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ANALYSE BACTRIOLOGIQUE DES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI

DJAMAL

DIFFERENTES METHODES DANALYSE

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES ALIMENTS:

Buts de lanalyse? Paramtres recherchs? Dnombrement des micro-organismes? Dfinition des germes recherchs?

Buts de lanalyse?
Rechercher et dnombrer les micro-organismes:

Qualit marchande
Germes qui provoquent laltration de laliment. Saveur, odeur

Qualit hyginique Germes potentiellement pathognes qui provoquent l'intoxication alimentaire.

3 groupes de germes recherchs:


Germes capables d altrer la qualit marchande de l aliment.
Moisissures et Pseudomonas

Germes potentiellement pathognes pour le consommateur.


Salmonella ,Listria

Tmoins de contamination fcale.


Coliformes

Dnombrement des micro-organismes?

Interprtation des rsultats


Plan 2 classes

2 plans sont dsigns


Plan 3 classes

pour faire lanalyse bactriologique des aliments?

Rfrentiels
Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF EN ISO 6887-1 relative la suspension mre et dilutions dcimales;1.rgle gnrale. Norme NF V 08- 057- 2 Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF ISO 7218 :rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

La prise dessai:
A - cas de produit solide (exemple:
fromage, viande.). B -cas de produit liquide (exemple: lait pasteuris, jus..).

A- Cas de produit solide.


Peser dans un sachet strile 3 25 gr du produit analyser aseptiquement.
25 gr

La 1re pese servira au contrle bactriologique. La seconde servira la recherche des Salmonella. La troisime servira la recherche de Listria.

BALANCE

a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:


Verser le TSE dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon de TSE.

BROYEUR
DE TYPE

STOMACHER

225 ml

TSE

(suspension mre) 10

b- La prise dessai pour la recherche des Salmonella et des Listria.


Verser lEau Peptone Tamponne(Salmonella) et le bouillon Fraser(Listria) dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans les flacons respectives.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER


225 ml 225 ml

Eau Peptone tamponne

Bouillon Fraser

B Cas de produit liquide:


a- La prise dessai pour une analyse bactriologique classique:
Faire un mlange de 3 5 units du produit analyser.
Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris Lait pasteuris

+1
Suspension mre

b- La prise dessai pour les recherches des Salmonella et des Listria.


Prlever 225 ml de la Suspension mre.
5
ml

25 ml

25 ml

+1
FRASER

Eau pepton peptone tamponn tamponne

Listria

Salmonella

PRPARATION DES DILUTIONS DCIMALES


a - cas de produit solide. b - cas de produit liquide.

a - Cas de produit solide:


Introduire 1 ml de la suspension 10 dans 9 ml de TSE. Mlanger,puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE.

1 ml

1 ml

1 ml
9 ml de TSE
10

10

10
Suspension mre

b - Cas de produit liquide:


Introduire 1 ml de la suspension +1 dans 9 ml de TSE. Mlanger,puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE,mlanger, puis prlever 1 ml de la dilution 10 et lintroduire ensuite dans 9 ml de TSE pour obtenir la dilution 10.

1 ml 1 ml
10

1 ml
9 ml de TSE
10

1 ml
9 ml de TSE
10

+1
suspension Solution mre mre

PARAMETRES RECHERCHES

Recherche et dnombrement des microorganismes totaux (Flore msophile). Recherche et dnombrement des levures et moisissures. Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et EscherichiaColi. Recherche et dnombrement des Anarobies Sulfito Rducteurs 37 C. Recherche et dnombrement de Clostridium Perfringens 46 C. Recherche et dnombrement des Staphylococcus aureus. Recherche des salmonelles. Recherche de Listria.

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

er 1

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Dfinition de la Flore Msophile Arobie Totale

Dfinition:
La Flore Msophile Arobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet d'valuer le nombre d'UFC (Unit Formant une Colonie) prsentes dans un produit. Ce dnombrement se fait 30 C ce qui permet de dnombrer trois grands types de flore : la flore thermophile, temprature optimale de croissance 45 C; la flore msophile, temprature optimale de croissance entre 20 C et 40 C; la flore psychrophile, temprature optimale de croissance 20 C.

