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Inmunologa
Volumen 22 Suplemento 1 Mayo 2003

Publicacin oficial de la Sociedad Espaola de Inmunologa
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XXIX CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE INMUNOLOGA Cdiz Del 27 al 30 de mayo de 2003
Libro de Comunicaciones y Posters
Inmunologa
www.inmunologia.org Copyright 2003 ERGON Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicacin puede ser reproducida, transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrnico o mecnico, incluyendo fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperacin de almacenaje de informacin, sin la autorizacin por escrito del titular del Copyright. Publicacin trimestral.
COMIT DIRECTOR
F. Lozano (Barcelona), Director Ejecutivo, B. Alarcn (Madrid), D. Alarcn-Segovia (Mxico), A. Ferreira (Santiago de Chile), M. Fresno (Madrid), M. Lpez-Botet (Barcelona), J.A. Lpez de Castro (Madrid), A. Nieto (Montevideo), I. Melero (Pamplona), R. Pujol-Borrell (Barcelona), J.M. Rojo (Madrid), F. Snchez-Madrid (Madrid).
COMIT EDITORIAL
J. Alberola-Ila (Pasadena), A. Alcover (Pars), R. Alvarez (Murcia), M. Alvarez de Mon (Madrid), P. Aparicio (Murcia), J. Aramburu (Barcelona), C. Ardavin (Madrid), A. Arnaiz-Villena (Madrid), A. Bootello (Madrid), L. Borche (Montevideo), J.A. Brieva (Cdiz), E. Carosella (Pars), A.C. Carrera (Madrid), E. Cuadrado (San Sebastin), C. Cuturi (Nantes), A. de la Hera (Madrid), M. del Val (Madrid), G. Dighiero (Pars), J. Egido (Madrid), P. Engel (Barcelona), G. Ercilla (Barcelona), T. Espaol (Barcelona), A. Ezquerra (Madrid), E. Fernndez-Cruz (Madrid), G. Fontn (Madrid), T. Gallart (Barcelona), R. Garca Delgado (Madrid), F. Garrido (Granada), J. Gavilondo (La Habana), M.L. Gaspar (Madrid), A. Gay (Palma de Mallorca), C. Gelp (Barcelona), E. Gmez de la Concha (Madrid), R. Gonzlez-Amaro (San Luis Potos), A. Gonzlez-Fernndez (Vigo), C. Gutirrez (Oviedo), J.C. Gutirrez-Ramos (Boston), D. Jaraquemada (Barcelona), C. Lahoz (Madrid), Z. Layrisse (Caracas), F. Leyva-Cobin (Santander), C. Lpez-Larrea (Oviedo), M. Lpez-Cabrera (Madrid), M. Lpez-Trascasa (Madrid), A. Madrigal (Londres), R.A. Margni (Buenos Aires), J. Martnez-Laso (Madrid), E. Martnez-Naves (Madrid), N. Matamoros (Palma de Mallorca), F. Merino (Bilbao), F. Mollinedo (Salamanca), I. Moneo (Madrid), A. Nez-Roldn (Sevilla), M. Ortiz de Landzuri (Madrid), L. Ortiz Ortiz (Mxico), M. E. Patarroyo (Bogot), J. Pea-Martnez (Crdoba), J.M. Redondo (Madrid), J.R. Regueiro (Madrid), S. Rodrguez de Crdoba (Madrid), J.L. Rodrguez-Snchez (Barcelona), P. Rubinstein (New York), J. Sancho (Granada), M. Santamara (Crdoba), L. Santos-Argumedo (Mxico), A. Silva (Madrid), R. Solana (Crdoba), J.L. Subiza (Madrid), M.L. Toribio (Madrid), J.L. Vicario (Madrid), C. Vilches (Madrid), R. Vilella (Barcelona), J. Vives (Barcelona), J. Yage (Barcelona), A. Zapata (Madrid).
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SECRETARA EDITORIAL
M. Bayo, Servei dImmunologia, Hospital Clnic, Villarroel 170, 08036 Barcelona, Espaa. Tel: +34 934 544 920; Fax: +34 934 518 038; E-mail: mbayo@medicina.ub.es
SECRETARA DE REDACCIN
Maria Rosa Sarrias i Forns
Inmunologa
www.inmunologia.org
SUMARIO
Vol. 22, Supl. 1, Mayo 2003
COMUNICACIONES ORALES Y POSTERS Sesin 01: Inmunodeficiencias Comunicaciones Orales (0101-0113) . . . . . . . . . 89 Posters (0114-0120) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Sesin 02: Linfocitos T: precursores, TCR y activacin Comunicaciones Orales (0201-0210) . . . . . . . . . 95 Posters (0211-0218) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Sesin 03: Linfocitos B y otras clulas del sistema inmune Comunicaciones Orales (0301-0310) . . . . . . . . 102 Posters (0311-0314) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 Sesin 04: MHC: estructura y funcin Comunicaciones Orales (0401-0412) . . . . . . . . 106 Posters (0413-0419) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Sesin 05: Inmunoterapia y terapias emergentes Comunicaciones Orales (0501-0507) . . . . . . . . 112 Posters (0508-0509) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Sesin 06: Aplicaciones del MHC e inmunologa del transplante Comunicaciones Orales (0601-0612) . . . . . . . . 116 Posters (0613-0631) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
Sesin 07: HIV y SIDA Comunicaciones Orales (0701-0708) . . . . . . . . 126 Posters (0709-0719) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Sesin 08: Inmunologa tumoral Comunicaciones Orales (0801-0810) . . . . . . . . 133 Posters (0811-0823) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Sesin 09: Autoinmunidad y autoinflamacin Comunicaciones Orales (0901-0921) . . . . . . . . 141 Posters (0922-0929) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 Sesin 10: Migracin celular: molculas de adhesin, quemoquinas y sus receptores Comunicaciones Orales (1001-1010) . . . . . . . . 151 Posters (1011-1023) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .155 Sesin 11: Linfocitos T y NK: funcin efectora y apotosis Comunicaciones Orales (1101-1112) . . . . . . . . 159 Posters (1113-1115) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Sesin 12: Polimorfismos No-MHC y su asociacin con enfermedades Comunicaciones Orales (1201-1212) . . . . . . . . 165 Posters (1212-1215) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 ndice de Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
Informacin para los autores

Inmunologa aceptar para su publicacin trabajos redactados en espaol o en ingls, aunque se considerar preferible y prioritario el uso del idioma ingls, que aborden cualquier aspecto clnico, experimental o metodolgico dentro de la Inmunologa. Dichos trabajos habrn de ser inditos, estar comprendidos en algunas de las secciones en que se estructura la revista y cumplir los requisitos de uniformidad para los manuscritos enviados a revistas biomdicas (www.icmje.org). Editoriales: Recoger estados de opinin sobre aspectos relacionados con la Inmunologa, preferentemente en conexin con algunos de los trabajos publicados en el mismo nmero de la revista. Si bien estos trabajos sern encargados por la Direccin de la revista, cualquier persona interesada en colaborar en esta seccin deber dirigirse previamente cualquier miembro del Comit Director. Originales: Comprender trabajos inditos de investigacin clnica o experimental en Inmunologa que puedan considerarse de utilidad e inters para nuestra comunidad cientfica. Revisiones: Acoger contribuciones en las que se realice una completa puesta al da de algn tema de inters dentro de la Inmunologa. Se dar preferencia a aquellos trabajos que aborden de forma crtica las implicaciones fisiopatolgicas del tema analizado y cuya bibliografa contenga citas lo ms recientes y relevantes posibles. Esta seccin tambin acoger ensayos de carcter terico, bien fundamentados, que propongan nuevas ideas o hiptesis de trabajo. Panorama: Recoger contribuciones de inters que no puedan ser incluidas en alguna de las secciones anteriormente citadas tales como reuniones o conferencias sobre temas relacionados con la Inmunologa, temas de actualidad cientfico-social y sanitario, etc. Cartas al Director: Recoger breves comentarios o crticas con relacin a trabajos publicados recientemente en nuestra o en otras revistas, as como temas de inters cientfico, educativo, sanitario y social. breve (conciso). En cualquier caso, la extensin deber estar en funcin exclusiva de la densidad de los datos y resultados presentados. A ttulo orientativo, se considera deseable no superar las 5000 palabras (sin incluir resumen, bibliografa y pies de tablas y figuras) en los artculos originales y revisiones y las 2000 palabras en las dems secciones. 2. En la primera pgina figurarn exclusivamente y, por este orden, los siguientes datos: ttulo del trabajo, nombre y apellidos de los autores, centro donde se realiz aqul y direccin completa (con Telfono, Fax y E-mail) del autor encargado de la correspondencia. 3. En la segunda pgina figurarn, por este orden: ttulo del trabajo, resumen del mismo y palabras clave en ingls (title, summary and key words). En la tercera pgina figurarn los mismos items pero en espaol; esta pgina no ser obligatoria en el caso de manuscritos redactados en ingls procedentes de pases no hispanohablantes. El resumen incluir la intencionalidad del trabajo, resultados obtenidos ms destacados y principales conclusiones, expuestos de tal forma que pueda ser comprendido sin necesidad de recurrir a la lectura completa del artculo. Ser obligatorio tanto en Revisiones como Originales y su extensin mxima no exceder de 250 palabras. Al pie del resumen se indicarn de 3 a 10 palabras clave extradas del Medical Subject Headings (MeSH) de Index Medicus (http://www.nlm. nih.gov/mesh/meshhome.html). 4. Estructura del texto. Variar segn la seccin a que se destine: a) Originales. Normalmente constarn de los siguientes apartados: 1) Introduccin: deber ser breve y contendr la intencionalidad y los fundamentos del trabajo, redactado de tal forma que el lector pueda comprender el texto que le sigue; 2) Material y mtodo: se expondr el material utilizado en el trabajo, humano o de experimentacin, sus caractersticas, criterios de seleccin y tcnicas empleadas, facilitando los datos necesarios, bibliogrficos o directos, para que la experiencia relatada pueda ser repetida por el lector; se har constar el cumplimiento de las normas de buena prctica clnica y de experimentacin animal; 3) Resultados: referir los datos obtenidos en la realizacin del trabajo, sin ms comentarios que los estrictamente necesarios para el encadenamiento lgico de su exposicin; 4) Discusin: los autores expondrn sus opiniones sobre la base de aquellos resultados, posible interpretacin de los mismos, aplicacin prctica, comparacin con los resultados obtenidos por otros autores en publicaciones similares, sugerencias para futuros trabajos sobre el tema, etctera. Los Originales tambin podrn adoptar la forma de Comunicaciones Breves en que los apartados arriba indicados (Introduccin, Materiales y mtodo, Resultados y Discusin) podrn presentarse de forma integrada, debiendo aadirse un apartado final de Conclusiones.
PRESENTACIN DE LOS TRABAJOS 1. Los trabajos debern ser remitidos preferentemente por va electrnica, bien directamente a la Secretara Editorial (lozano@medicina.ub.es), o bien a cualquier miembro del Comit Director (vanse direcciones adjuntas al final de este texto). Debern estar mecanografiados a doble espacio, en hojas tamao DIN A4, numeradas en el ngulo superior derecho, preferiblemente en formato Microsoft Word (texto) o Power Point (figuras). Asimismo, debern ir acompaados de una carta de presentacin en la que se solicite su examen para su posible publicacin en alguna de las secciones de Inmunologa y se especifique, en su caso, el nombre del miembro del Comit Editorial que promovi su envo. Aunque no existe una limitacin de espacio predeterminada para ninguna de las secciones, es aconsejable que la exposicin de todas las contribuciones se ajuste a un estilo sinttico y

b) Otros trabajos (Editoriales, Revisiones, Panorama, Cartas al Editor): Se estructurarn a criterio del autor o segn modelos convencionales en revistas cientficas. 5. Agradecimientos. Incluir la mencin de becas y ayudas a la investigacin que han permitido la realizacin del trabajo, as como agradecimientos a personas e instituciones que los autores estimen pertinentes. 6. La bibliografa ser referida, en hojas aparte, segn el orden de aparicin en el texto. La numeracin ser correlativa y, dentro del texto, se indicar entre parntesis. No es recomendable la utilizacin de referencias bibliogrficas de actas de reuniones y de libros de texto. No incluir citas de artculos sometidos a examen, las cuales debern ser referidas en el texto, entre parntesis, como observaciones no publicadas. Se utilizar el estilo reseado a continuacin basado en los Requisitos de uniformidad (estilo Vancouver). Artculos de revistas: Apellidos e iniciales de todos los autores cuando son seis o menos y de los seis primeros seguido de la expresin et al cuando son siete o ms, ttulo del trabajo, nombre de la revista, ao de publicacin, volumen y pginas inicial y final. Los nombres de las revistas deben abreviarse segn el estilo utilizado en el Index Medicus (List of Journals Indexed incluido en el nmero de Enero de Index Medicus y en la web de la biblioteca de la NLM http://www.nlm.nih.gov). Ejemplos: 1. Delgado P, Fernandez E, Dave V, Kappes D, Alarcon B. CD3delta couples T-cell receptor signalling to ERK activation and tymocyte positive selection. Nature 2000; 406: 426-430. 2. Marrack P, Kappler J. The antigen specific MHCrestricted receptor on T cells. Inmunologa 1986; 5: 312. Captulo de un libro: 3. Carrera AC, Martnez-A C. Lymphoid kinase detection and activation. En: Lefkovits I, editor. Immunology Methods Manual. San Diego, Academic Press, 1997; Vol.2, p. 1163-1181. 4. Denis K, Kennett RH, Kinman N, Molinario C, Sherman L. Defining the B-cell repertoire with hybridomas derived from monoclonal fragment cultures. En: Kennett RH, McKearn TJ, Bechtol KB, editors. Monoclonal antibodies. Hybridomas: a new dimension in biological analyses. 2 edicin. New York, Plenun Press, 1981; p. 49-59. 7. La iconografa de los trabajos ser de dos tipos: tablas y figuras. Ambas se enviarn en hojas aparte y numeradas correlativamente, con cifras romanas (tablas) o arbigas (figuras), segn su orden de aparicin en el texto. Las tablas irn encabezadas por un enunciado o ttulo en la parte superior y con las notas aclaratorias al pie. Las figuras debern ser de excelente calidad y en blanco y negro. Podrn ser grficos o fotografas y deber cuidarse su confeccin de forma que pueda comprenderse su significado sin necesidad de recurrir al texto. Las dimensiones sern tales que su anchura sea de 7 cm (una columna) o 15 cm (doble columna) y que su altura sea la menor posible. La publicacin de ilustraciones en color ser posible previo acuerdo econmico con la editorial. Las figuras llevarn pegadas una etiqueta autoadhesiva en el reverso indicando la numeracin, la parte superior con una flecha y nombre del autor. No debe escribirse directamente en el dorso de las figuras. Los pies de las figuras se mecanografiarn a doble espacio en hoja aparte y debern incluir un ttulo breve y una explicacin concisa que permita su comprensin sin necesidad de recurrir al texto. 8. Abreviaturas. La primera vez que se utilicen en el texto debern ir entre parntesis y precedidas del trmino/s al/los que sustituya. REVISIN Y PUBLICACIN La actuaciones y decisiones tomadas durante el proceso de revisin y publicacin estn de acuerdo con las recomendaciones sobre poltica editorial aprobadas por el Consejo de editores cientficos (www.CouncilScienceEditors.org/sevices_ DraftApproved.shtlm). Cada trabajo ser analizado por al menos dos revisores, generalmente del Comit Editorial. Sus comentarios, junto con la recomendacin del miembro del Comit de Directores que recibi el artculo, sern enviados al Director Ejecutivo. Este podr rechazar los trabajos no favorecidos por la evaluacin, o bien indicar al autor aquellas modificaciones que se juzguen necesarias para su aceptacin. Los criterios de aceptacin sern el rigor, la novedad y/o la utilidad de la aportacin. En caso de aceptacin del trabajo, los autores recibirn para su correccin las pruebas de imprenta, que debern ser devueltas dentro de las 72 horas siguientes a su recepcin. El primer autor recibir una copia en formato pdf de su trabajo una vez publicado (excepto las Cartas al Director). El Comit Director y la empresa editora de Inmunologa, as como la Sociedad Espaola de Inmunologa no se responsabilizan de los conceptos, opiniones o afirmaciones sostenidas por los autores en sus trabajos. Todos los artculos sern propiedad de Inmunologa no pudiendo reproducirse, ni siquiera en parte, sin previo consentimiento de la misma. Una vez publicado el trabajo, el autor cede en exclusiva a Inmunologa los derechos de reproduccin, distribucin, comunicacin de carcter pblico y traduccin del trabajo.

COMIT DIRECTOR. Los trabajos debern enviarse al editor ms prximo al tema del trabajo. BALBINO ALARCN Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa Consejo Superior de Investigaciones Cientficas Universidad Autnoma de Madrid Cantoblanco 28049 Madrid-ESPAA Tel +34 91 3978458; Fax +34 91 3974799 balarcon@cbm.uam.es ARTURO FERREIRA Departamento de Inmunologa Instituto de Ciencias Mdicas de la Universidad de Chile Santiago de ChileCHILE Tel +56 2 678 6724; Fax +56 2 735 3346 aferreir@machi.med.uchile.cl MANUEL FRESNO ESCUDERO Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CSIC), Universidad Autnoma, Cantoblanco, 28049 Madrid. Tel.: 34-913978413; Fax: 34-913974799 E-mail: mfresno@cbm.uam.es MIGUEL LOPEZ-BOTET Departament de Cincies Experimentals i de la Salut Dr Aiguader 82 08003 BarcelonaESPAA Tel +34 93 5422847; Fax +34 93 5422802 miguel.lopez-botet@cexs.upf.es JOSE ANTONIO LOPEZ DE CASTRO Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa Universidad Autnoma de Madrid, Cantoblanco 28049 MadridESPAA Tel +34 91 3978050; Fax +34 91 3978087 aldecastro@cbm.uam.es FRANCISCO LOZANO, Director Ejecutivo Servei d'Immunologia Hospital Clnic Villarroel 170 08036 BarcelonaESPAA Tel +34 93 4544920; Fax: +34 93 4518038 lozano@medicina.ub.es IGNACIO MELERO Divisin de Terapia Gnica Departamento de Medicina Interna Facultad de Medicina Universidad de Navarra Irunlarrea 1 31008 PamplonaESPAA Tel +34 94 8425668; Fax +34 94 8425649 imelero@unav.es ALBERTO NIETO CADENAZZI Ctedra de Inmunologa Facultad de Qumica Avda. Alfredo Navarro 3051 2 Casilla de Correos 1157 MontevideoURUGUAY Tel +598 2 9241884; Fax +598 2 9246079 anieto@bilbo.edu.uy RICARDO PUJOL-BORRELL Unidad de Inmunologa, Departamento de Biologa Celular, Fisiologa e Inmunologa, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol, Ctra. Canyet s/n, 08916 Badalona, Barcelona Tel: (+34) 93-4978892; Fax: (+34) 93-4978843 Ricardo.Pujol@uab.es JOSE MARIA ROJO Centro de Investigaciones Biolgicas Consejo Superior de Investigaciones Cientficas Velzquez 144 28006 MadridESPAA Tel +34 91 5611800 (Ext. 4217); Fax +34 91 5627518 jmrojo@cib.csic.es FRANCISCO SANCHEZ Servicio de Inmunologa Hospital de La Princesa Diego de Len 62 28006 MadridESPAA Tel +34 91 5202370; Fax +34 91 5202374 fsmadrid/princesa@hup.es
Information for authors

Inmunologa is devoted to publish articles in Spanish or English, the latter being considered preferable and of higher priority, describing clinical, experimental or methodological data within any field of Immunology. The articles should be completely new and encompassed in any of the Journal sections (Editorial, Originals, Reviews, Panorama and Letters to the Editor). Articles should fulfil the uniform requirements of manuscripts submitted to biomedical journals (www.icmje.org). Editorials. Should cover states of opinion on the field of Immunology, preferably related to the topics covered by the same issue of the Journal. Editorials are written only by invitation of the Committee of Directors. Interested authors should contact with any member of the Committee of Directors. Originals. Should cover completely new works on clinical or experimental investigations encompassed in the field of Immunology and which are considered of benefit and interest to the scientific community. Reviews. Should cover original contributions updating topics of broad scientific interest within the field of Immunology. Works critically reviewing the physiopathological implications of the topic subjected to analysis and containing the most recent and relevant citations are highly desired. This section will also cover well-reasoned theoretical essays, which propose new ideas and working hypothesis. Panorama. Should cover contributions of interest which do not fit in other Journal sections such as scientific meetings and conferences, scientific-social topics of current importance, etc. Letters to the Editor. Should cover brief comments and criticisms on recently published articles, as well as on topics of current scientific, educational, health care and social interest. SUBMISSION AND ORGANISATION OF MANUSCRIPTS 1. Manuscripts should be submitted preferably by electronic mail, directly to the Editorial Office (lozano@medicina.ub.es) or to any member of the Committee of Directors (see enclosed addresses below). Manuscripts should be typewritten, doublespaced, with wide margins on A4 paper, and numbered at the top right side. Microsoft Word (text) and Microsoft Power Point (figures) files are preferred. Each contribution must be accompanied by an introductory cover letter requesting consideration for publication in the appropriate the Journal section, and specifying, if applicable, the name of the member of the Editorial Committee which promoted its submission. There are no length restrictions to any of the Journal sections, but it is advisable to use a concise style. The length of the manuscript will be always a function of the density of the results presented. As a guidance, it is desirable not to exceed 5000 words for originals and reviews (excluding summary, references and figure and table legends), and 2000 words for the others sections. 2. The first page should include the title, authors names, institution(s) in which the study was done, and the complete address (including telephone, fax and e-mail) of the corresponding author. 3. All articles, except Letters to the Editor, must include a second page in English with the full title, a summary of less than 250 words and 3-10 MeSH keywords (www.nlm.nih.gov/ mesh/meshhome.html). A third page including the same items in Spanish will not be mandatory for manuscripts written in English coming from non-Spanish speaking countries. The summary should state the rationale, objectives, and main findings and conclusions in a comprehensible manner. 4. The structure of the text will vary depending on the Journal section: a) Originals. They should be arranged in the following sections: 1) Introduction, should contain the background and reasons for doing the work in a synthetic manner; 2) Materials and Methods, should provide the reader with all the necessary information to reproduce the reported results, and, if applicable, it must specify the fulfilment of the good clinical and animal research practice procedures; 3) Results, should present the data in a concise manner, with no other comments than those strictly required for their complete understanding; 4) Discussion, should include the significance of the work, its limitations and advantages, reference to others' work, and further work that should be done. Originals presented in the form of Brief Communications will be also accepted. These reports should contain a summary and all the above mentioned sections should be unified. A final paragraph of Conclusions should be included. b) Other works (Editorials, Reviews, Panorama, Letters to the Editor) should be arranged according to author criteria or to standard conventions followed by scientific journals. 5. Acknowledgements. Should cite individuals, institutions, grants, etc. that, under author criteria, have helped and/or contributed to the study. 6. References, published or in press (including those of tables and figures legends), should be numerically identified in the text within parentheses and grouped at the end of text in numerical order of appearance.. Manuscripts submitted or in preparation, and unpublished observations, should be included in the text in parentheses. References should include the name of all authors when less than 6 (or only the first six, followed by et al., when more than 6), title, journal (abbreviated according to Index Medicus, http://www.nlm.nih.gov), year, volume, first and last pages. Examples:
Information for authors

1. Delgado P, Fernandez E, Dave V, Kappes D, Alarcon B. CD3delta couples T-cell receptor signalling to ERK activation and tymocyte positive selection. Nature 2000; 406: 426-430. 2. Marrack P, Kappler J. The antigen specific MHC-restricted receptor on T cells. Inmunologa 1986; 5: 3-12. 3. Carrera AC, Martnez-A C. Lymphoid kinase detection and activation. In: Lefkovits I, editor. Immunology Methods Manual. San Diego, Academic Press, 1997; Vol.2, p. 11631181. 4. Denis K, Kennett RH, Kinman N, Molinario C, Sherman L. Defining the B-cell repertoire with hybridomas derived from monoclonal fragment cultures. In: Kennett RH, McKearn TJ, Bechtol KB, editors. Monoclonal antibodies. Hybridomas: a new dimension in biological analyses. 2 edition. New York, Plenun Press, 1981; p. 49-59. 7. Illustrations. Tables and Figures should be submitted one per page, separately at the end of the text. Tables with a descriptive title and footnotes should be identified with Arabic numerals in order of appearance in the text. Figures of excellent quality will be of 7 cm (one column) or 15 cm (full page) in width so that the height is minimised, and should be identified with Arabic numerals in the back. Figure legends should be numbered and grouped in a single separate page. Only black and white Figures will be accepted, unless otherwise agreed with the Editor. 8. Abbreviations. Should be defined at their first use in the text, within parenthesis. REVISION AND PUBLICATION The review and publication process is in agreement with the editorial policy statements approved by council of science editors (CSE) (www.CouncilScienceEditors.org/services_ DraftApproved.shtml). At least two referees, normally members of the Editorial Board, will review each manuscript. Their comments, together with the recommendation of the member of the Committee of Directors who received the article, will be sent to the Executive Director, who may reject unsuitable work or propose modifications before final acceptance. Acceptance of papers is based on rigour, originality and/or usefulness of the observation. Galley proofs of accepted manuscripts should be returned within 72 hours. The first author will receive a copy in pdf format of each accepted article. The contents and opinions included in the articles are responsibility of authors, and do not represent the opinions of the magazine or the Society, unless otherwise specified. In submitting an article, the author vouches that it has not been published and is not being and will not be submitted to other journals if published, and accepts that, in the event, the copyright of the article will belong to Inmunologa.
Comunicaciones
Inmunologa Vol. 22 / Supl. 1/ Mayo 2003: 89-171
Sesin 01. Inmunodeficiencias

Comunicaciones Orales: 0101-0113 0101. ANOMALAS EN EL GEN DE LA CADENA DEL RECEPTOR DE LA IL-7 (IL-7R) RESPONSABLES DE UNA FORMA DE INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA (IDCS). R. Cambronero1, B. Snchez2, A. Ferreira1, G. Fontn1, M.C. Garca Rodrguez1. 2Unidad de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Virgen del Roco. Sevilla Introduccin. La inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) es causada por diferentes defectos genticos. Una de las formas menos frecuentes es aquella que cursa con un fenotipo T-B+NK+, y que es debida a anomalas en el gen de la cadena a del receptor de la IL-7 (IL-7R). Objetivos. Diagnosticar a nivel molecular la anomala gentica responsable de la IDCS en un paciente cuyo fenotipo celular nos hizo sospechar una alteracin en el gen IL-7R. Pacientes y Metodologa: El enfermo estudiado, con el antecedente de una hermana fallecida a los 7 meses de probable IDCS, present desde los primeros meses de vida muguet, otitis, una neumona intersticial e hipogammaglobulinemia. El fenotipo celular encontrado fue T-B+NK+ y la proliferacin celular in vitro con distintos mitgenos estuvo ausente. El gen que codifica para la IL-7R_ se analiz, en el paciente y en sus padres, mediante secuenciacin automtica. Resultados. En este enfermo encontramos dos mutaciones en heterocigosis, una en el exn 4 G556A (W178X) de origen materno, y otra en el exn 3 A335C (S105R) heredada del padre. Estudiados ms de 100 cromosomas de controles sanos no hemos encontrado la mutacin de origen paterno en ninguno de ellos, lo que descarta que se trate de un polimorfismo. Sin embargo, este gen presenta numerosos polimorfismos, entre los que hemos descrito los siguientes: T517C, A434G (exn 4), C753T (exn 6) y G1088A (exn 8). Conclusiones. Nos parece importante poder caracterizar la anomala gentica en esta forma de IDCS autosmica recesiva. La incidencia de este tipo de IDCS es muy escasa y creemos que es el primer caso encontrado en nuestro pas. 0102. SNDROME DE HIPER IgM TIPO 2 (HIGM-2): ESTUDIO DE CUATRO CASOS. R. Cambronero1, T. Espaol2, A. Ferreira1, G. Fontn1, M.C. Garca Rodrguez1. 1Unidad de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid. 2Unidad de Inmunologa. Hospital Vall dHebrn. Barcelona Introduccin. El sndrome HIGM-2 es una de las formas autosmicas recesivas de sndrome de hiper IgM descritas hasta el momento. Clnicamente es similar a la forma ligada al cromosoma X (HIGM1), siendo su causa mutaciones en el gen de la citidn-deaminasa inducida tras activacin (AID). Objetivos. Diagnosticar cuatro pacientes de tres familias (A, B y C) con posible sndrome de hiper IgM. Pacientes y Metodologa. Los pacientes estudiados acuden a nuestra consulta por presentar infecciones bacterianas de repeticin de inicio temprano, y presencia de adenopatas en algunos de ellos. Realizamos cuantificacin de inmunoglobulinas, fenotipaje de linfocitos, expresin de CD40L y produccin in vitro de IgE tras estmulo con anti-CD40 e IL-4. El gen que codifica para AID se analiz mediante secuenciacin automtica. Resultados. Los cuatro pacientes presentaron niveles sricos de IgM elevados con cifras de IgG e IgA muy disminuidas, siendo la expresin de CD40L normal en todos ellos. En cuanto al estudio molecular del gen de AID, el enfermo A es homocigoto para la mutacin C146T (R24W), siendo su madre heterocigota para dicha alteracin. Esta misma mutacin est presente en heterocigosis en los dos hermanos de la familia B, siendo esta mutacin heredada de la madre, mientras que el cambio g/t en posicin +1 del intrn 2 es heredado del padre. La paciente C es homocigota para la mutacin G336C (C87S), su madre es heterocigota y en el padre no hemos encontramos ninguna alteracin, lo que no descarta una posible delecin allica. Conclusiones. Los pacientes estudiados presentan un fenotipo similar, aunque ms benigno, que el del sndrome HIGM-1, y todos ellos muestran una expresin de CD40L normal. El estudio molecular confirm que se trata de la forma autosmica recesiva del sndrome de hiper IgM al detectar en todos ellos mutaciones en el gen que codifica para AID. Este diagnstico definitivo tiene implicaciones importantes a la hora de dar un consejo gentico adecuado. 0103. DESCRIPCIN DE UNA NIA CON AUSENCIA SIMULTNEA DE LINFOCITOS NATURAL KILLER Y LINFOCITOS. B. E. Mancebo1, L.M. Allende1, P. de Pablos1, J.I. Sanchez2, V. Ramos2, P. Rojo2, S. Guillen2, J. Clemente2. 1Departamento de Inmunologa. 2Departamento de Lactantes e Inmunodeficiencias. Hospital 12 de Octubre. Madrid Caso clnico. Nia de 5 meses de edad previamente sana que acudi al hospital por catarros de un mes de evolucin y lceras orales. El embarazo y el periodo neonatal fue normal no habiendo historia de consaguinidad paterna. La nia ha recibido el calendario vacunal correspondiente sin complicaciones. La exploracin fsica mostr distress respiratorio, hepatoesplenomegalia y lcera faringea de un 1 cm, el distress respiratorio fue de rpida evolucin. Las radiografas mostraron infiltrado difuso bilateral. El lquido del lavado broncoalveolar revel infeccin por Pneumocystis carinii y citomegalovirus (CMV). Se comenz tratamiento con cotrimoxazol, ganciclovir e inmunoglobulinas especficas de CMV. CMV tambin se aisl en orina, secreciones farngeas y sangre. La paciente muri 25 das despus del ingreso debido a fallo multiorgnico y respiratorio. Estudio de laboratorio. Los resultados del inmunofenotipo linfocitario fueron linfocitos T CD3+: 98%, linfocitos Natural Killer (NK) CD16+CD56+CD3-: 0,4%, linfocitos B CD19+: 0,9%. La mayora de los linfocitos CD4 son linfocitos nave (CD4+CD45RA+). Inmunidad humoral: IgG 61mg/dL (rango normal: 170-560), IgM 7,61 mg/dL (normal: 30-100), IgA fue menor de 6 mg/dL (normal: 7-50). La respuesta linfoproliferativa inducida por mitgenos estaba alterada, pero la capacidad de produccin de interferon gamma en linfocitos estimulados con PMA+ionomicina fue normal. Adems la paciente mostr niveles sricos elevados de IL-6 e IL-10 y normales de interferon
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gamma. Estudios post-mortem: infeccin diseminada por CMV y P. carinii (incluyendo meningoencefalitis). Tambin, se encontr deplecin de los linfocitos B tanto a nivel tmico y esplnico. Conclusiones. La deficiencia de linfocitos NK es muy rara y normalmente se encuentra asociada con otras imunodeficiencias primarias como SCID, CVID, LAD, HIM. Este caso presenta una profunda disminucin de linfocitos NK y difiere de otros casos publicados en que la paciente adems presenta una deficiencia de linfocitos B circulantes. La deficiencia de linfocitos NK provoca una mayor susceptibilidad a padecer infecciones por CMV lo cual destaca la importancia de estas clulas en el control de este tipo de infecciones. 0104. DEFICIENCIA PARCIAL DE IFN-R1 EN TRES PACIENTES PROCEDENTES DE DOS FAMILIAS. M.I. GarcaLaorden1, A. Garca-Saavedra1, M.C. lvarez-Santana1, M. Martnez-Saavedra1, G. Hernndez-Daz1, A. Francs2, C. Rodrguez-Gallego1. 1Servicio de Inmunologa, Hospital de Gran Canaria Dr. Negrn. Las Palmas de Gran Canaria. 2Servicio de Medicina Interna. Hospital Insular. Las Palmas de Gran Canaria La deficiencia de IFN-R1es una de las anomalas genticas presentes en pacientes con susceptibilidad mendeliana a enfermedad por micobacterias. La forma ms frecuente es el dficit parcial autosmico dominante por delecciones en el exn 6. El dficit completo es debido a mutaciones que impiden la expresin del receptor o la unin a su ligando. Adems, se ha descrito una familia con dficit parcial autosmico recesivo. Presentamos 3 pacientes, de dos familias, con deficiencia de IFN-R1. MML present a los 7 aos de edad adenopatas cervicales que requirieron ciruga. A los 22 aos present una osteomielitis de cadera y fmur. La histopatologa mostr histiocitos con escasas micobacterias, no identificadas. El paciente se encuentra actualmente recuperado tras cinco meses de quimioterapia antimicobacteriana. Su hermano, OML, desarroll a los 17 aos una infiltracin mediastnica por una micobacteria no identificada, que fue tratada satisfactoriamente con terapia tuberculosttica clsica. La Histopatologa mostraba granulomas bien formados paubacilares. EGC es una nia de 5 aos que presentaba adenopatas de dos aos de evolucin. Los cultivos, PCR y tincin para micobacterias fueron negativos. Tras el diagnstico de deficiencia de IFN-R1 se identific un Mycobacterium abscessus resistente a la mayora de antimicobacterianos. La paciente fue tratada con rhIFN-. El examen con citometra de flujo mostr una expresin reducida del receptor con algunos MoAbs en las clulas de los pacientes. La estimulacin con IFN- induca un bajo incremento de CD64 en los monocitos y PMN de los pacientes, mientras que el aumento era considerable en las clulas de familiares sanos y controles. La tasa de produccin de TNF- por las PBMCs de los pacientes tras estimulacin con LPS y cantidades crecientes de IFN- respecto a la estimulacin con LPS slo fue tambin reducida. Los tres pacientes presentaron una mutacin T188G, Val63Gly, en el sitio de unin del receptor al IFN-. 0105. DEFICIENCIA DE IL12R1 EN UNA NIA CON INFECCIN DISEMINADA POR MYCOBACTERIUM AVIUM COMPLEX Y SALMONELLA ENTERITIDIS. M. MartnezSaavedra1, C. Fieschi2, M.I. Garca-Laorden1, J.L. Casanova23, M.C. lvarez-Santana1, G. Hernndez-Daz1, A. GarcaSaavedra1, M.I. Campos-Herrero4, C. Rodrguez-Gallego1.
