gr ou ml
N=
c D
/ gr ou ml

(produits solide)

(produit liquide)
Identification des staphylocoques pathognes
b- recherche de la coagulase libre:

0,1 ml
Plasma de lapin
0,3 ml
Incuber 24h 37 C
1re lecture aprs 6h dincubation.


tape didentification
repiquage sur TSI
Lecture de la boite Hektoen

Colonies ayant un contour rgulier. Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la glose Hektoen. Colonies typiques
Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI

Stries Anse de platine
faire une piqre centrale.
Isoler par des stries
Incuber 24h 37 C
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Lecture des levures et moisissures
levures
Aspergillus fumigatus culture sur glose Sabouraud
moisissures
Candida albicans culture sur glose Sabouraud
Dnombrer les levures et moisissures et noter la dilution correspondante
LEVURES
MOISISSURES
AZIZI - IPA - 2004
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES LAITS T PRODUITS LAITIERS
Calcul: c x 5 x inverse de la dilution
me 5
AZIZI
DJAMAL
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
Identification des staphylocoques pathognes

lecture de la staphylocoagulase
Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial.
Plasma de lapin coagul
Raction
Lecture et interprtation : nc c c nc a =b x c + b x c x FORMULE : a + nc c AAAAAAAAAAA c

A
= nombre de colonies caractristiques repiques. Anc = nombre de colonies non caractristiques repiques. bc = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase +. b nc = nombre de colonies non caractristiques repiques coagulase +. cc = nombre total de colonies caractristiques par boite. c nc =nombre total de colonies non caractristiques par boite.
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: a N= V x 1,1 x F
a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 1re dilution retenue et a 2 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 2me dilution retenue.
N
a /gr ou ml
1,1 x d a : La somme des colonies
+.
d :
Le taux de dilution de la 1re dilution retenue.
NB: retenir 2 boites de dilutions successives

contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.
Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml
D : taux de dilution de la suspension mre

Si c = 0 N< 1 D /gr ou ml


tape didentification
identification biochimique
Aspect de Salmonella sur TSI
TSI
TSI Pente Rouge Culot Noir
H2S + Gaz Pente Rouge Culot Jaune
H2S TSI Gaz
+ Gaz +
H2S
Pente Rouge Culot Jaune
Autres Salmonella
S.Typhi
S.Paratyphi A
Ensemencer une mini-galerie biochimique

CITRATE DE SIMMONS
TEMOIN LDC
ONPG UREE
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

Milieu utilis:
Bouillon Giolitti cantoni
AZIZI - IPA - 2004
Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:
10-
10-
10-
AZIZI - IPA - 2004
Couler 15 ml du bouillon Giolitti Cantoni additionn d1ampoule et de Tellurite de K:
10-
10-
10-
Incuber 48 h 37 C
AZIZI - IPA - 2004
Faire la 1re lecture:
10-
10-
10-
Reincuber 48 h 37 C
AZIZI - IPA - 2004
Faire la 2Me lecture:

Tubes +
10- 10- 10-
Tubes -
Isoler les tubes + sur la glose Chapman

AZIZI - IPA - 2004
Isoler par des stries :

Ensemencer sur boites de glose Chapman partir de chaque bouillon de Giolitti Cantoni +.
Anse de platine
24 48h 37 C
Faire une raction de la catalase partir de tout type de colonies ayant pousses.
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V. Dposer une partie de la colonie.

AZIZI - IPA - 2004
ensemencer un bouillon cur cervelle.
Si catalase +
Incuber 20-24h 37 C
AZIZI - IPA - 2004

0,1 ml
Plasma de lapin
0,3 ml
Incuber 24h 37 C
AZIZI - IPA - 2004
Raction
AZIZI - IPA - 2004
Nombre de staphylocoques pathognes /gr ou ml
1 x inverse de la dilution
AZIZI - IPA - 2004
Colonies caractristiques Colonies non caractristiques
15 X 150 pour 2 dilutions successives.
Recherche de la catalase puis de la coagulase

COAGULASE
CATALASE
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie

a- ensemencer un bouillon cur cervelle.
Incuber 20-24h 37 C

0,1 ml
Plasma de lapin
0,3 ml
Incuber 24h 37 C
Raction
Lecture et interprtation : nc c c nc a =b x c + b x c x FORMULE : a + nc c AAAAAAAAAAA c

A
= nombre de colonies caractristiques repiques. Anc = nombre de colonies non caractristiques repiques. bc = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase +. b nc = nombre de colonies non caractristiques repiques coagulase +. cc = nombre total de colonies caractristiques par boite. c nc =nombre total de colonies non caractristiques par boite.
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: a N= V x 1,1 x F
a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 1re dilution retenue et a 2 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 2me dilution retenue.
N
a /gr ou ml
1,1 x d a : La somme des colonies
+.
d :

Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml

Si c = 0 N< 1 D /gr ou ml
Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier.
10-
10-
10-
10-
Incuber 48 h 37 C
Dnombrer les colonies caractristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamtre reincuber.
ASR
colonie
Calcul:
(x1 + x
2
) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2me dilution
C= 2 Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r = 2me = 3me = 4me tube tube tube tube
RECHERCHE DES LISTERIA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.
AZIZI AZIZI
DJAMAL DJAMAL
La prise dessai pour la recherche de Listria.

a - cas de produit solide:
Verser le bouillon Fraser dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon.
225 ml
Fraser Bouillon
b cas de produit liquide:
Prlever
5
25 ml
ml
25 ml de la
Solution mre.
+1
FRASER
Listria
PREPARATION DU BOUILLON FRASER .

a Reconstituer le supplement Fraser :
11.25 ml 11.25 ml
SUPPLEMENT
ETHANOL
FRASER
EAU DISTILLEE STERILE
Acriflavine+Acide nalidixique+citrate de fer ammoniacal
b- additionner le supplment.
0,1ml 2.25 ml
SUPPLEMENT
FRASER
BOUILLON FRASER
BOUILLON
FRASER
PREPARATION DE LA GELOSE PALCAM.

5 ml 2,25 ml
EAU
DISTILLEE
Supplment
PALCAM
STERILE
Glose
PALCAM
Sulfate de polymyxine B + Ceftazine + Acriflavine
1re tape:
Enrichissement primaire.
Incuber le bouillon ensemenc FRASER 18-24h 30 C.
BOUILLON
FRASER
INCUBER 18-24h 30C
2me tape:
Enrichissement secondaire sur milieu Fraser en tube. 1er Isolement sur glose Palcam. 0,1ml
BOUILLON
FRASER
BOUILLON
FRASER
Enrichissement I
Incuber 24h 37 C Incuber 24-48h 37 C
FRASER
PALCAM 1
3me tape:
2me isolement sur la glose Palcam. Lecture de la boite Palcam 1.
BOUILLON
FRASER
Incuber 24-48h 37 C
PALCAM 1
PALCAM 2
Colonies caractristiques de Listria sur la glose Palcam.
Identification du genre Listria:

Coloration de gram. Catalase.
Bacilles gram +
Catalase +
Identification de lespce:
ensemencer une galerie biochimique.
Mobilit. Oxydase. Nitrate rductase. Ure. Indole. TDA. VP. RM. ESCULINE. VF : voir type respiratoire (aro-anarobie facultatif). TSI : (voir glucose + H2S).
ENSEMENCER UNE GALERIE BIOCHIMIQUE.

Esculine VF
Mannitol Mobilit
Bouillon Nitrate
Clark et Lubs
Ure
TSI
Incuber 24h 37 C.
Lecture de la galerie biochimique.

Mobilit + Nitrate Glucose + H2S GazEsculine + Ure IndoleTDA VP + RM +
Mannitol Mobilit Bouillon Nitrate
Esculine
Clark et Lubs
Ure
TSI
Clark et Lubs
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS PAR COMPTAGE DES COLONIES A 37 C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS
Milieu utilise:
Tryptone Sulfite Cyclosrine
AZIZI - IPA - 2004
Rfrences
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine. Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
AZIZI - IPA - 2004
Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions.

1 ml
1 ml
1 ml
ml
1 ml
1 ml
1 ml
ml
10
10
10
104
AZIZI - IPA - 2004
Couler la glose TSC 15 ml. Mlanger et laisser solidifier.
TSC
TSC
10
10
10
10 4
AZIZI - IPA - 2004
Couler une deuxime couche de glose TSC 10 ml, refroidie 47 2 C. Laisser solidifier.
TSC
TSC
10
10
10
10 4
AZIZI - IPA - 2004
Incuber 20 2h 37 C dans une atmosphre riche en CO 2 .
Jarre
AZIZI - IPA - 2004
Dnombrer les colonies noires caractristiques qui poussent en profondeur.
AZIZI - IPA - 2004
Ensemencer de 1 3 colonies suspectes sur le bouillon Thioglycolate.
BOUILLON
glycolate
THIO
Incuber 20 2h en anarobiose 37 C
AZIZI - IPA - 2004
Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose Sulfite + cloche partir du bouillon Thioglycolate. 2 gouttes
LACTOSE SULFITE
BOUILLON
glycolate
THIO
Incuber 24 2h en anarobiose
AZIZI - IPA - 2004
Voir un dgagement de gaz dans la cloche et un prcipit noir au fond du tube. Gaz
LACTOSE SULFITE
Gaz
Dpt noir
AZIZI - IPA - 2004
Formule: a = b : b x c
A Nombre de colonies caractristiques +
c : Nombre total de colonies caractristiques. A : Nombre de colonies caractristiques repiqus. a : Nombre de Clostridium Perfringens identifis.
AZIZI - IPA - 2004
N
a /gr ou ml
1,1 d a : La somme des colonies
+.
d :

