Aislamiento y caracterizacin de microsatlites a partir de la construccin de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

Vanessa Sarasola

Diciembre de 2007

NDICE Introduccin Metodologa 1. Extraccin, purificacin y estimacin del ADN 2. Tamao y pureza del ADN 3. Preparacin del ADN genmico en un rango de tamao de 300 a 700pb 4. Annealing y ligacin de linkers 5. Amplificacin por PCR del linker-DNA 6. Seleccin hbrida-enriquecimiento de la genoteca 7. PCR del ADN hbrido seleccionado 8. Eliminacin de linkers 9. Ligacin en el plsmido 10. Clonacin y seleccin de plsmidos que contienen microsatlites 11. Rastreo (screening) 12. Secuenciacin de los clones positivos 13. Anlisis de los microsatlites obtenidos Resultados y perspectivas Bibliografa 2 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 8 10 11 11 11 13

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

Introduccin
La gentica molecular tiene mltiples aplicaciones en la biologa de la conservacin, y de hecho la gentica de la conservacin ha emergido como una disciplina en s misma. Sus objetivos principales son la comprensin de la relacin entre la diversidad gentica y la viabilidad de las poblaciones, y el conocimiento del tamao efectivo de la poblacin, parmetro crtico para mantener la diversidad gentica. La habilidad de los organismos para adaptarse a los cambios ambientales (cambio climtico, nuevos patgenos), llamada potencial evolutivo, est muy relacionada con la diversidad gentica. Los marcadores moleculares son secuencias polimrficas de protenas o de ADN que pueden ser utilizadas como indicadoras de la variacin gentica y nos pueden ayudar a responder preguntas en ecologa que son difciles de resolver de otra manera. Son fragmentos del genoma generalmente muy pequeos, que son tratados como loci, aunque no codifiquen para protenas. El nivel de polimorfismo puede variar entre cero y cientos de alelos en una especie. La gran ventaja que tienen es que la variacin en los marcadores puede ser cuantificada, lo que permite utilizar la estadstica para hacer comparaciones. Hay distintos tipos de marcadores, cada uno con ventajas e inconvenientes (alozimas, RFLP, RAPD, minisatlites, microsatlites), pero en los ltimos aos los microsatlites se han hecho muy populares para resolver muchos aspectos de la ecologa molecular (Gonzlez, 2003; Beebee & Rowe, 2004). Los microsatlites o SSRs (simple sequence repeats) son motivos repetidos de 1 a 6 nucletidos encontrados en todos los genomas, tanto procariotas como eucariotas, analizados hasta el momento. Estn presentes en regiones del genoma tanto codificantes como no codificantes, con mayor presencia en estas ltimas, y presentan un alto grado de polimorfismo que los hace ptimos para utilizarlos como marcadores moleculares en estudios de mapeo de genomas, estudios forenses, o enfocados a la conservacin, tales como: deteccin de posibles cuellos de botella, medidas del flujo gnico e hibridacin entre poblaciones, asignacin de individuos a su poblacin de origen o determinacin de la estructura poblacional. Adems son selectivamente neutrales y co-dominantes, y se puede trabajar con reducidas cantidades de ADN, sin que resulte necesario el sacrificio de los animales porque se pueden amplificar con la tcnica de la PCR (Gonzlez, 2003; Zane et al., 2002).