Servicios de Inmunologa1 y Microbiologa4 Hospital de GC Dr. Negrn. Las Palmas de Gran Canaria. Laboratorio de Gentica humana de Enfermedades Infecciosas2. Universidad Ren Descartes. Paris. Francia. Unidad de Inmunologa Peditrica y Hematologa3. Hospital Necker. Paris La Susceptibilidad Medeliana a enfermedad micobacteriana puede estar causada por mutaciones en los genes codificantes de IFNR1, IFNR2, IL12Rb1, IL12p40, STAT-1 o STAT-4 que originan un defecto en la inmunidad mediada por el IFN. Los pacientes presentan generalmente infeccin diseminada por especies de micobacterias ambientales no tuberculosas, infeccciones por Mycobacterium tuberculosis de mala evolucin o BCGosis postvacunacin. La salmonelosis no tifoideas se presenta en menos de la mitad de los casos. Presentamos la historia clnica, estado inmunolgico y tratamiento de una paciente que ha sufrido 4 episodios de gastroenteritis severa y septicemia causada por Salmonella enteritidis. A los 3 aos y 4 meses, desarroll una infeccin diseminada por Mycobacterium avium con mltiples adenopatas mesentricas. La biopsia de un ndulo linftico mostr macrfagos multibacilares y necrosis, sin lesiones granulomatosas tuberculoides. La reaccin intradrmica a PPD fue negativa. La respuesta proliferativa de los PBMCs de la paciente a mitgenos, anticuerpos monoclonales e IL-2 fue normal. Sin embargo, se observ un descenso drstico en la produccin de IFN de los PBMCs de la paciente en respuesta a PHA, PHA/IL-12, CD2/IL-12 y CD2/CD28. El anlisis de lneas linfoblastoideas de la paciente mostr un severo dficit de produccin de IFN tras estimular con cantidades crecientes de IL-12, respecto a las lneas celulares de sus progenitores y un control sano,. El anlisis por citometra de flujo de las lneas celulares mostr una ausencia de expresin de IL12R1 en las clulas de la paciente, con una expresin normal de IL12R2 y CD25. La paciente es homocigota para la mutacin 1791+2T>G (intrn 15) que impide la expresin de IL12R1. Se administr quimioterapia antimicrobiana mltiple y a la edad de 3 aos y 8 meses se inici la terapia con IFN con una rpida respuesta clnica en los 3 meses siguientes. 0106. DEFICIENCIA DEL COMPONENTE C7 DEL COMPLEMENTO EN DOS FAMILIAS ESPAOLAS. S. Barroso, M.F. Vzquez-Bermdez, A.J. lvarez, A. Alarcn1, M. Lpez-Trascasa2, I. Wichmann, A. Nez-Roldn, B. Snchez. Servicio de Inmunologa, 1Unidad de Infecciosos. Hospital Universitario Virgen del Roco. Sevilla. 2Servicio de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid Se han descrito diferentes mutaciones que dan lugar a una deficiencia del componente C7 del complemento, un defecto molecular que se asocia clnicamente con un aumento de la susceptibilidad a padecer infecciones recurrentes por Neisseria. Hemos realizado la amplificacin por PCR y posterior secuenciacin de los 17 exones del gen que codifica C7 para determinar las bases moleculares de este dficit en dos familias espaolas en las que uno o varios miembros presentaron una capacidad hemoltica en suero indetectable. En ambas familias hemos encontrado una mutacin de cambio de sentido (G357R), descrita previamente en individuos judos marroques de origen sefard, combinada con otra mutacin no descrita previamente. En la familia 1 aparece una mutacin en la posicin 615 (exn 6) y la familia 2 presenta una delecin de una base en la posicin 1309-14 (exn 10), ambas mutaciones provocan la aparicin de un codn de parada
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(W183X y K416X419, respectivamente). Nuestros resultados muestran que las bases moleculares de la deficiencia de C7, as como la susceptibilidad a padecer infecciones meningoccicas son heterogneas, ya que las diferentes familias muestran diferentes defectos moleculares, aunque parece existir homogeneidad en individuos de ciertas reas geogrficas. Se est estudiando la prevalencia de la mutacin de cambio de sentido G357R en la poblacin espaola para relacionarla con la susceptibilidad a padecer infecciones meningoccicas. 0107. ANLISIS DE GRANDES ALTERACIONES EN EL GEN C1-INHIBIDOR EN LA POBLACIN ESPAOLA AFECTA DE ANGIOEDEMA HEREDITARIO. A. Blanch, O. Roche, E. Lpez Granados, M.A. Saboya, G. Fontn, M. Lpez Trascasa. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario La Paz. Madrid Introduccin. El angioedema hereditario (HAE) es una enfermedad de herencia autosmica dominante causada por la deficiencia del inhibidor del primer componente de la cascada del complemento (C1-inh), tanto a nivel antignico (HAE tipo I) como funcional (HAE tipo II). Se caracteriza por la variabilidad de su expresin clnica y la heterogeneidad de mutaciones encontradas. El gen c1-inh ocupa 17 Kb y presenta un elevado nmero de secuencias repetidas de la familia Alu en sus regiones intrnicas, especialmente en los intrones 3, 4 y 6. Esto confiere una cierta inestabilidad al gen y le predispone a sufrir procesos de recombinacin homloga desigual que median la aparicin de grandes deleciones e inserciones. Se ha descrito que este tipo de mutaciones puede llegar a suponer hasta el 20% de las alteraciones presentes en este gen. Objetivo. De una serie de 87 familias afectas de HAE, en 21 de ellas no se ha detectado la presencia de mutaciones puntuales, que son las ms frecuentes en este gen. En estas 21 familias se ha analizado la presencia de grandes deleciones o inserciones como causa de la enfermedad. Materiales y mtodos. La presencia de grandes alteraciones genmicas se estudia mediante Southern blot. El ADN genmico de los pacientes se digiere con el enzima de restriccin BclI, que genera un fragmento de 21 Kb que incluye todo el c1-inh. La sonda que se usa para hibridar es el cADN completo del c1-inh marcada con digoxigenina, y el sistema se revela con un mtodo quimioluminiscente. Resultados. De las 21 familias estudiadas 10 han presentado alguna alteracin en el patrn de restriccin compatible con la presencia de una gran insercin o delecin en el gen. Conclusiones. El 11,5% de la serie de HAE estudiada presenta alguna gran alteracin en el c1-inh. Este porcentaje es algo inferior al descrito en otras series. En estas familias se van a determinar los exones delecionados o duplicados mediante digestin con otras enzimas o una PCR mltiple. 0108. CARACTERIZACIN DE MUTACIONES PUNTUALES EN EL C1 INHIBIDOR EN 60 FAMILIAS CON ANGIOEDEMA HEREDITARIO. O. Roche, A. Blanch, M.A. Saboya, G. Fontn, M. Lpez Trascasa. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario La Paz. Madrid Introduccin. El angioedema hereditario (HAE) es una enfermedad de herencia autosmica dominante causada por la deficiencia del inhibidor de C1 del sistema de complemento (C1-inh). El gen que
codifica el C1-inh tiene 8 exones que se extienden a lo largo de 17 Kb. Un gran nmero de mutaciones afectan al exn 8, que codifica el centro activo, pero se han descrito mutaciones a lo largo de todos los exones. Objetivos. Estudiar la posible presencia de mutaciones puntuales en los exones 1 al 7 en una serie de 60 familias espaolas afectas de HAE que no presentaban mutacin en el exn 8. Materiales y mtodos. Los exones 1 al 7 se han amplificado mediante PCR y analizado por SSCP (polimorfismo de la conformacin de la cadena sencilla). Los casos que presentaron un patrn de migracin electrofortica alterado fueron secuenciados. Resultados. Se han encontrado 39 casos de migracin electrofortica alterada en el estudio por SSCP, de los cuales en 33 se ha identificado la mutacin. De estas mutaciones; 11 son misssense, de las cuales 2 pueden afectar al proceso de splicing; 6 son nonsense; 9 son pequeas deleciones e inserciones, 8 de las cuales alteran el marco de lectura; y 4 se encuentran en la zona de splicing. La mayora estas mutaciones no haban sido descritas previamente. Conclusiones. Las alteraciones encontradas son muy heterogneas y se distribuyen prcticamente a lo largo de todo el gen. En el exn 3 hay un dinucletido CpG que resulta ser un punto caliente de mutacin. En este sitio encontramos 2 mutaciones distintas que afectan a 6 familias no relacionadas. Las familias en las que no se ha encontrado mutacin ni por SSCP ni por secuenciacin directa del exn 8, se estn estudiando por Southern blot para buscar grandes deleciones e inserciones. 0109. ESTUDIO DEL PATRN DE PRODUCCIN DE CITOQUINAS (IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, TNF e IFN- Y NIVELES DE IgE EN SINDROME DE HIPER IgE. ESTUDIO COMPARATIVO DE DISTINTOS TRATAMIENTOS. Ivan Muoz-Sa, A. Etxagibel, N. Martinez-Pomar, J. Iglesias-Alzueta, M.T. Prez-Castellano, F. Pujalte, N. Matamoros. Servicio de Inmunologa. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca Introduccin. El sndrome de Hiper IgE (HIES) es una inmunodeficiencia primaria caracterizada por niveles elevados de inmunoglobulina E (IgE) srica y aumento de eosinfilos en sangre perifrica, junto a infecciones bacterianas de repeticin y dermatitis eczematoide crnica. La causa de este sndrome no es conocida. Algunos estudios relacionan el aumento de IgE srica con una disregulacin en el patrn de secrecin de citoquinas, con predominio Th2. Objetivos. analizar el perfil de citoquinas en los pacientes que pueda explicar el aumento de IgE en suero. Estudiar el efecto de ciclosporina A (CsA) y gammaglobulina intravenosa (IVIG) sobre la produccin de citoquinas y niveles de IgE srica. Metodologa. Anlisis por citometra de flujo de la produccin intracitoplasmtica de IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN- y TNF en condiciones basales y tras estimulacin en linfocitos T CD4, CD8 y monocitos en 3 pacientes tratados con IVIG, 1 paciente tratado con CsA y 6 controles sanos. Determinacin seriada de los niveles de IgE. Resultados. T CD4: porcentualmente aumentados productores de IL-13 y disminudos los de IFN- en los pacientes respecto a los controles. Esta diferencia es mayor en el paciente tratado con CsA. T CD8: aumento porcentual de productores de IL-4 en todos los pacientes, comparado con los controles. Monocitos: aumento porcentual productores de IL-12 en todos los pacientes, con respecto a los controles. Niveles de IgE srica: disminucin progresiva secundaria a trata-
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miento con IVIG. Aumento progresivo en el paciente tratado con CsA. Conclusiones. Se observa un predominio Th2 en los pacientes. El aumento de la produccin de IL-12 observado no se corresponde con aumento de IFN-. Las alteraciones observadas en los pacientes, apoyan la hiptesis del predominio Th2 que explicara el aumento de IgE srica, caracterstico de este sndrome. El patrn Th2 es ms marcado en el paciente tratado con CsA. 0110. ALTERACIN DEL BALANCE DE CLULAS DENDRITICAS MIELOIDES Y PLASMOCITOIDES E INCREMENTO SRICO DE IL-12 p40 EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMN. N. Martnez-Pomar1, S. Raga1, J. Ferrer1, J. Pons2, I. MuozSaa1, M. R. Juli1, A. Etxagibel1, J. de Gracia3, N. Matamoros1. 1Servicio de Inmunologa y 2Unidad de Investigacin del Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. 3Servicio de Neumologa del Hospital Vall dHebrn. Barcelona Introduccin. La Inmunodeficiencia Variable Comn (CVI) es un sndrome heterogneo que se caracteriza por la presencia de bajos niveles de inmunoglobulinas e infecciones bacterianas de repeticin. Estudios previos sugieren que los pacientes afectos de CVI tienen una respuesta celular T polarizada hacia TH1. Se ha sugerido que diferentes poblaciones celulares tienen un papel importante en la polarizacin de la respuesta celular T. En este sentido, se ha descrito que las clulas dendriticas mieloides (mDCs) polarizan preferentemente la respuesta celular T hacia TH1 y las clulas dendriticas plasmocitoides (pDCs) hacia TH2. Otra poblacin implicada en la polarizacin de la respuesta celular T es la subpoblacin linfocitaria T CD4+CD25+. Objetivos. Analizar los niveles sricos de IL-12 y estudiar poblaciones celulares implicadas en la polarizacin de la respuesta T en pacientes con CVI. Metodologa. Estudiamos los niveles sricos de IL-12 (p70) y IL-12 (p40 p70) en 27 pacientes y 45 controles mediante tcnica de ELISA. Analizamos en sagre perifrica y mediante citometra de flujo la poblacin celular T CD4+CD25+ y las poblaciones de clulas dendrticas, negativas para los marcadores CD3 CD14 CD16 CD19 CD20 CD56, e identificamos las mDCs (CD11+HLA-DR+) y las pDCs (CD123+HLA-DR+) en 13 pacientes y 15 controles sanos. Resultados. Los pacientes afectos de CVI presentan un aumento significativo (p<0,001) de IL-12 subunidad p40 srica y una disminucin significativa (p<0,05) de la poblacin pDCs que resulta en un incremento de la ratio mDC: pDC. No hallamos diferencias en la poblacin de clulas CD4+CD25+ entre pacientes y controles. Conclusin: La alteracin del balance mDC:pDC debido a una disminucin de la poblacin pDCs podra estar implicada en la polarizacin hacia TH1 descrita en los pacientes con CVI. 0111. INCREMENTO DE LOS RECEPTORES DE CITOCINAS IL-12 E IL-18 EN ENFERMOS CON INMUNODEFICIENCIA COMN VARIABLE. M. Bofill1, E. Almirall2, A.McQuaid1, V.J. Tormey, D. Webster2. 1ICREA. Fundaci Irsicaixa. HUGTIP. Badalona. 2RFH London. UK Introduccin. Uno de los factores que determina que las clulas T se diferencien en clulas Th1 o Th2 es el tipo de citocinas presentes durante esta diferenciacin. En un ambiente rico en IL-12 e IL-
18 las clulas tienden a diferenciarse en clulas Th1 mientras que en un ambiente rico en IL-4 e IL-10 las clulas se diferencian a Th2. Objetivos. En este estudio proponemos que la expresin de estos receptores podra estar relacionado con el desequilibrio en la proporcin de citocinas en enfermedades tales como asma e inmunodeficiencia comn variable en las que hay un desequilibrio de las respuestas Th1 y Th2. Mtodos. En este estudio hemos analizado la expresin de receptores de citocinas reguladoras mediante citometra de flujo en un grupo control, de pacientes asmticos y con ICV. Resultados. Un 35% de las clulas T del grupo control expresan el receptor beta 1 (CD212) de IL-12 e IL-18 mientras que los receptores de la IL-10, IL-4 e IL-12 beta 2 son indetectables. La gran mayora de clulas CD212 e IL-18R positivas tienen marcadores de clulas de memoria pero los enfermos con ICV tiene un aumento en el nmero de clulas CD45RA que expresan CD212 e IL-18R. En cambio la expresin de los receptores de estas citocinas en enfermos asmticos es muy parecida al de los controles. Despus de estimulas las clulas T con anti CD3 y anti CD28, hay un incremento en el nmero de clulas que expresan estos receptores ( 80%) y un 50% de clulas expresan el receptor Beta 2 del IL-12, que no era detectable en las clulas en reposo, indicando que el nmero de clulas que pueden ser susceptibles al IL-12 es limitado. Conclusin. Estos resultados complementan las observaciones anteriores de que una de las causas contribuyentes a ICV es una polarizacin a clulas Th1 debido posiblemente a un defecto de las vas de regularizacin del IL-12. 0112. DIAGNSTICO DIFERENCIAL DE LA INMUNODEFICIENCIA VARIABLE COMN (IDVC): ANLISIS DE PROTENAS (BTK, LCK, SAP, ICOS). C. Zarate 1, J. El Hakeh1, A. lvarez2, J.M. Bertran3, A. Vidaller4, I. Caragol1, X. de Gracia2, T. Espanol1, M.Hernandez1. Unidad de Inmunologa1, Servicio de Neumologa2 y Unidad de Inmunodeficiencias3 del Hospital Vall dHebron y Servicio de Medicina Interna4 del Hospital de Bellvitge. Barcelona Introduccin. La IDVC es una Inmunodeficiencia Primaria (IDP) con defecto predominantemente de anticuerpos. Despus del dficit de IgA, es la inmunodeficiencia primaria ms frecuente. La base gentica es actualmente desconocida. El diagnstico diferencial se basa en la exclusin de otros dficits primarios de etiloga conocida, aunque no es siempre fcil como lo demuestran los errores diagnsticos descritos en la literatura. Objetivos. Proponemos un mtodo de screening rpido, sencillo y reproducible estudiando algunos marcadores no especficos y un marcador probablemente especfico (ICOS) de IDVC. Metodologa. En 55 pacientes diagnosticados de IDVC se estudi la expresin de btk, lck y SAP por immunoblot. Asmismo, se valoraron diferentes sistemas comerciales y no comerciales de geles de poliacrilamida (NuPAGETM Novex y UnblotTM) y anticuerpos (antiBtk: H360B rabbit polyclonal antibody (C. Kinnon); rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology); moAb (BD-Transduction laboratories) and moAb (BD-Pharmingen); anti-lck mAb: BDPharmingen; anti- SAP: rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) y rabbit polyclonal antibody (K. Nichols). Se estudi la expresin de ICOS en PBMC estimuladas con PMA+ionomicina durante 18h (ac.mo. anti-ICOS C398.4A (JM Rojo) por CMF.
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Resultados. Expresin de btk en pacientes con linfopenia B: expresin negativa 1/4 nios y 1/11 adultos, expresin de lck en pacientes con linfopenia CD4: expresin negativa 0/1 (nios) y 0/10 (adultos) y expresin de SAP en pacientes con IDVC: expresin negativa 0/17 (nios) y 1/38 (adultos). La expresin de ICOS fue normal en una seleccin de 11 pacientes con historia familiar y enfermedad autoinmune. Conclusin. Este screening de protenas podra reducir el error diagnstico en la IDVC. 0113. REDIP (REGISTRO ESPAOL DE INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS) 1993-2003. VALORACIN DE 10 AOS DE FUNCIONAMIENTO. A. Etxagibel, I. Muoz-Sa, M.T. Prez-Castellano, F. Pujalte, J. Pons, N. Martnez-Pomar, J. Mil, N. Matamoros. Servicio de Inmunologa. Hospital Son Dureta. Palma de Mallorca. Baleares Introduccin. Los registros nacionales y supranacionales de IDPs (registro europeo ESID y latinoamericano LAGID), han demostrado su utilidad en el aumento y mejora del diagnstico, seguimiento y tratamiento de las IDP. Objetivos. Valoracin de 10 aos de REDIP. Resultados. De acuerdo a los criterios diagnsticos de la International Union of Immunological Societies (IUIS): Total IDP: 2424 , IDPde anticuerpos: 1621, IDP combinadas: 150, Deficiencias de complemento: 290, Ataxia-Telangiectasia: 52, Wiskott-Aldrich: 32, Agammaglobulinemia ligada a X:91 - La contribucin cualitativa de las distintas IDP por CC.AA. presenta variaciones significativas. - La contribucin cuantitativa de las distintas IDP por CC.AA y al total de casos registrados en Espaa, tambin presenta diferencias significativas. - Inicio de subregistros de las patologas ms frecuentes: IVC (n=458), dficit de IgA (n=887) y deficiencias del complemento (n=290) - Ampliacin del REDIP con diagnsticos moleculares (agammaglobulinemia ligada a X, sndrome de Hiper IgM ligado a X, deficiencia de TAP y Anomala de Di George). Conclusin. El REDIP es til. Existe un infradiagnstico y/o subregistro de las IDP con variaciones significativas entre las distintas CC.AA. Ampliacin del REDIP con diagnsticos moleculares y de enfermedades asociadas (autoinmunes y/o neoplsicas). Posters: 0114-0120 0114. ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRNICA: MUTACIONES EN EL GEN CYBB. E. Delgado Cervio, M. Pascual Campo, M.C. Garca Rodrguez, G. Fontn Casariego, A. Ferreira Cerdn. Servicio de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid Introduccin. La enfermedad granulomatosa crnica (EGC) es una inmunodeficiencia primaria que se caracteriza clnicamente por infecciones recurrentes fngicas y bacterianas de repeticin de comienzo temprano, debido a mutaciones en los genes que codifican para un complejo multienzimtico: la NADPH oxidasa de los fagocitos. Cuando las mutaciones aparecen en el gen CYBB, codificante para la subunidad gp91-phox, la herencia es ligada al cromosoma X. Objetivos. Identificar mutaciones en el gen CYBB de14 pacientes.
Materiales y mtodos. Para el diagnstico se determin la actividad respiratoria de los neutrfilos mediante citometra de flujo (oxidacin de dihidrorodamina), espectrofotometra (reduccin del ferricitocromo c) y reduccin de nitroazul de tetrazolio (prueba del NBT). Se cuantific la presencia de gp91-phox en membranas de fagocitos mediante citometra de flujo (anticuerpo monoclonal 7D5) y Western blot. Finalmente, se caracterizaron las mutaciones en el gen CYBB mediante la amplificacin y secuenciacin de los 13 exones y las regiones intrnicas adyacentes. Resultados. Los pacientes estudiados carecan de actividad NADPH oxidasa. Adems, el western blot y los estudios de citometra revelaron la ausencia de gp91-phox (fenotipo X91). En las regiones exnicas se encontraron dos mutaciones missense (G1024A y G266A), dos deleciones puntuales (G280del y G1632del), una insercin puntual en dos pacientes (A757), una delecin de 30 pb (a partir de T858) y una mutacin compleja en tres pacientes (delecin TCAGCACTGGCACTGGCCAGG entre las bases 156-176 e insercin de CCTGCCTGATTTCTAG en el mismo lugar). Un paciente presentaba un cambio gtgc en el intrn 7, que provocaba la delecin completa del exn 7 por un splicing defectuoso y dos pacientes presentaban un cambio atgt en el extremo 3 del intrn 5. Otro paciente careca del gen en su totalidad. Conclusiones. Las mutaciones encontradas se distribuyen a lo largo de todo el gen. Hemos encontrado cinco nuevas mutaciones. 0115. IDENTIFICACIN DE UNA NUEVA MUTACION EN EL GEN DE LA BTK. A.J. lvarez, S. Barroso, M.A. Montes, L. Lagarda, C. Guzman, J.M. Lara, C. Rangel1, C. Casas1, J.L. Madrazo1, A. Nez Roldn, B. Snchez. Servicio de Inmunologa. Unidad de Alergia1. Hospital Universitario Virgen del Roco. Sevilla El sndrome de Bruton es una inmunodeficiencia primaria, ligada al cromosoma X, (XLA) producida por mutaciones en el gen que codifica la protein kinasa de Bruton (BTK) que afecta al desarrollo de los linfocitos B y produce una hipogammaglobulinemia. Debido a la similitud con el sndrome de inmunodeficiencia variable comn (IDVC) se pueden plantear dudas en su diagnstico diferencial. La ausencia de expresin de Btk nos confirma el diagnstico de XLA, aunque el diagnstico definitivo lo determina el estudio molecular del gen de la BTK. Nuestro objetivo es establecer el diagnostico diferencial en un paciente clasificado inicialmente como IDCV y descenso acusado del nmero de linfocitos B con el Sindrome de Bruton e identificacin de posibles portadoras en la familia. En cada uno de ellos detectamos BTK en citoplasma de monocitos mediante citometra de flujo (CF) empleando un AcMo anti-Btk. Para determinar la base gentica de esta inmunodeficiencia secuenciamos el gen de la BTK y emplemos tcnicas de PCR-RFLP. En el paciente haba ausencia de expresin de BTK mediante CF, siendo reclasificado como XLA. La madre, una hermana y la abuela materna presentaban patrn de portadoras. El padre y otra hermana expresaban normalmente BTK. En el anlisis molecular identificamos una nueva mutacin en el paciente consistente en una delecion de dos bases en el gen de la BTK que origina un cambio en la pauta de lectura con la aparicin de un codn de parada (Y598X) que afecta al dominio kinasa. Mediante PCR-RFLP analizamos la mutacin en el resto de la familia confirmando los datos obtenidos mediante citometra de flujo.
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Se demuestra la utilidad inmediata de la CF ante la sospecha de un Sindrome de Bruton. Sin embargo, dada la existencia de casos con expresin de protena no funcional no podemos afirmar que no se trate realmente de un sndrome de Bruton ante una expresin positiva de Btk. En este caso hay que realizar el anlisis molecular. El diagnstico diferencial entre la IDCV y XLA es fundamental para el diagnstico y tratamiento precoz en recin nacidos y para poder ofrecer consejo genetico. 0116. TWO MUTANT ALLELES ASSOCIATED WITH HUMAN CD3 IMMUNODEFICIENCY WERE ABLE TO RESTORE TCR/CD3 SURFACE EXPRESSION IN JURKAT CD3-NEGATIVE CELLS. A.A. Jacome, J.R. Regueiro. Department of Immunology. Universidad Complutense de Madrid. Spain CD3-negative Jurkat cell variants such as JGN do not express TCR/CD3 complexes on the cell surface unless they are transfected with wild type CD3. However, T lymphocytes from naturally-occurring CD3-deficient humans can assemble and export apparently functional TCR/CD3 complexes onto the cell membrane. To solve this paradox and establish whether the human alleles were leaky, we aimed to recover TCR/CD3 expression on JGN cells by transfection of the corresponding mutant CD3g alleles. JGN cells were transfected with pcDNA3 carrying two different mutant CD3 cDNA described before [c.38A>G; c.242A>T] and TCR/CD3 expression was studied by flow cytometry. The preliminary results suggest that CD3 mutants alleles can restore partially TCR/CD3 expression on JGN cells. Possible explanations for these results will be discussed. 0117. AGAMMAGLOBULINEMIA AUTOSOMICA RECESIVA POSIBLEMENTE DEBIDA A DEFECTOS EN LA MOLCULA CD79a. M. Montes-Casado1, O. Montes-Ares1, L. Marn1, R. Moya-Quiles1, M. Sanchez-Solis de Querol2, M. Muro1, M.D. Pastor-Vivero2, J.A. Campillo-Marquina1, N. Guerra-Prez1, M.A. Soto-Garca1, M.R. Alvarez-Lpez1, A.M. Garca-Alonso1. Servicios de Inmunologa1 y Pediatra2. Hospital U. Virgen de la Arrixaca. Murcia Introduccin. La agammaglobulinemia no ligada a X suele ser consecuencia de defectos genticos que afectan a la molculas implicadas en puntos cruciales del desarrollo madurativo de las clulas B. Uno de esos puntos cruciales es la adecuada formacin y expresin del receptor de la clula pre-B (pre-BCR) que marca la transicin del estado pro-B a pre-B. El pre-BCR est formado por varias molculas: VpreB, 5, CD79a (Ig), CD79b (Ig) y la cadena pesada reordenada. Este complejo es imprescindible para lograr tanto la adecuada expresin de la molcula de inmunoglobulina en la membrana de la clula B como las seales de trasduccin a travs de la misma. Analizamos un caso de una nia de 8 aos con agammaglobulinemia severa que presenta desde la edad de los 5 aos cuadros de infecciones de repeticin, a veces severas, artritis, linfadenitis y abcesos. Objetivos. Estudiar las causas que han impedido el desarrollo normal de las clulas B y conocer en que etapa del desarrollo de las clulas B ha tenido lugar el bloqueo madurativo. Materiales y metodos. Se han estudiado muestras de sangre perifrica (SP) de la paciente y su familia, y de mdula sea (MO) de la paciente para valorar el estado de la inmunidad humoral y celular.
Resultados. Al diagnstico la paciente presentaba una agammablobulinemia con unos niveles sricos de IgG < 7,30 mg/dl, IgA <5,88 mg/dl e IgM < 4,31 mg/dl. No se observaban alteraciones en el sistema del Complemento. En la MO se detecta un arresto madurativo de las clulas pro-B a pre-B siendo la mayora de las ellas (9095%) negativas para el CD79a y la cadena pesada . Esto induce a pensar que el defecto es debido a alteraciones tempranas que impiden la formacin del pre-BCR. El recuento de linfocitos fue de 1886 cel/mL. Se observa ausencia de clulas B (0,5%) en SP, inversin del cociente CD4/CD8 debido a la disminucin relativa y absoluta de clulas T CD4+ (362 cel/L) frente a la poblacin T CD8+ (1018 cel/L), permaneciendo las clulas NK normales (283 cel/L). La expresin HLA de clase I y II, CD18, CD11 y CD16 era normal. La respuesta a mitgenos disminuida y ha presentado perodos transitorios con disminucin de la capacidad fagoctica y oxidativa de los neutrfilos que solan coincidir con ingresos en la UCI por infecciones graves. El padre y un hermano presentan un dficit parcial de IgG. Conclusiones. Agammaglobulinemia autosmica recesiva posiblemente debida a dficit del CD79a que impedira la formacin del complejo de membrana pre-BCR y la evolucin de las clulas proB a pre-B. En estos momentos estamos haciendo los estudios moleculares al objeto de conocer el defecto gentico causal. 0118. DEFICIENCIA DE IgM Y GAMMAPATIA MONOCLONAL EN UN PACIENTE CON INMUNODEFICIENCIA COMBINADA. S. Calleja1, J. Clemente2, B. Losada2, P. Paule1, P. Varela1, L.M. Allende1. 1Departamento de Inmunologa. 2Departamento de Lactantes e Inmunodeficiencias. Hospital 12 de Octubre. Madrid Caso clnico. Nio de 10 aos que acude al hospital a los 4 meses de vida por infecciones respiratorias recurrentes (6 episodios de neumona, dificultad respiratoria, otitis crnica, dermatitis atpica, candidiasis oral y alergia al huevo). No existe historia familiar de inmunodeficiencia ni consanguinidad. La exploracin fsica muestra que se trata de un nio plido, delgado, con eczema extenso y anormalidades dentales (debido a la retencin de la denticin primaria). Se observan mltiples verrugas planas en la parte anterior del cuello y en la zona flexora de la rodilla. Estudio de laboratorio. Los estudios inmunolgicos confirman la deficiencia aislada de IgM (IgG: 932mg/dL, IgA: 634 mg/dL, IgM: 18 mg/dL), con incremento de IgE (900UI/mL). La produccin de inmunoglobulinas especficas frente a antgenos polisacardicos estaba disminuda. En el inmunofenotipo linfocitario se observa linfopenia con disminucin porcentual y nmeros absolutos de linfocitos CD2+, CD3+, CD4+ y CD8+ y aumento de marcadores de linfocitos B (HLA- T frente a diferentes mitgenos fue normal y los estudios de autoinmunidad tambin fueron normales. Evolucin de la enfermedad: la terapia con inmunoglobulina intravenosa slo produjo mejora de algunas de las infecciones pero no de las lesiones cutaneas ni respiratorias. La espirometra realizada mostr alteraciones moderadas de patrn obstructivo y restrictivo. Recientemente, mediante electroforesis e inmunofijacin se ha encontrado una gammapata monoclonal IgG-Kappa en el suero del paciente, as como cadenas ligeras Kappa en orina. Conclusin. Este paciente comparte algunas caractersticas del sndrome Hiper IgE y de la deficiencia de IgM. Pero el incremento de las clulas B y la proliferacin monoclonal de esas clulas (gamma-
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pata monoclonal) podra significar el tener mayor riesgo a padecer una enfermedad linfoproliferativa. 0119. DEFICIT DEL COMPONENTE C6 DEL COMPLEMENTO. ESTUDIO FAMILIAR. O. MontesAres1, M. Montes-Casado1, P. Martnez-Garca1, L. Marn1, N. Guerra-Prez1, R. Moya-Quiles1, M. Muro1, J.B. VidalBugallo2, J. Rosique-Romn1, M.C. Garca-Calatayud1, M.R. Alvarez-Lpez1, A.M. Garca-Alonso1. Servicios de Inmunologa1 y Medicina Interna2. Hospital U. Virgen de la Arrixaca. Murcia Introduccin. La citolisis dependiente de la activacin del complemento, por la va clsica y/o alternativa, se debe a la agresin que sufren las clulas en su membrana por medio del Complejo de Ataque de la Membrana (MAC). El MAC es una organizacin supramolecular de gran tamao y su estructura fundamental est formada por una molcula de C5b, C6, C7 y C8, y una o varias molculas del componente C9. Los defectos en cualquiera de los anteriores componentes impiden la formacin del MAC y suelen ir asociados a meningitis y sepsis, por Neisseria meningitidis. Presentamos a una familia de cuatro miembros, uno de los cuales es una mujer de 31 aos que desde los 18 aos ha presentado varios procesos severos de meningitis y frecuentes amigdalitis purulentas. Entre los antecedentes familiares de inters encontramos dermatitis atpica en sus dos hermanas y rinitis alrgica en la madre. Objetivos. Conocer los posibles defectos del sistema del complemento presentes en esta familia. Resultados. Toda la familia presentaba valores normales de C3, C4 medidos por nefelometra. La actividad funcional del complemento (va clsica y alternativa), medida por un mtodo hemoltico comercial, era normal en todos los familiares salvo en la paciente donde la actividad del complemento era indetectable por ambas vas. En los ensayos de inmunodifusin radial para los otros componentes de la cascada del complemento se observ que todos los familiares tenan cifras normales de C7, C8 y C9. La paciente tena un dficit total del componente C6 y una hermana un dficit parcial (80%) del mismo. Conclusiones. Se describe una familia en la que dos de sus miembros presentan un dficit de C6, que en el caso de la paciente es total y en una hermana parcial. No hay evidencias de defectos de este componente en el padre y la otra hermana. Hasta el momento no
tenemos datos cuantitativos del C6 materno. En el futuro se proceder a realizar los estudios moleculares necesarios para conocer la causa de este defecto. 0120. MODELOS DE RESCATE EN INMUNO DEFICIENCIAS PRIMARIAS MEDIANTE TRANSDUCCIN DE CLULAS T INMORTALIZADAS CON HERPESVIRUS SAIMIRI CON VECTORES LENTIVIRALES. M. Garca Toscano, F. Martn, C. Frecha, C. Ortega1, M. Santamara1, I.J. Molina. Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad de Granada. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Reina Sofa. Universidad de Crdoba Las clulas T inmortalizadas con Herpesvirus Saimiri constituyen potencialmente un buen modelo potencial para el establecimiento de modelos in vitro de inmunodeficiencias primarias, en tanto que mantienen las propiedades funcionales de las clulas primarias de los pacientes. Sin embargo, su uso generalizado se ha visto limitado por la aparente resistencia celular a la introduccin de genes exgenos. Nosotros hemos estudiado en detalle este problema, utilizando para ello modelos de transduccin con vectores retrovirales y lentivirales. Hemos confirmado la interferencia entre vectores oncorretrovirales y el H. Saimiri, manifestado por la ineficaz e inestable transduccin de estas clulas con vectores retrovirales. Sin embargo, la utilizacin de vectores lentivirales bajo el control del promotor SFFV (Simian Focus Formed Virus) perrmite un porcentaje de transduccin tpicamente superior al 50% de las clulas del cultivo. Estos datos han sido obtenidos en lneas celulares procedentes de dos pacientes con el Sndrome de Wiskott-Aldrich, una Inmunodeficiencia Combinada Severa Autosmica y dos lneas procedentes de individuos normales. No obstante, el H. Saimiri interfiere con los vectores lentivirales provocando una restriccin relativa en un factor de 5-10, obtenido al evaluar los porcentajes de transduccin normalizados por la Multiplicidad de Infeccin (MOI) de los sobrenadantes lentivirales con respecto al obtenido en clulas primarias y tumorales de tejidos hematopoyticos y no hematopoyticos. Por tanto, la alta expresin porcentual del gen marcador y la estabilidad de la expresin a lo largo de varios meses de cultivo, sugieren que esta estrategia es idnea para demostrar rescates funcionales en pacientes con inmunodeficiencias primarias.