Rfrentiels
Norme NF 08 051 relative au dnombrement des micro organismes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme XP V 08 102 relative aux rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF V 08 002:Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V- 057- 2 Microbiologie alimentaire - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Milieu utilis:
Glose PCA
(Plate Count Agar)

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions.


1 ml
ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10

10

10

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.

Couler la glose PCA 15 ml refroidie 45 C. Mlanger et laisser solidifier.


A PC

PC A

10

10

10

Couler une deuxime couche de glose blanche 5 ml. Laisser solidifier.


SE GELO HE C N BLA
GE O L SE BLAN CHE

10

10

10

Incuber les boites couvercle en bas 72 3h 30 C.

Incuber 72h 30C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Dfinition des coliformes totaux:

Dfinition :
Les coliformes totaux sont des bactries en forme de btonnet arobies ou anarobies facultatives possdant lenzyme - galactosidase permettant lhydrolyse du lactose 35 C avec production de gaz Les principaux genres inclus dans le groupe sont : Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella et Serratia

coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux

Dfinition:

Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44 C

Dfinition d Escherichia coli

Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44 C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects

Milieu utilis:
VRBL:
glose au cristal

Violet et au Rouge neutre Bilie Lactose


(autres que les produits laitiers)

DESOXYCHOLATE 1
(pour les produits laitiers)

AZIZI

DJAMAL

Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30 C. Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016). Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Rfrentiels
Norme NF V 08-051:dnombrement des coliformes par comptage des colonies,mthode de routine. Norme NF V 08-017:dnombrement des coliformes fcaux et dEschrichia Coli(annexe NF V 08-015 et NF V08-016). Norme NF ISO 7218:rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V 08- 010 :rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08-102:rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats:cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Inoculer 2 sries de boites avec 1 ml des diffrentes dilutions.


1 ml
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10 10

10 10

10 10

Dposer linoculum(1 ml) goutte goutte sur toute la surface de la boite.

Couler une couche de glose de dsoxycholatee 1 ou VRBL 15 ml, refroidie la temprature 451 C. Mlanger et laisser solidifier.
Y- E OX AT S L DE O

CH 1

DE C SO H OL XYAT 1 E

Couler une 2me couche de glose blanche ou de dsoxycholatee 1 ou de VRBL 4ml. Laisser solidifier.
glose blanche

glose blanche

Incuber une srie de boites 24-48 h 37 C pour la recherche des coliformes totaux. Incuber lautre srie 44 C pour la recherche des coliformes thermo tolrants et Escherichia coli.
Co4-48 lif o h rm es 37C tot aux

2 4Co lifo 4 8h rm es 4 4 fc C au x

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Milieu utilis:
Glose Baird Parker

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

DEFINITION:
microorganismes de forme sphrique cooci Gram positif halophiles c'est--dire cultivent en prsence de 5 % de NaCl possdent une catalase
(se multiplier dans des salaisons, ou en surface de poissons sals.
Certaines espces psychrotrophes se dveloppent sur des aliments rfrigrs Certaines espces osmophiles se multiplient dans des produits sucrs exemple laits concentrs sucrs). .

Rfrentiels
Norme NF ISO 6888 - 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S.aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos de Baird Parker. Norme NF V 08 057 1 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37 C 1: technique avec confirmation des c olonies. Norme NF V 08 057 2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive par comptage des colonies 37 C 2: technique sans confirmation des c olonies. Norme NF ISO 6888 -2 relative au dnombrement des Staphylocoques coagulase positive(S.aureus et autres espces) Partie 1: technique utilisant le milieu glos au plasma de lapin et au fibrinogne. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Prparation du milieu Baird Parker:


Ajouter au milieu de base Baird Parker 15 ml de la solution jaune duf au tellurite de potassium

15 ml

de

JAUNE
DOEUF
TELLERUTE de POTASSIUM

au

Glose BAIRD PARKER

Couler la glose dans des boites de ptri et conserver +4 C.