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

El mayor inconveniente de los microsatlites es que necesitan ser aislados de novo en cada especie, debido a que se encuentran habitualmente en regiones no codificantes del genoma donde la tasa de sustitucin de nucletidos es muy alta, por lo que no existen primers o cebadores universales como en el ADN mitocondrial, lo que supone un elevado esfuerzo. ltimamente, y cada vez con mayor frecuencia, se intenta la amplificacin cruzada con cebadores de una especie en otra distinta, obtenindose en algunos casos resultados positivos (Schltterer et al., 1991; Gonzlez, 2003; Strecker, 2006). En el grupo de los anfibios su utilizacin es muy frecuente para realizar estudios poblacionales enfocados a la conservacin (Rowe et al., 2000; Beebee & Rowe, 2001; Vos et al., 2001; Gonzlez, 2003; Burns et al., 2004) y se han aislado en muchas especies (Brede et al., 2001; Wieczorek et al., 2002; Julian & King, 2003; Chan, 2007). Una genoteca, en sentido estricto, es una coleccin desordenada de clones de un microorganismo husped en el que se introduce el genoma del microorganismo de inters en forma de trozos aleatorios. Cuando se habla de una genoteca enriquecida, esos trozos han sido seleccionados por alguna caracterstica. En este caso, de bsqueda de microsatlites, se seleccionan determinadas secuencias de pares de bases que suelen formar parte de estos marcadores. Las poblaciones ibricas de Rana dalmatina representan el lmite de distribucin suroccidental de esta especie y se hallan separadas del resto de poblaciones europeas por la frontera natural que suponen los Pirineos (Gos, 2002). A nivel gentico esta situacin geogrfica implica que son poblaciones cuyo intercambio de genes est dificultado por dicha barrera que restringe el flujo de animales, y por tanto gentico, adems de que el intercambio es unilateral, por lo que es ms lento y la adaptacin a condiciones locales (climticas, de contaminacin) puede quedar retardada, como consecuencia de una baja heterocigosidad. El estudio gentico de las regiones SSR o microsatlites permitir averiguar si el aislamiento fsico al que pueden haber estado sometidas las poblaciones ibricas de la especie ha desembocado en una diferenciacin gentica. Si el aislamiento es antiguo, consecuencia de cambios climatolgicos pretritos, como se supone, se espera encontrar una diferenciacin gentica elevada con respecto a las poblaciones europeas, al otro lado de los Pirineos, y una baja heterocigosidad. Dentro de la Pennsula se repite el patrn de aislamiento de las poblaciones. A dicha escala las barreras que impiden la dispersin entre poblaciones suelen estar

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

relacionadas con cambios de origen antrpico en los ecosistemas: infraestructuras lineales, urbanizacin, campos de cultivo, etc. El anlisis gentico con microsatlites permitir conocer la estructura gentica y el grado de fragmentacin entre las poblaciones ibricas. Tambin se podr cuantificar la variabilidad gentica de las poblaciones. Estos parmetros poblacionales son decisivos para la supervivencia de las poblaciones y proporcionan una importantsima informacin a la hora de tomar medidas enfocadas a la conservacin. Si la variabilidad gentica de las poblaciones es baja significa que el proceso de aislamiento, aunque reciente, es importante y que puede existir una alta tasa de consanguinidad, pudiendo ser recomendables programas de reintroduccin y restauracin gentica. La obtencin de microsatlites, realizada entre abril y septiembre de 2007 en la Universidad de Sussex (Inglaterra) bajo la tutela del Dr. T. J. C., Beebee, es el primer paso, e ineludible, para desarrollar este proyecto enfocado a la conservacin de la especie en las poblaciones Ibricas.

Metodologa
Hay distintas estrategias para la obtencin de genotecas enriquecidas en microsatlites, documentadas por Zane et al. (2002). En la genoteca desarrollada para Rana dalmatina se ha seguido una combinacin de algunas de ellas. Los pasos han sido:

1. Extraccin, purificacin y estimacin del ADN Se obtuvo ADN de alta calidad siguiendo el protocolo estndar de extraccin y purificacin del fenol-cloroformo, a partir de cuatro larvas de Rana dalmatina procedentes de la cra en cautividad de huevos de las poblaciones ibricas en el ao 2004, y conservadas en alcohol de 96. Se estim la cantidad y pureza de los cidos nucleicos en la preparacin mediante espectrofotometra. stos, en disolucin acuosa, presentan mximos de absorbancia en la regin ultravioleta del espectro, a 260 nm, debido a la presencia de las bases nitrogenadas. Para calcular su concentracin, una unidad de absorbancia (UA) corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN de cadena doble. Se utiliz el espectrofotmetro de UV UNICAM HELIOS.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

2. Tamao y pureza del ADN La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica, a travs de una matriz gelatinosa. Se utiliz la electroforesis en gel de agarosa para identificar y purificar los fragmentos de ADN (figura 1). Como marcador se utiliz bromuro de etidio, sustancia que emite una luz roja-anaranjada que se intensifica unas 20 veces despus de haberse unido al ADN, cuando se expone a la luz ultravioleta. Es una sustancia que se debe manipular con mucha precaucin, porque tiene importantes efectos mutgenos y posiblemente cancergenos.

Figura 1. Tamao y pureza del ADN obtenido.