Sesin 02. Linfocitos T: precursores, TCR y activacin

Comunicaciones Orales: 0201-0210 0201. TCR DYNAMICS IN HUMAN MATURE T LYMPHOCYTES LACKING CD3. N. Rossi1, P.S. Torres1, A. Alcover2, D.A. Zapata1, Jacques Arnaud3, Alberto Pacheco1, J.M. Martn-Fernndez1, E.M. Villasevil1, O. Sanal4, J.R. Regueiro1. 1Inmunologa, Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Spain. 2Unit de Biologie des Interactions Cellulaires CNRS URA 1960. Institute Pasteur, 75724 Paris Cedex 15. France. 3Unit de Physiopathologie Cellulaire et Molculaire, CNRS, CHU Purpan. 31059 Toulouse Cedex 03. France. 4Hacettepe University Childrens Hospital. 06100 Ankara. Turkey The contribution of CD3 to TCR/CD3 complex (TCR) surface expression, internalization, and intracellular traffic has not been completely defined, but it is believed to be crucial for constitutive as well as for phorbol ester-induced internalization. We have explored TCR dynamics in resting and stimulated mature T lymphocytes derived from two unrelated human congenital CD3-deficient individuals. In contrast to CD3- deficient Jurkat mutants selected for the lack of membrane TCR, which are therefore constitutively surface TCR-, these natural CD3-deficient T cells expressed significant constitutive sur-
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face TCR levels which were maintained mainly through biosynthesis of new chains other than CD3. Proper surface TCR expression, however, was clearly CD3-dependent, as it was restored by retroviral transduction of CD3. The reduced surface, but not intracellular, TCR expression was likely caused by an impaired assembly or membrane transport step during recycling, whereas constitutive internalization and degradation were apparently normal. Antibody binding of the mutant TCR, but not phorbol ester, caused its downmodulation from the cell surface, albeit at a slower rate than in normal controls. Kinetic confocal analysis indicated that early ligand-induced endocytosis was impaired. After its complete downmodulation, TCR re-expression was also delayed. The results suggest that CD3 contributes to, but is not absolutely required for the regulation of TCR trafficking in resting and antigen-stimulated mature T lymphocytes. They also indicate that TCR internalization is regulated differently in each case. 0202. FUNCIN DE LAT EN LA MADURACIN Y ACTIVACIN DE LINFOCITOS T. E. Aguado, S. Nez-Cruz, S. Richelme, M. Richelme, M. Malissen, B. Malissen. Centre dImmunologie de Marseille-Luminy. Parc Scientifique de Luminy. 13288 Marseille Cedex 9. Francia La mayora de los linfocitos T maduros expresan en su membrana el complejo TCR/CD3. Tras el reconocimiento de un antgeno por parte del TCR, se desencadenan una serie de seales intracelulares, entre las que se incluyen la fosforilacin en residuos de tirosina en los ITAMs presentes en las cadenas intracitoplsmicas de CD3, -, - y -. La fosforilacin de estas tirosinas recluta a la membrana a la tirosn-quinasa ZAP-70, que una vez activada fosforila varias protenas intracelulares. LAT (Linker for Activation of T cells) es uno de los principales sustratos de ZAP-70. LAT es una protena transmembrana de 36-38 Da, que presenta en su regin inracitoplsmica 9 residuos de tirosina conservados en humanos, ratones y rata. Tras la fosforilacin de estas tirosinas, LAT recluta a la membrana varias protenas y acta acoplando las seales intracelulares tempranas con varias rutas de sealizacin intracelular. Cada una de estas tirosinas manifiesta cierto grado de especializacin en las protenas de sealizacin a las que se une. LAT es esencial para la transduccin de seales intracelulares. Efectivamente, ratones deficientes para LAT carecen de linfocitos T y la maduracin tmica est detenida en un estado muy precoz. Nuestro grupo ha demostrado previamente que ratones homocigotos para una mutacin de la tirosina 136 de LAT (LATY136F/Y136F) presentan un desarrollo tmico defectuoso y una posterior acumulacin de clulas T policlonales de tipo TH2. Este fenotipo paradjico demuestra una inesperada funcin inhibitoria de LAT cuya base molecular an no ha sido elucidada. Con el objetivo de analizar en profundidad las funciones de estas tirosinas en la activacin y maduracin de linfocitos T, se han generado varias cepas de ratones Knock In en los que se han mutado selectivamente varias de ellas. En este trabajo se presentan los resultados del anlisis de estos ratones 0203. PAPEL DE LOS INHIBIDORES ESPECFICOS DE FOSFODIESTERASA 4 SOBRE LA INDUCCIN DE LA CICLOOXIGENASA 2 EN LINFOCITOS T. J.L. Jimnez1, M.A. iguez2, M.A. Muoz-Fernndez1 y M. Fresno2. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Gregorio Maran. Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa. Universidad Autnoma de Madrid
La induccin transcripcional de la Ciclooxigenasa-2 ocurre de una manera temprana despus de la activacin de los linfocitos T a travs de su receptor, indicando una implicacin funcional de la actividad ciclooxigenasa en el proceso. Nuestro estudio demuestra una inhibicin en la induccin de COX-2 mediante la inhibicin de la fosfodiesterasa 4 (PDE4) en linfocitos T. As, la inhibicin provocada por un inhibidor especfico como Rolipram (RP) sobre la PDE4, inhibi la induccin producida tras la activacin con anti-CD3+ CD28 o con PMA+Ion de las clulas T del ARN mensajero y de la protena COX2. RP tambin inhibi la produccin de prostaglandinas en clulas T activadas. Este efecto producido por RP tiene lugar a nivel transcripcional debido a la inhibicin sobre la induccin del promotor de la COX-2. El mapeo sobre el promotor de COX-2 desvel que la regin del ADN localizada entre las posicines 117 y 58 del sitio de inicio de la transcripcin, el cual tiene sitios de unin para el factor de transcripcin NFAT, era la requerida en la inhibicin por RP. Por otro lado, los sitios de unin para NF-B ni NF-IL6 no se requirieron para la inhibicin causada por RP. Cuando se realiz la sobreexpresin de la fosfatasa calcineurina se revirti de forma parcial la inhibicin provocada por RP sobre la induccin del promotor de COX-2. Tambin es importante destacar que RP produjo una fuerte inhibicin de la induccin de la capacidad transactivadora de una construccin GAL4 NFAT (1-415) y que no se encontr una inhibicin en la translocacin del factor NFAT al ncleo. Conclusin. Nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la PDE4 puede inhibir la induccin de la COX-2 en linfocitos T y que esta inhibicin afecta a la intensificacin de la actividad transactivadora del factor nuclear de clulas T activadas. 0204. LA INTEGRINA VLA-4 SE LOCALIZA EN EL ANILLO PERIFERICO DURANTE LA SINAPSIS IMMUNE Y REGULA LA POLARIZACIN HACIA UNA RESPUESTA TH1. M. Mittelbrunn1, A. Molina2, M.M. Escribese2, M. Yaez-M1, E. Escudero2, . Ursa1, R. Tejedor1, F. Mampaso2, F. Sanchez-Madrid1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario de la Princesa y 2Departamento de Patologa del Hospital Ramn y Cajal. Madrid. Espaa La integrina VLA-4, adems de su papel en la adhesin y transmigracin leucocitaria, media seales co-estimuladoras para la activacin de linfocitos T. Sin embargo, no se conoce el comportamiento de VLA-4 durante la formacin de la sinapsis inmunolgica (SI) entre un linfocito T y una clula APC, ni el papel de sus seales coestimuladoras durante la activacin linfoide. Hemos estudiado el comportamiento de VLA-4 en distintos modelos de presentacin antignica. La lnea humana linfoblastoide J77 es capaz de reconocer el superantgeno SEE presentado por una clula B Raji establecindose entre ambas una SI. Mediante inmunofluorescencia se determin que VLA4 est presente en la zona de interaccin de estos conjugados de forma SEE-dependiente, sugiriendo que esta integrina es importante durante el establecimiento de una SI. Se confirm la presencia de VLA-4 en la SI entre un linfocito T no transformado que reconoce el SEB presentado por una Clula Dendrtica (CD) humana, as como en un modelo murino de presentacin T-B pptido-especfico. Mediante microscopia confocal se demostr que VLA-4 colocaliza con LFA-1 en el anillo perifrico (pSMAC) que rodea a complejo TCR-CD3. El estudio con mAbs especficos frente a la conformacin activa de la integrina 1 revel que VLA-4 est en conformacin activa en el pSMAC de la SI. Mediante el uso de mAbs e inhibidores especficos de VLA-4 se ha
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demostrado la implicacin de esta integrina en la polarizacin hacia una poblacin Th1 de los linfocitos T vrgenes tras su activacin con CD autlogas. Por ltimo, la administracin del mAb HP2/1 frente a VLA-4 en ratas a las que se les induce una nefritis autoinmune mediada por HgCl2 disminuye la subpoblacin de linfocitos T CD4 autorreactivas que producen IL-4 y previene el desarrollo de la enfermedad. Se ha demostrado la localizacin antgeno-especfica de VLA-4 en conformacin activa en el pSMAC de la sinapsis y su implicacin funcional tanto in vivo como in vitro en la respuesta Th1. 0205. SEALES COESTIMULADORAS DE CRRY/P65: IMPLICACIN DEL DOMINIO CITOPLSMICO Y DE LA INCLUSIN EN RAFTS EN LA SEALIZACIN. A. Jimnez-Periaez, G. Ojeda, J.M. Rojo y P. Portols. C. Nac. Microbiologa (Insto. de Salud Carlos III) y Centro de Investigaciones Biolgicas. CSIC Recientemente hemos demostrado que Crry/p65, una glicoproteina de tipo I perteneciente a la familia de reguladores de complemento, es capaz de coestimular la proliferacin y diferenciacin de clulas T CD4+. Las seales procedentes de Crry amplifican las seales procedentes del complejo TCR/CD3 que conducen a la fosforilacin de sustratos de la va de las MAP quinasas, como ERK . Ahora mostramos que las seales procedentes de Crry adems incrementan la fosforilacin en una ruta tpicamente coestimuladora como es la via de Jun quinasa, produciendo incrementos en fosfo-JNK 2. Seales mas tempranas como fosforilacin de ZAP-70 o Vav son tambin incrementadas y la implicacin de P-I-3-quinasa y el citoesqueleto es necesaria en este proceso. Crry/p65 no precisa de su dominio citoplsmico para funcionar como regulador de complemento, como se demostr con el uso de formas recombinantes solubles. Para analizar la implicacin de esta parte intracelular de la molcula en la seal coestimuladora, hemos obtenido clulas Th2 mutantes deficientes en la expresin de Crry que han sido reconstruidas con la forma nativa o truncada en el dominio citoplsmico de Crry. El fenotipo de estos transfectantes en cuanto a sealizacin temprana y funciones efectoras ha sido analizado observndose una distinta implicacin del dominio citoplmico de Crry en las vias de transduccin de seal. As, la coestimulacin de seales propias del complejo TCR/CD3, como fosforilacin de ZAP-70 y ERK se ve poco afectada en los mutantes delecionados en el dominio citoplsmico de Crry, no as la fosforilacin de JNK2. La seal coestimuladora de Crry conduce a un incremento marcado de la secrecin de IL4 y de IL5, pero no de IL10 por parte de las clulas Th2. Resultados preliminares en ensayos de mutantes y tranfectantes nos permiten sugerir que el dominio citoplsmico de Crry est implicado de distinta forma en la coestimulacin de la secrecin de IL4 y en la de IL5. Estos resultados sugieren la existencia de diferentes mecanismos de coestimulacin asociados o no al dominio citoplsmico de Crry. La presencia de otras molculas coestimuladoras en microdominios lipdicos de la membrana celular y el hecho de que la coestimulacin de la ruta de MAPK ERK no se vea prcticamente afectado en los mutantes delecionados en el dominio citoplsmico de Crry nos han llevado a analizar la presencia de Crry en rafts. Hemos detectado la inclusin de Crry en estos dominios de membrana cuando la clula est en reposo, incrementndose su presencia cuando la clula es activada por anti-CD3 junto con anti-Crry. Esta coestimulacin
activa tambin la inclusin de otras molculas de sealizacin como CD3 y ZAP-70 en los rafts. 0206. IMPLICACIN DE MIEMBROS DE LA FAMILIA ETS EN LA REGULACIN TRANSCRIPCIONAL DE CD5 EN CLULAS T. M. Arman1, J. Calvo2, P. N. Cockerill3, M.E. Trojanowska4, M. Santana5, M. Lpez-Cabrera5, J. Vives1, F. Lozano1. 1Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Hospital Clnic de Barcelona. Facultat de Medicina. Universtitat de Barcelona. 2Fundaci Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears. Palma de Mallorca. 3Molecular Medicine Unit. Sant James Hospital. University of Leeds. Leeds (UK). 4Medical University of South Carolina. Charleston. South Carolina (USA). 5Biologa Molecular. Hospital de la Princesa. Madrid CD5 es un receptor de membrana capaz de modular los procesos de activacin y diferenciacin de timocitos y clulas T y B1a maduras. En este estudio, hemos caracterizado funcionalmente el promotor de CD5 humano. Mediante el mapaje de sitios hipersensibles a la digestin por DNasaI (DNaseI hypersensitive sites, DH sites) se puso de manifiesto la existencia de DH sites en la regin 5 al gen CD5 en blastos T y clulas Jurkat, pero no en las lneas Raji (B, CD5-) ni K562 (mieloide). Transfecciones transitorias con vectores luciferasa mostraron que una regin de 292 pares de bases (pb) a 5 del gen son capaces de alcanzar la mxima actividad transcripcional en las lneas T Jurkat y CEM, pero nula en lneas B CD5- (Raji, Daudi) o mieloides (K562). Por 5-RACE (5-Rapid amplification of cDNA ends) a partir de RNA de la lnea CEM se detectaron sus mltiples inicios de la transcripcin, localizndose el ms frecuente de ellos a 58 pb en direccin 5 al primer codn ATG. Dos motivos de unin a Sp1, localizados a 37-57 bp 5 del sitio de inicio de la transcripcin ms frecuente, resultaron ser funcionales, lo cual concuerda con el conocido papel de Sp1 en la formacin de los complejos de preiniciacin en genes que carecen de caja TATA y secuencia Iniciadora com es el caso de CD5. En la regin de 282 pb se encuentran dos motivos de unin a factores de transcripcin Ets conservados en ratn. La relevancia funcional de estos motivos fue demostrada por ensayos EMSA y lucifierasa en clulas Jurkat, as como en ensayos de co-transfecciones en clulas HeLa con vectores de expresin para los factores de transcripcin Ets-1 y Ets-2. En conclusin, nuestros estudios sugieren que la regin promotora de CD5 humano es activa en clulas T pero no en B ni en mieloides y que factores de transcripcin Ets juegan un importante papel en el control de la expresin de CD5 en clulas T, de forma anloga a lo reportado para otros genes relevantes de linfocitos (TCR,, IL-2R, IL-5, GM-CSF y TNF-). 0207. EL LINAJE NK/T, LA PRIMERA POBLACIN LINFOHEMATOPOPOETICA EN EL EMBRIN DE RATN. P. Gonzalo, B. de Andrs, D. Melero, M. Cortegano, P. Gomz, M.L. Gaspar. M. Marcos1. Centro Nacional de Microbiologa (ISCIII) 1Centro Biologa Molecular (CBMSO) Madrid Hemos caracterizado la diferenciacin hacia linaje NK/T a partir de progenitores embrionarios, localizados en el saco vitelino a tiempos tempranos en la gestacin del ratn (9 dpc), y a medida que se avanza en la gestacin, en otras estructuras embrionarias como la
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Esplanchnopleura-paraartica, la sangre y pricipalmente el hgado y el bazo. Las condiciones de cultivo utilizan citoquinas caractersticas para diferenciacin NK/T, SCF, IL-7, IL-2, IL-15. En estas condiciones, se obtienen lneas celulares de morfologa polarizada. Estas lneas se caracterizaron fenotipicamente por citometra de flujo analtica, mostrando la expresin en membrana de los siguientes marcadores, DX-5, NK.1.1, CD44, CD45, IL-2R, c-kit, Thy-1. Los valores de expresin de CD3, Mac-1, IL7-R y B220 fueron variables, desde lneas negativas hasta otras donde el 60% de las clulas fue positivo. Los marcadores caractersticos de linaje linofide B (CD19, IgM), de linaje eritroide (TER-119), y de linaje dendrtico (N-418, Dec 205), fueron negativos. Las lneas se caracterizaron mediante tcnicas de RT-PCR analizando la expresin de genes caractersticos de linaje NK, (CD94, NKGA, NKG2A, Perforina y Grazima A), de linaje T (Notch-1, PreT, V1 y V14), o de linaje B (PAX-5). Los genes especficos de linaje NK, se expresaron de manera heterognea, pero en todos lo casos se expresaron de al menos 3 de los genes analizados. La mayora de las lneas expresaban Notch-1 en altos niveles, generalmente acompaados de la expresin de PreT-. V1 fue negativo en todas las lneas y V14 fue positivo en el 20% de las lneas analizadas. Los resultados de Pax5 fueron negativos. Todos estos resultados caracterizan a estas lneas como de tipo NK/T. Se realizaron estudios sobre cultivos organotpicos tipo FTOC (Fetal Thymic Organotipic Culture), comprobando, que la poblacin CD3 aumentaba, o, en caso de lneas negativas se induca. Cultivos in vitro sobre methocult de las lneas NK/T concluyeron que no exista dediferenciacin a linaje eritroide o mieloide. Cultivos con ST2 e IL-7 mostraron que tampoco se apreciaba de-diferenciacin a linaje linofide B con lneas NK/T ya establecidas. Con motivo de averiguar si estas lneas eran funcionales se realizaron estudios de citotoxicidad comprobando que la lneas NK/T son capaces de lisar la diana Yac.1, resaltando una lisis mayor cuando la lnea NK/T est cultivada con IL-2. Como conclusin, nuestros datos muestran que el linaje NK/T es el primer linaje linfoide al que diferencian las clulas precursoras linfohematopoeticas embrionarias (Saco vitelino 9 dpc), que son capaces de originar in vitro lneas NK/T, que llegan a ser maduras y funcionales. 0208. MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN LA INTERNALIZACIN Y DEGRADACIN CONSTITUTIVA DEL COMPLEJO PRE-TCR HUMANO. M.N.Navarro, G. Nusspaumer, Y.R. Carrasco, M.L. Toribio. Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa. Madrid Durante el desarrollo intratmico de los linfocitos T los timocitos que reordenan de forma productiva el locus TCRb expresan en la superficie celular el complejo pre-TCR, compuesto por la cadena TCRb asociada a la cadena invariante pre-TCR alpha (pT) y a los mdulos de CD3. La expresin de este complejo conlleva la seleccin, expansin y progresin en la secuencia madurativa de estas clulas, proceso conocido como seleccin b, que culmina con los reordenamientos del locus TCR. A pesar de la similitud en la composicin bioqumica de los complejos TCR y pre-TCR, la sealizacin a travs del complejo preTCR parece ocurrir de manera independiente de su interaccin con un ligando extracellular, y su expresin en membrana debe estar altamente regulada, puesto que slo se expresa de manera transitoria y a niveles bajos durante el desarrollo T.
Se han identificado dos mecanismos responsables de los bajos niveles de expresin en membrana del complejo pre-TCR, ambos dependientes especficamente de la cadena pT: la retencin en el retculo endoplsmico de la cadena pT y la internalizacin y degradacin constitutiva del complejo. El objetivo de este estudio ha sido el anlisis de los mecanismos moleculares implicados en la internalizacin y degradacin constitutiva del complejo pre-TCR. Datos previos sugeran un mecanismo independiente de PKC y parcialmente dependiente de la activacin de Src-quinasas. Mediante tcnicas de doble-hbrido en levaduras y pull-down, hemos identificado la interaccin de la cadena pT con una protena adaptadora, CIN85, que podra estar implicada en este mecanismo. Asimismo, mediante tcnicas de citometra de flujo, microscopa confocal y Western-Blot, hemos abordado el papel del sistema de ubiquitina-proteasoma en el mecanismo de internalizacin y degradacin constitutiva del complejo pre-TCR. Nuestros datos sugieren que el complejo pre-TCR se internaliza de manera ubiquitin-dependiente, y que la protena CIN85 estara implicada en la ubiquitinacin del complejo. 0209. IN T CELLS CD38-MEDIATED SIGNALING OCCURS WITHIN RAFTS. P. Muoz1, M.C. Navarro1, E. Pavn1, J. Salmern3, N. Ortego3,F. Malavasi2, J. Sancho1, M. Zubiaur1,3. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Granada. Spain. 2Laboratory of Immunogenetics. University of Torino Medical School. Torino. Italy. 3Hospital Universitario San Cecilio. Granada. Spain Here we present data supporting that CD38 clustering induces the translocation into rafts of key signaling-transducing molecules. We observe that upon CD38 ligation Lck, and LAT become tyrosine phosphorylated exclusively in raft fractions, while ZAP-70 and the CD3 chains (CD3- and CD3-) become tyrosine phosphorylated in bot raft and non-raft compartments. However, the fully phosphorylated forms of CD3- and CD3- are only detected in rafts, while CD38-mediated c-Cbl tyrosine phosphorylation occurs exclusively in the non-raft fraction. These results suggest that immediately upon CD38 engagement several signaling pathways become activated in raft microdomains, whereas inhibitory signals are subsequently initiated in the bulk of the disordered plasma membrane. Overall, these findings provide the first evidence that CD38 operates in functionally distinct microdomains of the plasma membrane. 0210. THE INFLUENCE OF THE THYMIC ENVIRONMENT ON THE CD4 VERSUS CD8 T LINEAGE DECISION. M. Caelles, M.L. Park, O.M. Schwartz, B.J. Fowlkes. NIAID, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA TCR signaling is a critical factor regulating thymocyte selection; however, the role of the thymic environment has been less well studied. In MHC class II-restricted TCR transgenic mice, every thymocyte is potentially selectable for maturation in the CD4 lineage. To address whether selection frequency affects positive selection, hematopoietic chimeras were created with mixtures of selectable and nonselectable precursors. With increased proportions of non-selectable thymocytes, positive selection of class II-specific precursors is enhanced, generating not only CD4, but also CD8 thymocytes. This suggests
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that the CD4/CD8 fate of selectable precursors can be influenced by the selection potential of its neighbors. One possible explanation for this phenomenon is the limited availability of niches supporting positive selection in the thymus, resulting in less than optimal positive selection when all the thymocytes bear selectable TCRs. This hypothesis was explored by studying the localization of selectable thymocytes on thymic sections of chimeric mice containing selectable and nonselectable precursors. Surprisingly, it was found that expression of LFA-1 on selectable thymocytes correlates with TCR levels, while nonselectable thymocytes express low LFA-1 levels. LFA-1 high cortical thymocytes associate preferentially with ICAM-1 expressing stromal elements, present in limited quantities in the thymic cortex. LFA1 high thymocytes that associate with ICAM-1 expressing stromal cells show signs of positive selection such as TCR and ZAP-70 polarization, as well as ERK phosphorylation. These results suggest that integrin receptor expression on the thymic stroma may be a key regulator of positive selection. Posters: 0211-0218 0211. LA AUSENCIA DE CD69 EN LINFOCITOS T ALOREACTIVOS NO AFECTA A LA CINTICA DEL RECHAZO INMUNOLGICO PRIMARIO. R. Domnguez-Perles, D. Sancho, G. Peuelas-Rivas, Antonio Muoz, P. Ramirez, P. Parrilla, F. Snchez-Madrid, J.I. Rodrguez-Barbosa. 1Unidad de Investigacin. Ciruga Experimental. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. El Palmar. Murcia. E-mail: jirodrig@um.es. 2Servicio de Inmunologa. Hospital de la Princesa. Universidad Autnoma de Madrid. Madrid Introduccin. CD69 es una molcula de la familia de las lectinas tipo 2C, que se expresa nicamente en condiciones fisiolgicas en una pequea subpoblacin de clulas T y B maduras, as como tambin en plaquetas, precursores de la mdula sea y timocitos CD3hi. Es un marcador tpico de activacin temprana en linfocitos, aunque no se conoce su papel en la fisiologa del sistema inmune. El objetivo de este trabajo es el estudio de la respuesta inmune aloreactiva primaria en ratones CD69 KO (H-2b) comparado con ratones CD69 WT (H-2b) al ser injertados con piel de ratones BALB/c (H-2d), histoincompatible para clase I, clase II y antgenos menores. Material y mtodos. Ratones receptores de la cepa C57BL/6 CD69 KO (n=8) y WT (n=10) de cuatro meses de edad recibieron dos injertos de piel, uno singnico (C57BL/6) y otro alognico full mismatched procedente de la cepa BALB/c, a ambos lados del dorso. Se recogieron muestras de suero antes de realizar el injerto, y los das 13 y 31 despus del mismo, y se estudi la respuesta inmune humoral mediante citometra de flujo usando timocitos del mismo haplotipo que el donante. A las tres semanas de haber rechazado los injertos, los ratones fueron sacrificados y se determin la respuesta inmune de base celular. Para ello, se enfrentaron los esplenocitos aloreactivos de los ratones CD69KO y WT a esplenocitos y clulas dendrticas singnicas y alognicas (BALB/c) irradiadas para medir la respuesta proliferativa en la reaccin mixta de linfocitos (MLR). Los linfocitos T activados en la reaccin de MLR se enfrentaron en la prueba de citotoxicidad a blancos celulares alognicos y singnicos marcados con 51Cr (Cromo 51). Resultados. Tanto los ratones CD69 KO como los controles WT, mostraron una cintica de rechazo primario de los aloinjertos de piel similar, no existiendo entre ellos diferencias significativas, mientras que los injertos singnicos control permanecieron perfectamente
viables durante el curso del experimento. Tampoco se observaron diferencias en la respuesta inmune humoral entre CD69 KO y WT para los distintos isotipos de inmunoglobulinas (IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3). La respuesta proliferativa en la MLR frente a estimuladores alognicos y la citottoxica frente a blancos alognicos no mostr diferencias entre los ratones CD69 KO y los WT controles. Conclusiones. La ausencia de CD69 en los ratones receptores de trasplante alognico no afecta a su capacidad de desarrollar una respuesta inmune primaria aloreactiva de rechazo. 0212. EXPRESIN DIFERENCIAL DEL RECEPTOR DE IL12 EN LINFOCITOS T DERIVADOS DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL. M. Naranjo1, R. Pea2, F.E. Borrs1, M. Bofill2,3. 1Laboratori dImmunobiologia per a la Recerca i Aplicacions Diagnstiques. Centre de Transfusions i Banc de Teixits (LIRAD-CTBT). 2Fundaci IrsiCaixa. 3Instituci Catalana de Recerca i Estudis Avanats (ICREA). Fundaci Institut dInvestigaci en Cincies de la Vida Germans Trias i Pujol. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona La utilizacin de sangre de cordn umbilical (UCB) como fuente de progenitores hematopoyticos es una alternativa a los transplantes de mdula sea que puede estar indicada en diversas situaciones. La principal complicacin de estos procedimientos sigue siendo la enfermedad del injerto contra el huesped (GvHD), - observada en menor frecuencia en los transplantes de UCB -, en la que los linfocitos T estn directamente implicados. Tradicionalmente, se ha definido la GvHD como una respuesta de tipo Th1, que promueve la generacin de linfocitos citotxicos aloreactivos. Las citocinas implicadas en la generacin de la respuesta Th1 son, entre otras, las interleuquinas 12 y 18 (IL12, IL18). El receptor de IL12 comprende dos subunidades, IL12R1 (de unin) y 2 (de transmisin de la seal). El receptor de IL18 comprende as mismo dos subunidades, IL18R (unin) y IL18R (transmisin de la seal). El objetivo de este trabajo es estudiar la expresin basal e inducida de los receptores de IL12 y IL18 en los linfocitos T de cordn umbilical. En el adulto, la expresin del receptor de IL12R1 y IL18R se detecta mayoritariamente en los linfocitos T CD45RO, siendo mucho menor en el compartimento T CD45RA. Tras la estimulacin policlonal, los linfocitos T adultos exhiben un incremento significativo de clulas positivas para IL12R1 y 2 e IL18R, en especial en el compartimento CD45RA. En los linfocitos derivados de sangre de cordn umbilical, en que el compartimento CD45RA es mayoritario, resultados preliminares muestran una expresin nula de IL12R1 y 2, mientras que IL18Ra se expresa de forma muy leve en algunas clulas. Tras la estimulacin policlonal con antiCD3 y antiCD28, estas clulas incrementan la expresin de IL12R1 e IL18R, sin embargo la expresin de IL12R2 permanece nula. Estos resultados podran reflejar la incapacidad de los linfocitos T de UCB de transmitir la seal de IL12, y por lo tanto podran explicar, al menos parcialmente, la reducida incidencia de GvHD y la mayor frecuencia de recidivas observada en los trasplantes hematopoyticos con sangre de cordn umbilical. 0213. REGULATION OF EXPRESSION OF T CELL CORECEPTORS ON POLYCLONALLY STIMULATED T CELLS BY IL-2. A. Prieto1, D. Daz1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine.
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CSIC R&D Associated Unit University of Alcal. Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares. Madrid. Spain Background. IL-2 is not only a T cell growth factor, it has diverse effects from promotion of T cell differentiation to induction of cell death. Objective. To determine if exogenous IL-2 (eIL-2) regulates the expression of T cell coreceptors on activated T cells using cell tracking strategies. Materials and methods. PBMCs were labelled with carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) and sorted to obtain a population with a homogeneous label of this probe. T lymphocytes were stimulated with phytohemagglutinin or microbeads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies and cultured in presence or absence of eIL-2. Results. In both models of activation with lectins and anti-CD3 and anti-CD28 coated microbeads progressive increases in the expression of CD4 by CD4+ T cells and also in that of CD8 by CD8+ T cells were found with respect to their basal levels The MFI for CD4 expression increased until three folds over original CD4 MFI and that of CD8 increased until five folds. These increases in coreceptor expression were observed in undivided blasts, but were of greater magnitude on blasts which have suffered at least one cell division in culture. At 7 days of culture, the intensity of expression of both CD4 and CD8 gradually increased with the number of divisions until the second division and then remain constant in subsequent (third, fourth and fifth) divisions. The presence of eIL-2 further increased the expression of CD4 coreceptor in both lymphocytes stimulated either with lectins or anti-CD3 and anti-CD28 coated microbeads. In contrast, the presence of eIL-2 did not increased the expression of CD8 coreceptor. Conclusions. The stimulation with either PHA or anti-CD3 and anti-CD28 coated microbeads increases the expression of both CD4 and CD8 coreceptors on polyclonally activated T lymphocytes. The addition of eIL-2 up regulates specifically CD4 expression but not CD8 expression. 0214. CD25 EXPRESSION DECREASES ALONG SERIAL CELL DIVISIONS ON CD8+ T CELLS BUT REMAIN CONSTANT FOR SEVERAL DIVISIONS ON CD4+ T CELLS. D. Daz1, A. Prieto1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal. Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares. Madrid. Spain Background. After mitogenic stimulation, IL-2 induces on on T cells both proapoptotic and proliferative effects which obviously require the expresion of interleukin 2 receptor (IL-2R). Material and Methods. PBMCs were labelled with carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester (CFSE). PBMCs were stimulated policlonally with microbeads coated with antiCD3 and antiCD28 antibodies and cultured for 6 days with IL-2. After culture, CD4+ and CD8+ T cells were enumerated and the expresion of IL-2R (CD25) on these cells was monitorized. Results. After 6 days of culture, both CD8+ and CD4+ T cells have developed an asynchronic proliferative response and underwent until six rounds of cell divisions. CD25 mean fluorescence intensity
(MFI) of mitogen stimulated undivided CD8+ T blasts was 50 folds higher than their expression before stimulation while for undived CD4+ T cells the MFI increment was only 15 folds. CD25 expression on CD8+ T cells decreased progresively along succesive cell divisions, instead CD25 expression on CD4+ T cells remained constant until the fifth division. We also studied the mean expression of CD25 by cell progeny derived of one ancestor T cell. We found a progressive increase of CD25 expression in the cell progeny of individual cell from both subsets along cell divisions but this increase was insufficient to maintain CD25 levels on daughter cells. Conclusions. CD25 expression increases significantly on undivided stimulated T blasts and this increase is significantly higher in CD8+ T cells than in CD4+ T cells. CD25 MFI decreases along serial cell divisions on CD8+ T cells and is constant for CD4+ T cells. To maintain the MFI of CD25 per individual cell along serial cell divisions, an active synthesis of CD25 which folds their original quantity before each cell division is needed. However, the increase observed in CD25 content in T cell progeny of individual cells do not completely compensate the distribution of CD25 molecules between daughter cells. 0215. CD25 EXPRESSION PRECEDES BOTH AICD AND PROLIFERATION INDUCED BY MITOGENIC STIMULATION. D. Daz1, A. Prieto1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, J. Barbarroja1, E. Perucha1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine. CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares, Madrid, Spain Background. After mitogenic stimulation IL-2 induces on T cells both proapoptotic and proliferative effects. Methods. The viable and apoptotic CD8+ and CD4+ T cells within resting and blastic cell populations were enumerated at 1 and 3 days after the policlonal stimulation with PHA with or without exogeneous IL-2 (eIL-2). The effects of IL-2 deplection with anti-IL-2 antibodies was studied. After culture, CD4+ and CD8+ T cells were enumerated and the expression of IL-2R (CD25) on these cells was monitorized. Survival rate (SR) measures the fraction of original cells that survive after the initial phase of predominant apoptosis (day 3). Results. The SR of CD8+ T cells was 0.23 for PHA stimulated cultures, 0.04 for PHA plus IL-2 cultures and 0.22 for PHA plus antiIL-2 antibodies cultures.The SR of CD4+ T cells was 0.22 for PHA stimulated cultures, 0.12 for PHA plus IL-2 cultures and 0.18 for PHA plus anti-IL-2 antibodies cultures. Resting CD8+ and CD4+ T cells cultured 1 or 3 days with PHA with or without eIL-2 presented similar values of CD25 mean fluorescence intensity (MFI) in both viable and death cells. CD25 MFI of death T blasts was always higher than of viable T blasts. eIL-2 did not affect to CD25 MFI of CD8+ T blasts. eIL-2 increased two folds the CD25 MFI of CD4+ T blast cultured for 3 days. The addition of anti-IL-2 antibodies do not affect to CD25 MFI of resting T cells. CD25 MFI of CD8+ T viable blasts decreased 70% when blockade IL-2 antibodies were added, while in the death blasts decreased 28%. In CD4+ T blasts the decrease was of 48% in viable blasts and only 7% in death blast. Conclusions. eIL-2 impacts on different ways in the expression of CD25 on CD8+ and CD4+ T cells. The addition of IL-2 also affects to CD25 expression on both resting cells and blasts CD25 expression. The proapoptotic effect of IL-2 was evidenced by decrease in SR in both CD8 and CD4 cells grown in cultures with eIL-2 compared to cultures deprived of IL-2 with anti-IL-2 antibodies
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0216. REGULATION OF THE EXPRESSION OF CD45 ISOFORMS ON POLYCLONALLY STIMULATED SORTED NAVE T CELLS BY CSFE TRACKING METHOD, A. Prieto1, D. Daz1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine. CSIC R&D Associated Unit University of Alcal. Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares. Madrid. Spain Background. The patterns of expression of CD45 isoforms can be used to identify nave, effector and memory T cells. The nave are CD45RA+CD45R0-, the effector are positive for both isoforms and the memory are CD45RA-CD45RO+. Material and Methods. The effect of exogenous IL-2 (eIL-2) on the surface expression of CD45 isoforms on mitogen stimulated nave T cells was studied by flow cytometry on CFSE labelled cells. Policlonal stimulation was performed with either lectin phytohemagglutinin (PHA) or with antiCD3 and antiCD28 antibodies coated microbeads. The mean expression of each isoform per individual cell was quantified by its mean fluorescence intensity which was converted into number of antigen molecules by interpolation in a standard curve of Rainbow microbeads. Results. We found a significant increase until day 3 in the mean expression of both isoforms of CD45 per individual cell (PIC). From day 3 to day 5 the synthesis of both isoforms continues but the dividing cells distribute their CD45 content between its daughter cells. From day 5 to day 7 only the CD45RO isoform increases while CD45RA isform expression PIC decreases as is distributed between their daughter cells. eIL-2 increases CD45RA expression and decreases CD45RO expression. Conclusions. The polyclonal activation induces synthesis of both CD45 isoforms which results in the initial increase of expression of both isoforms until day 3. From day 3 to day 5 the synthesis of both isoforms continues although the CD45 content is distributed between the cell progeny. After this phase of cell proliferation the production of CD45 switches to exclusive CD45RO production increasing the quantity of CD45RO PIC while that of CD45RA decreases. This causes transition to memory phenotype which coincides with the end of proliferation. The eIL-2 increases CD45RA expression but decreases that of CD45RO in the proliferating cells extending its period of proliferation and fostering their clonal expansion. 0217. REGULATION OF THE EXPRESSION OF CD45 ISOFORMS ON POLYCLONALLY STIMULATED SORTED MEMORY T CELLS BY CSFE TRACKING METHOD. D. Daz1, A. Prieto1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine. CSIC R&D Associated Unit University of Alcal. Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares. Madrid. Spain Background. The patterns of expression of CD45 isoforms can be used to identify nave, effector and memory T cells. The nave are CD45RA+CD45R0-, the effector are positive for both isoforms and the memory are CD45RA-CD45RO+. Material and Methods. The modulation of expression of CD45 isoforms on mitogen stimulated negatively sorted memory T cells was
studied by flow cytometry on CFSE labelled cells. Policlonal stimulation was performed with antiCD3 and antiCD28 antibodies coated microbeads plus IL-2. The mean expression of each isoform per individual cell (PIC) was quantified by its mean fluorescence intensity which was converted into number of antigen molecules using Rainbow microbeads. Results. No significant changes in the mean expression of both isoforms of CD45 PIC were observed from day 0 to day 1. The expression of each isoform PIC increased two folds on day 3. From day 3 to day 5 the expression of both isoforms PIC increased three folds. At day 5, the expression of CD45RO isoform on divided T cells was two folds higher than the expression of this isoform on undivided T cells. In contrast, CD45RA expression PIC progressively increases from undivided cells to cells which have suffered three divisions and then remains constant. We also studied the expression of both isoforms by cell progeny derived of one ancestor cell. We found a progressive increase of both isoforms along cell divisions which involves an active synthesis of both CD45 isoforms before each cell division. Conclusions. The polyclonal activation of memory T cells induces synthesis of both CD45 isoforms which results in their increase of expression PIC until day 5. The expression of CD45RO was similar for all the divided cells while the expression of CD45RA increases progressively along serial cell divisions. This two patterns require an active synthesis of both isoforms before each cell division. The expression of CD45 isoforms on undivided T cells was always lesser than of the proliferating T cells 0218. EFECTO DE NFAT EN LA RESPUESTA A LEISHMANIA MAJOR A TRAVES DE IFN? F.J. Garca-Czar1, A. Kiani2, I. Habermann2, S. Laforsch3, T. Aebischer3, G. Ehninger2, A. Rao. 1Hospital Universitario de Puerto Real. Universidad de Cdiz. Carretera Nacional IV km 665. Puerto Real 11510 Cdiz. Department of Pathology. Harvard Medical School. and The Center for Blood Research. Boston. MA. 2Department of Medicine I. University Hospital Carl Gustav Carus, Dresden. 3University of Technology; and the Max-Planck-Institute for Infection Biology. Berlin. Germany El factor nuclear de clulas T activadas (NFAT), dependiente de Ca2+ y Calcineurina y sensible a los inmunosupresores Ciclosporina A (CsA) y FK506, est claramente implicado en la regulacin de la expresin de varios genes de citoquinas (IL2, IL4, TNF, etc.), mientras que su papel en la transcripcin de una de las principales citoquinas implicadas en la respuesta inmune celular, como es el caso de Interferon gamma (IFN), no est claramente establecido. Utilizando ratones KO para NFAT1, se observo que presentaban una disminucin en su capacidad para expresar el gen de IFN que fue atribuida inicialmente al aumento de expresin de IL4 descrito en estos animales y que ocasionaba una diferenciacin mayoritaria a Th2, con la consecuente hiperexpresin de los factores de transcripcin Maf y GATA3, especficos de Th2. En el presente estudio se presentan evidencias de que la ausencia de NFAT1 afecta a la expresin del gen de IFN en ausencia de diferencias en la expresin de IL4, puesto que en ratones KO para IL4, las diferencias en la expresin de IFNg entre NFAT+/+ y NFAT1-/se mantienen. Las diferencias mencionadas tienen una implicacin in vivo por cuanto los ratones NFAT1-/- tienen incrementada la susceptibilidad a infecciones por Leishmainia Major cuya resolucin depende del desarrollo de una respuesta Th1 adecuada.