Inoculer les boites avec 0,1 ml des diffrentes dilutions


1
ml

ml

ml

0,1 ml

0,1 ml

0,1 ml

10

10

10

taler les gouttes laide dune pipette rteau

10

10

10

Incuber les boites de Baird Parker couvercle en haut 48h 2 37 C

Incuber 48h 2 37C 1re lecture 24h 2

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

les levures et les moisissures


Ce sont des champignons

les levures:
la forme unicellulaire est prdominante la forme la plus frquente est ovalaire ou sphrique

les moisissures:
Sont des micro-organismes filamenteux qui sont dissmins par lmission de spores

Rfrentiels
Norme XP V 08 059 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C. Norme NF ISO 7954 relative au dnombrement des levures et moisissures par comptage des colonies 25 C. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Milieu utilis:
Sabouraud au Chloramphnicol

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Ensemencer les boites comme lindique le schma.


1
ml

0,2 ml

1
ml

0,2 ml 0,2 ml
TEMOIN DILUANT

ml

0,2 ml
TEMOIN MILIEU

ml

10

10

10

Ne pas ensemencer la boite tmoin

taler les gouttes laide dune pipette rteau.

Tmoin diluant

10

10

10

Incuber les boites de Sabouraud au Chloramphnicol couvercle en haut 5 jours 25 C.

Incuber 3 5 jours 25C Lecture tous les jours.

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37 C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Rfrentiels
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine. Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Milieu utilis:
Glose Viande Foie

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Chauffer 100C pendant 5;puis refroidir rapidement leau de robinet :


10- 10-

15 mn 75 C 10 mn 80 C

100C

Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:

10-

10-

10-

10-

Couler 15 ml de la glose VF additionne d1ampoule de Sulfite de Na et 1 ampoule dAlun de Fe:

10-

10-

10-

10-

Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier.

10-

10-

10-

10-

Incuber 48 h 37 C

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

SALMONELLA
Entrobactrie Bacilles Gram ngatif, Mobile (ciliature pritriche), Aro-anarobie facultatif, Oxydase Fermentative du glucose, Lactose

flagelles

Responsable de toxi-infection alimentaire

Rfrentiels
Norme NF V 08 6- 052 relative la mthode de routine pour la recherche des Salmonella. Norme EN 12824 relative la recherche des Salmonella. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

A- Cas de produit solide.


Peser dans un sachet strile 25 gr du produit analyser aseptiquement.

25 gr

BALANCE

Verser lEau Peptone Tamponne dans le sachet strile contenant 25 gr de produit Broyer laliment. Verser le contenu dans le flacon dE.P. Tamponne.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

Eau Pepton Peptone tamponn tamponne

flacon de 225 ml

B - Cas de produit liquide.


25 ml
1
ml

Prlever 25 ml de la Suspension mre

Introduire dans 225 ml dEau Peptone Tamponne

(+1) +1

Eau

Pepton Peptone tamponn tamponne

tape de pr- enrichissement

Incuber la solution ensemence dEau Peptone Tamponne

Eau Pepton Peptone tamponn tamponne

INCUBER 16- 20h 37C

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

me 2

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

re 1

Lecture

24h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30 C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Lecture des coliformes totaux


Glose VRBL

Dnombrer les colonies rouges qui poussent en masse , noter la dilution correspondante. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.

Colonies rouges

Colonies rouges

Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150. Appliquer cette formule:

N
c :

1,1 x d

c 1 + c 2 (c 1 = nombre de colonies de la 1re dilution et c 2 = nombre de colonies de la 2me dilution retenues). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.

= nombre de

coliformes totaux / gr ou ml.