3. Preparacin del ADN genmico en un rango de tamao de 300 a 700pb Las enzimas de restriccin se han convertido en una herramienta bsica de la ingeniera gentica. Son endonucleasas que reconocen y cortan secuencias especficas en la doble hlice de ADN. Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entra en la clula.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

En este caso, se utilizaron para obtener fragmentos de ADN con tamaos entre 300 y 700 pb, suficientemente grandes como para albergar los microsatlites, y suficientemente pequeos para manejarlos. El ADN genmico de Rana dalmatina fue digerido con la enzima de restriccin Mbo I, que proviene de la bacteria Moraxela bovis, causante de conjuntivitis en el ganado vacuno. Produce el corte en la siguiente secuencia: 5GATC..3 3..CTAG5 Y es isosquizmero de la enzima Sau 3A1 (procedente de Staphylococcus aureus), es decir, reconoce y digiere la misma secuencia de ADN y adems rompe en el mismo sitio de la secuencia, por lo que ambas enzimas generan extremos compatibles. Los fragmentos de 300 a 700 pb fueron seleccionados y purificados a partir del gel de agarosa en que se corri la muestra junto con un marcador de 100 pb.

4. Annealing y ligacin de linkers Los linkers son oligonucletidos sintticos autocomplementarios, que tienen secuencias de reconocimiento de las endonucleasas y para los que existen cebadores para la PCR. Forman enlaces fosfodister fcilmente con las molculas de ADN. Se ligaron los linkers SaulA y SaulB a los fragmentos de ADN cortados, utilizando para ello la enzima T4 DNA ligasa. SaulA: 5-GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3 SaulB: 5-GATCCCAAGCTTCCCGGGTACCGC-3

5. Amplificacin por PCR del linker-DNA La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica de biologa molecular que ha permitido un gran avance en los estudios, ya que permite la obtencin de grandes cantidades de ADN a partir de una pequea muestra. Emplea ciclos de altas y bajas temperaturas para desnaturalizar las hebras de ADN y dejar que las DNA polimerasas las repliquen a partir de los cebadores o primers. Para ello se utiliza un aparato llamado termociclador.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

Utilizando primers especficos para la secuencia de los linkers, se amplificaron los fragmentos de ADN de Rana dalmatina obtenidos.

6. Seleccin hbrida-enriquecimiento de la genoteca Consiste en dirigir la genoteca hacia la bsqueda de microsatlites. Se realizaron dos genotecas enriquecidas siguiendo la misma metodologa. En primer lugar se buscaron microsatlites formados por una secuencia repetida de dinucletidos, que se ha comprobado en otras especies que es muy polimrfica. El resultado de esta bsqueda no fue muy fructuoso y la cantidad de secuencias obtenidas fue baja, por lo que se opt en buscar otro tipo de microsatlites (dinucletidos y tetranucletidos) para obtener una cantidad adecuada y suficiente de secuencias polimrficas. Se utilizaron las propiedades de la estreptavidina y de las bolitas paramagnticas para separar secuencias de ADN de inters. La primera es una protena que presenta una extrema afinidad por la biotina y con la que se pueden recubrir las bolitas paramagnticas. Se fabricaron oligonucletidos con la secuencia de los microsatlites de inters y se marcaron con una cola de biotina en el extremo 3, para utilizarlos como sondas de captura de los fragmentos de ADN de Rana dalmatina con la secuencia complementaria. Estas sondas se unen fuertemente a la estreptavidina, que se encuentra recubriendo bolitas paramagnticas. Tras realizar la hibridacin con el ADN genmico y la captura de los microsatlites complementarios, se separaron las bolitas utilizando un imn (vibrating simple magnetometer). De esta manera se recuperaron los fragmentos de ADN que nos interesaban utilizando HCl y calor para separarlos de las sondas. As, se buscaron los microsatlites con la secuencia GT/AC en la primera genoteca y AG/CT, TATC/GATA y GACA/TGTC) en la segunda.

7. PCR del ADN hbrido seleccionado Los fragmentos recuperados se usaron como molde para una nueva amplificacin, utilizando de nuevo la tcnica de la reaccin en cadena de las polimerasas.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

8. Eliminacin de linkers Para eliminar los linkers se utiliz de nuevo una enzima de restriccin. Los linkers tienen adems de secuencias que posibilitan la amplificacin en la PCR, secuencias de reconocimiento para enzimas de restriccin, en este caso para la enzima Mbo 1. De esta forma se recuperaron los fragmentos del ADN original, precipitndolo con etanol y centrifugndolo.