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Sesin 03. Linfocitos B y otras clulas del sistema inmune

Comunicaciones Orales: 0301-0310 0301. INHIBICIN DE LINFOPOIESIS B POR IFN. R. Gngora1,2, M. Snchez-Prez1, M.D. Cooper2. 1Instituto de Microbiologa Bioqumica, Universidad de Salamanca, Salamanca y 2Developmental & Clinical Immunology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham (USA) El interfern gamma (IFN) es una citocina pleiotrpica producida en la periferia principalmente por linfocitos T y NK activados y con un papel inmunomodulador bien caracterizado. Aunque se sabe que el IFN inhibe el desarrollo de los linfocitos B as como el de otros progenitores hematopoyticos tanto in vitro como en situaciones patolgicas, su papel en la ontogenia normal de estos linfocitos B en la mdula sea todava no est bien caracterizado. Nuestro objetivo fue detectar la presencia de este interfern en mdula sea de ratn y estudiar su posible papel fisiolgico y para ello utilizamos un sistema de cultivo ex vivo de estos progenitores. Brevemente, progenitores B se crecieron sobre una capa de clulas NIH3T3 trasfectadas con el gen de la IL-7, citocina esencial para el desarrollo en el ratn. La expresin de trascritos de IFN fue analizada por RTPCR y su efecto en los procesos de muerte celular y proliferacin fueron analizados por citometra de flujo y microscopa confocal. Nuestros resultados indicaron la presencia de trascritos de IFN producidos por macrfagos residentes en la mdula sea y su efecto inhibidor de la proliferacin de estos progenitores mediante apoptosis en un paso previo al estadio de progenitor pre-B. IFN induca selectivamente la expresin de Fas en estos progenitores aunque no se pudo confirmar in vitro un mecanismo de apoptosis mediado por interaccin de este receptor Fas. No obstante, IFN induca tambin la expresin de Daxx, una protena constituyente de los cuerpos nucleares y que se sabe esta relacionado con los procesos de proliferacin y muerte celular por apoptosis. En consecuencia IFN es un regulador del desarrollo de los linfocitos B y parece inducir la muerte por apoptosis mediante varios mecanismos que pueden ser redundantes. 0302. VIABILIDAD INDUCIDA POR BCR EN LEUCEMIA LINFOIDE CRNICA. G. Prez-Chacn1, B. Contreras2, S. Cun1, J. Jord3, F. Gonzlez4, J. Delgado5, J.A. Vargas2, P. Prez-Aciego1, A. Durntez1,2. 1Fundacin LAIR. 2Servicio de Medicina Interna I. 4O.R.L. Hospital Universitario Puerta de Hierro. 3Hematologa. Hospital Clnico San Carlos. 5Hematologa. Hospital Universitario La Paz. Madrid. Espaa Introduccin. La leucemia linfoide crnica de clula B (LLCB) es una enfermedad de etiologa desconocida caracterizada por una expansin clonal de linfocitos B de fenotipo relativamente maduro, que expresan CD5 y una baja densidad de inmunoglobulina de superficie (BCR). A pesar de esta baja expresin, parece que la seal de antgeno a travs de su receptor puede ser crtica en el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estudios in vitro han revelado datos contradictorios, puesto que anticuerpos anti-BCR pueden inducir apoptosis o supervivencia en las clulas tumorales. Objetivo. Estudiar la viabilidad mediada por BCR en clulas B de LLC-B. Materiales y mtodos. Se aislaron linfocitos B de sangre perifrica de 28 pacientes de LLC-B, mediante centrifugacin en gradiente y seleccin negativa por mtodos inmunomagnticos. Como controles se emplearon linfocitos B de pacientes con linfoma de clula del manto (LCM), de cordn umbilical y de amgdala. Se cuantific la viabilidad celular en presencia o ausencia de estmulos especficos de BCR (Anti-IgM F(ab)2 y SAC/IL-2), mediante tincin con anexina V/Ioduro de propidio y anlisis por citometra de flujo. Resultados. Se observ que el porcentaje de viabilidad a las 120 h era mayor en los linfocitos B de LLC-B tratados con anti-IgM (42 23) o SAC/IL-2 (54 24) que en los no estimulados (28 20; p < 0,001). En el caso de los controles los resultados eran heterogneos; mientras que en cordn umbilical la viabilidad a 120 h era nula en todas las condiciones estudiadas, las clulas B de LCM y de amgdala presentaban una tendencia similar a las de LLC. Sin embargo, slo se encontraron diferencias significativas en el caso de estimulacin con SAC/IL-2 (p < 0,05). Conclusiones. La estimulacin a travs de BCR produce un aumento de la viabilidad en los linfocitos B de LLC-B a tiempos largos, pudiendo ser un mecanismo importante en la prolongada supervivencia in vivo de estas clulas. 0303. ANLISIS DEL REPERTORIO DE INMUNOGLOBULINAS HUMANAS EN RATONES TRANSGNICOS DEFICIENTES EN IgM/KAPPA ENDGENA. S. Magadn1, E. Surez2, I. Sanjun3, M. Valladares1, A. Molina1, F. Gambn3, F. Daz-Espada2, . Gonzlez-Fernndez1. 1rea de Inmunologa. Universidad de Vigo. Pontevedra. 2Servicio de Inmunologa. Clnica Puerta de Hierro. Madrid. 3Unidad de Inmunologa. Hospital Meixoeiro de Vigo Los reagrupamientos de los segmentos V(D)J que dan lugar al repertorio de las Inmunoglobulinas no se producen al azar, ya que se ha visto que tanto en humanos como en ratones, existe una utilizacin preferente de algunos segmentos gnicos. Quisimos estudiar si los genes humanos presentes en los transloci de ratones portadores de cadenas pesada y ligera (BAB ) y humanas (BAB,) pero deficientes en la produccin de IgM/ endgena (MT/-/-), reordenan con una frecuencia similar a la descrita en humanos, y si este repertorio se ve alterado tras la inmunizacin. Se compararon los segmentos utilizados en los reagrupamientos de linfocitos B de bazo de ratones sin inmunizar con los de diversos hibridomas (un total de 28) obtenidos de ratones inmunizados con diversos antgenos humanos (clulas o protenas). A partir de cDNA, se realizaron amplificaciones con diversos primers especficos de los segmentos VH y JH presentes en el transgen, y se analizaron las secuencias de los reagrupamientos de las Igs humanas. Los resultados muestran importantes diferencias en el repertorio de segmentos gnicos utilizados por clulas de bazo y por los hibridomas. Mientras que las clulas de bazo de estos ratones reagrupan ms de un VH del transgen (VH1-2, VH4-4, VH6-1), todos los hibridomas analizados utilizaron exclusivamente el segmento VH12. Esta importante restriccin en hibridomas parece ser exclusiva de estos ratones, y viene sin embargo acompaada por una gran variedad en los reordenamientos JH-DH, introduccin de nucletidos N y P, y, tambin a una mayor variabilidad en el uso de segmentos gnicos
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que codifican para la cadena ligera k humana. El anlisis del uso de los segmentos JH y DH muestra tambin que existen diferencias entre clulas de bazo e hibridomas, siendo en estos ltimos donde los reagrupamientos son ms similares a los descritos en clulas de sangre perifrica de humanos adultos. Con respecto a la frecuencia de mutaciones introducidas por el proceso de hipermutacin somtica, fue similar tanto en linfocitos esplnicos como en hibridomas. Nuestros resultados indicaran que la utilizacin de un solo gen VH es suficiente en estos ratones para generar una buena respuesta inmune frente a una gran variedad de antgenos, y que los esfuerzos para desarrollar nuevos ratones transgnicos deben centrarse ms en incluir segmentos D, J y regiones reguladoras, que en el nmero de segmentos V. Financiado por el Instituto de Salud Carlos III (Red del Fis exp. CG03/136) 0304. EFECTO DEL FAS Y DEL BCL-2 EN LA HIPERMUTACIN SOMTICA DEL TRANSGEN VkOx1-Jk5-Ck rata EN LAS PLACAS DE PEYER DE RATN. E. Fernndez Mastache1, K. Lindroth2, C. Fernndez2, A. Gonzlez Fernndez1. 1rea de Inmunologa. Universidad de Vigo. Pontevedra. 2Departamento de Inmunologa. Universidad de Estocolmo En las placas de Peyer los centros germinales (CGs) estn presentes en ausencia de una inmunizacin especfica debido a una estimulacin crnica por Ags del ambiente intestinal. Quisimos estudiar la contribucin relativa tanto de la va apopttica activada a travs del receptor de membrana FAS como de la va bloqueada por la protena intracelular BCL-2, en la regulacin del proceso de seleccin y de hipermutacin somtica de los linfocitos B de CG (B220+ PNAhigh ) de las Placas de Peyer de ratn. Se utilizaron dos cepas de ratones, una que sobreexpresa el gen bcl-2 (Bcl-2-36) y otra que presenta el gen del Fas mutado (B6.MRL-lpr), ambas cruzadas con ratones transgnicos portadores del gen reagrupado VkOx1-Jk5 de ratn unido a una constante kappa de rata. La cepa Bcl-2/VkOx1 y un grupo control fueron mantenidos en el animalario en condiciones estndar, mientras que la cepa lpr/VkOx1 y su control, estuvieron en condiciones semiestriles. El anlisis de las mutaciones incorporadas en el transgen reagrupado VkOx1-Jk5 tras amplificacin por PCR, clonacin y posterior secuenciacin, revela que los ratones Bcl-2/VkOx1 presentan una tasa de mutacin inferior al control, con una ausencia significativa de mutaciones en posiciones conocidas como hospots intrnsecos al proceso de mutacin. En el caso de los ratones lpr, an estando en condiciones de baja estimulacin antignica por el ambiente semiestril, presentaron una elevada tasa de mutacin, gran nmero de hostspots, y un nmero elevado de codones stop. Estos datos contrastan con la baja tasa de mutaciones encontrada en su grupo control. Los datos sugieren que la sobreexpresin del bcl-2 podra estar alterando a la maquinaria de hipermutacin somtica en los linfocitos B de las placas de Peyer, mientras que en los ratones lpr, las clulas B acumularan mutaciones en sucesivas reentradas al CG por una alteracin en el proceso apopttico. 0305. ANLISIS DE LAS MUTACIONES SOMTICAS EN GENES IgVH PRESENTES EN CLULAS PLASMTICAS HUMANAS DE SANGRE Y MDULA SEA. I. Salcedo, A. Campos-Caro, C. Segundo, F. Medina, J.A. Brieva. Servicio de Inmunologa y Unidad de Investigacin. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz
Las clulas plasmticas (CP) son la fase final de la diferenciacin B inducida por el antgeno (Ag). Coordinado con el proceso madurativo que da lugar a la transformacin de los linfocitos B a CP, se producen fenmenos adaptativos de las Ig que sintetizan, mediante la seleccin de las clulas que, tras sufrir mutaciones somticas en sus genes IgV, desarrollan las Ig con mayor afinidad por el Ag. Recientemente, se ha podido establecer en humanos que las CP no son homogneas, observndose un gradiente madurativo que se inicia en las CP tempranas de los rganos linfoides (amgdala, bazo), progresa en la fase circulante en sangre (S) de las CP y es mxima en CP presentes en rganos de depsito final (mdula sea MO- y lmina propia mucosa). A pesar de su posible inters, no hay estudios de mutaciones somticas en genes IgV de CP de S y MO. En este trabajo se han obtenido CP humanas de S y MO altamente purificadas, secuencindose el cDNA codificante de las regiones IgVH6 procedente de CP secretoras de IgM e IgG (n= 56). De acuerdo con lo descrito, estos genes aparecan densamente mutados, sobretodo en CDR1 y 2 y, en menor medida, en FR3. En contra de lo esperado, se observaron mayores frecuencias de mutaciones en las CP de S que en las de MO (5,5 y 5,6 versus 3,4 y 4,9 para y , respectivamente). Esto se deba esencialmente a diferencias en la cantidad de mutaciones en CDR2 entre ambos isotipos (p<0,04). Otro hecho llamativo es que las mutaciones que ocurren en FR se asientan con frecuencia sobre motivos RGYW/WRCY (53%), mientras esto no es as en las presentes en CDR (18%). La relacin de mutaciones de reemplazamiento sobre silentes (R/S) en FR era inferior a la que se producira al azar. La relacin R/S en CDR era claramente superior a la encontrada en FR, aunque en ningn caso superaba a lo esperado si dependiera exclusivamente del azar. Estos datos parecen indicar que la influencia de la seleccin por Ag in vivo sobre la distribucin y naturaleza de las mutaciones somticas en genes IgVH, sobrepasa a la de factores intrnsecos descritos como asociados a las mismas. 0306. LOCALIZACIN SUBCELULAR DE PROTENAS SNAREs EN LNEAS DE CLULAS PLASMTICAS HUMANAS E IMPLICACIN DE STAS EN LA SECRECIN DE INMUNOGLOBULINAS. E. Reales, F. Mora-Lpez, J.A. Brieva1, A. Campos-Caro. Unidad de Investigacin y 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz Las clulas plasmticas (CP) son el resultado final de los procesos madurativos de la denominada respuesta inmune humoral. Son clulas con una alta tasa de secrecin de anticuerpos y caracterizadas morfolgicamente por presentar un citoplasma con un desarrollado retculo endoplsmico (RE) y un amplio aparato de Golgi, como corresponde a su funcin secretora. El estudio de la maquinaria proteica secretora en clulas eucariotas ha llevado a la identificacin de un gran nmero de protenas denominadas SNAREs (Soluble Nethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptors) que median la secrecin de vesculas. No obstante, no se han descrito las posibles protenas SNAREs que podran estar interviniendo en este proceso secretor. ste es nuestro principal objetivo. Utilizamos para el estudio lneas de CP humanas como IM-9 (IgG) y U266-B1 (IgE). La realizacin de centrifugacin diferencial a partir de un homogeneizado de clulas nos ha permitido caracterizar la localizacin subcelular de protenas SNAREs ya detectadas en las lneas de CP humanas mencionadas. SNAP-23, SX3, SX4, VAMP-2 estn presentes en el pellet de la fraccin mitocondrial pesada (3000 xg); pellet de
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la fraccin mitocondrial ligera (17000 xg), donde se detecta una mayor presencia y pellet microsomal (100000 xg). En la fraccin citoslica (sobrenadante de 100000 xg) no detectamos ninguna de las protenas a estudio. En esta ltima fraccin tampoco detectamos inmunoglobulinas, lo cual nos indica que stas no se encuentran de forma soluble en el citosol y que deben almacenarse en vesculas. Para el estudio funcional de las protenas SNAREs incorporamos en las lneas de CP, mediante un reactivo que introduce protenas en las clulas, anticuerpos frente a las protenas objeto de estudio y analizamos mediante la tcnica de ELISA, su efecto sobre la secrecin de inmunoglobulinas. Los resultados obtenidos presentan una notable inhibicin de la produccin con anticuerpos que bloquean a SNAP-23 y en menor medida a SNAP-25, y un aumento de la produccin con anticuerpos frente a SX3. Estos resultados demuestran una implicacin de protenas SNAREs sobre la secrecin de anticuerpos, datos que estn tratando de ser confirmados mediante experimentos con formas mutadas de estas protenas. 0307. LA VA DEL CD14 SOLUBLE REGULA LA EXPRESIN DE TLR4 EN MONOCITOS HUMANOS. C. Moreno, N. Ramrez, A. Echeverra, F. Pastor, J. Merino, A. SnchezIbarrola. Servicio de Inmunologa. Clnica Universitaria. Facultad de Medicina. Universidad de Navarra Alguno de los componentes del receptor de LPS sufren regulacin en su expresin tras interaccin con el propio ligando. Concretamente TLR4 reduce dramticamente la expresin en membrana tras exposicin a LPS. Hemos querido estudiar los efectos de LPS directamente sobre TLR4 en monocitos humanos deplecionados de CD14 de membrana. Mediante bloqueo de la exocitosis va Golgi por Brefeldina A se impide la reexpresin de CD14 tras su liberacin a la fase soluble. La expresin de TLR4 en la membrana se detect mediante el monoclonal HTA125 y citometra de flujo. En este modelo resultados previos muestran que la expresin de TLR4 es normal. Estos datos apoyan la teora de que los componentes del receptor multimrico de LPS se unen en la membrana. Comprobamos que LPS no interacciona directamente con TLR4 dado que la expresin de esta molcula no se altera en presencia de LPS en clulas desprovistas de mCD14. Sin embargo en cultivos en presencia de suero o bien sobrenadantes de cultivos, como fuente de CD14 soluble, LPS regula negativamente la expresin de TLR4. Este efecto se comprueba es dependiente de CD14 soluble dado que anticuerpos monoclonales anti CD14 lo inhiben. Estos datos demuestran que la va de CD14 soluble es capaz de interaccionar directamente con TLR4 en la membrana de monocitos humanos, regulando negativamente su expresin. 0308. CONEXIN EN MACROFAGOS DE LAS RUTAS DE SEALIZACIN LISTERICIDAS MEDIADAS POR LINFOCINAS NEUTRALIZANTES. C. Pea Macarro, B. Renedo Chico, E. Carrasco Marn, C. lvarez Domnguez. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla (HUMV). Santander. Cantabria En los ltimos aos se ha descrito que la seal listericida inducida por el IFN-gamma se produce a travs de dos vas de sealizacin: una mediada por JAK/STAT y otra por Rab5a/Rac2. Sin embargo, existen otras citocinas listericidas que induciendo la primera ruta
no se conoce si son capaces de inducir la segunda ruta, esto es, la mediada por Rab5a/Rac2. En este estudio se abordar si existen otras citocinas listericidas capaces tambin de inducir la va de sealizacin, Rab5a/Rac2 en macrfagos. Este anlisis se correlacionar tanto con el ndice de replicacin de Listeria monocytogenes como con la produccin de radicales oxigenados con alta capacidad listericida. Adems se analizarn los posibles mediadores de conexin de ambas rutas de sealizacin. Las citocinas a estudiar son: TNF, IL-6, IL-10 e IL-12. Se utilizarn cinticas de incubacin con las distintas citocinas para estudiar la activacin de Rab5a/Rac2 mediante immunoprecipitacin de sus formas activas, formas GTP, que se correlacionarn con los perfiles de fosforilacin/activacin de los diferentes Stats caractersticos de cada citocina y con experimentos de co-precipitacin de mediadores de ambas rutas (GEFs, GAPs, PI3K, MAPK etc). Los ndices de replicacin de Listeria monocytogenes se analizarn mediante contaje de viables en placas de agar-BHI. La produccin de radicales oxigenados se medir mediante el mtodo colorimtrico de oxidacin del citocromo C. Los resultados demuestran que slo alguna de estas citocinas sigue un patrn de activacin de la ruta Rab5a/Rac2 similar al IFN-gamma y al igual que ste se correlacionan con un menor ndice de replicacin bacteriano, una mayor produccin de radicales oxigenados y comparten igual perfil de Stats activados y mediadores. Aquellos mediadores de conexin entre las vas de sealizacin: Jak/Stat y Rab5a/Rac2 sern candidatos adecuados para ser responsables de bloquear factores de virulencia indispensables para la supervivencia del patgeno. 0309. IDENTIFICACIN DE UNA POBLACIN CD45-AA4.1ckithi PROGENITORA DE CLULAS DENDRTICAS DURANTE LA GESTACIN MEDIA DEL RATN. D. Melero, S. Minguet, P. Gonzalo, A. Izcue1, B. de Andrs, P.G. Soro, M.A.R. Marcos1, M.L.Gaspar. Centro Nacional de Microbiologa (ISCIII). 1Centro de Biologa Molecular (CBMSO) Madrid El hgado fetal adquiere su potencial hematopoytico a partir de da 10 de gestacin y llega a convertirse en el principal rgano hematopoytico durante el estado fetal. Sirve de reservorio de las clulas progenitoras que encuentran en l un microambiente propicio para desarrollar su diferenciacin hematopoytica. De esta forma, se conoce su potencial para diferenciar in vitro, en condiciones adecuadas, hacia clulas T, B, NK, macrfagos, mastocitos y clulas dendrticas. Partiendo de una poblacin CD45-AA4.1-ckit+ de hgado fetal de da 11.5 de gestacin optimizamos un protocolo de diferenciacin dirigido hacia linaje dendrtico. Su cultivo en presencia de un coctel de citoquinas basado fundamentalmente en la combinacin de SCF, GM-CSF y Flt3-L permite diferenciar dos poblaciones fcilmente distinguibles por su tamao celular y su capacidad de adhesin: clulas pequeas no adherentes c-kit+, que postulamos pudiera tratarse de una poblacin precursora, y una poblacin de clulas de mayor tamao y capacidad adherente que por citometra de flujo se revelaba como CD11c+CD11b+DEC205+. En presencia de un estmulo adecuado como es LPS bacteriano, esta poblacin adquiere un proceso madurativo clsico sobreexpresando marcadores de activacin y presentacin antignica e inhibiendo su capacidad endoctica. Diferencias en los niveles de trnscritos tanto de IE, RelB o DC-Sign tambin han sido puestos de manifiesto.
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Actualmente, nuestros esfuerzos se encuentran dirigidos a demostrar la presencia ex vivo de poblaciones que expresan marcadores fenotpicos propios de linaje dendrtico como CD11c o DEC205 en diferentes localizaciones embrionarias con potencial hematopoytico. As, nuestro trabajo aborda la identificacin de una poblacin precursora de clulas dendrticas dos das ms temprana a la descrita en la bibliografa con anterioridad. Pensamos que la identificacin de progenitores de linaje dendrtico en periodos tempranos de la hematopoyesis fetal es de gran inters para comprender su origen y desarrollo durante el establecimiento del sistema inmune. 0310. DETECCIN DE CLULAS DENTRTICAS EN LA DECIDUA HUMANA NORMAL Y EN EL ABORTO ESPONTNEO. I. Tirado, R. Muoz Fernndez, M. Kimatrai, E. Garca Olivares. Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad de Granada La decidua es el tejido materno en ntimo contacto con el trofoblasto fetal. Es en este tejido donde se producen mecanismos inmunolgicos que conducen a la aceptacin del embrin por la madre en el embarazo normal o al rechazo del trofoblasto durante el aborto espontneo. En el presente trabajo hemos identificado mediante inmunohistoqumica la presencia en decidua de una poblacin significativa de clulas dentrticas que expresan el antgeno DC-SING (CD-209) y que se localizan preferentemente alrededor de los vasos deciduales. Mediante citometra de flujo hemos podido observar que estas clulas DC-SING+ co-expresan CD25, CD11c, CD40, CD14, HLA-DR, pero son negativas para CD83. Comparando las proporciones de clulas DC-SING+, hemos podido observar un descenso significativo de estas clulas en el aborto espontneo en comparacin con la decidua normal. Estos resultados sugieren que las clulas dendrticas de la decidua en el embarazo normal y en el aborto espontneo se encuentran en una etapa intermedia de diferenciacin y que su descenso en el aborto espontneo se debe a una emigracin de estas a los tejidos linfoides locales para completar su maduracin e iniciar la presentacin antignica. Posters: 0311-0314 0311. LINFOCITOSIS B POLICLONAL: A PROPSITO DE 9 CASOS. C. Serrano1, S. Castan2, J. Snchez3, M.D. Monteagudo3, C. Soto2, J.F. Toms2, D. Subir2. Servicio de Inmunologa1 y Hematologa2 Fundacin Jimnez Daz. Servicio de Hematologa del Hospital de Mstoles3. Madrid La linfocitosis B policlonal es un hallazgo raro y heterogneo. La Linfocitosis Policlonal B Persistente (LPBP) aparece en mujeres jvenes, fumadoras. La Plasmocitosis Medular Policlonal (PMP) afecta a sujetos de mayor edad con hiperplasia medular de clulas plasmticas. La expresin sistmica de la variante plasmocelular de la Enfermedad de Castleman (Hiperplasia Angiofolicular Linfoide o HAL) es la nica de estas entidades que puede evolucionar a linfoma. Objetivo. Revisar 9 casos con linfocitosis B policlonal. Pacientes. Seis mujeres entre 32 y 43 aos diagnosticadas de LPBP; una mujer de 73 aos diagnosticada de PMP; dos casos diagnosticados de HAL (un varn, HIV+, de 44 aos y una mujer de 83 aos).
Mtodos. Inmunofenotipo, hemograma y frotis en sangre perifrica; cuantificacin de inmunoglobulinas (Ig) e inmunoelectroforesis en suero; estudio del reordenamiento de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. Resultados. 1. Todos las pacientes, excepto el enfermo HIV+, tenan linfocitosis moderada. 2. En la LBPB la linfocitosis afectaba a la poblacin B (rango de 1.660 A 3.600 cel/l) pero tambin a los linfocitos T. 3. El inmunofenotipo de los linfocitos B en las LPBP es homogneo (CD45++, CD19+, CD20++, CD22+, FMC7+, HLA DR+; ambas cadenas ligeras de las Ig en superficie -Igs-). En la PMP, aparecen subpoblaciones de linfocitos B que van perdiendo CD19, CD20, CD22, HLA DR y adquiriendo marcadores de clulas plasmticas (CD38, CD138; prdida de intensidad de las Igs o Igs indetectables). En las HAL, existen dos poblaciones claramente diferenciadas: una de LB maduros y otra de plasmablastos (CD19 , CD38++, CD138 ; Prdida de intensidad de las Igs). Todos los casos de LPBP permanecen estables sin tratamiento. Slo los pacientes con HAL y PMP recibieron tratamiento con buena evolucin posterior. Conclusiones. La linfocitosis B policlonal es una entidad de curso benigno y fcil diagnstico con el estudio del inmunofenotipo en sangre perifrica. 0312. EXPRESIN DE DOS ISOFORMAS DE CD33 EN CLULAS LINFOIDES Y MIELOIDES HUMANAS GENERADAS POR PROCESAMIENTO ALTERNATIVO. T. Hernndez-Caselles, A.M. Quintanilla-Cecconi, M. Martnez-Florensa, A.B. Prez-Oliva, P. Aparicio, P. Garca-Pearrubia. Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular (B) e Inmunologa, Universidad de Murcia Las sialoadhesinas o siglecs son glicoprotenas de membrana de la superfamilia de las Ig que poseen secuencias tipo ITIM en sus colas citoplsmicas que las convierten en excelentes candidatas como protenas inhibidoras o reguladoras de la funcin de las clulas que las expresan. Se piensa que el reconocimiento de cido sialico por parte de los siglecs podra tener un papel importante en la regulacin del sistema inmune innato. En nuestro laboratorio hemos estudiado la expresin del siglec-3 (CD33) en clulas linfoides y mieloides humanas. Nuestros datos anteriores demostraron que CD33 se expresa tambin en clulas T y NK activadas por mitgenos y por aloantgenos y sugieren que CD33 puede ser un importante regulador de la actividad efectora de estas clulas. En el trabajo presente, mediante RT-PCR y Northern blot, hemos detectado la presencia de una isoforma desconocida de CD33, que llamamos CD33m, en todas las clulas CD33+ analizadas, tanto de tipo linfoide como mieloide. La isoforma CD33m (GenBank accession number AY62464) es idntica a CD33 conocida (a la cual llamamos CD33M) en el pptido seal, en el dominio tipo Ig C2 y las regiones transmembrana y citoplsmica. Sin embargo, CD33m carece del dominio Ig tipo V presente en CD33M, el cual est codificado por el exn 2 del gen de CD33. Nuestros resultados indican que el mRNA de CD33m se expresa en lneas mieloides y NK pero es muy escaso en lneas B y T. La expresin de la isoforma CD33m en membrana se estudiar tras obtener mAb especficos contra ella. Tambin hemos estudiado la expresin de CD33 en clulas de ratn, sin embargo, al contrario de lo descrito, hemos detectado una sola isoforma de CD33 (m33-A).
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Nuestros datos demuestran que CD33, en clulas hematopoyticas humanas, puede existir como dos isoformas diferentes obtenidas por splicing alternativo del gen de CD33 las cuales podran participar en la regulacin de la funcin de estas clulas. En clulas hematopoyticas murinas, en cambio, podra existir una sola forma de CD33. 0313. CARACTERIZACIN DEL PROMOTOR DEL GEN DE BLIMP-1 EN HUMANOS. F. Mora-Lpez, E. Reales, J.A. Brieva1, A. Campos-Caro. Unidad de Investigacin y 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz Los linfocitos B se originan a partir de precursores en la mdula sea; los linfocitos B maduros, despus de entrar en contacto con el antgeno, dan lugar a las clulas plasmticas, que constituyen el estadio terminal del desarrollo de las clulas B y cuya funcin es la secrecin de grandes cantidades de inmunoglobulinas. En esta diferenciacin desde los precursores B en la mdula sea hasta la clula plasmtica la regulacin transcripcional tiene un papel crtico, interviniendo diversos factores de transcripcin. En humanos, uno de ellos, el factor de transcripcin PRDI-BF1 (Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1), ms conocido por su homlogo en ratn denominado BLIMP-1 (B Lymphocyte-Induced Maturation Protein 1) es clave en la etapa final de diferenciacin a clula plasmtica. BLIMP1 es un represor transcripcional cuya expresin en el linfocito B dispara la transformacin en clula plasmtica. Se sabe que BLIMP-1 reprime la expresin de genes como los del INF-beta, c-Myc, Pax-5 (BSAP), CIITA y otros. Sin embargo poco se conoce sobre la regulacin transcripcional del propio gen de blimp-1. Con el objetivo de indagar sobre la regulacin de la expresin de BLIMP-1 en las clulas plasmticas hemos estudiado la regin promotora del gen de blimp-1 humano. Mediante PCR utilizando DNA genmico hemos amplificado una regin de unas ~2200 pb. La secuenciacin de esta regin nos ha permitido precisar algunas diferencias entre las secuencias genmicas y de cDNA publicadas en las bases de datos. Por otro lado, mediante ensayos de proteccin de RNasas se ha determinado la regin que contiene el inicio de transcripcin del gen de blimp-1 que result ser mltiple como es normal en genes que poseen promotores sin cajas TATA. Se estn realizando distintas construcciones del promotor en vectores reporteros con luciferasa y se estn trasfectando en lneas celulares plasmticas y no plasmticas con la fina-
lidad de ver diferencias en la regulacin transcripcional del gen de blimp-1. 0314. TRANSFECCIN DE LNEAS CELULARES LINFOIDES MEDIANTE ELECTROPORACIN. F. Mora-Lpez, E. Reales, J.A. Brieva1, A. Campos-Caro. Unidad de Investigacin y 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz Las lneas celulares de origen linfoide son particularmente difciles de transfectar mediante los mtodos qumicos convencionales. La introduccin de ADN en las clulas mediante electroporacin (electrotransfeccin) es una tcnica alternativa para la transfeccin de lneas celulares linfoides y de otras lneas reacias a la transfeccin mediante los mtodos qumicos. La electroporacin consiste en la exposicin de las clulas a un pulso elctrico intenso, con una duracin de microa milisegundos, que abre poros en la membrana celular hacindola transitoriamente permeable a molculas de alto peso molecular. La electrotransfeccin es un mtodo rpido y simple para introducir ADN en clulas eucariotas. Sin embargo, para obtener una alta eficiencia en la transfeccin se requiere una previa optimizacin individualizada de los parmetros elctricos para cada lnea celular. Un factor crtico es el voltaje del pulso elctrico: es necesario definir el voltaje ptimo de electroporacin para cada lnea celular. Voltajes inferiores al ptimo conllevan menor eficiencia en la transfeccin; con voltajes superiores la eficiencia de la transfeccin decae debido al aumento de la muerte celular que se produce durante el pulso elctrico. Otros factores importantes en la electrotransfeccin son la duracin del pulso elctrico (que es dependiente de la capacitancia y del volumen de electroporacin), el medio de electroporacin y la densidad celular. La calidad del ADN es un es un factor importante para el xito de la transfeccin; cuando se trata de clulas linfoides se convierte en un factor crtico, debido fundamentalmente a la accin de la endotoxina (lipopolisacrido) liberada de las paredes celulares bacterianas durante el aislamiento del ADN plasmdico. Utilizando el electroporador Gene Pulser II (BioRad) hemos puesto a punto la transfeccin mediante electroporacin de varias lneas celulares de origen linfoide: Jurkatt (linfoide T), IM9 (linfoblastoide B), U266-B1 y NCI-H929 (plasmticas), optimizando los parmetros elctricos para conseguir una alta eficiencia de transfeccin y optimizando la tcnica para reducir la muerte celular consiguiendo una elevada viabilidad celular.
Sesin 04: MHC: estructura y funcin

Comunicaciones Orales: 0401-0412 0401. CLONACIN Y CARACTERIZACIN DEL PROMOTOR DEL GEN MICB HUMANO. S. Rodrguez-Rodero1, S. Gonzlez1, J.L. Fernndez-Morera2, J. Martnez-Borra2, J. Ramn de los Toyos1, L. Rodrigo3, C. Lpez-Larrea2. 1Departamento de Biologa Funcional.Universidad de Oviedo. Servicios de 2Inmunologa y 3Digestivo. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo La expresin de MICB se induce en clulas infectadas o transformadas. El objetivo de este trabajo es estudiar los mecanismos implicados en la induccin de la expresin de MICB. Para ello clonamos su regin promotora (+115/-473) a partir de diversas lneas homocigotas especficas para los alelos de MICB ms frecuentes: MICB0101 (IMR90), 01021(WT51), 01031(LZL), 0104(PLH), 0105(DMO), 0106(COX). El anlisis de estas secuencias revel la existencia de tres variantes de promotor que incluan tres cambios puntuales G/C y una deleccin (TTagGG/TTGG). Mediante una tcnica de PCR-SSP comprobamos que estos cambios estaban presentes en nuestra poblacin, encotrndose la deleccin en homocigosis en el 9% de los individuos y en heterocigosis en el 42%. Para estudiar el efecto de estas variantes sobre la actividad transcripcional de MICB, subclonamos los diferentes promotores de MICB, as como el de MICA (+34/-586), en un
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plsmido reporter y estudiamos su actividad transcripcional mediante la transfeccin en diferentes lneas celulares (HeLa, A375, GMR). Los promotores de MICB fueron capaces de inducir la trascripcin de manera tejido-especfica en aquellas lneas que expresaban el gen, lo que sugiere que posee todos los elementos necesarios para regular la expresin del gen. Adems se observaron grandes diferencias entre los diferentes variantes del promotor de MICB. Aquellas que no presentaban la deleccin tenan una actividad transcripcional similar a MICA, sin embargo la presencia de la deleccin disminua notablemente la transcripcin (>8 veces, p<0,05). No se observ ningn efecto en la respuesta inducida por heat shock. Para estudiar la contribucin relativa de cada uno de los polimorfismos sobre la actividad transcripcional construimos diversas delecciones de cada una de las variantes (+115/-185, +115/-107, +115/-46, +115/-22). Los datos obtenidos sugieren que la deleccin podra ser la principal responsable del descenso de la trascripcin de MICB.