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Lecture des coliformes totaux et fcaux


Glose dsoxycholate 1
(produits laitiers)

Exposer la boite sous radiation UV Lecture immdiate dans une chambre noire Dnombrer les colonies fluorescentes

Lampe UV

Dnombrer les colonies rouges fluorescentes qui poussent en masse , noter les dilutions et les tempratures correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 150.
Colonies fluorescentes

Colonies rouges

Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150. Appliquer cette formule:

N
c :

1,1 x d

c1 + c2 (c = nombre de colonies de la 1 re 1 dilution et c = nombre de colonies de la 2me 2 dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.

= nombre de coliformes totaux

ou coliformes fcaux / gr ou ml

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

nombre de coliformes totaux ou = coliformes fcaux / gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Recherche et dnombrement dEschrichia Coli

Repiquer 3 5 colonies caractristiques sur le milieu Ure Indole

Coliformes thermotolrants

Ensemencer le milieu Ure Indole.

Incuber le milieu Ure Indole ensemenc 24 h 37 C

UREE

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture des staphylocoques


1re lecture

Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes
Colonies caractristiques (halo) Colonies non caractristiques

rincuber les boites 48 h

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37 C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Lecture des ASR


re 1

lecture

16h dincubation

Dnombrer les colonies qui poussent en profondeur

1 cm
10- 10-
10-

10-

rincuber 48 h 37 C

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

tape denrichissement

ENSEMENCER UN BOUILLON SFB: 100 ml


Additionn de 20 disques de slnite

SFB
Eau Pepton Peptone tamponn tamponne

D/C

Flacon dEau Peptone pr enrichie

Incuber 18 24h 37 C

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

me 3

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

me 2

Lecture

48h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30 C

Lecture des coliformes fcaux(E. coli)

Lecture du milieu Ure Indole


KOVACS KOVACS

Production dindole = formation dun anneau rouge.

indole -

indole +

E.Coli: ure Indole +

Lecture et interprtation.
Formule: a = b x A b : Nombre de colonies caractristiques indole + c : Nombre total de colonies caractristiques sur la boite. A :Nombre de colonies caractristiques repiqus. a : Nombre dEscherichia Coli identifis par boite. c

Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 150. Appliquer cette formule: a

a=

1,1 x d Nombre dEscherichia Coli identifis.

d : le taux de dilution correspondant la 1re dilution retenue.

N = nombre dEscherichia Coli /gr ou


ml.

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture et identification des staphylocoques pathognes


- 2me lecture 48h - tests de confirmation

Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes
Colonies caractristiques (halo) Colonies non caractristiques

15 X 150 pour 2 dilutions successives.

Recherche de la catalase puis de la coagulase


COAGULASE

CATALASE

Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie

Apparition de bulles dair.


Observation loeil nu ou au microscope.

Raction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cur cervelle.

BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h 37 C

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DES ANAROBIES SULFITORDUCTEURS A 37 C DANS LES DENRES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Lecture des ASR


me 2

lecture

48h dincubation

Dnombrer les colonies noires qui poussent en profondeur

1 cm
10- 10-
10-

10-

Dnombrer les colonies caractristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamtre

ASR

colonie

Calcul:
(x1 + x
2

) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2me dilution

C= 2 Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r = 2me = 3me = 4me tube tube tube tube

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape disolement
glose hektoen

Isoler par des stries :


Ensemencer une boite de glose Hektoen partir du bouillon SFB
Additionn de 2 disques de slnite

10 ml
Anse de platine
SFB
D/C
SFB D/C

Incuber 18- 24h 37C

18-24 h 37 C

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

me 4

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DENOMREMENT DES MICROORGANISMES PAR COMPTAGE DES COLONIES OBTENUES A 30 C, DANS LES DENRES ALIMENTAIRES
AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

me 3

Lecture

72h dincubation

Dnombrer les colonies de formes lenticulaires qui poussent en masse et noter les dilutions correspondantes. Tenir compte des boites ayant un nombre compris entre 15 et 300.

Germes totaux

Germes totaux

Rincuber 30 C

Lecture et interprtation:
Retenir 2 dilutions successives ( plus fortes dilutions) o le nombre de colonies dnombres soit : 15 c 300. Appliquer cette formule:

N
c :

1,1 x d

c 1 + c 2 (c 1 = nombre de colonies de la 1re dilution et c 2 = nombre de colonies de la 2me dilution ). d : le taux de dilution de la 1re boite retenue.