9. Ligacin en el plsmido Los plsmidos son fragmentos de ADN extracromosmico presentes en bacterias, que se utilizan en ingeniera gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal, y porque es relativamente fcil manipularlos e insertar en ellos nuevas secuencias genticas. Para ligar los fragmentos seleccionados en el plsmido, se digirieron los plsmidos pUC19 con la enzima de restriccin Sau 3A1, la cual genera extremos cohesivos en el plsmido, compatibles con los extremos generados en los fragmentos del ADN seleccionado tras la digestin con Mbo1. Se incubaron ambos productos con la enzima T4 DNA ligasa en las condiciones apropiadas y as se obtuvieron los plsmidos hibridados, relativamente fciles de replicar in vivo.

10. Clonacin y seleccin de plsmidos que contienen microsatlites La clonacin permite una amplificacin de los fragmentos de ADN in vivo y de forma inespecfica. Se utiliz un plsmido que insert los fragmentos de ADN y se incluy en clulas competentes que replican dichos fragmentos. Las clulas competentes son bacterias tratadas con iones de calcio y choques de temperatura para alterar las envueltas, sobre todo la membrana externa, y aumentar su permeabilidad al ADN forneo, como son los plsmidos, que entran en la clula como molculas de cadena doble. El plsmido utilizado fue pUC19, un plsmido pequeo (tamao 2686pb), procedente de Escherichia coli (figura 2). En su secuencia destacan dos genes que actan como marcadores de seleccin. Un gen de resistencia al antibitico ampicilina

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

(gen AmpR), que confiere a las bacterias que incorporan este plsmido resistencia a dicho antibitico. Y el gen LacZ, que codifica para la enzima -galactosidasa, la cual degrada la lactosa y otros -galactsidos como el X-gal, permitiendo la seleccin por el mtodo White/Blue. Se transformaron clulas de Escherichia coli competentes DH5 con el plsmido pUC19, con los insertos de ADN de Rana dalmatina, para que los vectores recombinantes se multiplicaran. Una vez transformado el cultivo bacteriano se seleccionaron las bacterias que haban insertado el plsmido recombinante. El mtodo de White/Blue es usado a menudo en ingeniera gentica; est basado en la expresin del Opern Lac y sirve para reconocer las bacterias recombinantes. Consiste en utilizar los reactivos IPTG (isopropil--D-tiogalactsido), un inductor artificial del gen lacZ y X-gal, un galactsido artificial. Las colonias que han insertado el plsmido sin inserto tienen un aspecto azul por la degradacin del X-gal. Si el gen lacZ es inactivado por la presencia del inserto, las colonias son de color blanco. Adems el medio de cultivo tena ampicilina (antibitico de seleccin), por lo que las clulas que no insertaron el plsmido no podan crecer.

Figura 2. Mapa de restriccin del plsmido pUC 19 (obtenido de Fermentas Life Science).

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina

11. Rastreo (screening) El conjunto de todos los clones, cada uno con un fragmento distinto del genoma de Rana dalmatina, constituye la genoteca. El rastreo (screening) de sta nos permiti encontrar y aislar los clones de inters, que contienen los microsatlites. Un elemento clave para identificar cualquier secuencia son las sondas: fragmentos de ADN clonados que contienen parte de la secuencia que estamos buscando. stas se marcan, usualmente con istopos radioactivos, aunque tambin existen procedimientos no radioactivos, para luego poder encontrarlas cuando hayan hibridado con el fragmento de inters. Es una segunda seleccin de los microsatlites utilizando sondas con las secuencias bi y tetranucletidos antes seleccionadas (GT/AC, AG/CT y TATC/GATA), y polimerasa. A la hora de realizar la hibridacin se escogieron condiciones ms o menos relajadas para que se formaran los heterodplex aunque la homologa no fuera completa, que permitiera cierto porcentaje de malos emparejamientos entre la sonda y el ADN diana. Para ello, las colonias se incubaron en membranas neutras de nylon con capacidad de fijacin de los cidos nucleicos (Hybond-N membrane), sobre medio de cultivo slido (LB, agar y ampicilina). Previamente, estas colonias haban sido seleccionadas y recogidas una a una en placas de 96 celdillas. Las clulas de las colonias se lisaron in situ con un tratamiento suave utilizando detergente, que disuelve la membrana de las clulas y diluye las protenas cubrindolas de cargas negativas. El ADN se desnaturaliza y se fija a las membranas mediante altas temperaturas. En medio lquido (solucin de hibridacin) se mezclaron las membranas con el ADN fragmentado y desnaturalizado de Rana dalmatina, y las sondas marcadas con radioactividad y desnaturalizadas para que se produjera la hibridacin. Si el ADN sonda tiene algn grado de homologa con el de algunos clones, se empareja para generar la doble hlice. Luego se lavaron las membranas para eliminar el exceso de sonda radioactiva y el resto de ADN no hibridado, y se secaron. Finalmente, revelamos el resultado. Se pusieron los filtros en contacto con una pelcula de rayos X y al cabo de unas horas o das, la pelcula se revel. Las colonias que haban hibridado quedaron marcadas como unos puntos negros que nos indicaban su posicin. Por ltimo, se volvi a las placas matrices, donde estaban las