0402. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO DEL PROMOTOR DE DIFERENTES SUBTIPOS DE HLA-B27. S. GarcaFernndez1, M.A. Blanco-Gelaz1, S. Gonzlez2, C. LpezLarrea1. 1Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo; 2Departamento de Biologa Funcional, Universidad de Oviedo Aunque las molculas HLA de clase I clsicas son expresadas por la mayora de clulas somticas maduras, su nivel de expresin vara ampliamente segn diferentes tejidos y estadios de diferenciacin. En la regin promotora de estos genes han sido identificados una serie de elementos reguladores dispuestos en cis, entre ellos una secuencia denominada enhancer A la cual une factores de transcripcin pertenecientes a la familia NF-B y es la diana de activacin por TNF; tambin se ha identificado un elemento de respuesta a interfern y una secuencia enhancer B. Puesto que la regin del promotor de HLAB estudiada es de unos 300 pb, nos planteamos el estudio gentico y funcional de una regin ms amplia del promotor. Para el presente trabajo hemos analizado la posible existencia de polimorfismos en el promotor de HLA-B27. Para ello, hemos clonado y secuenciado una regin de 517 pb de los promotores de ocho diferentes subtipos de HLA-B27 (B*2702-09) a partir de DNA de lneas linfoblastoides. Estos estudios nos han permitido detectar un polimorfismo en posicin 332 (C/A) con la siguiente distribucin entre alelos: -332/A (HLA-B*2704, 06, 07), -332/C (HLA-B*2702, 03, 05, 08, 09). Para el anlisis de la influencia del polimorfismo 332 (C/A) sobre la actividad del promotor de HLA-B27, hemos clonado ambos promotores en un sistema reporter de transcripcin eucariota y transfectado la lnea celular HeLa. La cuantificacin de la actividad luciferasa en extractos celulares de dicha lnea celular, indica un aumento de la actividad del promotor del orden de doble para el alelo 332/C con respecto al 332/A. Hemos identificado la presencia de un posible sitio de unin para el factor de transcripcin eucariota Est-1. Ensayos EMSA en fase de desarrollo permitirn determinar la unin de algn posible factor de transcripcin, para posteriormente determinar la funcionalidad de esta regin polimrfica. 0403. ESTUDIO DE LA REGULACIN TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES MHC DE CLASE II. Q. Segun, M. Krawczyk, J. Jimnez, W. Reith, M. Snchez-Prez. Dpto. Microbiologa y Gentica Instituto de Microbiologa Bioqumica Universidad de Salamanca/CSIC misanper@usal.es
La expresin, tanto constitutiva como inducible, de las diferentes molculas del MHC de clase II humano, est regulada principalmente a nivel transcripcional. Esta regulacin se lleva a cabo mediante la interaccin de diversos factores transcripcionales con secuencias altamente consevadas de las regiones promotoras de estos genes. Adems de esta regulacin coordinada de los diferentes isotipos de clase II, existen evidencias que indican una regulacin descoordinada de estos genes. Disponemos de una coleccin de mutantes LCLs que evidencian la anteriomente citada descoordinacin en la regulacin transcripcional de los distintos genes del complejo. Estas lneas mutantes fueron seleccionadas por carecer de HLA-DP en superficie, mientras que s expresan HLA-DR y DQ. Entre ellas, hemos elegido las lneas 45.EM2 y 45.EM18 que carecen de HLA-DP debido a la ausencia de expresin del gen HLA-DPB1 y HLA-DPA1 respectivamente. Experimentos previos realizados en nuestro laboratorio sugieren la existencia de un defecto en un factor transcripcional necesario para la expresin de HLA-DP. Para apoyar esta hiptesis presentamos ensayos de expresin acoplada al gen de la luciferasa en ambas lneas mutantes. Con objeto de saber si el defecto es especfico de HLADPA1 o HLA-DPB1, medimos los niveles de transcritos de los diferentes genes de clase II en las lneas 45.EM2 y 45.EM18 mediante PCR cuantitativa en tiempo real lo que desvel diferencias de expresin de los genes anteriores. Por ltimo, para ver si CIITA y RFX5 (factores transcripcionales indispensables para la expresin de clase II) se unen de forma correcta a los promotores de HLA-DPA1 y HLA-DPB1 en las lneas 45.EM2 y 45.EM18, estamos realizando ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina de las lneas celulares. 0404. POLIMORFISMO DE LA REGIN PROMOTORA DEL GEN HLA-DQB1 Y DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO CON EL GEN ESTRUCTURAL EN POBLACIN ESPAOLA. M. Muro, L. Marn, R. Moya-Quiles, A. Toro, O. Montes, M. Montes, N. Guerra, J.M. Alemany, R. lvarez. Servicio de Inmunologa. Hospital Virgen Arrixaca. Murcia La diversidad allica en el promotor y elementos reguladores de los genes HLA de clase II se ha informado como una fuente adicional de variabilidad. Ya que se han descrito mutaciones en las cajas X1, X2 y W, sin variabilidad en la caja Y, y no existe ningn estudio de las frecuencias allicas del polimorfismo de la regin promotora de DQB1 (QBP) en poblacin espaola, este trabajo investig la distribucin de alelos QBP y haplotipos QBP-DQB1 en dicha poblacin. Se incluyeron en este estudio donantes de la Regin de Murcia (n=108), los cuales haban sido oligotipados previamente para alelos de clase II. El tipaje de los alelos QBP se realiz mediante mtodos moleculares de PCR-SSO and PCR-SSP clsicos como se describo previamente. El alelo ms prevalente fue QBP2.1, seguido de los alelos QBP5.11, 3.1, 6.2, 6.3, 3.21, 5.12 y 6.11. Las frecuencias observadas para los alelos QBP3.22, 3.3 y 4.1 fueron menos del 2%. Las frecuencias allicas del promotor correspondieron mayormente con las frecuencias observadas para los alelos ligados DQB1, ya que se demostr una estrecha unin entre la regin promotora y el segundo exn del gen DQB1, excepto para los alelos DQB1*0302, *0501 y *0604. DQB1*0302 se observo en desequilibrio con las variantes QBP3.21, 3.22 y 3.3. DQB1*0501 se encontr en ligamiento con QBP5.11 y 5.12, y el alelo DQB1*0604 con las variantes QBP6.2 y 6.3. Adems, los alelos del promotor QBP3.3,
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4.1, 5.11, 6.2 y 6.3 estaban ligados al menos a 2 alelos DQB1 diferentes: QBP3.3 se observ ligado a DQB1*0302 y *0303, QBP4.1 a DQB1*0401 y *0402, y QBP5.11 se observ ligado con DQB1*0501, *0502 y *0503. El alelo QBP6.2 se encontr ligado con DQB1*0602 y *0604, y el alelo QBP6.3 con DQB1*0603 y *0604. Por lo tanto, como ocurre en otras poblaciones europeas estudiadas, los alelos de la regin promotora QBP exhiben un fuerte desequilibrio de ligamiento con el locus estructural HLA-DQB1. 0405. ALTERACIN DE LOS CUERPOS DE PML EN TUMORES DE COLON CON PRDIDA TOTAL DE MOLCULAS HLA DE CLASE I. C.M. Cabrera, T. Cabrera, P. Jimnez, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello. Servicio de Anlisis Clnicos e Inmunologa. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada La translocacin cromosmica t(15;17) que implica al gen PML y al gen que codifica el receptor a del cido retinoico (RAR ) se encuentra en la mayora de los pacientes diagnosticados de leucemia promieloctica aguada (LPA). Esta translocacin es la responsable de que la protena PML que se localiza en el ncleo formando los cuerpos de PML se desorganice y pierda por tanto el tpico patrn moteado que se observa en clulas normales. Los cuerpos de PML son estructuras compuestas por un gran nmero de protenas que intervienen en diferentes procesos, como apoptosis, regulacin transcripcional y degradacin proteasomal de protenas unidas a ubiquitina. La ruta de degradacin proteoltica proteasoma-ubiquitina presente en los cuerpos de PML es dependiente del reclutamiento de varios componentes del proteasoma. Se ha observado que tumores de diferente histologa que presentan alteracin de la expresin de molculas HLA de clase I igualmente presentan alteracin de la expresin de componentes de la maquinaria de procesamiento antignico como TAPs y LMPs. En nueve casos de tumores de colon con prdida total de molculas HLA de clase I en superficie, hemos encontrado que la causa responsable estaba en la alteracin de la expresin del gen LMP7. El estudio inmunohistolgico de los cuerpos de PML empleando el anticuerpo monoclonal PG-M3 en este grupo de tumores revel la existencia de patrones desorganizados similares a los que aparecen en clulas LPA. Por lo tanto, la alteracin de los cuerpos de PML est claramente asociada con la ausencia de LMP7 y prdida de molculas HLA de clase I. 0406. EFECTO DE DIFERENTES PPTIDOS INMUNOMODULADORES EN LA POLIMERIZACIN DE LA -TUBULINA Y LA PROLIFERACIN DE LINEAS TUMORALES. M.J. Garca-Moreno, J.G. Casado, E. Peralbo, O. DelaRosa, J.M. Lozano, F. Barahona1, C. Marn2, G. Dueas, A. Cabello Creus, M. Santamara, R. Solana R. Tarazona, J. Pea. Departamento de Inmunologa. Hospital Universitario Reina SofaUniversidad de Crdoba. 1Centro de Biologa Molecular. Universidad Autnoma de Madrid. Madrid. 2Unidad de Investigacin. Hospital Universitario Reina Sofa. Universidad de Crdoba Previamente en nuestro laboratorio, hemos demostrado que el pptido dimrico HLA-B702 (77-83/83/77) (p5) posee un potente efecto inhibidor de la lisis natural y de la lisis redirigida de clulas NK (J. Immunology, 2000). En este mismo trabajo se identifica la -tubu-
lina como ligando del pptido p5. La -tubulina forma microtbulos que son componentes del citoesqueleto esenciales para un gran nmero de procesos celulares como el transporte intracelular, el mantenimiento de la morfologa, la polaridad celular y mitosis. En la actualidad continuamos el anlisis de la funcin del pptido p5, tanto en su forma dimrica como monomrica, y otros pptidos de estructura similar en experimentos de polimerizacin de tubulina y de proliferacin de lneas celulares de tipo tumoral. El estudio sobre la polimerizacin de tubulina se llev a cabo utilizando y tubulina en experimentos in vitro a 37C y midiendo su grado de polimerizacin a 350 nm. Para ello se utilizan diferentes pptidos y as como cierta drogas de accin antitumoral, tales como el taxol y la vimblastina. Se utiliza como control positivo de polimerizacin GTP. El estudio del efecto de los pptidos sobre la proliferacin celular se realiza utilizando diversas lneas celulares obtenidas de melanomas y se cuantifica su efecto mediante timidina tritiada. En los experimentos de polimerizacin in vitro de tubulina, se observ que el p5 monomrico no presenta capacidad de inducir la polimerizacin en contraposicin con lo que ocurre con el pptido p5 dimrico. Se muestran tambin los resultados obtenidos de la accin inductora del taxol y de la accin inhibidora de la vimblastina sobre la polimerizacin de la tubulina y como cuando se utilizan otros ppticos el efecto sobre la polimerizacin de la tubulina es muy variada segn su estructura. Por otra parte los resultados obtenidos indican que el pptido p5 en su forma dimrica a 100 g/ml bloquea significativamente la proliferacin celular de diferentes lneas de melanomas. 0407. GENERACIN DE UNA FORMA DE MR1 HUMANO RECOMBINANTE, SOLUBLE Y UNIDA A 2MICROGLOBULINA EN CLULAS NS-0 DE RATN. B. Gozalbo Lpez, F. Setin Baranda, E. Martnez Naves. Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina U.C.M. Madrid MR1 es una molcula de la familia MHC de clase Id cuya funcin todava no ha sido aclarada, codificada en el cromosoma 1q25.3. Se ha descrito recientemente la asociacin de MR1 con 2microglobulina (2m) en ratn y se ha sugerido que podra actuar como molcula presentadora de antgeno a ciertos linfocitos T. Nuestro objetivo fue la expresin de una forma de MR1 recombinante y soluble (MR1s) unida a 2m, que nos sirva como herramienta para una mayor comprensin de la estructura y funcin de esta molcula. Para ello se ha utilizado el sistema de expresin gnica GS. Los cDNA que codifican para MR1 y 2m fueron clonados en el plsmido pEE 12.4 que contiene el gen de la glutamina sintetasa. Los plsmidos obtenidos fueron electroporados en clulas NS-0 de ratn, que fueron inmediatamente clonadas por dilucin lmite. Los clones fueron seleccionados en medio de cultivo sin glutamina. La produccin de MR1 en los clones seleccionados fue comprobada mediante Western Blot utilizando antisueros de conejo anti MR1 desarrollados en nuestro laboratorio. Tambin se comprob la presencia de 2m mediante un antisuero de conejo comercial y mediante el anticuerpo monoclonal BBM1.1. Nuestros resultados indican que MR1 es secretada en forma de una protena de 40 KD de peso molecular. Esta protena se secreta al medio unida a 2m, y puede ser co-inmunoprecipitada con el anticuerpo monoclonal BBM1.1, especfico de 2m. La molcula recombinante que hemos generado ser de gran utilidad en diversos estudios que estamos realizando para determinar la estructura y funcin de MR1.
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0408. DISTRIBUCIN DE ALELOS HLA-B EN LAS POBLACIONES AMERINDIAS DE MXICO. G. VargasAlarcn2, J. Moscoso, J. Zamora, G. Hernndez-Pacheco1, J. Ziga2, J.M. Rodriguez-Perez 2, J.M. Martn-Villa1, M. Prez-Blas1, M. Lpez-Santalla1, J. Martnez-Laso, J. Granados2, A. Arnaiz-Villena. Dep. Inmunologa, Facultad de Medicina. Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense. Madrid. E-mail: aarnaiz@med.ucm.es. 1Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. 2Physiology Department. Instituto Nacional de Cardiologa Ignacio Chvez. Mxico City. Mxico En el presente estudio hemos analizado, mediante la tcnica PCR-SSO, las frecuencias allicas de HLA-B en 281 individuos sanos de grupos tnicos Mexicanos Amerindios (Mayas, Mazatecos, Nahuas y Teenek, n=281). Los alelos ms frecuentes en las poblaciones estudiadas fueron HLA-B35, HLA-B39, y HLA-B40; sin embargo, se han observado algunas diferencias entre poblaciones. El alelo HLA-B35 es el ms frecuente en tres de las cuatro poblaciones estudiadas (Mayas, Nahuas y Teenek), mientras que en Mazatecos el alelo ms frecuente es HLA-B39. HLA-B40 presenta frecuencias superiores al 10% en todos los grupos. Por otra parte, slo los Mayas muestran frecuencias allicas superiores al 10% para el alelo HLA-B51. Las comparaciones realizadas arrojan importantes diferencias entre grupos. El grupo Teenek presenta una frecuencia superior de HLA-B52 en comparacin con los Mazatecos, La frecuencia de HLA-B39 es mayor en Mazatecos que en Nahuas, Mayas y Teenek. Adems, se observa una mayor frecuencia de HLA-B51 en Mayas respecto de Mazatecos y Nahuas. Estos datos corroboran el polimorfismo restringido de los alelos HLA-B y la alta frecuencia de HLA-B35, HLA-B39 y HLA-B40 en poblaciones Americanas autctonas. A pesar de la restriccin del polimorfismo, las diferencias en frecuencias de alelos HLA-B podran ser de ayuda para distinguir cada una de esas poblaciones. 0409. El ORIGEN DE LOS MAYAS DE ACUERDO CON LOS GENES HLA Y LA SINGULARIDAD GENTICA DE LOS AMERINDIOS. E. Gmez-Casado, J. Martnez-Laso, J. Moscoso, J. Zamora, P. Lucas-Gramajo1, C. Silvera, E. Lowy, J.M. Martn-Villa2, M. Prez-Blas2, M. LpezSantalla2, A. Arnaiz-Villena. Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Hosp. 12 de Octubre. Universidad Complutense. Madrid. E-mail: aarnaiz@med.ucm.es. 1Departamento de Laboratorio. Hospital Regional de Xela. Quetzaltenango. Guatemala. 2Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid Se han estudiado las frecuencias de los alelos HLA de la poblacin Maya de Guatemala, y se han comparado con las de las poblaciones de los primeros Nativos Americanos (Amerindios) y con las del resto del mundo (analizndose un total de 12.364 cromosomas y 6.182 individuos de 60 poblaciones diferentes). Las principales conclusiones son: 1. El grupo Amerindio ms cercano a los Mayas es el de los Arahuacos, que se consideran los primeros moradores de las islas del Caribe. 2. Los Mayas no son tan similares al grupo de Zapotecos, Mixe y Mixtecos. Los Mixe estn emparentados con los Mayas slo en bases lingsticas. 3. Los alelos DRB1*0407 y DRB1*0802 estn presentes en el 50% de la poblacin Maya, estos alelos se han encontrado en otras poblaciones Amerindias, pero las frecuencias tan elevadas en los Mayas hacen suponer
que sean debidas a un efecto fundador para estas poblaciones mesoamericanas-Caribeas. 4. Se han descrito por vez primera los haplotipos HLA extendidos de la poblacin Maya. 5. Los estudios microgeogrficos revelan que no hay una correlacin entre el lenguaje y los genes. 6. El poblamiento de las Amricas probablemente sea ms complejo que el postulado por Greenberg y otros autores (las tres oleadas migratorias clsicas). Con respecto a los anlisis genticos, no se ha observado una entrada significante de genes desde fuera en Amerindios meso y suramericanos, mientras que el resto de las poblaciones del mundo (incluidas las Africanas, Europeas, Asiticas, Polinesias, Indias Na-Dene de Norte-Amrica y Eskimales) estn genticamente emparentadas. Por tanto, los Amerindios meso y suramericanos se mantienen aislados a la vista de nuestros anlisis genticos de dendrogramas, de correspondencia y de distancias genticas. 0410. DETERMINACIN DE LAS RELACIONES GENTICAS ENTRE LAS POBLACIONES DEL MEDITERRNEO DEFINIDAS POR LA DISTRIBUCIN DE ALELOS HLA Y DESDE UNA PERSPECTIVA HISTRICA. A. ArnaizVillena, E. Gmez-Casado, J. Moscoso, J. Zamora, E. Lowy, J.M. Martn-Villa1, M. Prez-Blas1, M. Lpez-Santalla1, J. Martnez-Laso. Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Hosp. 12 de Octubre. Universidad Complutense. Madrid. E-mail: aarnaiz@med.ucm.es. 1Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid Se han estudiado la distribucin de los alelos de los genes HLA en poblaciones Mediterrneas y sub-Saharianas. Se han realizado anlisis de distancias genticas, dendrogramas y anlisis de correspondencia para estudiar sus relaciones. Se han comparado estos resultados de gentica de poblaciones con la historia de los grupos tnicos clsicos que viven en la regin. Habra que emprender una revisin de los postulados histricos, especialmente en los casos donde la gentica y la historia difieren radicalmente. La genmica HLA nos muestra que: 1. los griegos comparten una parte del pool gentico con africanos Sub-Saharianos (Etopes y Africanos occidentales); esto est tambin apoyado por estudios en marcadores del cromosoma 7, del polimorfismo del gen de fibrosis qustica. El flujo gentico del frica negra pudo llegar hasta Grecia en tiempos faranicos o cuando los Saharianos migraron despus de establecerse las actales condiciones hiperridas (5000 AC). 2. Los Turcos no difieren significativamente de los dems Mediterrneos, indicando que mientras los Turcos Asiticos llevaron a cabo una invasin con gran impacto cultural (lenguaje), esto no se refleja genticamente. 3. Los Kurdos y los Armenios estn genticamente muy prximos a los Turcos y a otras poblaciones de Oriente Medio. 4. No hay datos genticos HLA de la llamada invasin Aria, que slo ha sido definido en dudosas bases lingsticas. 5. Los beros, incluyendo a los Vascos, estn relacionados con los Berberes del norte de frica. 6. Los actuales Argelinos y Marroques tanto de ciudad como de zonas rurales muestran un perfil HLA indistinguible con los Berberes. 0411. ALELOS HLA EN POBLACIONES AISLADAS DEL NORTE DE ESPAA: ORIGEN DE LOS VASCOS Y LOS ANTIGUOS BEROS. P. Snchez-Velasco1, J. MartnezLaso, E. Gmez-Casado, J. Moscoso, J. Zamora, E. Lowy, C. Silvera, A. Cemborain1, F. Leyva-Cobin1,J.M. MartnVilla2, M. Prez-Blas2, M. Lpez-Santalla2, A. ArnaizVillena. Dep. Inmunologa, Facultad de Medicina, Hosp. 12 de
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Octubre, Universidad Complutense. Madrid. E-mail: aarnaiz@med.ucm.es. 1Dep. Inmunologa. Hosp. Universitario Marqus de Valdecilla. Santander. 2Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid Se han analizado los alelos HLA-A, -B, -DRB1, -DQA1 y DQB1 en tres poblaciones relativamente aisladas del norte de Espaa: Cantabria (Habitantes del Valle del Pas o Pasiegos y Caburnigos) y Pas Vasco (Habitantes del Valle de Arratia). Estas poblaciones se han comparado con otras vecinas y otras Mediterrneas usando dendrogramas neighbor-joining, distancias genticas, anlisis de correspondencia y de haplotipos HLA. Estas poblaciones estn ms relacionadas entre s y con las Norteafricanas que con el resto de las Espaolas. Los Pasiegos muestran un ligero grado de mezcla con poblaciones de centro y oeste de Europa. Estas poblaciones pueden representar un remanente de la poblacin espaola primitiva (antiguos beros). Una hiptesis alternativa es que descendiesen de refugiados norteafricanos que podran haber ocupado ese rea antes de su expulsin por los Reyes Catlicos despus de 1492, cuando los Norteafricanos fueron definitivamente expulsados. La primera teora es ms probable ya que no hay registros de una invasin musulmana permanente en esas reas durante la Edad Media. 0412. LA EVOLUCIN DEL SISTEMA PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD ES DIFERENTE EN LAS ISLAS GEOGRFICAS. E. Lowy, J. Zamora, J. Moscoso, J. Martnez-Laso, E. Gmez-Casado, J.M. Martn-Villa1, M. Prez-Blas1, M. Lpez-Santalla1, A. Arnaiz-Villena. Dep. Inmunologa, Facultad de Medicina. Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense. Madrid. E-mail: aarnaiz@med.ucm.es. 1Dep. Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid Se han estudiado con la molcula de cit b mitocondrial las relaciones filogenticos entre las distintas especies de Canarios salvajes (genus Serinus), que se distribuyen geogrficamente por frica y Eurasia. Asimismo, se han secuenciado los genes de histocompatibilidad de este modelo de poblacin natural y se confirma la poca variabilidad de las molculas encontradas ya en los jilgueros sudamericanos. Sin embargo, los canarios salvajes de las Islas Canarias muestran una gran divergencia respecto a otras especies de canarios en estas molculas y ms variabilidad. La hiptesis de que el aislamiento y la consanguinidad desarrollan sistemas de histocompatibilidad ms polimrficos es apoyado por nuestros datos, que se discuten en el contexto de la patogenia de las enfermedades autoinmunes ligadas a los genes de histocompatibilidad. Posters: 0413-0419 0413. VALORACION DEL TIPAJE HLA POR SSO-LUMINEX (ONE LAMDA) EN UN BANCO DE CORDON UMBILICAL. F. Snchez Gordo, A. Domnguez Cobos, M.T. Martn Bjar, M. Rodrguez Corts, Prat Arrojo, I. Laboratorio de Inmunohematologa y Tpaje HA. Centro de Transfusiones, Mlaga Introduccin. La sangre de placenta ha demostrado ser una fuente de progenitores hematopoyticos adecuada para su uso en el rescate post-acondicionamiento en el transplante de mdula. Dada la
nmero de muestras y el volumen de sta, el tipaje HLA por mtodos de biologa molecular requiere la utilizacin de un mtodo rpido, economicamente asequible, y de resultados fiables. En la actualidad, el mtodo de eleccin en nuestro laboratorio el SSP, ya que, aunque las tcnicas de SSO requieran menos cantidad de ADN y permitan la realizacin de mas muestras, han mostrado en nuestras manos entre un 15% de resultados dudosos que necesitaban ser confirmados mediante SSP. La aparicin de la tecnologa Luminex ha permitido incrementar el nmero de sondas y automatizar la lectura, permitiendo la realizacin de un gran nmero de test en un breve espacio de tiempo, y con resultados inicialmente mas adecuados. Hemos realizado un breve estudio de su aplicacin en nuestro medio. Material y mtodos. Analizamos 36 muestras de ADN procedentes de sangre de cordn umbilical, y comparamos los tipajes mediante SSP (One Lambda) y SSO (mediante Luminex con sondas de One Lambda). En clase II utilizamos inicialmente SSO, confirmando el resultado mediante la realizacin de SSP alelo especfica, en los casos inicialmente homozigticos para DR, as como en los casos de asignacin inconclusa de resultados a nivel genrico, realizamos la determinacin del tipaje genrico por SSP para confirmar los resultados. Los tipajes HLA de clase I (A y B) se comparan con los tipajes serolgico (placas monoclonales) y de biologa molecular por SSP. Resultados y conclusiones. Presentamos los resultados en os que hemos encontrado una buena correlacin entre los resultados de clase II con un 95% de resultados definitivos para DRB1* a nivel genrico, mientras que en alta resolucin con nomenclatura NMDPes una buena herramienta que permite acotar las posibilidades. En cuanto a clase I los resultados preliminares fueron superiores. Aunque es necesario ampliar el estudio, el tipaje HLA mediante la tcnica SSO de Luminex puede revolucionar la rutina de tipaje en los Registros de Donantes no emparentados y el los bancos de sangre de Cordn Umbilical. 0414. EXPRESIN DE HLA-G EN LA LEUCEMIA LINFOIDE CRNICA. S. Rosado1, G. Prez-Chacn2, B. Contreras1, S. Cun2, T. Martn-Donaire1, I. Losada-Fernndez2, F. Gonzlez3, J.A. Vargas 1, P. Prez-Aciego2, J. GarcaMarco4, A. Durntez1,2. 1Servicio de Medicina Interna I. 3O.R.L. 4Hematologa. Hospital Universitario Puerta de Hierro. 2Fundacin LAIR. Madrid. Espaa Introduccin. El antgeno HLA-G pertenece al grupo de molculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I no clsicas. Se expresa en la interfase materno-fetal durante el embarazo, donde participa en la inhibicin de la citotoxicidad mediada por los linfocitos NK y CD8+ maternos. Recientemente se ha encontrado expresin de esta molcula en distintas neoplasias, asocindose con mecanismos de escape tumoral y progresin de la enfermedad. La leucemia linfoide crnica (LLC) se caracteriza por una acumulacin lenta y progresiva de linfocitos B maduros, que expresan CD5 y una baja densidad de inmunoglobulinas de superficie. Objetivo. Analizar la expresin de HLA-G en los linfocitos B de LLC. Materiales y Mtodos. Se analizaron 19 pacientes de LLC y como control 5 muestras de amgdalas procedentes de pacientes sin enfermedad neoplsica. Los linfocitos B se aislaron por centrifugacin en gradiente y seleccin negativa mediante mtodos inmunomagnticos. A continuacin, se cultivaron durante 4 das sobre una
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monocapa de fibroblastos murinos transformados con CD32 (Ltk-) y en presencia de anticuerpos anti-CD40 y anti-IgM. La expresin de HLA-G se determin basalmente y tras estimulacin mediante citometra de flujo. Resultados. Al igual que en los controles, no detectamos expresin basal de HLA-G en los linfocitos B de la LLC (1% 1), pero s tras estimulacin con anti-CD40/anti-IgM (13% 6). Conclusiones. Se describe la expresin de HLA-G en linfocitos B de Leucemia Linfoide Crnica, tras estimulacin con anti-CD40 y anti-IgM. Esto podra estar relacionado con mecanismos de escape tumoral en esta neoplasia. 0415. CARACTERIZACIN DE UN NUEVO ALELO HLA-C, Cw*1606. V. Mas, I. Gimferrer, M.T. Arias, V. Fabregat, E. Palou, J. Vives, F. Lozano. Servei dImmunologia. Institut Clnic dInfeccions i Immunologia (ICII). Institut dInvestigacions Mdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Hospital Clnic. Barcelona. Espaa. Servei dImmunohematologia. Centre de Transfusi i Banc de Teixits. Barcelona. Espaa HLA-Cw*16 comprende las variantes Cw*1601, Cw*1602 y Cw*160401 y es relativamente frecuente entre la poblacin caucasoide. El alelo Cw*1601 es la variante ms frecuente y Cw*1602 ha sido descrito como marcador de susceptibilidad de la enfermedad de Behet en el sur de Espaa. En este estudio presentamos la identificacin de un nuevo alelo HLA-Cw*16 en un donante de sangre de nuestra poblacin. Al secuenciar los exones 2 y 3 del locus C, pudimos observar dos incompatibilidades en las posiciones 361 y 368 respecto a la variante Cw*1601. Para solventar esta ambigedad, amplificamos DNA genmico y lo clonamos para, posteriormente, secuenciar ambos alelos individualmente. La nueva variante, designada oficialmente por el Comit de Nomenclatura de la OMS como Cw*1606, difiere de Cw*1601 en dos cambios nucleotdicos (de T a A) en la posicin 361 y (A a C) en la posicin 368 del exn 3. Estas mutaciones originan la sustitucin de los aminocidos Trp (TGG) por Arg (AGG) y Tyr (TAT) por Ser (TCT) en los codones 97 y 99 del dominio 2. Dichas posiciones se localizan en el suelo de la hendidura de unin peptdica y han demostrado ser relevantes en la presentacin antignica en otros alelos ( HLA-A*02) lo cual podra se tambin el caso para el alelo HLA-Cw*16. Mediante anlisis de alineamiento observamos que estos cambios slo estn presentes en las variantes Cw*0105, Cw*0702 y Cw*0703. De ello se deduce que la nueva variante allica podra haberse originado mediante conversin gnica intralocus entre el alelo HLACw*1601 y cualquiera de las tres variantes mencionadas anteriormente. 0416. DESARROLLO DE UNA APLICACIN AUXILIAR PARA EL TIPAJE MEDIANTE SECUENCIACIN (SBT). J. Caubn, M. Fernndez Arquero, E. Gmez de la Concha. Servicio de Inmunologa. Hospital Clnico San Carlos. Madrid Introduccin. La tcnica de tipaje HLA mediante secuenciacin (SBT) se basa en la obtencin de la secuencia heterozigota de la regin polimrfica del gen de inters y su comparacin con una librera de alelos. Sin embargo realizar manualmente este ltimo paso es una tarea tediosa, propensa a errores y fcilmente automatizable. Existen aplicaciones comerciales capaces de realizar esta tarea sin embargo no se dispona de ninguna alternativa de dominio publico libremente accesible.
Objetivos. El objetivo de este trabajo ha sido elaborar una aplicacin bajo los principios de cdigo abierto (libre disposicin tanto de los ejecutables como de las fuentes) capaz de: a partir de una secuencia problema de longitud y orientacin arbitraria y una librera de alelos sealar el o los pares de alelos que encajan con la secuencia dada. Metodologa. La aplicacin se ha construido sobre una serie jerrquica de tipos abstractos de datos (TAD) buscando la mxima claridad del cdigo y su fcil reutilizacin. El TAD de partida es el tipo BASE formado por el conjunto {A, C, G, T, R, Y, K, M, W, S, B, D, H, V, N} que representa a los cuatro nucletidos as como a sus posibles combinaciones, junto con los operadores complemento, suma, inclusin y resta. Sobre el TAD BASE se construye el TAD SECUENCIA definido como un vector de bases y los operadores y procedimientos necesarios. El modulo principal del programa lee la secuencia problema, la orienta correctamente y la alinea con una secuencia consenso para acotar la regin de trabajo y a continuacin implementa un sencillo algoritmo de bsqueda que permite identificar a todas las parejas de alelos cuya suma es igual a la secuencia problema. Todo el programa se ha escrito en lenguaje de programacin MODULA 2 caracterizado por su valor acadmico y claridad. Resultados. La aplicacin escrita cumple las especificaciones iniciales, puede ser verificada formalmente y se ha contrastado con un extenso juego de pruebas con resultados satisfactorios. Conclusiones. Hemos desarrollado una aplicacin simple y de fcil utilizacin para auxiliar en el tipaje mediante secuenciacin. Al hacer disponible el cdigo fuente esta aplicacin puede ser fcilmente mejorada y adaptada a las necesidades de cada caso. 0417. DESCRIPCIN DE UN NUEVO ALELO DEL GEN CD1D2 DE RATN. B. Gozalbo Lpez, A. Prez Rosado, E. Martnez Naves. Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina U.C.M. Madrid El sistema CD1 codifica diversas protenas de la familia MHC de clase Id. En humanos los genes CD1 estn en el cromosoma 1q2223 y en ratn en el cromosoma 3. El sistema humano consta de 5 genes (CD1 A-E) mientras que el de ratn slo presenta dos genes pertenecientes ambos al tipo CD1D por su homologa con CD1D humano: CD1D1 y CD1D2. El gen CD1D1 codifica una protena que se expresa en la superficie celular y es reconocida por clulas NKT. La funcin de CD1D2 es desconocida y adems codifica una protena estructuralmente alterada por la falta de un puente disulfuro intracatenario en el dominio 3. Nuestro objetivo fue determinar si el sistema CD1 de ratn es monomrfico y especialmente comparar CD1D1 y CD1D2. Para ello se han analizado 7 cepas consanguneas. El anlisis llevado a cabo consisti en amplificacin a partir de ADN genmico mediante PCR de los exones 2 y 3 de ambos genes y posterior anlisis de los amplificados por SSCP. Al analizar los patrones de bandas obtenidos para los exones 2 y 3 del gen CD1D1 y del exn 2 del gen CD1D2, no se observaron diferencias para las siete cepas analizadas, lo que indica ausencia de polimorfismo. Sin embargo, al observar el del exn 3 del gen CD1D2 se obtuvieron tres patrones diferentes, indicando la posibilidad de polimorfismo. Se observ uno ms frecuente que corresponda a las cepas: Balb/c, C57, NMRI, NOD y HS. Al secuenciar los productos de PCR, se vio que corresponda al alelo salvaje ya descrito que aparece en el Gen Bank (X15036). Los otros dos patrones se correspondan con
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la misma mutacin, que consista en un cambio de base C1113 a T (GCAGTA), la cual predice un cambio de la alanina 176 a valina. La cepa C57/BL6, es homocigota para este alelo, mientras que CD1 es heterocigota, y por lo tanto el patrn obtenido para ella es una mezcla de los dos anteriores. Concluimos que el gen CD1D2 no es monomrfico, ya que existen al menos dos alelos. 0418. NUEVO ALELO EN LA REGIN TRANSMEMBRANA DEL GEN MIC A. B. Rueda1, M. Pascual1, E. Gonzlez1, J. Martn1. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina LpezNeyra. CSIC. Granada. Espaa Los genes MIC (MHC class I related genes) pertenecen a una familia de genes ubicados dentro de la regin HLA de clase I en el cromosoma 6. Codifican para protenas cuya organizacin y expresin difieren considerablemente de las molculas HLA de clase I: no se unen a la 2 microglobulina, no presentan ligandos peptdicos, se expresan principalmente en clulas epiteliales bajo condiciones de estrs y son reconocidas por el receptor NKG2D. Uno de los miembros de esta familia es el gen MICA que se encuentra 40 Kb 5 del gen HLA B. Est formado por seis exones que codifican respectivamente para un pptido lider, tres dominios extracelulares, una regin transmembrana y una cola intracitoplasmtica. El gen MICA se caracteriza por su elevado grado de polimorfismo con ms de cincuenta alelos MICA descritos. Adems en el exn 5 del gen se describi un microsatlite polimrfico consistente en un nmero variable de repeticiones GCT que codifican para 4, 5, 6, 9 y 10 alaninas en la regin transmembrana adems de una insercin nudcleotdica GCTGGCT (alelo MICA A5.1) que genera un stop codon prematuro. Durante el estudio de de los polimorfismos del gen MICA en una poblacin de familias celacas espaolas, se identific una muestra heterozigota que presentaba un patrn de pesos moleculares en el cual se poda identificar el alelo MICA A9 y un patrn de peso molecular (188 pb) que no corresponda a ninguno de los alelos descritos. De esta forma se sospech que se poda tratar de un nuevo alelo y se procedi al clonaje y secuenciacion de esta muestra. Los resultados mostraron un nuevo alelo del microsatlite consistente en siete repeticiones GCT que codificara para siete alaninas en la regin transmembrana. Siguiendo la nomenclatura previamente descrita se denomin a este alelo MICA A7 (GenBank AY095537). El nuevo alelo result ser semejante al alelo MICA*0201 salvo por un cambio CT en el
exon 3 (nucletido 541) y por el nmero de repeticiones GCT en la regin transmembrana. 0419 LA RESPUESTA CELULAR CD4 EN EL MODELO MURINO DE DIABETES TIPO I (NOD) FRENTE AL AUTOANTGENO E ALFA GENERA DIVERSIDAD CLONAL POR UN MECANISMO QUE IMPLICA LA UNIN DEL PPTIDO AL MHCII EN VARIOS REGISTROS. B. Renedo-Chico, C. Pea-Macarro, C. lvarez-Domnguez, E. Carrasco-Marn. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla (HUMV). Santander. Cantabria
El ratn NOD es un valioso modelo para el estudio de la diabetes mellitus tipo I. A semejanza de humanos en el modelo murino espontneamente desarrolla diabetes. La diabetes es una enfermedad polignica cuyo principal factor de riego es el HLA. La peculiaridad del MHCII tanto en humanos como en modelos animales (ratn NOD, rataBB) es la carencia de un cido asprtico en la posicin 57 de la cadena beta del MHCII. Estudios recientes han demostrado que est ausencia confiere al MHCII la propiedad de tener una vida media muy corta y unir pptidos con baja afinidad. Mediante estudios celulares y cristalogrficos se ha encontrado que los bolsillos de unin del pptido al MHCII aceptan prcticamente cualquier residuo, lo que implica que la promiscuidad de unin de pptidos sea muy alta. Estas caractersticas biolgicas establecen que posiblemente el MHCII represente un papel muy importante en el establecimiento de la ausencia de tolerancia frente a antgenos propios. En el presente estudio utilizando un modelo de autoantgeno (pptido 52-68 de la cadena E alfa) y generando clulas T frente al mismo encontramos que el mnimo eptopo corresponde a las posiciones 55-65 (EAQGALANIAV). Mediante anlisis de mapeo del eptopo y ensayos de competicin encontramos que en un grupo de clones los residuos de contacto T son las posiciones 60,62,63 mientras que en otro grupo de clones los residuos de contacto T son los residuos 57, 60, 63. Sorprendentemente estos resultados implican que los residuos de unin a MHCII son las posiciones 56,59,61,64 en el primer grupo mientras que en el segundo grupo son las posiciones 55,58,60 y 64. Esto implica que el mismo eptopo genera diversidad clonal por las peculiares caractersticas del MHCII diabtico y puede ser un mecanismo por el cual la eliminacin completa de clulas T autorreactivas es defectuosa en esta patologa autoinmune.