= nombre de

micro-organismes /gr ou ml

Lecture et interprtation
Cas dune seule boite positive o C > 30:

N=

c D

/ gr ou ml

D : - taux de dilution de la suspension mre


(produits solide)

- Inverse de la 1re dilution


(produit liquide)

Identification des staphylocoques pathognes

b- recherche de la coagulase libre:


0,1 ml

BOUILLON COEUR CERVELLE

Plasma de lapin
0,3 ml

Incuber 24h 37 C
1re lecture aprs 6h dincubation.

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape didentification
repiquage sur TSI

Lecture de la boite Hektoen


Colonies ayant un contour rgulier. Colonies ayant la couleur du milieu ,parfois avec ou sans centre noir sur la glose Hektoen. Colonies typiques

Repiquer 5 colonies typiques de Salmonella sur le milieu TSI


Stries Anse de platine

faire une piqre centrale.

Isoler par des stries

Incuber 24h 37 C

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES DENREES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Lecture des levures et moisissures

levures

Aspergillus fumigatus culture sur glose Sabouraud

moisissures

Candida albicans culture sur glose Sabouraud

Dnombrer les levures et moisissures et noter la dilution correspondante

LEVURES

MOISISSURES

AZIZI - IPA - 2004

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES LEVURES ET MOISISSURES DANS LES LAITS T PRODUITS LAITIERS

Calcul: c x 5 x inverse de la dilution

JOUR DES TARVAUX PRATIQUES

me 5

AZIZI

DJAMAL

RECHERCHE ET DNOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENRES ALIMENTAIRES

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

Identification des staphylocoques pathognes


lecture de la staphylocoagulase

Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial.

Plasma de lapin coagul

Raction

Lecture et interprtation : nc c c nc a =b x c + b x c x FORMULE : a + nc c AAAAAAAAAAA c


A

= nombre de colonies caractristiques repiques. Anc = nombre de colonies non caractristiques repiques. bc = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase +. b nc = nombre de colonies non caractristiques repiques coagulase +. cc = nombre total de colonies caractristiques par boite. c nc =nombre total de colonies non caractristiques par boite.

Lecture et interprtation.
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: a N= V x 1,1 x F
a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 1re dilution retenue et a 2 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 2me dilution retenue.

Lecture et interprtation.
N

a /gr ou ml

1,1 x d a : La somme des colonies

+.

d :

Le taux de dilution de la 1re dilution retenue.

NB: retenir 2 boites de dilutions successives


contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.

Lecture et interprtation
Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre


Si c = 0 N< 1 D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre

RECHERCHE DES SALMONELLA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


AZIZI AZIZI DJAMAL DJAMAL

Recherche des Salmonella


tape didentification
identification biochimique

Aspect de Salmonella sur TSI

TSI

TSI Pente Rouge Culot Noir

H2S + Gaz Pente Rouge Culot Jaune

H2S TSI Gaz

+ Gaz +
H2S

Pente Rouge Culot Jaune

Autres Salmonella

S.Typhi

S.Paratyphi A

Ensemencer une mini-galerie biochimique


CITRATE DE SIMMONS

TEMOIN LDC

ONPG UREE

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DANS LES DENREES ALIMENTAIRES


Milieu utilis:
Bouillon Giolitti cantoni

AZIZI - IPA - 2004

Inoculer les tubes avec 1 ml des diffrentes dilutions:

10-

10-

10-

AZIZI - IPA - 2004

Couler 15 ml du bouillon Giolitti Cantoni additionn d1ampoule et de Tellurite de K:

10-

10-

10-

Incuber 48 h 37 C
AZIZI - IPA - 2004

Faire la 1re lecture:

10-

10-

10-

Reincuber 48 h 37 C
AZIZI - IPA - 2004

Faire la 2Me lecture:


Tubes +
10- 10- 10-

Tubes -

Isoler les tubes + sur la glose Chapman


AZIZI - IPA - 2004

Isoler par des stries :


Ensemencer sur boites de glose Chapman partir de chaque bouillon de Giolitti Cantoni +.