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 10

colonias con las clulas vivas, y se recuperaron los clones que haban insertado los microsatlites.

12. Secuenciacin de los clones positivos Los clones positivos se mandaron a secuenciar en una empresa especializada. Se disearon los primers con un programa informtico llamado PRIMER3, que tambin proporciona las condiciones ptimas de amplificacin en el termociclador, aunque haba que revisarlas y algunas veces cambiarlas porque las temperaturas en la PCR no eran las adecuadas.

13. Anlisis de los microsatlites obtenidos Utilizando el protocolo del fenol-cloroformo de nuevo, purificamos ADN de 10 individuos procedentes de tres poblaciones de la pennsula Ibrica, aisladas entre ellas: 4 de los robledales de la sierra de Izki (lava), 3 del valle de Ultzama (Navarra) y 3 de Amurrio (lava). Con estas muestras fueron probados los microsatlites aislados y los primers diseados para amplificarlos. Despus de la amplificacin, utilizando nucletidos sonda marcados con radioactividad, las muestras se corrieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, donde se pudo comprobar si los microsatlites eran mono o polimrficos en las poblaciones seleccionadas. Estos primeros muestreos se hacen para determinar si los microsatlites son polimrficos en las poblaciones ibricas. Como nicamente utilizamos 10 individuos, cuando haba ms de un alelo, definimos el microsatlite como polimrfico. Cuando se estudia una poblacin de 20-100 individuos, los microsatlites se consideran altamente polimrficos cuando se encuentran 8 alelos.

Resultados y perspectivas
En total fueron secuenciados 20 microsatlites, y diseados y construidos primers para todos ellos. El ADN procedente de 10 animales de la pennsula Ibrica fue amplificado con todos ellos para comprobar su mono o heteromorfismo. Adems se test un microsatlite de Rana latastei y tres de R. temporaria. En ocho ocasiones

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 11

se tuvo que repetir el diseo de los primers porque no amplificaron en el termociclador. Los resultados obtenidos fueron (tabla I):

Microsatlite Monomrfico Polimrfico Rtemp1 Rtemp5 Rtemp9 RlatCa17 Rdal-1 Rdal-2 Rdal-3 Rdal-4 Rdal-5 Rdal-6 Rdal-7 Rdal-8 Rdal-9 Rdal-10 Rdal-11 Rdal-12 Rdal-13 Rdal-14 Rdal-15 Rdal-16 Rdal-17 Rdal-18 Rdal-19 Rdal-20 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Tabla I. Carcter de los microsatlites obtenidos, en las poblaciones ibricas.

Las poblaciones definidas como grupo de individuos de la misma especie aislados reproductivamente de otros grupos estn sujetas a cambios evolutivos, entre los que se encuentran los cambios genticos. stos pueden actuar disminuyendo la variabilidad de las poblaciones (seleccin, deriva gentica) o aumentndola (mutacin,