Sesin 5. Inmunoterapia y terapias emergentes

Comunicaciones Orales: 0501-0507 0501. ENFERMEDADES POR VIRUS LENTOS DEL SNC; UN NEXO FISIOPATOGNICO COMN?: VAS HACIA NUEVOS ABORDAJES TERAPUTICOS. J.F. Bermejo Martn, E. Seoane Reula, M. . Muoz Fernndez. Laboratorio de Inmunobiologa Molecular H.G.U Gregorio Maran, Madrid Introduccin. Existen distintos virus con capacidad de infeccin crnica del SNC: Panencefalitis Esclerosante Subaguda (PEES, virus mutado del sarampin), Paraparesia Espstica Tropical (PET, mielopata causada por HTLV-1), Leucoencefalopata multifocal progresiva (LMP, virus JC), Panencefalitis progresiva por rubeola, Demencia asociada a SIDA. Bin tengan tropismo por neuronas (sarampin o VIH), o por clulas del Sistema Inmune (S.I.) (HTLV-1 o VIH), su caracterstica comn es la persistencia y la incapacidad del S.I para eliminar la infeccin. Objetivos. Proponer una posible fisiopatogenia comn para plantear nuevas alternativas terapeticas basadas en intervencin sobre el S.I. Metodologa. revisin de la bibliografa (fisiopatologa, terapias, casos clnicos).
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Descripcin. HTLV-1 y VIH en SNC incrementan TNF, que inhibe recaptacin de glutamato por los astrocitos, acumulndose en la sinapsis, produciendo neurotoxicidad; el HTLV-1 bloquea la apoptosis TNF-mediada, induciendo persistencia de las clulas infectadas. El xido ntrico es un importante mediador de apoptosis en la infeccin VIH del SNC. En la PEES y LMP, se ha demostrado en cerebro de pacientes positividad de citoquinas proinflamatorias, IL-1, IL-2, IL-6, TNF, linfotoxina, IFN e infiltracin por linfocitos. En la PET, la terapia con Pentoxifilina (que disminuye los niveles de TNF), abre un camino de actuacin en estas enfermedades con drogas inmunomoduladoras-antiinflamatorias, en uso actual o de prxima aparicin: Ej: MSH (hormona melanocitotrpica, con propiedades antiinflamatorias y antiinfecciosas), dexabinol (derivado del cannabis con propiedades neuroprotectoras y que tambin disminuye TNF). Conclusiones. Un estmulo antignico crnico viral en SNC provoca una respuesta inmune mantenida, que es en gran parte la responsable de la patogenia; se postula la importancia del enfoque terapetico con moduladores del SI y de la inflamacin, asociado al enfoque antiviral clsico. 0502. TERAPIA GNICA CON GALECTINA-3 EN UN MODELO DE RATAS ASMTICAS. E. Lpez, C. Serrano, M. Ortega, E. Civantos, G. Peces-Barba, B. Crdaba, S. Gallardo, B. Sastre, C. Martn- Mosquero, N. GonzalezMangado, P. Palomino, V. del Pozo, C. Lahoz. Servicio de Inmunologa. Fundacin Jimnez Daz. Madrid Antecedentes. Estudios anteriores realizados en nuestro laboratorio, demuestran la capacidad de la Galectina- 3 para inhibir el gen de la IL-5. Esto ha sido demostrado tanto in vitro como in vivo(1,2). Objetivos. Determinar cunto tiempo es efectivo el tratamiento con el gen de la Galectina-3, la expresin del mismo en las clulas del rbol bronquial, as como evaluar los cambios morfolgicos en el tejido pulmonar. Metodologa. Se estudian los siguientes grupos de ratas: 1. Sin sensibilizar. 2. Sensibilizadas con OVA y sin plsmido. 3. Sensibilizadas con OVA y que reciben el plsmido que contienen el gen de la Galectina-3. Los grupos 2 y 3 despus de la inmunizacin recibirn OVA al 1% en solucin salina por aerosol, 15 min. al da. A las 3, 5 y 8 semanas despus del tratamiento, se hacen anlisis de las funciones pulmonares, y estudios de subpoblaciones celulares y citoquinas, tanto en sangre como en lavados broncoalveolares (LBA), el anlisis molecular e histolgico de los pulmones y la expresin de la Galectina3. Tambin se evala la respuesta inmune, analizando anticuerpos Ig E e Ig G frente a los diferentes antgenos con los cuales fueron inmunizadas las ratas. Resultados. El tratamiento con el gen de la Galectina-3 disminuye significativamente el nmero de clulas totales en los LBA, en concreto clulas T y eosinfilos. Tambin se observa una disminucin significativa de los eosinfilos en sangre perifrica. La curva de tiempo, muestra que los efectos de la terapia gnica se mantienen al menos 8 semanas despus de la instilacin del plsmido con el gen de la Galectina-3, tanto en los parmetros de funcin pulmonar como en la celularidad. La expresin de la Galectina-3 se demostr en clulas epiteliales bronquiales, encontrndose diferencias importantes en el infiltrado inflamatorio pulmonar de las ratas tratadas frente a las no tratadas.
Conclusin. El tratamiento de ratas asmticas con Galectina3, es efectivo al menos durante 8 semanas, mejorando tanto la infiltracin celular como las funciones pulmonares. 1. I. Cortegano et al. J Immunol 1998; 161: 385-89. 2. V. del Pozo et al. Am J Respir Crit Care Med 2002;. 166: 732-7. 0503. TRATAMIENTO CON SECUENCIAS INMUNOESTIMULADORAS DE ADN EN LAS ENFERMEDADES ALRGICAS: APLICACIN EN UN MODELO ANIMAL. L. Conejero, M.L. Baeza, M. Rubio, J.M. Beitia, J.M. Zubeldia. Servicio de Alergologa. Hospital General Universitario Gregorio Maran. Madrid La prevalencia de las enfermedades alrgicas ha aumentado notablemente en los ltimos aos. A pesar de la existencia de tratamientos sintomticos eficaces, se est intentando mejorar los resultados clnicos con inmunoterapia especfica. Recientemente se ha postulado que una alteracin en el equilibrio en la respuesta Th2/Th1 en favor de la Th2, es uno de los factores responsables en la patogenia de estas enfermedades. El objetivo de este trabajo es estudiar la capacidad inmunoestimuladora Th1 de las secuencias de ADN que contienen motivos CpG (ISS), las cuales podran actuar como adyuvantes en la inmunoterapia para las protenas del polen de olivo. Para ello, se sensibilizaron ratones Balb/c al polen de olivo y, posteriormente, se distribuyeron en tres grupos que fueron vacunados con olea, olea junto con ISS o suero salino. Se obtuvieron muestras sricas antes y despus de la vacunacin para cuantificar mediante ELISA los niveles de IgG1, IgG2a e IgE especficos frente a olea. Tras sacrificar a los animales, se cultivaron los esplenocitos y se midieron los niveles producidos de IFN- e IL-5 antgeno especficos. Los resultados muestran una mejor respuesta Th1 en el grupo de animales a los cuales se les administr ISSolea. Por ltimo, se ha observado una significativa reduccin de la infiltracin celular en el pulmn, as como de la presencia de moco en las vas areas, en los ratones tratados con ISS-olea, respecto a los otros grupos. Estos resultados sugieren que el uso de estas secuencias como adyuvante en la inmunoterapia para el polen de olivo puede contribuir a una mejor regulacin de la respuesta Th1/Th2, disminuyendo determinados parmetros inmunolgicos caractersticos de la enfermedad alrgica. 0504. EFECTOS DE LA TRANSDUCCIN RETROVIRAL DE CD3 EN LINFOCITOS T NORMALES. J.M. MartnFernndez1, A. Pacheco-Castro1,2, J.R. Regueiro1. 1Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid. Espaa. 2Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Alfonso X El Sabio. Villanueva de la Caada. Madrid. Espaa Las subunidades CD3 del receptor de antgeno de la clula T (TCR/CD3) participan en la seleccin intratmica y en el reconocimiento antignico en periferia mediante la regulacin de la expresin de dicho complejo en membrana y la transduccin de seales al interior celular. Apoyndonos en datos obtenidos durante el proceso de reconstitucin gnica de CD3, investigamos el rol de la suplementacin extra del cDNA de CD3 mediante la transduccin con el vector retroviral LZRSpBMN-CD3-IRES-EGFP en la estructura y funcin del complejo de clulas T primarias de individuos normales (+/+). La
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transduccin retroviral de CD3 en clulas T primarias no afecta a parmetros estructurales como la expresin en superficie del complejo TCR/CD3 como la modulacin por PMA y la produccin basal de citocinas (IL2 e IFN). Tambin reflejaran disfunciones que podran ser peligrosas en protocolos de terapia gnica in vivo que tuviesen como diana la transferencia del TCR o quimeras de CD3 a linfocitos T humanos para enfermedades como Cncer y Sida. Adems, la simple expresin del vector con o sin CD3 produce alteraciones en la regulacin de marcadores de membrana como CD69, CD25 y CD152. Estos efectos podran ser tiles para la modulacin de las respuestas T dependientes. 0505. VECTORES LENTIVIRALES CONTENIENDO EL PROMOTOR ENDGENO DEL GEN TERAPUTICO: HACIA UNA EXPRESIN REGULADA Y ESTABLE EN PROTOCOLOS DE TERAPIA GNICA. I.J. Molina, M. Garca Toscano, C. Frecha, C. Ortega1, A. Thrasher2, M. Santamara1, F. Martn. Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad de Granada. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Reina Sofa. Universidad de Crdoba. 2Institute of Child Health. University College. Londres La expresin de genes teraputicos en vectores apropiados para su utilizacin en protocolos de terapia gnica tiene el problema potencial de que la transcripcin est gobernada por promotores exgenos muy potentes, necesarios para obtener unos niveles adecuados de la neoprotena. Ello implica que la expresin de estos genes se encuentra completamente disregulada, tanto en lo que se refiere a la especificidad de tejido como en sus niveles de expresin. Este problema es potencialmente importante en aquellas estrategias de terapia gnica en la que se sospeche que una sobreexpresin del gen teraputico puede tener un efecto negativo en las clulas diana. En experimentos iniciales, comprobamos que la sobreexpresin del gen WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) contenido en vectores lentivirales controlados por promotores exgenos provocaba sustanciales cambios morfolgicos en clulas no hematopoyticas. Este efecto indeseado nos hizo valorar la posibilidad de utilizar el promotor del propio gen teraputico como regulador de la transcripcin. Para ello, un fragmento de 505 bp perteneciente a la secuencia genmica del promotor del gen WASP fue introducido en el vector lentiviral pHRSINcppt para obtener as el vector pHRSINcppt-WpEWW. El promotor de WASP regula la expresin del gen WASP fusionado con GFP. Hemos encontrado que la expresin de esta protena quimrica es funcional y estable en diversas lneas celulares, demostrando la eficiencia transcripcional de la secuencia promotora endgena. Los niveles de expresin son sustancialmente diferentes a los obtenidos con vectores equivalentes conteniendo promotores virales, demostrando as la idoneidad de esta estrategia como primer paso hacia la expresin regulada de los genes teraputicos. 0506. TRATAMIENTO DE LINFOMAS FOLICULARES MEDIANTE VACUNACIN ANTI-IDIOTIPO. S. Inogs, M. Rodriguez-Calvillo, A. Lopez-Daz de Cerio, C. Panizo, E. Rocha, M. Bendandi. rea de Terapia Celular. Clnica Universitaria de Navarra. Pamplona Introduccin. El linfoma folicular (LF) se caracteriza por permanecer incurable a pesar de responder a los tratamientos habituales de quimioterapia, debido a la inevitable reexpansin de clulas tumo-
rales residuales tras el tratamiento. La inmunoterapia se muestra como un atractivo tratamiento adyuvante para posiblemente, eliminar las clulas residuales y as prevenir el crecimiento tumoral tras la quimioterapia. La inmunoterapia activa mediante vacunas paciente-especficas se basa en el hecho de que las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina tumoral expresada en la membrana de las clulas tumorales poseen determinantes antignicos (idiotopos y en su conjunto, idiotipo) que, debido a su clonalidad, permiten emplearlos como antgenos tumorales especficos para inducir una respuesta inmune. En nuestro centro se ha decidido aplicar esta estrategia a pacientes afectos de LF en primera recada. Objetivos y Material y Mtodos. 1. Fusin celular y generacin de hibridomas. 2. Seleccin del hibridoma especfico productor de la inmunoglobulina 3. Cultivo de las clulas del hibridoma seleccionado a gran escala, purificacin de la Ig mediante cromatografa de afinidad, conjugacin con KLH grado clnico e inoculacin al paciente junto con GM-CSF. 4. Monitorizacin de remisin molecular y de la respuesta inmune tras la vacunacin. 5. Valoracin de la duracin de la respuesta inmune tras la suspensin de la inmunoterapia. 6. Comparacin de la duracin de la remisin obtenida tras el tratamiento previo de primera lnea y la obtenida tras la aplicacin de este protocolo inmunoteraputico. Resultados. Hasta la fecha se han incluido un total de 18 pacientes, de los que 5 han completado el calendario vacunal. Se presentaran los resultados obtenidos hasta el momento. 0507. AN ANTI-ICAM-2 (CD102) MONOCLONAL ANTIBODY INDUCES IMMUNE-MEDIATED REGRESSIONS OF TRANSPLANTED ICAM-2-NEGATIVE COLON CARCINOMAS THROUGH INHIBITION OF ACTIVATION-INDUCED T-CELL DEATH: SYNERGY WITH IL-12 GENE TRANSFER. I. Melero1, I. Gabari1, A.L. Corb2, M. Relloso2, G. Mazzolini1, I. Tirapu1, E. Baixeras1, J.P. Albar3, J. Prieto3. 1Gene Therapy Unit. Department of Medicine. University of Navarra School of Medicine. Pamplona. 2Centro de Investigaciones Biolgicas. CSIC. Madrid. 3Proteomics Facility and Department of Immunology and Oncology. Centro Nacional de Biotecnologa (Pharmacia/CSIC). Canto Blanco. Madrid Monoclonal antibodies (mAbs) can mediate antitumor effects by indirect mechanisms involving antiangiogenesis and upregulation of the cellular immune response rather than by direct tumor cell destruction. From mAbs raised by immunization of rats with transformed murine endothelial cells, a mAb (EOL4G8) was selected for its ability to eradicate a fraction of established CT26 colon carcinomas that did not express the EOL4G8-recognized antigen. The antigen was found to be ICAM-2 (CD102). Antitumor effects of EOL4G8 required a functional T-cell compartment, were abrogated by depletion of CD8+ cells and correlated with antitumor CTL activity, while it only induced a mild inhibition of angiogenesis. Interestingly, we found that EOL4G8 mAb acting on endothelial ICAM-2 markedly enhances LFA-1-independent adhesion of immature dendritic cells to endothelium, an effect that is at least in part mediated by DC-SIGN (CD209).
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Well-established tumors derived from the MC38 colon carcinoma cell line were largely refractory to treatment with anti-ICAM2 antibodies, as well as with intratumor injection of a recombinant adenovirus encoding Interleukin-12 (AdCMVIL-12). We found that combined treatment with various systemic doses of EOL4G8 mAb plus intratumor injection of AdCMVIL-12 induced complete regression of MC38 tumors treated 7 days after implantation. Unfortunately, most of such mice succumbed to a systemic inflammatory syndrome, that could be prevented if IFN-gamma activity was neutralized once tumors had been rejected. Importantly, dose reduction of EOL4G8 mAb opened a therapeutic window for combination treatment leading to a complete cure of 9 out of 18 cases without toxicity. Published evidence has demonstrated that ICAM-2 crosslinking on the plasma membrane transmits potent apoptosis-inhibitory signals. Our experiments using OT-I TCR-transgenic mice show that ICAM-2 ligation by EOL4G8 on activated CTLs prevents activation-induced cell death, thus extending IFN-gamma production. This mechanism provides a plausible explanation for the synergy of anti-ICAM-2 and AdCMVIL-12, both for their toxic and therapeutic effects. Posters: 0508-0509 0508. IMMUNOMODULATION OF ANAPSOS ON LA PEYRONIES DISEASE (PD). J.M. Sempere, A. Segura1, M. De La Sen2, A. Pelluch1, M. Snchez1, P. Torrs1, S. Chilln1, C. Muoz2, FM. Marco3, J.J. Lobato1. Biotechnology Department, University of Alicante. 1Andrology Unit-Dept of Urology and 2Immunology Division. General Hospital of Alicante. 3ASAC-PHARMA. Alicante PD is an autoimmune disorder that usually courses with different degrees of penis plaques and fibrosis. Anapsos (Armaya Fuerte) is an immunomodulating phyto-drug used in the treatment of inflammatory and/or autoimmune diseases. Tamoxifen (Nolvadex 20) is sometimes used to treat PD, due to its regulating role on the immunoinflammatory response. In this study we pretend to assess the efficacy of Anapsos to treat PD. For this purpose, 34 patients were randomly assigned to group A (Anapsos,19 patients) and group T (Tamoxifen,15 patients), and followed-up for six months. Plaques were assessed by physical examination and penis echography. Penis incurvation, by self-photography or IC injection. Pain and coitus difficulties, by visual analogical scale. CD11b,CD18,CD29,CD4,CD8,CD4/CD45RA, CD4/CD29), by flow cytometry. TGF- and IL-10 by ELISA, in cell supernatant cultures. Patient categories: improve(Imp), no change (same) and worse A T Imp Same Worse Imp Same Worse PLAQUE 25% 75% 0 27% 55% 18% PAIN 67% 33% 0 64% 36% 0 INCURV. 67% 25% 8% 46% 36% 18% COI.DIFF. 42% 33% 25% 40% 20% 40%
66.7% of A and 45% of T patients were satisfied with the treatment.Clinical improvement was better in A. It was found a 22%TGF decrease post-treatment in A (vs.initial values), against 5% in T. IL-10 diminished 17% in A and 79% in T. CD4/CD45RA expression increased 20% in both groups. TGF- decrease observed with Anapsos, indicates a possible regulating effect on fibrosis. Increase on CD4/CD45RA observed after A and T treatments, can help to partially stop the autoimmune PD response. Although Anapsos seeems to be helpful in PD treatment, these results must be considered preliminar. 0509. H24: A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY FROM TRANSGENIC MICE TO TARGET HUMAN LEUKAEMIA CELLS. M. Valladares1, I. Sanjun2, S. Magadn1, A. Molina1, F. Gambn2, . GonzlezFernndez1. 1rea de Inmunologa. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo. 2Unidad de Inmunologa. Hospital Meixoeiro de Vigo. Pontevedra (africa@uvigo.es) In recent years, mAb-based therapies have become standard treatments for cancer, including haematological malignancies. As examples, the anti-CD20 antibody rituximab, is now part of the standard armamentarium for treating lymphoma; other mAbs are also being used to deliver radiation specifically to lymphoma cells, and the antiCD33-calicheamicin immunoconjugate has recently been approved for the treatment of acute myeloid leukaemia. However, all those mAbs are chimerical or humanized antibodies which still carry some mouse sequences, and reactions by the patients receiving the therapy to the foreign antigens has been described with some of those treatments. These problems could be avoided if antibodies used in human therapy could carry fully human sequences. For this purpose, we have used transgenic mouse that carries the human immunoglobulin IgM// transloci integrated in its germline in an inactivated endogenous heavy and background, to generate human monoclonal antibodies (mAbs) of IgM isotype. Mice were immunized with the human tumor cell line U937 and obtained several hybridomas secreting human monoclonal antibodies. We selected a human IgM/ mAb called h24 that specifically recognizes a protein of 80 kDa expressed on normal granulocytes and monocytes but not in resting lymphocytes, red blood cells, platelets or bone marrow progenitor cells. The monoclonal antibody h24 reacts with all myeloid leukemias tested (either acute or chronic) and in all the myelodysplastic syndromes tested, and it is able to specifically kill leukemia cells in the presence of rabbit complement. Interestingly, h24 does not recognize B-cell acute, chronic lymphocytic or plasma cell leukemias, but binds to lymph node cells from all CD5-negative Non-Hodgkins lymphomas (CD5-neg NHL) tested. Thus, this human monoclonal antibody shows specificity to granulocyte, monocyte and CD5neg NHL cells, and appears to fulfill several criteria for clinical utility in the treatment of malignant pathologies as myeloid leukemias and some NHLs. Supported by Instituto de Salud Carlos III (Red del FIS exp. CG03/136).
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Sesion 06. Aplicaciones del MHC e inmunologa del transplante

Comunicaciones Orales: 0601-0612 0601. BUSQUEDA DE UN MODELO ANIMAL PARA EL ESTUDIO DEL SINDROME DEL ACEITE TOXICO (SAT) UTILIZANDO DISTINTAS CEPAS DE RATONES Y MODELOS TRANSGENICOS. S. Gallardo1, B. Crdaba1, V. Pozo1, E. Llanes1, E. Civantos1, E. Lpez1, C.S. David3, V. Chowdhary3, M. Posada2, C. Lahoz1. 1Dpto. de Inmunologa. Fundacin Jimnez Daz. 28040 Madrid. 2CISATER. Instituto de Salud Carlos III. 3Immunology Dept. Mayo Clinic. Rochester. MN El SAT es una enfermedad multisistmica que ocurri en Espaa en 1981. Las caractersticas inmunolgicas encontradas en los pacientes fueron: incremento de IgE, sIL-2R en suero y ARNm para distintas citoquinas Th2 (IL-4, IL-5) en pulmn. Tambin se ha descrito un incremento en la frecuencia fenotpica de DR2 en pacientes fallecidos por el SAT. Desde que surgi la enfermedad, se han realizado grandes avances en la comprensin de su mecanismo, pero hasta la fecha, los intentos por encontrar un modelo animal que reproduzca total o parcialmente la enfermedad han resultado infructuosos. Nuestro objetivo es estudiar el efecto de aceites txicos (sintetizados siguiendo el mismo proceso de manipulacin de los aceites implicados en el SAT) en cepas de ratones con distintos haplotipos (A/J, BALB/c, DBA/2 y C57BL/6) y en ratones transgnicos de HLA (DR2, DR3, DR4, DQ6, DR2/DQ6 y DR2/DQ8). Los ratones recibieron el aceite por va oral: 5mg/Kg de peso durante 8 o 16 das. Los parmetros estudiados fueron: IgE total en suero, porcentaje de eosinfilos por citometra de flujo y expresin de ARNm para IL-4 e IL-5 en pulmn. Los resultados se analizaron comparndolos con sus valores basales y con su grupo control. Hemos encontrado ARNm para IL-5 y un mayor porcentaje de eosinfilos en ratones BALB/c, as como altos niveles de IgE en DBA/2 (ambos con haplotipo H2d). En cuanto a los modelos transgnicos, los ratones que expresan DR2 y DQ6 (ambos en desequilibrio de ligamiento), presentan un alto porcentaje de eosinfilos (principalmente DQ6) e IgE (DR2). Estas diferencias no se encuentran en el resto de los ratones tratados. Como conclusin, hemos encontrado una respuesta Th2 en estos ratones, y esta respuesta depende de la cepa y del tipo de transgnico. Basados en estos resultados, podemos deducir que este tipo de ratones reproduce parcialmente la patologa encontrada en humanos. 0602. EFECTOS EPISTTICOS ENTRE GENES DE PROTECCIN Y SUSCEPTIBILIDAD EN EL DFICIT DE IgA. L. Gual Garca1, A. Martnez1, P. Vigil1, A. Ferreira2, M.C. Garca Rodrguez2, G. Fontn2, M. Fernandez-Arquero1, E. G. de la Concha1 . 1 Servicio de Inmunologa. Hospital Clnico San Carlos. Madrid. 2 Servicio de Inmunologa. Hospital La Paz. Madrid Introduccin. El Dficit de IgA (D IgA), la inmunodeficiencia primaria ms comn en poblaciones caucsicas, presenta una herencia polignica. Algunos de los genes asociados a esta enfermedad estan localizados en el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Objetivo. Determinar cules de las asociaciones descritas previamente en el MHC son primarias (y no secundarias a un aumento o disminucin en las frecuencias de otros haplotipos en el MHC). Adems, nos proponemos estudiar las interacciones genticas entre todos los haplotipos del MHC asociados a la enfermedad. Por ltimo, se pretende determinar la importancia relativa de los genes de proteccin respecto a los genes de susceptibilidad. Mtodos. Nuestra poblacin de estudio estaba formada por 183 pacientes de D IgA procedentes del Hospital La Paz (Madrid) y 342 controles sanos. Todos ellos fueron tipados para estos genes en el MHC: HLA-DRB1, DQA1, DQB1, HLA-B y los microsatlites TNFa y TNFb. Tambin dispusimos de las familias de 100 enfermos, lo que facilit la deduccin de los haplotipos parentales y el posterior estudio RPE (Relative Predispositional Effects). El anlisis estadstico de los datos se realiz a travs de un test chi-cuadrado, usando un paquete informtico de anlisis estadstico ( EPI-INFO v. 6.02) Resultados. Adems de las asociaciones primarias positivas de los haplotipos que incluyen los alelos DRB1*0102, DR3/TNFa2b3 o DR7 (RR de 10, 4.6 y 3.2 respectivamente para heterozigotos simples), existe un factor primario protector (marcado por el alelo DRB1*1501) en la poblacin espaola. Por otra parte, entre los individuos que tienen un factor de susceptibilidad es ms frecuente la aparicin de un segundo factor de riesgo en pacientes que en controles (48 de 147 vs. 15 de 137; p=0.00001); y el hecho de ser portador de dos haplotipos de susceptibilidad da un riesgo mayor al que confiere cada alelo de susceptibilidad por separado (RR=18.2). Tambin observamos que no existe ningn enfermo que sea portador a la vez de un alelo de susceptibilidad al D IgA y del alelo protector DRB1*1501(0 de 99 vs. 15 de 122 controles; p=0.0003). Conclusin. 1. Los haplotipos que contienen los alelos DR3/TNFa2b3, DRB1*0102 y DR7 confieren por ellos mismos susceptibilidad al D IgA, pero existe un incremento del riesgo a padecer la enfermedad dependiente de dosis gnica. 2. DRB1*1501 es un alelo de proteccin episttico sobre los tres alelos de susceptibilidad antes mencionados, lo que indica un posible papel de todos ellos dentro de un mismo mecanismo biolgico. 0603. LA COLITIS ULCEROSA Y LA FORMA COLNICA DE LA ENFERMEDAD DE CROHN COMPARTEN ALELOS DE SUSCEPTIBILIDAD ESPECFICOS DE GENES EN EL MHC. L. Fernndez Franco1, J.L. Mendoza2, A. Martnez1, E. Urcelay1, M. Fernandez-Arquero1, J. Garca-Paredes2, S. Pea3, M. Daz-Rubio2, E. G. de la Concha1. Servicios de 1Inmunologa Clnica y 2Gastroenterologa. Hospital Clnico San Carlos, Madrid. 3 Servicio de Gastroenterologa y Laboratorio de Inmunogentica. Vrije Universiteit medisch centrum. Amsterdam. Holanda Introduccin. La enfermedad de Crohn (EC) es un proceso inflamatorio crnico del tracto digestivo que se manifiesta gentica y clnicamente de forma heterognea. Aunque de causa desconocida, se ha publicado la existencia de genes de susceptibilidad en la clase II del MHC y recientemente en el cromosoma 16 (NOD2/CARD15), que afecta a un 30% de los pacientes y especialmente a los que presentan la forma ileal de la enfermedad.
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Objetivo. Dado que los genes de la region HLA confieren un riesgo moderado a la EC, es posible que estas asociaciones sean mas fuertes o solamente exitan en un determinado subgrupo fenotpico. Se pretende estudiar los polimorfismos de genes del MHC estratificando los pacientes por fenotipo y por la presencia de mutaciones del gen NOD2/CARD15. Mtodos. Nuestra poblacin de estudio estaba formada por 210 pacientes con EC y 343 contoles sanos. El fenotipo de los pacientes se determin segn la Clasificacin de Viena en base a su localizacin y comportamiento. Todos ellos fueron tipados para HLA-DRB1 y para tres polimorfismos del gen NOD2/CARD15. El anlisis estadstico de los datos se realiz a travs de un test chi-cuadrado, usando un paquete informtico de anlisis estadstico ( EPI-INFO v. 6.02). En los casos de alelos de susceptibilidad ya descritos, el valor de p no se corrigi por el numero de alelos estudiados. Resultados. Se observ una mayor frecuencia de los alelos DRB1*07 (p=0.03,OR=1.48) y DRB1*0103 (p=0.005,OR=3.43) en enfermos que en controles. Al estratificar por localizacin y comportamiento, el alelo DRB1*07 se asociaba slo a la forma ileal (p=0.03,OR=2.6). El alelo DRB1*0103 se asociaba fuertemente a la forma colnica (p<106,OR=40) y, aunque de forma secundaria, a la forma perianal (p=0.007,OR=4.16). DRB1*07 se asociaba de la misma manera a la forma ileal en el grupo de pacientes sin mutaciones para NOD2/CARD15 (41/112 ileales vs 7/32 colnicos) que en el de pacientes con mutaciones (25/62 ileales vs 0/4 colnicos). La asociacin de DRB1*0103 a la forma colnica tambin era independiente de la presencia o ausencia de mutaciones, aunque, en este caso, debido a la gran asociacion entre NOD2/CARD15 y la forma ileal, era ms dificil de determinar debido al escaso numero de pacientes NOD2 positivos con localizacin colnica. Conclusin. El alelo DRB1*0103, asociado tambin a la colitis ulcerosa, se asocia a la forma menos frecuente de la EC, la forma colnica, que parece tener una base gentica diferente a otras localizaciones de la enfermedad. La heterogeneidad en la clnica de la enfermedad se puede pues relacionar con determinados genotipos. 0604. ESTUDIO INMUNOGENETICO DE DISTINTAS FORMAS DE LA ENFERMEDAD CELACA EN LA POBLACIN SAHARAUI. A. Lpez-Vzquez1, L. Rodrigo2, D. Fuentes2, J. Martnez-Borra1, S. Gonzlez3, C. LpezLarrea1. Servicios de 1Inmunologa y 2Digestivo. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo. 3Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo Estudios previos han demostrado que la poblacin saharaui residente en los campamentos de Tinduz, presenta la mayor prevalencia conocida de la enfermedad celaca en el mundo. El motivo de este estudio es analizar si otros genes candidatos, distintos de HLADQ2, son capaces de modificar el comportamiento de la enfermedad celaca en una poblacin de enfermos saharauis. Hemos seleccionado 125 pacientes celacos, los cuales han sido divididos en dos grupos de acuerdo con sus manifestaciones clnicas. Un grupo de pacientes con manifestaciones gastrointestinales clsicas (n=70) y otro con manifestaciones atpicas (n=55). Tambin hemos seleccionado un grupo de controles sanos (n=103) sin historia conocida de celaca, ni familiares conocidos con la enfermedad. Todos ellos fueron tipados para HLAB, DR, DQ y MICA-TM. No existen diferencias en la distribucin de HLA-DQ2 entre ambos grupos de pacientes. Las formas atpicas de EC se encontraron
asociadas con el haplotipo B8/MICA-A5.1/DQ2 cuando se compararon con las formas clsicas (p=0.0006) y con los controles sanos (pc<0.000001). De estos alelos MICA-A5.1 se encontr en un 84% de las formas atpicas y solo en un 53% de las formas clsicas (pc=0.003). HLA-B8 estaba tambin aumentado en las formas atpicas cuando las comparamos con las clsicas (69% vs. 38,5%, pc=0.01). Hemos encontrado que el riesgo de padecer enfermedad celaca atpica est claramente asociado al haplotipo B8/MICA-A5.1/DQ2 en los enfermos saharauis, lo que parece confirmar los resultados previos descritos en la poblacin espaola. Dentro de este haplotipo, MICA-A5.1 parece ser un candidato adecuado, capaz de modular las manifestaciones clnicas de la enfermedad celaca. 0605. ASOCIACIN DE HLA-B*1403 A LA ESPONDILITIS ANQUILOPOYTICA EN UNA POBLACIN DE FRICA OCCIDENTAL. C. Lpez-Larrea1, M. Mijiyawa2, S. Gonzlez3, J.L. Fernndez-Morera1, M.A. Blanco-Gelaz1, J. Martnez-Borra1, A. Lpez-Vzquez1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo. 2Centre Hospitalier Universitaire. Lom. Togo. 3Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo El fin de este estudio fue analizar la contribucin de los alelos HLA de clase I en la susceptibilidad a padecer espondilitis anquilopoytica (EA) primaria en una poblacin de Africa Occidental. Se realiz un amplio estudio epidemiolgico sobre un total de 9.065 pacientes reumatolgicos de Togo, con el fin de identificar a los enfermos con EA primaria, encontrndose 8 individuos con esta enfermedad. Se seleccionaron tambin 85 controles sanos al azar, no relacionados con los pacientes. De todos ellos se obtuvo una muestra de DNA genmico y fueron tipados para HLA-B mediante la tcnica de PCR-SSO. Se encontr una asociacin estadsticamente significativa entre la EA primaria y HLA-B14. Este alelo se encontr en un 62,5% de los pacientes y solo en un 2% de los controles sanos (pc=0,0005, OR=69). El anlisis de los subtipos de HLA-B14 mostr que HLA-B*1403 era el alelo predominante en los pacientes con EA (pc=0,0005, OR=171), estando ausente en los controles. Por el contrario, HLA-B27 estaba prcticamente ausente, encontrndose en un solo paciente con EA primaria. HLA-B*1403 comparte el pocket B con HLA-B27 y podra ejercer un efecto en la susceptibilidad a EA acorde con el modelo del pptido artritognico. Esta asociacin de HLA-B*1403 y EA primaria no haba sido descrita hasta ahora en ninguna poblacin. 0606. CONSERVACIN DE LAS CARACERSTICAS ANTIGNICAS DE LIGANDOS PEPTDICOS COMPARTIDOS ENTRE SUBTIPOS DE HLA-B27 ASOCIADOS DIFERENCIALMENTE A ENFERMEDAD. V. Montserrat, M. Mart, J.A. Lpez de Castro. Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa ( Consejo Superior de Investigaciones Cientficas y Universidad Autnoma de Madrid). Facultad de Ciencias. Universidad Autnoma de Madrid. 28049 Madrid. Espaa HLA-B*2702, B*2704 y B*2705 estn fuertemente asociados con espodiloartropatas , mientras que B*2706 no lo est o lo est muy dbilmente. Estos subtipos slo difieren entre s en un mximo de 4 aminocidos en el sitio de unin a pptido.