Anse de platine

24 48h 37 C

Faire une raction de la catalase partir de tout type de colonies ayant pousses.

Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V. Dposer une partie de la colonie.

Apparition de bulles dair.


Observation loeil nu ou au microscope.
AZIZI - IPA - 2004

Raction de la coagulase:
ensemencer un bouillon cur cervelle.

Si catalase +
BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h 37 C
AZIZI - IPA - 2004

b- recherche de la coagulase libre:


0,1 ml

BOUILLON COEUR CERVELLE

Plasma de lapin
0,3 ml

Incuber 24h 37 C
1re lecture aprs 6h dincubation.
AZIZI - IPA - 2004

Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial.

Plasma de lapin coagul

Raction

AZIZI - IPA - 2004

Lecture et interprtation.

Nombre de staphylocoques pathognes /gr ou ml

1 x inverse de la dilution

AZIZI - IPA - 2004

Dnombrer les colonies caractristiques et non caractristiques et noter les dilutions correspondantes
Colonies caractristiques Colonies non caractristiques

15 X 150 pour 2 dilutions successives.

Recherche de la catalase puis de la coagulase


COAGULASE

CATALASE

Raction de la catalase:
Pipette Pasteur. Dposer 1 goutte dH2O2 20V Dposer une partie de la colonie

Apparition de bulles dair.


Observation loeil nu ou au microscope.

Raction de la coagulase:
a- ensemencer un bouillon cur cervelle.

BOUILLON COEUR CERVELLE

Incuber 20-24h 37 C

b- recherche de la coagulase libre:


0,1 ml

BOUILLON COEUR CERVELLE

Plasma de lapin
0,3 ml

Incuber 24h 37 C
1re lecture aprs 6h dincubation.

Le coagulum occupe + des du volume du liquide initial.

Plasma de lapin coagul

Raction

Lecture et interprtation : nc c c nc a =b x c + b x c x FORMULE : a + nc c AAAAAAAAAAA c


A

= nombre de colonies caractristiques repiques. Anc = nombre de colonies non caractristiques repiques. bc = nombre de colonies caractristiques repiques coagulase +. b nc = nombre de colonies non caractristiques repiques coagulase +. cc = nombre total de colonies caractristiques par boite. c nc =nombre total de colonies non caractristiques par boite.

Lecture et interprtation.
Calcul du nombre de staphylocoques aureus: formule: a N= V x 1,1 x F
a = a1 + a 2 (a 1 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 1re dilution retenue et a 2 = nombre de staphylocoques coagulase + de la 2me dilution retenue.

Lecture et interprtation.
N

a /gr ou ml

1,1 x d a : La somme des colonies

+.

d :

Le taux de dilution de la 1re dilution retenue.

NB: retenir 2 boites de dilutions successives


contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.

Lecture et interprtation
Si c < 15 c Ne = D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre


Si c = 0 N< 1 D /gr ou ml

D : taux de dilution de la suspension mre

Mlanger doucement par retournement. Laisser solidifier.

10-

10-

10-

10-

Incuber 48 h 37 C

Dnombrer les colonies caractristiques de couleurs noires et de 5 mm de diamtre reincuber.

ASR

colonie

Calcul:
(x1 + x
2

) x inverse de la 1re dilution + ( x 3 + x 4 ) x inverse de la 2me dilution

C= 2 Nombre d ASR / gr OU ml x1 x2 x3 x4 = 1r = 2me = 3me = 4me tube tube tube tube

RECHERCHE DES LISTERIA DANS LES DENREES ALIMENTAIRES.

AZIZI AZIZI

DJAMAL DJAMAL

La prise dessai pour la recherche de Listria.


a - cas de produit solide:
Verser le bouillon Fraser dans le sachet strile contenant 25 gr de produit analyser. Broyer laliment 6 8 minutes. Verser le contenu dans le flacon.