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 12

migracin). La prdida de variabilidad gentica disminuye la eficacia biolgica de las especies ante los cambios ambientales. A pesar de que la mayor parte de los microsatlites obtenidos son monomrficos en las poblaciones ibricas, hay ocho que son polimrficos. Este nmero se considera adecuado y suficiente para realizar los estudios poblacionales previstos, describir la variabilidad y distribucin biolgica. Los microsatlites se amplificarn en un gran nmero de individuos de diferentes poblaciones para comprobar el nmero de alelos existente en cada uno de ellos. Las frecuencias de los alelos de ocho microsatlites son suficientes para realizar los anlisis estadsticos y poblacionales propuestos: cuantificar la variabilidad gentica (heterocigosidad) de las poblaciones ibricas, conocer su estructura gentica y comprobar si estn siendo afectadas por problemas como la endogamia, especialmente la de las ms amenazadas, cuya gestin debe acometerse a corto plazo, y valorar el flujo gnico existente entre poblaciones y grupos de poblaciones, parmetro muy importante en estudios enfocados a la conservacin ya que en hbitats fragmentados, como es el caso de la poblacin ibrica, no se pueden producir las recolonizaciones habituales, el flujo gnico se ve interrumpido, los efectos genticos pueden afectar al precario estado de la especie y tal vez sea necesario disear programas de restauracin gentica. El conocimiento de todos estos parmetros es bsico para acometer los planes de conservacin de la especie en la pennsula Ibrica. Forman parte del estudio multidisciplinar (biogeografa, hbitat, estado poblacional, etc.) al que deben someterse las especies cuando se hacen planes de conservacin.

Bibliografa
Beebee, T. J. C. & Rowe, G. 2001. Application of genetic bottleneck testing to the investigation of amphibian declines: a case study with Natterjack Toads. Conservation Biology, 15(1): 266-270. Beebee, T.J.C. & Rowe, G. 2004. An introduction to molecular ecology. Oxford University Press. 346 pp. Brede, E. G., Rowe, G., Trojanowski, J. & Beebee, T. J. C. 2001. Polymerase chain reaction primers for microsatellite loci in the common toad Bufo bufo. Molecular Ecology Notes, 1: 308-310.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 13

Burns, E. L., Eldridge, M. D. B. & Houlde, B. A. 2004. Microsatellite variation and population structure in a declining Australian hylid Litoria aurea. Molecular Ecology, 13: 1745-1757. Chan, L. M. 2007. Characterization of microsatellite markers for Couchs spadefoot toad (Scaphiopus couchii) and cross-amplification in other species of the family Scaphiopodidae. Molecular Ecology Notes, 7: 318-320. Gonzlez, E.G. (2003). Microsatlites: sus aplicaciones en la conservacin de la biodiversidad. Graellsia, 59 (2-3): 377-388. Gos, A. (2002). Rana dalmatina Bonaparte, 1840. En: Atlas y Libro Rojo de los Anfibios y Reptiles de Espaa (Pleguezuelos, J.M., R. Mrquez y M. Lizana, eds.). Direccin General de Conservacin de la Naturaleza-Asociacin Herpetolgica Espaola (2 impresin). Madrid: 120-122. Julian, S. E. & King, T. L. 2003. Novel tetranucleotide microsatellite DNA markers for the wood frog, Rana sylvatica. Molecular Ecology Notes, 3: 256-258. Rowe, G., Beebee, T. J. C. & Burke, T. 2000. A microsatellite analysis of natterjack toad, Bufo calamita, metapopulations. Oikos, 88: 641-651. Schltterer, C., Amos, B. & Tautz, D. 1991. Conservation of polymorphic simple sequences in cetacean species. Nature, 354: 63-65. Steinfartz, S., Ksters, D. & Tautz, D. 2004. Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in the Fire salamander Salamandra salamandra (Amphibia: Caudata). Molecular Ecology Notes, 4: 626-628. Strecker, U. 2006. Characterization and cross-species amplification of microsatellite loci in a Cyprinodon species flock. Molecular Ecology Notes, 6: 843-846. Vos, C. C., Antonisse-De Jong, A. G., Goedhart, P W. & Smulders M. J. M. 2001. Genetic similarity as a measure for connectivity between fragmented populations of the moor frog (Rana arvalis). Heredity, 86: 598-608. Wieczorek, A. M.; Zamudio, R., King, T. L. & Gjetva, G. 2002. Isolation of microsatellite loci in spotted salamanders (Ambystoma maculatum). Molecular Ecology Notes, 2: 313-315. Zane, L., Bargelloni, L. & Patarnello, T. 2002. Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology, 11: 1-16.

Aislamiento de microsatlites a partir de genotecas enriquecidas de Rana dalmatina 14