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La asociacin de un subtipo a enfermedad se correlaciona con la unin especfica de pptidos, o por la modificacin de las caractersticas antignicas de ligandos compartidos. Generamos clones de CTLs aloreactivos contra B*2704 y analizamos su capacidad de reconocer B*2705, B*2706 y B*2702 y dos mutantes intermedios entre B*2704 y B*2705. El uso de clones alognicos tiene la ventaja de poder analizar un conjunto grande de pptidos que se unen constitutivamente a la molcula de HLA-B27 y nos permite ver las modificaciones antignicas que sufren los pptidos a ser presentados por los diferentes subtipos. La reactividad cruzada de estos CLTs con B*2705 (36%) y B*2702 (63%) se correlaciona con el solapamiento de sus motivos peptdicos de anclaje, sugiriendo la conservacin de la antigenicidad en muchos de los pptidos compartidos. Un estudio exhaustivo del solapamiento peptdico de B*2704 y B*2706, y nuestro anlisis del reconocimiento por CLTs revela que, tan slo en el 16% de los ligandos compartidos han variado en mayor o menor medida sus caractersticas antignicas al ser presentados por B*2706. El bajo reconocimiento que presentaban los CTLs anti-B*2704 con B*2705 a pesar de diferenciarse ambos subtipos en tan slo dos cambios S77D y E152V, nos llev a estudiar de la reactividad con dos mutantes que se diferenciaban de B*2704 en uno de los dos residuos, para ver el efecto de cada mutacin por separado. Los resultados revelan una importancia considerable, aunque parecida, de cada uno de los dos cambios, abolindose el reconocimiento en el 45 y 41% de los casos, respectivamente. De los diferentes patrones de reactividad, cabe destacar la ausencia de clones capaces de reconocer los subtipos asociados a enfermedad y de no hacerlo a subtipos no asociados, lo que supone que la frecuencia de pptidos cuya unin a HLA-B27 se correlacione con asociacin de subtipos a es pequea dentro del repertorio peptdico de HLA-B27. Se observaron diferencias entre respondedores en la frecuencia de los distintos patrones de reaccin clonal. Esto sugiere que la aloinmunogenicidad de los ligandos naturales de HLA-B27 varia para distintos individuos. 0607. LOS SUBTIPOS DE HLA-B27 QUE SE ASOCIAN A ENFERMEDAD PRESENTAN UN LIGANDO CON ALTA HOMOLOGA A PPTIDOS DERIVADOS DE PROTENAS DE CHLAMYDIA. M. Ramos1, I. Alvarez1, L. Sesma1, A. Logean2, D. Rognan2, J.A. Lpez de Castro1. 1Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (C.S.I.C.-U.A.M.). Universidad Autnoma de Madrid, Facultad de Ciencias. Madrid. Spain. 2Laboratoire de Pharmacochimie de la Communication Cellulaire. UMR 7081 CNRS, 74 route du Rhin, F-67401, Illkirch, France. HLA-B27 se asocia a un grupo de enfermedades denominadas espondiloartropatas, entre las que se encuentran la espondilitis anquilosante y la artritis reactiva. Esta ltima se caracteriza por que se produce tras la infeccin de determinadas bacterias Gram-negativas, entra las que se encuentra Chlamydia trachomatis. En este trabajo se describe la presentacin por tres de los subtipos asociados a enfermedad (B*2702, B*2704 y B*2705), de un dodecamero derivado de la regin intracitoplasmtica de la propia molcula de HLAB27, ligando que no aparece en el repertorio peptdico de los dos subtipos que no se asocian a enfermadad (B*2706 y B*2709). Este pptido presenta adems, una alta homologa de secuencia con prote-
nas de bacterias artritognicas, especialmente con una regin de la DNA primasa de C. trachomatis. Un pptido sinttico con la secuencia homloga de esta protena bacteriana se une en un ensayo in vitro a los subtipos asociados a enfermedad de manera anloga al ligando natural derivado de HLA-B27. As mismo, el pptido de Chlamydia se genera directamente por el proteasoma 20S, en digestiones in vitro de un precursor con la secuencia de la protena bacteriana. La modelizacin molecular de los pptidos derivados de la DNA primasa bacteriana y del ligando natural unidos a HLA-B27 sugiere que ambos pptidos adoptan una conformacin similar. Estos resultados demuestran que un pptido derivado de la molcula de HLA-B27, que presenta homologa con secuencias de protenas bacterianas, es ligando natural de los subtipos asociados a enfermedad, y sugieren que el pptido homlogo derivado de la protena de Chlamydia puede ser presentado por HLA-B27 en clulas infectadas por esta bacteria. 0608. TIPIFICACIN DE ALTA RESOLUCIN PARA LA FAMILIA ALLICA HLA-B*27 MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL CON SONDAS DE HIBRIDACIN Y CURVAS DE FUSIN. R. Faner, R. Colobran, N. Casamitjana, A. Ribera, E. Palou, R. Pujol, M. Juan. LIRAD (Laboratori dImmunobiologia Aplicada a la Recerca i Aplicacions Diagnstiques). SSR-CTBT. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. UAB. Ctra del Canyet s/n 08916. Badalona. Barcelona Objetivo. Definir si la PCR en tiempo real con sondas FRET (metodologa donador-receptor) permite la tipificacin de HLAB*27, superando las limitaciones de las tcnicas actuales en cuanto a tiempo, reacciones necesarias y resolucin allica para nuestra poblacin. Metodologa. Para resolver el polimorfismo, hemos diseado una aproximacin reducida en base a tres amplificaciones (simultaneas): a) una reaccin de presencia de HLA B*27 (incluyendo un control de amplificacin/DNA de la muestra, la -globina) que se monitoriza con Sybr Green; b) la segunda o reaccin de polimorfismo con dos sondas de hibridacin FRET es especfica para la mayora de alelos de HLA B*27; c) la tercera reaccin con una sonda de hibridacin permite el refinamiento de la resolucin. Ambas reacciones de polimorfismo se analizan usando las temperaturas de fusin de las sondas de hibridacin, estableciendo as una discriminacin en grupos de los distintos alelos HLA-B*27. El sistema se ha optimizado en muestras procedentes de lineas homocigotas y heterocigotas para HLAB*27, y ha sido validado analizando 60 muestras tipificadas en nuestro laboratorio con tcnicas de alta y baja resolucin (Sequenciacin y PCR-SSP). Resultados. La discriminacin en once grupos allicos proporciona una alta resolucin para el 99% de las formas allicas comunes HLA-B*27 en nuestra poblacin. A la vez permite diferenciar alelos con asociacin a diferentes patologas autoinmunitarias, como la espondilitis anquilopoytica (B*2705 y otros) de alelos (como B*2703, B*2706 y B*2709) que parecen mantener una correlacion negativa. Los resultados obtenidos mediante esta tcnica, concuerdan con los obtenidos mediante la sequenciacin, reduciendo el tiempo total a 65 minutos. Conclusiones. Dicha aproximacin permite realizar una discriminacin aceptable del plurialelismo de los genes HLA-B*27 con un tiempo y nmero reducido de reacciones necesarias.
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0609. EFECTO DE HLA-C SOBRE LA ACEPTACIN DE INJERTOS HEPTICOS. M.R. Moya-Quiles, M. Muro, A. Toro, L. Marn, A. Minguela, O. Montes-Ares, M. Miras2, A. Parrado, F. Sanchez-Bueno1, A.M. Garca-Alonso, P. Parrilla1, M. R. lvarez-Lpez. Servicios de Inmunologa. 1Ciruga y 2Medicina Digestiva. Hospital U. Virgen de la Arrixaca. Murcia El papel del HLA-C hasta ahora ha sido poco estudiado en trasplante y menos an en trasplante heptico. El objetivo de este estudio fue analizar la implicacin del HLA-C en la aceptacin del injerto a corto y largo plazo. Para ello se estudiaron 100 parejas donantereceptor, clasificando los receptores en dos grupos, con rechazo agudo y sin rechazo agudo. El tipaje HLA-C se realiz mediante PCR-SSP. Llos anlisis estadsticos se realizaron utilizando el programa SPSS y las tasas de supervivencia se calcularon con el mtodo de KaplanMeier y el test de Wilcoxon. Cuando se analiz la compatibilidad HLA-C donante-receptor, se observ que la compatibilidad allica y de grupo HLA-C mejoraba tanto la tasa de rechazo agudo como la supervivencia del injerto a 5 aos. La frecuencia de rechazo agudo disminuy de 46,3% en trasplantes HLA-C incompatibles (2 mismatches) a 33,3% y 16,6% para trasplantes con 1 o 0 incompatibilidades, respectivamente. Las tasas de supervivencia del injerto incrementaron con el nivel de compatibilidad HLA-C, de modo que los trasplantes realizados con 2 incompatibilidades mostraron una tasa de supervivencia de 58,2% a los 5 aos, frente al 74,0% para injertos con 1 incompatibilidad y el 83,3% para trasplantes realizados con 0 incompatibilidades. En conclusin, estos resultados muestran, por primera vez, que el estudio de la compatibilidad allica HLA-C podra tener un efecto beneficioso en la aceptacin del injerto a corto y largo plazo. 0610. INCOMPATIBILIDAD KIR EN LA EVOLUCIN DEL TRASPLANTE NO EMPARENTADO DE PROGENITORES DE SANGRE DE CORDON UMBILICAL. G.F. Sanz1, D. Planelles, F. Moscard1, D. Jarque, I. Lorenzo1, C. Jimnez1, E. Vila, M. Gmez, R. Granell, L. Ser, N. Puig, R. Rodrguez, M.A. Sanz1, J.A. Montoro. Unidad de Biologa Molecular. Centro de Transfusin de la Comunidad Valenciana y 1Unidad de Trasplante de Mdula. Hospital La Fe de Valencia En la ltima dcada se han identificado diversos receptores en clulas NK especficos para molculas HLA de clase I (KIR, killer cell Ig-like receptors): KIR2DL2/3 reconoce los alelos HLA-C del grupo 1 (C*01, *03, *07, *08, *12 salvo *12DF-, *13, *14 y *16AD) y KIR2DL1 los del grupo 2 (C*02, *04, *05, *06, *12DF, *15, *1602, *17 y *18); KIR3DL1 reconoce los alelos HLA-Bw4, y KIR3DL2 las molculas HLA-A3 y A11. El reconocimiento por parte de estos receptores de las molculas de clase I propias inhibe la lisis en el ambiente autlogo. Por el contrario, la ausencia de expresin de estas molculas estimula la actividad NK. En un ambiente alognico, las clulas NK tendrn capacidad para lisar las clulas heterlogas que expresen molculas de clase I no reconocidas por sus KIR (clulas NK aloreactivas). Tomando como hiptesis de partida la aloreactividad NK, recientemente se ha demostrado en pacientes con leucemia mieloide aguda sometidos a trasplante haploidntico que incompatibilidades en direccin injerto contra husped (GVH) en ligandos KIR mejoran considerablemente la supervivencia libre de enfermedad.
El OBJETIVO de este trabajo ha sido evaluar el impacto de disparidades en ligandos KIR en la evolucin de 35 adultos sometidos a trasplante no emparentado de sangre de cordn (TNE-SC). Los trasplantes se realizaron entre 1997 y 2002 en el Hospital La Fe de Valencia. Los criterios mnimos de seleccin de donantes compatibles se establecieron sobre 6 identidades (A, B y DRB1), permitindose un mximo de 2 disparidades sobre 6. El tipaje HLA se realiz mediante PCR-SSP/SSO a nivel de 4 dgitos en clase II (DRB1, DRB3/4/5, DQA1, DQB1, DPB1) y 2 4 dgitos en clase I. Para evaluar la evolucin del trasplante se analiz el prendimiento/rechazo del injerto, la incidencia/severidad de la enfermedad GVH, las curvas de supervivencia y la mortalidad. Los RESULTADOS obtenidos revelaron disparidades en ligandos KIR en direccin GVH en 8 casos (23%): tres en KIR3DL2, uno en KIR3DL1, dos en KIR2DL2/3, uno en KIR2DL1 y un caso presentaba dos disparidades (KIR3DL2 + KIR2DL1). El anlisis de la incidencia y severidad de la enfermedad GVH no detect diferencias significativas en funcin de la presencia o ausencia de incompatibilidad KIR. Tampoco se observ relacin con la velocidad de prendimiento mieloide ni con la supervivencia libre de enfermedad. En CONCLUSIN estos resultados indican que, a diferencia de lo que ocurre en el trasplante haploidntico, la incompatibilidad en ligandos KIR en direccin GVH no mejora significativamente la evolucin del TNE-SC en adultos. 0611. COMBINACIN EN EL DIAGNSTICO GENTICO PREIMPLANTACIONAL EL SISTEMA HLA Y MUTACIONES ASOCIADAS A ENFERMEDADES SUBSIDIARIAS DE TRANSPLANTE DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS. M. AlonsoNieto, J.L. Vicario, E. Fernndez1, A. de la Fuente1, Y Mnguez2, J.A. Garca2. Histocompatibilidad. Centro de Transfusin de Madrid, 1Reproduccin Humana. Fundacin Jimnez Daz. 2Instituto Valenciano de Infertilidad. Madrid El Diagnstico Gentico Preimplantacional del sistema HLA combinado con la deteccin de enfermedades genticas subsidiarias de TPH es una nueva opcin para pacientes que no tiene donante HLA idntico. Los primeros casos que se han propuesto en nuestros Centros fueron: un caso de Enfermedad Granulomatosa Crnica ligada a X, en la que se solicit la determinacin del sexo del embrin; una Anemia Falciforme, con una nica mutacin recesiva; y una Adrenoleucodistrofia ligada a X, con una mutacin conocida (R401Q). La metodologa que seguimos en todos los casos es: estudio gentico de la mutacin causante de la enfermedad, estudio de posibles tcnica a utilizar para su deteccin, puesta a punto de dicha tcnica con cantidades mnimas de DNA de muestras familiares y no emparentados, puesta a punto en blastmeros individuales procedentes de embriones no aptos para la transferencia y, por ltimo, diagnstico. La aproximacin tcnica utilizada es: PCR-mltiple en la que se combinan primers locus especficos para genes HLA-A, -B y DRB1, junto a los correspondientes en cada caso para determinacin de sexo, primers del gen de la amelogenina y del gen TSPY; para Anemia falciforme, primers del exn 1 del gen de la beta-globina; y para Adrenoleucodistrofia, primers del exn 3 del gen ABCD1 del cromosoma X. A continuacin, se realiza una nested-PCR de cada alelo probable (segregacin familiar) por separado en el caso del HLA, y tambin nested-PCR para el caso de las enfermedades o determinacin de sexo.
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Para el reconocimiento de mutaciones puntuales asociadas a enfermedad se ha diseado una digestin con endonucleasas siempre dirigidas al alelo normal, de modo que si la digestin estuviera inhibida habra un sistema adicional de seguridad en el diagnstico. Aunque no se ha realizado ningn diagnstico real, la combinacin en un diagnstico gentico preimplantacional del tipaje dirigido HLA y de mutaciones asociadas a enfermedades subsidiarias de TPH es posible, con un nmero asumible (<4%) de falta de amplificaciones o contaminaciones, que podra beneficiar a un nmero de pacientes considerable. 0612. DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI GSTT1 EN SUERO MEDIANTE TCNICA DE ELISA. E. Franco, I. Aguilera, I. Wichmann, A. Nez-Roldn. Servicio de Inmunologa, HH.UU. Virgen del Roco Introduccin. Los anticuerpos frente al antgeno GSTT1, que producen en IFI un patrn caracterstico, aparecen en trasplantados hepticos que presentan el alelo nulo para este gen y han recibido un rgano de un donante que presenta el gen GSTT1 y por tanto expresa la protena. El gen que codifica la GSTT1 se encuentra en aproximadamente el 80% de la poblacin, poseyendo el 20% restante un alelo nulo no codificante como resultado de una delecin. Objetivos. Desarrollar un ELISA con el antgeno recombinante humano para detectar y cuantificar anticuerpos frente a la GSTT1 en suero de pacientes trasplantados, as como de otros individuos con genotipo nulo que hayan entrado en contacto con este antgeno. Metodologa. Partiendo de una genoteca de cDNA, se subclon el inserto de la GSTT1 en el vector pRSET utilizando cebadores complementarios a los extremos del gen y se transformaron bacterias BL21, a partir de las cuales se purific la protena de inters en columna de agarosa-Ni. Con la protena purificada se realiz un ELISA con 75 sueros repartidos en cinco grupos: un grupo con el patrn caracterstico en IFI (predominando trasplantados hepticos) (1) y cuatro grupos control negativo sin ese patrn: individuos sanos (2), individuos con enfermedades autoinmunes (3), hepatpatas (4) y trasplantados hepticos (5). Resultados. los resultados demuestran que esta tcnica discrimina con gran precisin los grupos GSTT1 positivo y negativos en los diferentes subgrupos poblacionales estudiados. Los valores de la OD en cada uno de los grupos fueron (media desviacin tpica): (1) 1,552 0,857 (2) 0,027 0,016 (3) 0,031 0,023 (4) 0,028 0,022 (5) 0,025 0,024. Conclusiones. el resultado del ELISA con la protena GSTT1 recombinante humana corrobora la especificidad de los anticuerpos encontrados en IFI, permite cuantificarlos, realizar seguimiento de pacientes, resolver casos de enmascaramiento en IFI por presencia simultanea de otros anticuerpos, as como estudiar los sueros que slo reconocen determinantes conformacionales en la molcula GSTT1. Posters: 0613-0631 0613. AUSENCIA DE TRANSMISIN ENTRE ESPECIES DE RETROVIRUS ENDOGENO PORCINO (PERV) EN XENOTRASPLANTE DE RGANOS DE CERDO A BABUINO CON DEPLECIN PERSISTENTE DE ANTICUERPOS ANTI-GAL. I. Moscoso1, M. Hermida2, T. Daz1, A. Centeno1, R. Maez1, N. Domnech1. 1Unidad de
Investigacin e 2Instituto Ciencias de la Salud CHU Juan Canalejo. A Corua. Spain Introduccin. Los primates no humanos son potenciales modelos animales para estudiar el riesgo de una infeccin por retrovirus endgeno porcino (PERV) tras un xenotrasplante. Los anticuerpos naturales anti-Gal se consideran una de las barreras para evitar la infeccin por PERV y se ha postulado su reduccin puede aumentar el riesgo de infeccin. Nuestro objetivo fue investigar el papel de la inmunosupresin y del GAS 914 (polilisina que contiene aGal que depleciona los anticuerpos anti-Gal) en la posible transferencia in vivo de PERV despus de un xenotrasplante de rganos de cerdo a babuino. Material y mtodos. Se xenotrasplantaron 13 babuinos con rganos de cerdo transgnico hDAF, incluyendo corazones heterotpicos (n=4) y riones (n=9). Todos recibieron GAS antes y despus del trasplante. Fueron tratados con inmunosupresin que inclua ciclofosfamida, ciclosporina, ERL y esteroides o basiliximab, ciclosporina y FTY. Las partculas de PERV se detectaron en el plasma mediante RT-PCR, y en clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMCs) mediante PCR y RT-PCR. La bsqueda de anticuerpos anti PERV en el plasma se llev a cabo mediante Western blot en el momento de la muerte del receptor. Adems se test por PCR la presencia de secuencias especficas de DNA mitocondrial porcino como marcador de xenoquimerismo. Resultados. La media de la supervivencia de los rganos hDAF fue de 3817 das (60-24) para los trasplantes cardiacos y 148 das (31-4) para los renales. El GAS 914 deplecion persistentemente los anticuerpos anti-aGal antes y despus del trasplante. No se detect RNA de PERV ni anticuerpos frente al virus en ninguna de las muestras de plasma. Sin embargo se detectaron secuencias de DNA y/o RNA, en las muestras de PMBCs de 10 animales, pero en todas ellas tambin se encontr DNA mitocondrial porcino indicando la presencia de xenoquimerismo. Conclusin. La deplecin persistente de anticuerpos anti-Gal junto con la inmunosupresin no aumenta el riesgo de infeccin por PERV en el trasplante de rganos hDAF de cerdo a babuino. 0614. ESTUDIO DEL DRB1*03 COMO POSIBLE MARCADOR GENETICO EN ENFERMOS DE ALZHEIMER DE CASTILLA Y LEN. V.J. Len, J.L. Cacho1, C. Gonzlez. Servicio de Bioqumica, 1 Servicio de Neurologa. Hospital Universitario de Salamanca Introduccin. Nuestra regin, Castilla y Len, presenta una poblacin estanca superior a 2 millones de habitantes la cual no ha recibido emigrantes en los ltimos siglos, ms bien su poblacin ha emigrado, asimismo es una poblacin muy envejecida en comparacin con otras regiones espaolas. Todo ello hace idnea para un estudio poblacionales de enfermedades que aparecen en personas altas edades y sus marcadores. Hemos elegido en nuestro estudio el alelo DR3, marcador que ha comenzado a estudiarse recientemente, con resultados contradictorios, en poblaciones de enfermos de Alzheimer, EA, a fin de dilucidar su posible empleo como marcador gentico en este grupo de enfermos. Material y Mtodos. Hemos estudiado una serie de 20 de pacientes diagnosticados de Probable EA segn criterios NINCDSADRDA, y 29 sujetos sanos control (SC) El ADN fue extrado mediante la tcnica de Salting-Ont. El HLA-DR3 fue estudiado mediante el
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Kit HLA-DRB1*03 de DyNal , paralemante se estudio un marcador gentico de EA bien definido como es la Apo E, hit de Innogenetics. Resultados. Hemos encontrado un incremento significativo de la frecuencia de aparicin del DR3 (p= 0,008) y del alelo _4 (p= 0,038) en los pacientes con EA frente a los SC. Concretamente, se encontr que 13 de los 20 (55%) pacientes con EA presentaron DR3 , mientras que solo 3 de los 20 (15%) SC tuvieron un DR 3. En el grupo EA, no hubo relacin entre presencia de _4 y de DR3 (p= 0,193). De acuerdo con estos resultados, el DR3 aparece como un probable factor de riesgo para padecer EA y, adems, es independiente de la presencia o ausencia de APOE _4. Estimamos necesario otros estudios con mayor nmero de sujetos, para poder confirmar estos resultados preliminares 0615. HLA DE CLASE I Y II EN ESCLEROSIS MLTIPLE EN CASTILLA Y LEON: ESTUDIO PRELIMINAR. V.J. Len, J.L. Cacho1, R. Rodrguez1, C. Gonzalez. Servicio de Bioqumica, 1Servicio de Neurologa.Hospital Universitario de Salamanca Introduccin. Nuestra regin, Castilla y Len, presenta una poblacin estanca superior a 2 millones de habitantes la cual no ha recibido emigrantes en los ltimos siglos, ms bien su poblacin ha emigrado. Todo ello hace idnea para un estudio poblacionales de enfermedades que aparecen en personas jvenes con EM. Hemos elegido en nuestro estudio los marcadores A2, A3, B7 y DR15 en enfermos de Esclerosis Mltiple (EM) de nuestra regin. Material y Mtodos. Hemos estudiado una serie de 20 de pacientes diagnosticados de EM segn criterios de POSER, , y 29 sujetos sanos control (SC) El ADN fue extrado mediante la tcnica de Salting-Out. Los genes HLA fueron estudiados empleando Kits de Dynal , asimismo se estudio un marcador gentico de EM bien definido como es la Apo E, hit de Innogenetics. Resultados. La frecuencia del alelo HLA A3 fue del 41% en EM (24% en GC), la del alelo HLA B7 fue 43% ( 23% en GC) y la de DR 15 fue 63% ( 30& GC). Estos resultados, comparables a los obtenidos por otros autores, inducen pensar la posible utilizacin de los alelos HLA A3,B7 y DR15 como posibles marcadores riesgo de la EM , tal com ya se emplea la Apo E. 0616. IMPACTO DE LA PRUEBA CRUZADA EN EL RECHAZO AGUDO Y EN LA SUPERVIVENCIA DEL INJERTO EN EL TRASPLANTE HEPATICO. C. Alonso, A. Torio, P. Sanchez, M.J. Formoso, C. Lemos, F. Arnal, S. Pertega, M. Gmez. Unidades de Inmunologa y de Trasplante Heptico. Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo. La Corua Introduccin. El rechazo de aloinjertos en los trasplantes de rganos slidos, es un proceso complejo en el que estn involucradas tanto la respuesta inmune de tipo humoral como la de tipo celular. Los receptores pueden haber sido sensibilizados produciendo anticuerpos que son capaces de reconocer antgenos portados por el rgano que reciben y originar el rechazo del mismo. La prueba cruzada o crossmach se realiza habitualmente en todos los pacientes que reciben un rgano slido antes del trasplante, excepto en trasplante heptico, a pesar de que en algunos casos resulte positiva. Objetivo. Desde 1996, la Unidad de Histocompatibilidad e Inmunogentica en colaboracin con la Unidad de Trasplante Heptico, rea-
liza de forma retrospectiva la prueba cruzada y el tipaje HLA a los pacientes que han recibido un injerto heptico. El propuesto de este estudio fue evaluar el impacto que tiene la prueba cruzada, en la supervivencia de los injertos y de los pacientes, en el trasplante de hgado. Pacientes y mtodos. El estudio se realiz en 316 pacientes que recibieron un primer injerto heptico. Los sueros de todos los pacientes, fueron estudiados utilizando la tcnica de microlinfocitoxicidad dependiente de complemento (CDC). Los sueros que resultaron positivos por esta tcnica, se estudiaron por un mtodo de ELISA que nos permiti diferenciar los anticuerpos anti-HLA de clase I y clase II, asi como identificar los anticuerpos que eran dependientes o independientes de complemento. Resultados. Quince de los 316 pacientes tuvieron una prueba cruzada positiva, siendo el porcentaje de positividad mayor en las mujeres que en los hombres. El significado que tuvo la prueba cruzada en la supervivencia del injerto, fue mucho mas acusada que en la supervivencia del paciente; los receptores que presentaban una prueba cruzada positiva tuvieron una supervivencia del injerto mucho menor que los pacientes con prueba cruzada negativa (46,67% vs 70,69%). En este mismo estudio, tambin se comprob que los receptores que presentaron la prueba cruzada positiva, rechazaron el injerto en un porcentaje superior a los pacientes con prueba cruzada negativa (53,3% vs 31,2%). El efecto de esta prueba en la supervivencia del paciente fue menor en el grupo de las mujeres que en el de los hombres. Conclusiones. Este estudio muestra el inters que puede tener la realizacin las pruebas cruzadas pretasplante, de una manera rutinaria como se hace con otros rganos, antes de proceder a la indicacin de un trasplante de hgado, y el beneficio que la prctica de esta prueba puede aportar, tanto para mejorar la supervivencia del injerto, como para la morbimortalidad del paciente. 0617. GENES DE SUSCEPTIBILIDAD A LA DIABETES TIPO 1 EN EL HLA DISTINTOS DE DRB1DQ. J.L. Santiago1, H. de la Calle2, Julin Mendez1, A. Martnez1, M. Fernandez-Arquero1, E. G. de la Concha1, E. Urcelay1. 1Servicio de Inmunologa Clnica. Hospital Clnico San Carlos. Madrid. 2Servicio de Endocrinologa, Hospital Ramn y Cajal, Madrid Introduccin. La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune polignica en la que se encuentran implicados tanto factores ambientales como genticos. Entre estos ltimos la contribucin ms importante al riesgo de padecer la enfermedad es debida al complejo HLA de clase II (DQ2-DR3 y DQ8-DR4 fundamentalmente). Estudios recientes parecen indicar la existencia en ciertos haplotipos de otro (u otros) genes en el MHC. Objetivo. Determinar si entre los haplotipos DQ2-DR3 existen genes adicionales de susceptibilidad diferentes a los ya conocidos de clase II. Mtodos. Nuestra poblacin de estudio fueron individuos DR3 heterocigotos: 140 pacientes y 79 controles sanos, todos ellos de la regin de Madrid. Tanto enfermos como controles fueron tipados para los genes del HLA: DQA1, DQB1 y DRB1 mediante PCR-SSOP, HLAB por PCR especfica de alelo y los microsatlites D6S273, BAT-2, TNFa, TNFb, y MICA por PCR seguida de electroforesis capilar en ABI-PRISM 310. El anlisis estadstico de los datos se llev a cabo a travs de un test chi-cuadrado, usando un paquete informtico de anlisis estadstico (EPI-INFO v. 6.02).
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Resultados. Se observ que la frecuencia de los alelos del TNF a1b5 en individuos DR3 heterocigotos era superior en enfermos que en controles (64 de 140 vs. 22 de 91; OR=2.64, p=0.0009). La mayoria de dichos individuos, tanto enfermos como controles, portaban adems los marcadores del haplotipo conservado 18.2: D6S273*2, BAT2*2, TNFa*1, TNFb*5, MICA*4, HLA-B18. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en individuos DR3 heterocigotos portadores de alelos diferentes para el TNFab. Conclusin. El haplotipo conservado 18.2 contiene un alelo de susceptibilidad adicional a la que le confiere el HLA de clase II. Estos resultados parecen confirmar los datos obtenidos en otras poblaciones. La elevada conservacin de este haplotipo 18.2 en los individuos estudiados dificulta la localizacin de dicho alelo con una mayor precisin. 0618. ESTUDIO DE ALELOS HLA EN RECHAZO CRNICO Y EN SUPERVIVENCIA DEL ALOINJERTO HEPTICO. NO ASOCIACIN DEL ALELO HLA-DQB1*0302. N. Guerra, M. Muro, L. Marn, MR. Moya-Quiles, A. Toro, A. Minguela, O. Montes, M. Montes, JM. Alemany, MJ. Perez-Lpez, 1F. Snchez-Bueno, AM. Garca-Alonso, MR. lvarez-Lpez. Servicios de Inmunologa y 1Ciruga. Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia Nuestro grupo haba informado previamente que los receptores hepticos portadores de un determinado alelo HLA de clase II, DQB1*0302, presentaban una frecuencia mayor de rechazo celular agudo, pudiendo jugar un papel en el proceso de regulacin que conduce al rechazo o ruptura de la tolerancia. El proposito de este estudio fue investigar si la presencia de un alelo HLA concreto en el receptor o en el donante poda influir en el desarrollo de rechazo crnico y/o en la supervivencia actuarial del aloinjerto heptico. En este estudio, evaluamos 342 trasplantes hepticos consecutivos realizados entre los aos 1989 y 1999. El diagnstico de rechazo crnico se bas en criterios clnicos, bioqumicos e histolgicos convencionales. El tipaje HLA de clase I se realiz por ensayo standar de CDC y el tipaje HLA de clase II mediante mtodos clsicos de PCRSSO y PCR-SSP. Las funciones de supervivencia a 5 aos se analizaron utilizando el mtodo de Kaplan-Meier y las comparaciones entre las curvas mediante el test generalizado de Wilcoxon. En el anlisis del desarrollo de rechazo crnico, no se encontraron alelos HLA asociados con la aparicin de dicho rechazo. El analisis de los alelos HLA clase I y II en los receptores no present diferencias significativas entre las curvas de supervivencia actuariales del aloinjerto heptico para ninguno de los alelos testados. Particularmente, la diferencia en supervivencia del aloinjerto a 5 aos entre los receptores que portaban o no el alelo HLA-DQB1*0302 en su fenotipo fue de un 3% (p>0.05). Tampoco se observaron diferencias en supervivencia del injerto cuando el alelo HLA-DQB1*0302 estuvo presente en el fenotipo portado por el donante de hgado. En conclusin, aunque el alelo HLA-DQB1*0302 puede tener papel en el desarrollo de rechazo agudo en receptores hepticos, no parece influir en el desarrollo de rechazo crnico, ni en la supervivencia del aloinjerto heptico a largo plazo. 0619. RELACIN ENTRE PRUEBAS CRUZADAS CDC Y DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI-HLA DE CLASE I POR CITOMETRA DE FLUJO EN RECEPTORES HEPTICOS. M. Muro, L. Marn, A. Toro, M.R. Moya-
Quiles, A. Minguela, O. Montes, M. Montes, N. Guerra, M.J. Prez-Lpez, F. Snchez-Bueno1, A. Garca-Alonso, MR. lvarez. Servicios de Inmunologa y 1Ciruga. Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia Los anticuerpos detectados mediante pruebas cruzadas se han asociado con una disminucin de la tasa de supervivencia del injerto heptico. El proposito de este estudio fue investigar restrospectivamente la relacin entre la presencia de anticuerpos anti-donante detectados por CDC, deteccin de anticuerpos HLA mediante FlowPRATM, desarrollo de rechazo agudo y crnico, y la supervivencia del injerto, determinando si los anticuerpos anti-donante, previamente detectados por CDC correlacionaban con el screening citomtrico. Se analizaron 342 trasplantes hepticos consecutivos. La prueba cruzada pretransplante se realiz mediante tcnica standar CDC. Los sueros se testaron restrospectivamente para la presencia de aloanticuerpos mediante el test de screening de anticuerpos HLA de clase I FlowPRATM. De los 268 transplantes hepticos con datos de prueba cruzada, 14 (5,2%) receptores se trasplantaron con una prueba cruzada, de clulas T donante-especfica, positiva. La incidencia de rechazo agudo en los pacientes con prueba cruzada CDC+ (29%) fue similar a los pacientes con CDC- (36%). Ningn paciente con prueba cruzada positiva desarrollo rechazo crnico. La supervivencia del injerto fue inferior en receptores con prueba cruzada CDC+ [(59,78% en CDC- vs 21,43% en CDC+ (p=0,0016)]. Adems, la mayora de receptores con prueba cruzada CDC+ tuvieron un fallo de injerto antes del primer ao postrasplante (10 de 11 prdidas de injerto; la supervivencia a 1 ao fue 28,57%), indicando la importancia de la determinacin de la prueba cruzada CDC antes del trasplante. Los resultados de la determinacin positiva de FlowPRA mostraron una concordancia con la prueba cruzada CDC+ en un 85,71% de los casos testados. En conclusin, la sensibilizacin HLA es una barrera para un trasplante heptico con exito. Los receptores de alto riesgo pueden ser previamente detectados mediante un screening FlowPRA prospectivo, bien para indicar el trasplante o una modulacin de la terapia inmunosupresora. 0620. ANTICUERPOS FRENTE A GLUTATION S-TRANSFERASE T1 (GSTT1) EN PACIENTES TRASPLANTADOS RENALES. I. Aguilera1, I. Wichmann1, MA. Gentil2, E. Franco1, A. Nez-Roldn1. Servicios de Inmunologa1 y Nefrologa2. HH.UU. Virgen del Roco. Sevilla Recientemente nuestro grupo ha descrito la aparicin de anticuerpos anti-GSTT1 en pacientes trasplantados de hgado y su papel en el desarrollo de hepatitis immune de novo. Esta enzima pertenece a una superfamilia de enzimas que intervienen en la biotransformacin y eliminacin de sustancias txicas para el organismo. La GSTT1 est codificada por un solo gen polimrfico ausente en un 20% de los individuos de la poblacin caucsica, siendo el alelo nulo el resultado de una deleccin que elimina el gen en su totalidad. Adems de su alto grado de expresin en el hgado, esta enzima se expresa abundantemente en rin, por lo que nos planteamos estudiar la aparicin de anticuerpos en trasplantados renales y las repercusiones clnicas que esta respuesta inmune pudiera tener sobre el rgano trasplantado.