BROYEUR DE TYPE STOMACHER

225 ml
Fraser Bouillon

b cas de produit liquide:

Prlever
5

25 ml
ml

25 ml de la

Solution mre.

+1
FRASER

Listria

PREPARATION DU BOUILLON FRASER .


a Reconstituer le supplement Fraser :
11.25 ml 11.25 ml

SUPPLEMENT

ETHANOL

FRASER

EAU DISTILLEE STERILE

Acriflavine+Acide nalidixique+citrate de fer ammoniacal

b- additionner le supplment.

0,1ml 2.25 ml

SUPPLEMENT

FRASER

BOUILLON FRASER

BOUILLON

FRASER

PREPARATION DE LA GELOSE PALCAM.


5 ml 2,25 ml

EAU
DISTILLEE

Supplment

PALCAM

STERILE

Glose
PALCAM

Sulfate de polymyxine B + Ceftazine + Acriflavine

1re tape:
Enrichissement primaire.
Incuber le bouillon ensemenc FRASER 18-24h 30 C.

BOUILLON

FRASER

INCUBER 18-24h 30C

2me tape:

Enrichissement secondaire sur milieu Fraser en tube. 1er Isolement sur glose Palcam. 0,1ml

BOUILLON

FRASER

BOUILLON

FRASER

Enrichissement I
Incuber 24h 37 C Incuber 24-48h 37 C

FRASER

PALCAM 1

3me tape:
2me isolement sur la glose Palcam. Lecture de la boite Palcam 1.

BOUILLON

FRASER

Incuber 24-48h 37 C

PALCAM 1

PALCAM 2

Colonies caractristiques de Listria sur la glose Palcam.

Identification du genre Listria:


Coloration de gram. Catalase.

Bacilles gram +

Catalase +

Identification de lespce:
ensemencer une galerie biochimique.
Mobilit. Oxydase. Nitrate rductase. Ure. Indole. TDA. VP. RM. ESCULINE. VF : voir type respiratoire (aro-anarobie facultatif). TSI : (voir glucose + H2S).

ENSEMENCER UNE GALERIE BIOCHIMIQUE.


Esculine VF

Mannitol Mobilit

Bouillon Nitrate

Clark et Lubs

Ure

TSI

Incuber 24h 37 C.

Lecture de la galerie biochimique.


Mobilit + Nitrate Glucose + H2S GazEsculine + Ure IndoleTDA VP + RM +
Mannitol Mobilit Bouillon Nitrate

Esculine

Clark et Lubs

Ure

TSI

Clark et Lubs

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS PAR COMPTAGE DES COLONIES A 37 C DANS LES LAITS ET PRODUITS LAITIERS

Milieu utilise:
Tryptone Sulfite Cyclosrine
AZIZI - IPA - 2004

Rfrences
Norme XP V 08 061 relative au dnombrement en anarobiose des bactries Sulfito Rductrices par comptage des colonies 46 C. Mthode de routine. Norme V 08- 056 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF V 08 019 relative au dnombrement des Clostidium perfringens par comptage des colonies . Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

AZIZI - IPA - 2004

Inoculer les boites de ptri avec 1 ml des diffrentes dilutions.


1 ml
1 ml

1 ml

ml

1 ml

1 ml

1 ml

ml

10

10

10

104

AZIZI - IPA - 2004

Couler la glose TSC 15 ml. Mlanger et laisser solidifier.

TSC

TSC

10

10

10

10 4

AZIZI - IPA - 2004

Couler une deuxime couche de glose TSC 10 ml, refroidie 47 2 C. Laisser solidifier.

TSC

TSC

10

10

10

10 4

AZIZI - IPA - 2004

Incuber 20 2h 37 C dans une atmosphre riche en CO 2 .

Jarre
AZIZI - IPA - 2004

Dnombrer les colonies noires caractristiques qui poussent en profondeur.

AZIZI - IPA - 2004

Ensemencer de 1 3 colonies suspectes sur le bouillon Thioglycolate.