AZIZI - IPA - 2004
AZIZI DJAMAL
Mthode en milieu liquide

(VBL + Cloche)
Vert brillant Bouillant Lactos

a - Test de prsomption
AZIZI DJAMAL
Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30 C. Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016). Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.
Introduire 1ml des diffrentes dilutions dans chaque tube. Chasser le gaz prsent dans les cloches avant lincubation.
1 ml
1 ml
1 ml
10 10 10
10 10 10
10 10 10
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
Incuber 24 - 48h 37C
Lecture des coliformes totaux 37 C:

Aspect d un tube de milieu VBL + cloche positif.
Acidification du milieu
Gaz +
Noter le nombre de tubes positifs 37 C et se rfrer la table de NPP.
10 10 10
10 10 10
10 10 10
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
++
2
+
2
++ +
3
RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET Eschrichia coli

b- Test de confirmation:
coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux
Dfinition:
Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44 C
Dfinition d Escherichia coli
Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44 C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects
Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un autre tube de VBL et un tube dEau Peptone Exempt dIndole.
2 gouttes 2 gouttes
VBL
Eau Peptone Exempt DIndole
VBL
Chasser le gaz prsent dans la cloche avant lincubation. Incuber 24h 44 C.
VBL
-voir acidification du milieu VBL et le dgagement de gaz dans la cloche. -Ajouter le milieu Kovacs au tube dEau Peptone Exempt dIndole et voir la formation dun anneau rouge.
Anneau 2 gouttes de Kovacs

rouge
Gaz +
VBL
Acidification du milieu
Noter le nombre de tubes positifs pour chaque srie de dilutions et se rfrer la table de NPP.
10 10 10 10 10 10
1010 10 10 10 10
10 1010 10 10 10
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
Eau Peptonne
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
VBL
+
2
+
1
+
2

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ANALYSE BACTRIOLOGIQUE DES DENREES ALIMENTAIRES

DIFFERENTES METHODES DANALYSE

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES ALIMENTS:

Qualit hyginique Germes potentiellement pathognes qui provoquent l'intoxication alimentaire.

3 groupes de germes recherchs:

Germes potentiellement pathognes pour le consommateur.

Tmoins de contamination fcale.

Dnombrement des micro-organismes?

Interprtation des rsultats

2 plans sont dsigns

pour faire lanalyse bactriologique des aliments?

A- Cas de produit solide.

a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:

b- La prise dessai pour la recherche des Salmonella et des Listria.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

Eau Peptone tamponne

B Cas de produit liquide:

b- La prise dessai pour les recherches des Salmonella et des Listria.

Eau pepton peptone tamponn tamponne

PRPARATION DES DILUTIONS DCIMALES

a - Cas de produit solide:

b - Cas de produit liquide:

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

Dfinition de la Flore Msophile Arobie Totale

Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions.

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.

Couler la glose PCA 15 ml refroidie 45 C. Mlanger et laisser solidifier.

Couler une deuxime couche de glose blanche 5 ml. Laisser solidifier.

Incuber les boites couvercle en bas 72 3h 30 C.

Incuber 72h 30C

Dfinition des coliformes totaux:

coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux

Dfinition d Escherichia coli

Violet et au Rouge neutre Bilie Lactose

Inoculer 2 sries de boites avec 1 ml des diffrentes dilutions.

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

Prparation du milieu Baird Parker:

Glose BAIRD PARKER

Couler la glose dans des boites de ptri et conserver +4 C.

Inoculer les boites avec 0,1 ml des diffrentes dilutions

taler les gouttes laide dune pipette rteau

Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h 2 37 C

Incuber 48h 2 37C 1re lecture 24h 2

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

les levures et les moisissures

Ensemencer les boites comme lindique le schma.

Ne pas ensemencer la boite tmoin

taler les gouttes laide dune pipette rteau.

Incuber les boites de Sabouraud au Chloramphnicol couvercle en haut 5 jours 25 C.

Incuber 3 5 jours 25C Lecture tous les jours.

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37 C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

Chauffer 100C pendant 5;puis refroidir rapidement leau de robinet :

Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:

Couler 15 ml de la glose VF additionne d1ampoule de Sulfite de Na et 1 ampoule dAlun de Fe:

Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier.

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

Responsable de toxi-infection alimentaire

A- Cas de produit solide.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

Eau Pepton Peptone tamponn tamponne

B - Cas de produit liquide.

Prlever 25 ml de la Suspension mre

Introduire dans 225 ml dEau Peptone Tamponne