BOUILLON

glycolate

THIO

Incuber 20 2h en anarobiose 37 C
AZIZI - IPA - 2004

Repiquer 5 gouttes sur le bouillon Lactose Sulfite + cloche partir du bouillon Thioglycolate. 2 gouttes

LACTOSE SULFITE

BOUILLON

glycolate

THIO

Incuber 24 2h en anarobiose
AZIZI - IPA - 2004

Voir un dgagement de gaz dans la cloche et un prcipit noir au fond du tube. Gaz
LACTOSE SULFITE

Gaz

Dpt noir

AZIZI - IPA - 2004

Lecture et interprtation.
Formule: a = b : b x c

A Nombre de colonies caractristiques +

c : Nombre total de colonies caractristiques. A : Nombre de colonies caractristiques repiqus. a : Nombre de Clostridium Perfringens identifis.
AZIZI - IPA - 2004

Lecture et interprtation.
N

a /gr ou ml

1,1 d a : La somme des colonies

+.

d :

Le taux de dilution de la 1re dilution retenue.

NB: retenir 2 boites de dilutions successives


contenant entre 15 et 150 colonies caractristiques.
AZIZI - IPA - 2004

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES,COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET ESCERICHIA COLI DANS LES DENREES ALIMENTAIRES
AZIZI DJAMAL

Mthode en milieu liquide


(VBL + Cloche)

Vert brillant Bouillant Lactos


a - Test de prsomption
AZIZI DJAMAL

Rfrentiels
Norme NF ISO 4831 relative au dnombrement des coliformes technique du nombre le plus probable aprs incubation 30 C. Norme NF V 08 - 050 relative au dnombrement des coliformes mthode par comptage des colonies obtenues 30 C. Norme NF V 08 017 relative au dnombrement des coliformes fcaux et dEscherichia coli (annexe NF V 08 015 et NF V 08 -016). Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

Introduire 1ml des diffrentes dilutions dans chaque tube. Chasser le gaz prsent dans les cloches avant lincubation.

1 ml

1 ml

1 ml

10 10 10

10 10 10

10 10 10

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

Incuber 24 - 48h 37C

Lecture des coliformes totaux 37 C:


Aspect d un tube de milieu VBL + cloche positif.

Acidification du milieu

Gaz +

Noter le nombre de tubes positifs 37 C et se rfrer la table de NPP.

10 10 10

10 10 10

10 10 10

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

++
2

+
2

++ +
3

RECHERCHE ET DENOMBREMENT DES COLIFORMES THERMOTOLERANTS ET Eschrichia coli


b- Test de confirmation:

coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux

Dfinition:

Les coliformes thermotolrants ou coliformes fcaux sont un sous-groupe des coliformes totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44 C

Dfinition d Escherichia coli

Dfinition:
Escherichia coli: Il sagit l de coliformes thermotolrants qui produisent , en outre , de lindole partir du tryptophane 44 C . La bactrie E. coli reprsente toutefois 80 90 % des coliformes thermotolrants dtects

Repiquer chaque tube de milieu VBL + sur un autre tube de VBL et un tube dEau Peptone Exempt dIndole.
2 gouttes 2 gouttes

VBL
Eau Peptone Exempt DIndole

VBL

Chasser le gaz prsent dans la cloche avant lincubation. Incuber 24h 44 C.

VBL

Eau Peptone Exempt DIndole

-voir acidification du milieu VBL et le dgagement de gaz dans la cloche. -Ajouter le milieu Kovacs au tube dEau Peptone Exempt dIndole et voir la formation dun anneau rouge.

Anneau 2 gouttes de Kovacs


Eau Peptone Exempt DIndole

rouge

Gaz +
VBL

Acidification du milieu

Noter le nombre de tubes positifs pour chaque srie de dilutions et se rfrer la table de NPP.
10 10 10 10 10 10

1010 10 10 10 10

10 1010 10 10 10

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

Eau Peptonne

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

VBL

+
2

+
1

+
2