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Tras analizar 100 trasplantes renales realizados con anterioridad al ao 1995, se han encontrado anticuerpos anti-GSTT1 en 4 pacientes. En la siguiente tabla se describen las causas que ocasionaron el fallo renal, el tiempo transcurrido desde el transplante hasta la deteccin de anticuerpos y un dato cuya significado est por determinar, el hecho de que todos los pacientes son virus C positivo. Todos recibieron el mismo tratamiento inmunosupresor inicial con ciclosporina, azatioprina y prednisona. Paciente Causa del fallo renal 1 2 3 4 Sexo Edad al Tx 38 39 32 43 Ab antiGSTT1 (aos) 5 6 8 7 Genotipo VHC GSTT1 GSTT1*0 GSTT1*0 GSTT1*0 GSTT1*0 + + + +
0622. TIPAJE DE MICB MEDIANTE AMPLIFICACION POR PCR CON PRIMERS ESPECIFICOS DE SECUENCIA. APLICACIN AL ESTUDIO DE SU ASOCIACIN A ENFERMEDAD CELIACA. S. Gonzlez1, S. RodrguezRodero1, L. Rodrigo2, A. Lpez-Vzquez3, L. Agudo-Ibez1, J. Martnez-Borra3, C. Lpez-Larrea3. 1Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo. Servicios de 2Digestivo e 3Inmunologa. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo MICB es un gen miembro de la familia MIC. Se han descrito hasta la fecha, 16 alelos de MICB, pero su distribucin en poblaciones y su relevancia funcional, as como su asociacin a enfermedad todava no han sido evaluados. En este estudio hemos desarrollado un sistema de tipaje mediante la amplificacin por PCR usando primers especficos de secuencia, que permite la identificacin sin ambigedades de todos los alelos de MICB. Esta tcnica ha sido utilizada para tipar MICB en 100 individuos sanos, no relacionados, de una poblacin espaola, detectndose en ella slo 9 de los 16 alelos de MICB. Los alelos MICB01021 (46%), MICB0103101 (13,5%), MICB0104 (13,5%) y MICB0106 (12,5%) resultaron ser los ms frecuentes. Como complemento a este trabajo, decidimos estudiar la distribucin de los alelos de MICB en un grupo de pacientes con enfermedad celaca (EC), que previamente habamos estudiado para MICA, HLA-B y HLA-DQ. Se encontr que MICB0106 estaba asociado con la EC (pc<0,000001) y adems su frecuencia estaba aumentada en los enfermos con formas atpicas de la EC, al compararlas con las tpicas (pc=0,04). MICB0106 forma parte del haplotipo EH8.1 y se encuentra en desequilibrio de ligamiento con DQ2 y con MICA-A5.1. El estudio de los pacientes DQ2 negativos mostr un incremento de MICB0104 (p=0,01, pc=NS). En este grupo, MICA-A5.1 se encontr aumentado en la EC atpica (pc=0,001), y este incremento result ser independiente de DQ2 y DQ8 (pc=0,02). La expresin de MIC bajo condiciones de estrs en los enterocitos, su funcin como ligando de los linfocitos T d y CD8+ intraepiteliales, as como los datos genticos presentados, sugieren un papel potencial de estas molculas en la patognesis de la enfermedad celaca. 0623. HAPLOTIPOS HLA ASOCIADOS A LAS MUTACIONES DEL GEN DE LA HEMOCROMATOSIS EN LA POBLACIN ESPAOLA. A. Pacho, M.J. del Rey, B. Surez, M J. Castro, M. Gonzlez, M. Garca, J. Trpaga, L. Gonzlez, P. Morales. Inmunologa, Hospital 12 de Octubre, Carretera de Andaluca Km. 5.4, 28041 Madrid La hemocromatosis hereditaria (HH) es un trastorno congnito del metabolismo del hierro que se hereda como un rasgo autosmico recesivo. En los ltimos aos se ha demostrado que el gen HFE, localizado en el cromosoma 6, telomrico al sistema HLA, est mutado en la mayor parte de los pacientes con HH. Su cercana al sistema HLA es la responsable del desequilibrio de ligamiento entre ciertos alelos HLA y la enfermedad. De las tres mutaciones ms importantes que causan HH, se sabe que la C282Y viaja preferentemente con el haplotipo HLA-A3/B7 y otros, la mutacin H63D presenta desequilibrio de ligamiento con HLA-A29 y HLA-B44, y no hay nada descrito hasta el momento sobre la S65C y HLA. El objetivo del presente trabajo es estudiar los haplotipos HLA en los que estas tres mutaciones se asocian en la poblacin espaola.
Desconocida M Poliquistosis F Glomerulonefritis M Desconocida M
Cuando estudiamos el genotipo de estos pacientes vemos que todos son homocigotos para el alelo nulo, es decir, no expresan la protena al igual que ocurra con los receptores de hgado. No hemos podido comprobar el genotipo de los donantes por tratarse de trasplantes muy antiguos. Esta respuesta inmune, mediada por anticuerpos, no parece tener un efecto sobre la evolucin del rgano trasplantado, aunque estamos realizando estudios para clarificar esta cuestin. 0621. IMPORTANCIA DE LA MONITORIZACION DE IL-10 EN TRASPLANTE DE CORAZON. M. Mir, R. Gonzlez, N. Ballesteros, S. Cantisn, C. Romn, J.M. Arizn, J. Pea. Servicio de Inmunologa. Hospital Reina Sofa de Crdoba La IL-10 es una citocina de accin inmunosupresora y antiinflamatoria postulndose que pueda jugar un importante papel en la tolerancia de los rganos trasplantados. El objetivo del presente estudio fue establecer el grado de relacin entre los niveles de IL-10 en trasplante de corazn y el riesgo de padecer infecciones y rechazo. As mismo se establecer si los niveles de IL-10 tienen valor pronstico en la evolucin del trasplante Para la realizacin de este estudio se analizaron 25 pacientes trasplantados de corazn en nuestro hospital. Se recogieron muestras pretrasplante y postrasplante (das 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente un control al mes hasta el ao). Durante un cuadro infeccioso o de rechazo se realizaron determinaciones cada 2 das. Para la determinacin en suero de IL-10 se utiliz la tcnica Quantikine de R&D Systems. El diagnstico y grado de rechazo se hizo por criterios clnicos y anatomopatolgicos segn protocolos de seguimiento vigente en este hospital. Tambin se determinaron Ac anti-HLA soluble ((tcnica Pra-stat de Sangstat). Los cuadros infecciosos fueron diagnosticados segn los criterios establecidos en cada caso Se analizarn detalladamente los resultados obtenidos aunque de forma resumida se puede concluir que niveles elevados de IL-10 y sobre todo una elevacin brusca de la misma se asocian a un mayor nmero de infecciones y gravedad de las mismas y que niveles bajos o un descenso brusco de los mismos se relaciona con mayor riesgo de rechazo. Los niveles de IL-10 en el periodo inmediato tras solucionarse un cuadro infeccioso o de rechazo tiene gran importancia en la posterior evolucin del paciente. En conclusin, estos resultados podran aconsejar la monitorizacin de los enfermos trasplantados de forma rutinaria con estas determinaciones.
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Para ello hemos contado con ms de 2000 individuos estudiados para las mutaciones HFE. Se seleccionaron los siguientes individuos no relacionados: 100 homocigotos para C282Y, 138 homocigotos para H63D y 17 heterocigotos para S65C. Las mutaciones fueron determinadas por PCR/RFLP y el tipaje HLA de clase I por tcnicas serolgicas estandar. Se utilizaron como controles 1113 individuos no relacionados. Los resultados obtenidos indican que la mutacin C282Y viaja preferentemente con el haplotipo HLA-A3/B7 confirmando los resultados obtenidos por otros grupos, y tambin con HLA-A3/B62; adems, se observa una disminucin de los haplotipos extendidos en la poblacin espaola HLA-A30/B18 y HLA-A2/B51. La mutacin H63D lo hace con el haplotipo HLA-A29/B44, y S65C se asocia con el alelo HLA-A26. Las frecuencias de las mutaciones, su distribucin geogrfica y los valores estadsticos de asociacin sern utilizados para discutir el origen y la antigedad de las mutaciones estudiadas. 0624. SIGNIFICADO PRONOSTICO DE LOS Ac ANTI-HLA SOLUBLE y NIVELES DE IL-10 TRAS TRASPLANTE DE HIGADO. R. Gonzlez, M. Mir, N. Ballesteros, S. Cantisn, C. Romn, M. de La Mata, J. Pea. Servicio de Inmunologa. Hospital Reina Sofa de Crdoba Actualmente sigue resultando de gran inters definir diferentes marcadores que puedan determinarse de forma rutinaria en los laboratorios de Inmunologa y sirvan de ayuda para mantener la inmunosupresin de enfermos trasplantados. El objetivo del presente estudio fue establecer el valor pronstico de la presencia de Ac anti-HLAs y de los niveles de IL-10 en trasplantados de hgado. Para la realizacin de este estudio se analizaron muestras de 25 pacientes trasplantados de hgado en nuestro hospital recogidas en el pretrasplante inmediato y postrasplante (das 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente un control al mes hasta el ao). Este control se intensific durante los cuadros infecciosos o de rechazo. Para la determinacin en suero de IL-10 se utiliz la tcnica Quantikine de R&D Systems. El diagnstico y grado de rechazo se hizo por criterios clnicos y anatomopatolgicos segn protocolos de seguimiento vigente en este hospital. Tambin se determinaron Ac anti-HLA soluble ((tcnica Pra-stat de Sangstat). Los cuadros infecciosos fueron diagnosticados segn los criterios establecidos en cada caso Se analizarn detalladamente los resultados obtenidos aunque de forma resumida se puede concluir que niveles elevados de IL-10 y sobre todo una elevacin brusca de la misma se asocian a un mayor nmero de infecciones y gravedad de las mismas y que niveles bajos o un descenso brusco de los mismos se relaciona con mayor riesgo de rechazo. Los niveles de IL-10 y ttulo de Ac anti-HLAs en el periodo inmediato tras solucionarse un cuadro de rechazo tiene gran importancia en la posterior evolucin del paciente. En conclusin, estos resultados podran aconsejar la monitorizacin de los enfermos trasplantados de forma rutinaria con estas determinaciones. 0625. ASOCIACIN DE LA TUBERCULOSIS CON ALELOS Y HAPLOTIPOS DE LOS GENES HLA CLASE II EN CANTABRIA. A. Garca Martn, P. Sanchez-Velasco, C. Ruiz de Alegra Puig F. Ausin Ortega, F. Leyva-Cobin. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. Santander
Introduccin. La tuberculosis es una enfermedad infecciosa en cuya patognesis existen claras evidencias de implicacin gentica. Esta influencia parece ser de carcter polignico e interacciona de forma todava no conocida al detalle con otros factores constitucionales y ambientales. Ciertos alelos y haplotipos HLA clase II han sido asociados de forma significativa con la tuberculosis, esta asociacin parece mantenerse cualesquiera sea la poblacin a estudio y debe de tener una influencia decisiva en la respuesta inmune frente a M.tbc. Objetivos. El objetivo es analizar si diversos marcadores genticos HLA clase II se asocian con tuberculosis en nuestro medio (provincia de Cantabria). Pacientes y mtodos. 112 pacientes con tuberculosis confirmada por cultivo BK o por PCR fueron comparados con una poblacin control de 94 donantes de sangre (no tuberculosos). Ambas poblaciones fueron tipadas para los alelos de las especificidades HLA-DRB1, HLA-DQA1 y HLA-DQB1, obteniendose posteriormente los haplotipos correspondientes en desequilibrio de ligamiento. Resultados. Las asociaciones en los alelos HLA clase II fueron: En DRB1 no se encontraron asociaciones significativas, DQA1*0301 (p:0.04, OR:1.8) y DQA1*0505 (p:0.01, OR:10.6) con respecto a los sujetos controles, DQB1*0202 (p:0.01), DQB1*0301 (p:0.02, OR:2.3) y DQB1*0603 (p:0.01, OR:0.26) con respecto a los sujetos controles. Finalmente, los haplotipos estadsticamente significativos fueron: DRB1*1301-DQA1*0103-DQB1*0603 (p:0.01, OR:0.11). Conclusiones. Las OR ms significativas (10.6 y 0.11) se presentaron en el alelo HLA-DQA1*0505 (de susceptibilidad) y en el haplotipo DRB1*1301-DQA1*0103-DQB1*0603 (de resistencia) respectivamente. Nuestros datos sugieren que existen determinantes genticos en el HLA que modulan y/o determinan la susceptibilidad a la tbc, aunque evidenciamos pequeas diferencias con respecto a lo determinado en otras poblaciones. 0626. ADVANTAGES OF EIA/LUMINEX VS CDC IN THE ANTI-HLA SPECIFIC ANTIBODIES DETECTION IN SECOND RENAL TX. J.F. Teixeira1, M.S. Monteiro1, G.Oliveira2, J. Fernandes2, A. Castro-Henriques3, E.Osrio1, H. Alves1. 1Centro Histocompatibilidade do Norte, Porto, Portugal; 2 Servio de Nefrologia do Hospital S. Joo, Porto; 3Servio de Nefrologia do Hospital Geral Santo Antnio, Porto Introduction. Alloantibodies (Ab) anti-HLA class I may be detected by Complement Dependent Citotoxicity (CDC), Enzyme Imuno Assay (EIA) or Flow Cytometry (FC). We compare these techniques and studied the association of positive Ab with graft outcome. Materials and Methods. We studied 103 patients in our waiting list for a second transplant (Tx), with a control group of 371 patients with a functioning graft. From every patients a blood samples was drawn at 1, 3 and 6 months after Tx. Anti-HLA Ab were determined by CDC, EIA (OneLambda LATmix, and Luminex techniques (Orchid LifeScreen Class I/II, LifeMatch ID, OneLambda LabScreen Mix and LabScreen PRA). Recipient age, donor age, acute rejection and post-TX HLA EIA Ab showed significancy (p<0,001) when tested with Logistic Regression (LR), but the more significant result was obtained with post-TX HLA-class I EIA Ab. Results. Of those patients who rejected Tx, 52 out of 103 had post-Tx Ab detected by CDC (26/371 in the control group), Odds Ratio (O.R.)=2,33 p<0,001 (LR) which means that the probability of patients rejecting Tx is 2,33 times higher if they had post-Tx Ab. We have veri-
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fied that 70 out of 103 patients who rejected the organ have Ab, class I and/or II by EIA/Luminex, (39/371 in the control group), O.R.= 9,79 p<0,001. The increase in the O.R. (from 2,33 to 9,79) enhance the predict value of these techniques in relation to CDC. The EIA/Luminex techniques have allowed us to detect Ab specificities in 18 patients (70-52) who were repeatedly PRA negative by CDC. Anti- Class I Class II ClassI+II CREGS -donor Specificities CDC+/EIA+ 52 44 32 7 5 CDC-/EIA+ 18 11 5 2 1 3 70 55 Conclusion. Our data suggests that crossmatch testing by CDC for 2 Tx may give as until 26% of false negatives, which may bring disastrous consequences ending in kidney loss. The EIA and/or Luminex may allow an optimised sensitivity and specificity of HLA Ab detection. 0627. MONITORIZACIN DE CLULAS T CD8+CD28+ y CD8+CD28- EN TRASPLANTE CARDIACO. N. Guerra, D. Pascual1, M.R. Moya-Qules, O. Montes-Ares, M. Montes-Casado, L. Marn, A. Bernal-Ramos, A. Minguela, M. Muro, R. Arcas2, M. Valds1, A.M. Garca-Alonso, M.R. lvarez-Lpez. Servicios de Inmunologa. Cardiologa1 y Ciruga Cardiovascular2. Hospital Virgen de la Arrixaca. Murcia Las clulas T CD8+CD28- se les ha asignado un papel regulador dependiente de su capacidad citotxico/supresora, que es de inters especial en procesos de alorreconocimiento y de modulacin de la respuesta alognica que influye en la buena o mala aceptacin de injertos. El propsito del estudio fue monitorizar enfermos sometidos a trasplante cardiaco con el fin de valorar si la posible existencia de un disbalance de la poblacin CD8+CD28+/CD8+CD28- en etapas pre y postrasplante puede facilitar informacin sobre el xito o fracaso de estos trasplantes. El estudio de fue realizado sobre clulas circulantes presentes en muestras de sangre perifrica, usando citometra de flujo y anticuerpos monoclonales especficos combinados apropiadamente. La serie analizada const de un total de 40 pacientes. Despus de excluir los trasplantes que fracasaron por causas no inmunolgicas, el grupo qued constituido por 30 trasplantes que se compararon con 21 individuos control. Los datos demostraron que la determinacin del nmero de clulas CD8+CD28- permita distinguir dos grupos de receptores: a) uno que inclua 19 de los 30 receptores con cifras pretrasplante significativamente mayores que la media de individuos normales (P<0.001) y b) un grupo ms reducido (9 de 30) de pacientes con cifras inferiores al valor normal (p=0.034). En cuanto a la evolucin postrasplante, los pacientes del primer grupo mantena o expandan dicha poblacin despus de un ao de seguimiento. Esta expansin fue an ms destacada en los pacientes del segundo grupo, a pesar de que en el pretrasplante la representacin de esta poblacin era mucho ms reducida. En resumen, en todos los trasplantes, con independencia de su valor inicial respeto a la poblacin control, se detecta una expan-
sin de clulas CD8+CD28-, de ah el inters de proceder a completar su caracterizacin fenotpica y funcional para valorar su implicacin en la aceptacin del injerto. 0628. ANLISIS DE ANTICUERPOS ANTI HLA CLASE I Y CLASE II EN PACIENTES EN LISTA DE ESPERA DE TRASPLANTE MEDIANTE ANALIZADOR DE FLUJO (LUMINEX). C. Romn, S. Cantisn, M. Mir, R. Solana, J. Pea. Departamento de Inmunologa. Hospital Reina Sofa. Crdoba Los sueros de los pacientes en lista de espera de trasplante renal han sido analizados mediante la tcnica de analizador de flujo utilizando microesferas marcadas con color recubiertas de antgenos HLA purificados. Se han determinado anticuerpos tipo IgG contra antgenos HLA clase I y clase II. De estos pacientes un 37% presentan anticuerpos anti HLA: 10,37% presentan slo anticuerpos anti HLA clase I, 8,14% presentan slo anticuerpos anti HLA clase II, y 18,51% presentan anticuerpos anti HLA clase I y clase II. La presencia de estos anticuerpos se ha relacionado con episodios sensibilizantes previos como: transfusiones, trasplantes, embarazos. Esta tcnica muestra un elevado grado de sensibilidad y reproducibilidad en comparacin con la tcnica clsica de citotoxicidad dependiente de complemento. La utilizacin de esta tcnica ha permitido la identificacin en algunos pacientes de especificidades anti HLA que no haban sido previamente detectadas. En la mayora de los pacientes las especificidades detectadas en el suero se han mantenido a lo largo de los dos aos del estudio. Si bien esta tcnica presenta una serie de limitaciones (es difcil asignar especificidades en pacientes hiperinmunizados, el anlisis 2x2 enmascara especificidades, tiende a informar las especificidades ms representadas en el panel reduciendo la posibilidad de asignar anticuerpos de menor frecuencia, asigna especificidades que comparten grupo de reaccin cruzada) consideramos que su sensibilidad, reproducibiblidad y especificidad la convierten en una tcnica muy adecuada para el estudio de los anticuerpos anti HLA en pacientes en lista de espera de trasplante y su relevancia en la evolucin del enfermo trasplantado. 0629. ANLISIS COMPARATIVO DE ESPECIFICIDADES DE ANTICUERPOS ANTI-HLA CLASE I DETERMINADOS POR CITOMETRIA DE FLUJO Y POR TEST DE ELISA DE ANTIGENO UNICO. S. Cantisn, C. Romn, M. Mir, R. Solana, J. Pea. Servicio de Inmunologa. Hospital Reina Sofa. Crdoba La determinacin de anticuerpos anti-HLA se puede realizar por varios mtodos, siendo el ms utilizado la linfocitotoxicidad dependiente de complemento (CDC), sin embargo presenta el inconveniente de la poca reproducibilidad entre diferentes laboratorios. La aparicin de nuevos sistemas de deteccin, tales como la citometra de flujo o las pruebas de ELISA de antgeno nico, han ayudado a eliminar la variabilidad a la hora de determinar especificidades de anticuerpos anti-HLA. El objetivo de nuestro estudio es realizar un anlisis comparativo entre las especificidades de anticuerpos anti-HLA Clase I determinadas por citometra de flujo y test de ELISA de antgeno nico.
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Para el estudio se seleccion una serie de pacientes de nuestro hospital, incluidos en lista de espera de trasplante renal, todos ellos con un PRA superior a 25%, teniendo un 33% de los pacientes un PRA de 25-50%, un 42% de los pacientes con PRA de 50-75%, y por ltimo un 25% de los pacientes con un PRA superior al 75%, considerados hiperinmunizados. Los sueros de todos los pacientes seleccionados, extrados en diciembre de 2002, se analizaron por ambas tcnicas. El mtodo de deteccin por citometra de flujo (LABScreen) es un mtodo sensible y rpido, pero presenta ciertas dificultades a la hora de asignar especificidades en aquellos sueros con un PRA ms alto. En estos casos no siempre es posible determinar todos los anticuerpos debido al enmascaramiento de especificidades, siendo ms til el test de ELISA de antgeno nico, que permite definir todas las especificidades, e incluso, en los pacientes hiperinmunizados, determinar los antgenos HLA que no son reconocidos por el suero del paciente, facilitando as la seleccin de un posible donante. 0630. RISK FACTORS IN KIDNEY TRANSPLANT REJECTION IN 556 PATIENTS OF NORTHERN PORTUGAL. J.F.Teixeira1, M. S. Monteiro1, G. Oliveira2, J. Fernandes2, A. Castro-Henriques3, E. Osrio1, H. Alves1. 1Centro Histocompatibilidade do Norte, Porto, Portugal; 2 Servio de Nefrologia do Hospital S.Joo, Porto; 3Servio de Nefrologia do Hospital Geral Santo Antnio. Porto Introduction. Taking into account that kidney transplantation is a multi-risks therapy, we have studied the factors which may significantly influence both rejection and graft loss. Materials and Methods. We have studied 556 patients who were submitted to a cadaver kidney transplant (TX). 345 (62%) were male and 211 (38%) female. The average age was 40+/-13.4 years old. The rejection rate and graft loss were examined by Logistic Regression, Pearson Qui-Square ant T-Test. We considered significant all P<0.05 values. Of the 556 patients, 451 remain with a functioning kidney, whereas 105 have lost the organ after 39+/-43 months. Causes related to immunological components contributed for 83% of the organ loss, chronic rejection being the most frequent cause (46%). We studied the several receptor data: anti-HLA Pre-Tx alloantibodies [P not significant (NS)] and post-Tx Ab (P<0.05), sex (NS), age [P=0.001; Odds Ratio (OR)=0.96], pregnancy (P<0.001), transfusions (P<0.001), time of haemodialysis 41+/-38 months (NS), number of mismatches (NS) and acute rejection episodes (P<0.001; OR=7.19).
The donor data which we studied was: sex (NS), age 35+/-16 years old (P=0.037; OR=1.02), duration of intensive care 3.9+/3.5 days (NS), cause of death (NS), time of Cold Ischemia 1372+/-267 min (NS) and immediate vs. delayed function (NS). Of all studied data, the presence of post-Tx class I alloantibodies, detected by EIA proved to be the best indicator of the rejection/organ loss OR=9.8 (IC 95% 4.06523.563) P<0.001. Conclusion. We have documented a strong association between allograft rejection and the factors which involve immunological components of the receptor (transfusions, pregnancy, anti-HLA alloantibodies, rejection episodes, age) and the quality of the transplanted organ (donor age). 0631. IDENTIFICACIN INDIVIDUALIZADA DE ANTICUERPOS CITOTXICOS ANTI HLA EN SUEROS DE PACIENTES EN LISTA DE ESPERA DE TRASPLANTE. C. Muoz1, M.A Miguelsanz1, A. Franco2, M.L. De la Sen1. 1Seccin de Inmunologa. 2Servicio de Nefrologa. Hospital General Alicante. El tradicional anlisis 2x2 para la deteccin de anticuerpos citotxicos antiHLA limita las posibilidades de trasplante en pacientes con valores alto de PRA. Adems es totalmente dependiente de la frecuencia antignica en el panel de clulas empleadas lo que relativiza mucho los resultados obtenidos en los distintos laboratorios y enmascara posibles reacciones frente a ciertas especificidades, segn sean los haplotipos empleados. La utilizacin de un mtodo en el que las distintas especificidades antiHLA de un suero pudieran identificarse directamente al reaccionar con antgenos aislados mejorara notablemente la resolucin de los mtodos actuales para detectar anticuerpos frente a antgenos del CPH. Con este objetivo hemos analizado 50 sueros con un valor de PRA entre el 10% y el 100% y otros 25 con PRA del 0% (One Lambda LABScreen) mediante tcnicas de citotoxicidad y ELISA (One Lambda LAT) y comparado los resultados obtenidos con los de un mtodo de identificacin individualizada de anticuerpos HLA (One Lambda LAT HD). La correlacin de los resultados obtenidos con cada una de las tcnicas probadas nos permite concluir que la deteccin de anticuerpos antiHLA mediante sistemas con antgenos individualizados identifica dichos anticuerpos con ms claridad y evita la dependencia de paneles celulares, mejorando, incluso, la sensibilidad de la deteccin, lo que posibilita la utilizacin del mtodo durante las primeras fases de reaccin del paciente.
Sesion 07: HIV y SIDA

Comunicaciones Orales: 0701-0708 0701. INDUCCIN POR FACTORES DEL SUERO HIV-1 POSITIVO, DE LA MOLCULA HLA-G1 EN MONOCITOS DE SANGRE PERIFRICA DE INDIVIDUOS SANOS. G. Dueas, J.M. Lozano, M.J. Garca-Moreno, R. Gonzalez, M.A. Cabello, R. Solana, M. Santamaria, A. Ojeda, J.M. Kindeln, E. Vidal, J. Pea. Servicio de Inmunologa y Unidad de Infecciosos. Hospital Reina Sofa. Universidad de Crdoba Los mecanismos por los que el virus VIH-1 evita ser destruido por el sistema inmune, son objeto de intenso estudio. Una de las estrategias ya descritas consiste en variar los niveles de las molculas de histocompatibilidad en la superficie de las clulas en las que el virus se replica. A la vista de los resultados encontrados en nues-
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tro grupo de que un 33.63.5% de los linfocitos T (CD3) y un 92.91.7% de los monocitos (CD14) de individuos infectados por VIH-1 expresaron HLA-G1 (en individuos sanos la expresin de esta molcula es muy baja), nos marcamos como objetivo en este trabajo investigar los posibles factores presentes en suero de individuos VIH seropositivos y que pudiesen estar implicados en la induccin de HLA-G1 y otras isoformas en monocitos de individuos normales. La expresin de molcula HLA-G fue analizada por inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonal anti-HLA-G (MEM-G/09), sobre las clulas CD14+, CD3+ o la lnea celular monoctica THP-1. Dichas clulas fueron puestas en cultivo durante 3 das en medio RPMI 1640 completado con suero de individuos HIV-1 seropositivos, suero humano de individuos sanos, IL-10 (10nM) y/o TGF-beta (1nM). Las distintas isoformas HLA-G fueron analizadas por western-blot, usando lisados celulares en SDS-PAGE y utilizando MEM-G/01 como anticuerpo monoclonal anti-HLA-G. Como clulas control se utilizaron la lnea celular de coriocarcinoma humano, JEG-3. Se ha encontrado que el suero de individuos VIH+ es capaz de inducir la expresin de la molcula HLA-G en monocitos sanos de sangre perifrica (681.8 %), tras 72 horas de cultivo. Resultados equivalentes hemos encontrado cuando el suero VIH-1 seropositivo se aade a cultivos efectuados con clulas THP-1. El anlisis por western-blot confirma estos hallazgos, existiendo la expresin de dos bandas de 49 y 13 kDa positivas al anticuerpo MEM-G/01 en las clulas en cultivo con suero HIV-1 seropositivo. Considerando que este efecto pudiera deberse a IL-10 y TGFbeta, normalmente elevados en el suero de este tipo de enfermos, nos propusimos estudiar el efecto de estas citocinas sobre la expresin de HLA-G. Para este anlisis pusimos en cultivo PBLs de sangre perifrica de individuos sanos en presencia de IL-10 y TGF-beta. En dichos cultivos, se elevaron significativamente los niveles de HLA-G en clulas CD14+ no observndose este efecto en clulas CD3+. Resultados similares a los obtenidos en clulas CD14+, se obtuvieron utilizando la lnea celular monoctica THP-1, apuntando a la idea de que el efecto de estas citocinas sobre la expresin de HLA-G, es restringido a clulas monocticas. Estos datos han sido corroborados por westernblot, en donde se confirma la existencia de diversos isotipos de la molcula HLA-G como consecuencia del tratamiento con IL-10 y/o TGFbeta tanto de PBLs sanos como en clulas THP1. 0702. DIFERENCIAS INMUNOFENOTPICAS ENTRE PACIENTES INFECTADOS POR VIH CON DISTINTA EVOLUCIN CLNICA. R. Sez1, P. Echniz1, N. Olivares1, X. Camino2, J.A. Iribarren2, E. Cuadrado1. Servicio de 1Inmunologa y Unidad de 1Enfermedades Infecciosas. Hospital Donostia. San Sebastin. Guipzcoa Hemos seleccionado dos grupos extremos de sujetos infectados por VIH: personas con infeccin asintomtica de ms de 10 aos de evolucin (LS) N=8, y pacientes que han sufrido una rpida progresin clnica y analtica (RP) N=5; ninguno ha sido tratado con antirretrovirales. En cada caso se analizaron subpoblaciones de linfocitos CD4, CD8, clulas NK, NK-T y clulas dendrticas mieloides y linfoplasmocitoides. Como controles se estudiaron 20 sujetos de sexo y edad comparables con los grupos de estudio. Observamos diferencias significativas para la mayora de las poblaciones en ambos grupos de estudio respecto a los controles, sin embargo, al compararlos entre s (LS y RP), nicamente hallamos diferencias significativas en las subpoblaciones CD4+/CD7-, CD4+/CD26+ y CD8+/CD38.
0703. ESTUDIO FUNCIONAL DE DOS GRUPOS DE SUJETOS INFECTADOS POR VIH CON DISTINTA EVOLUCIN CLNICA. R. Sez1, P. Echniz1, N. Olivares1, M.D. de Juan1, X. Camino2, J.A. Iribarren2, E. Cuadrado1. Servicio de 1Inmunologa y Unidad de 2Enfermedades Infecciosas. Hospital Donostia. San Sebastin. Guipzcoa El estudio se ha orientado a analizar la inmunidad innata en dos grupos extremos de sujetos infectados por VIH: personas con infeccin asintomtica de ms de 10 aos de evolucin (LS) N=8, y pacientes que han sufrido una rpida progresin clnica y analtica (RP) N=5; ninguno ha sido tratado con antirretrovirales. Como controles se estudiaron 20 sujetos de sexo y edad comparables con los grupos de estudio. Hemos analizado la produccin intracelular de IFN gamma en linfocitos T y NK y la produccin de IFN alfa en clulas dendrticas linfoplasmocitoides en respuesta a diversos estmulos activadores, incluidos oligonucletidos CpG, capaces de estimular diferencialmente a poblaciones celulares a travs de interacciones con los TLRs. Encontramos que las clulas NK (CD3-/CD56+) productoras de IFN gamma, estimuladas con un oligonucletido CpG tipo D, estn significativamente disminuidas en los sujetos VIH RP, mientras que la produccin de IFN alfa est significativamente aumentada en respuesta a otro oligonucletido CpG. No encontramos diferencias en respuesta a otros estmulos activadores. Las respuestas funcionales de los sujetos LS fueron similares a las de los controles, observando nicamente una mayor produccin espontnea de IFN gamma por las clulas NK y linfocitos T. 0704. EVALUACION DE LAS SUBPOBLACIONES ACTIVADAS DE CELULAS T CD4 Y CD8 COMO MARCADORES PRONOSTICOS Y DE EVALUACION TERAPEUTICA EN PACIENTES CON INFECCION POR EL VIH. J. Carbone, J. Navarro, J. Gil, C. Rodrguez Sainz, M.L. Abad, L. Daz, C. Cant, J.M. Benito, E. FernndezCruz. Servicio de Inmunologa. HGU Gregorio Maran. Madrid Nuestro grupo ha demostrado que las subpoblaciones activadas T CD4 y CD8 tienen poder predictivo de progresin clnica a SIDA independiente de los niveles de CD4 y carga viral VIH (CV). Objetivos. Demostracin de que los niveles de las subpoblaciones activadas T CD4 y CD8 tienen poder predictivo de la cada de linfocitos T CD4, pueden modularse con el tratamiento y predecir la respuesta teraputica. Metodologa. 1. Estudio de seguimiento de una cohorte de 50 pacientes ADVP VIH+ con ms de 200 clulas T CD4, para establecer el poder predictivo de cada de clulas T CD4 (progresin a una categora inferior de clulas T CD4 segn CDCP). 2. Estudio prospectivo de 50 pacientes VIH+ includos en un ensayo clnico en fase II, en el que los pacientes reciban terapia antirretroviral en combinacin con la administracin de un inmungeno VIH-1 (n=25) o terapia antirretroviral asociada a placebo (n=25). Estudio de los cambios en las subpoblaciones linfocitarias durante un periodo en el cual la viremia VIH era menor a 5000 copias/ml; y del poder predictivo de incremento de la CV por encima de 5000 copias/ml. Subpoblaciones linfocitarias: citometra de flujo de tres colores. Estadstica: Anlisis de regresin de Cox y prueba T de Student. Resultados. 1. Los porcentajes aumentados de las clulas CD4+DR+ [Riesgo relativo (RR) 2.13, p=0.03], CD4+CD38+DR+ (RR
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1.03, p=0.02) y CD8+CD38+ (RR 1.03, p=0.0057) se asociaron a mayor riesgo de deplecin de CD4. 2. Se observaron descensos significativos en el porcentaje de las subpoblaciones activadas CD4+DR+, CD4+CD45RO+DR+, CD8+CD45RO+CD38+, CD8+DR+ y CD8+CD38+ tras tratamiento. Niveles aumentados antes del tratamiento de las subpoblaciones CD4+CD38+DR+ (RR 1.11, p=0.03), CD8+CD38+ (RR 1.06, p=0.0008) y CD8+CD45RO+CD38+ (RR 1.05, p=0.009) se asociaron a mayor riesgo de incremento de CV, tras ajuste por el tipo de tratamiento recibido. Conclusiones. El porcentaje de clulas T activadas CD4 y CD8 podra utilizarse junto a los marcadores clsicos recuento de CD4 y CV, para predecir el deterioro inmunolgico, para monitorizar la terapia anti-VIH y para predecir la respuesta al tratamiento. 0705. RECONSTITUCIN INMUNE DE NIOS INFECTADOS VERTICALMENTE POR EL VIH DURANTE LA TERAPIA ANTIRETROVIRAL POTENTE. A. Perez1, S. Resino1, I. Galn1, J.M Belln1, M.D. Gurbindo2, J.A. Leon3, M. Muoz-Fernndez1. 1Servicio de Inmunologa del Hospital Gregorio Maran Madrid. 2Servicio de InmunoPediatra del Hospital Gregorio Maran Madrid. 3Servicio de Pediatra-Infecciosas del Hospital Virgen del Roco Sevilla Objetivos. Estudiar los cambios que tienen lugar durante la reconstitucin inmune en nios infectados por el VIH en terapia antirretroviral potente (TAP). Materiales y mtodos. Se realiz un estudio longitudinal en 20 nios infectados por el VIH durante un ao en TAP. Los TRECs se realizaron por PCR cuantitativa; y las subpoblaciones de clulas T por citometra de flujo, la carga viral (CV) se cuantific usando un ensayo molecular estndar. La respuesta linfoproliferativa (LPR) fue evaluada en cultivos de CMSP mediante la incorporacin de timidina tritiada, y las citocinas de los sobrenadantes de los cultivos se midieron por ELISA. Resultados. A la entrada en el estudio, los nios VIH tuvieron valores de TRECs ms bajos que el grupo de nios sanos, pero un ao ms tarde hubo un incremento significativo de TRECs (p<0.05). Encontramos una correlacin positiva entre los TRECs y el nmero absoluto de clulas T CD4+ (r=0.558; p=0.05) y su porcentaje (r=0.625; p=0.030). Durante el ao de estudio, el porcentaje y nmero absoluto de clulas T CD4+ y CD8+ vrgenes se incrementaron (p<0.05). El porcentaje de CD4+CD45RAhi+CD62L+, CD4+CD45RA+, y CD4+CD38+, y el nmero absoluto de CD8+CD45RAhi+CD62L+ alcanz valores similares a los del grupo control sano despus de un ao con TAP. Tambin, disminuyeron los valores del porcentaje de CD8+CD45RO+CD38+ y CD8+CD45RO+, y del nmero absoluto de CD8+CD45RO+CD38+ (p<0.05). La LPR frente a PWM antes de la TAP fue ms baja que el grupo control, pero se recuper un ao ms tarde. La produccin de TNF- y IFN- por las CMSP estimuladas con PHA aument (p<0.001), y fue similar al grupo control despus de un ao con HAART. Conclusin. La recuperacin del sistema inmune por la TAP en nios infectados verticalmente por el VIH parece ser consecuencia del descenso de la activacin del sistema inmune y por la reconstitucin del clulas T vrgenes de origen tmico. 0706. PAPEL INMUNOLGICO DEL CAMBIO GENOTPICO Y FENOTPICO DEL VIH EN PACIENTES CON FRACASOS TERAPUTICOS. M. Gonzlez-Rivera1 ,
J.L. Jimenez1, I. Galn1, M.I. De Jos2, M.L. Navarro1, J.T. Ramos3, M.J. Mellado4, M.D. Gurbindo1, J.M. Belln1, S. Resino1, E. Cabrero5, M.A. Muoz-Fernndez1. 1Gregorio Maran. 2La Paz. 3 12 de Octubre. 4Carlos III y 5Abbot del CEIPVIH Objetivo. Estudiar en nios VIH+ con varios fracasos teraputicos los efectos de TARGA de rescate con lopinavir-ritonavir (L+R) en caractersticas del VIH. Pacientes y Mtodos. Estudiamos 20 nios VIH+ con cambios de tratamiento de 3,80,3, durante 16.1 meses desde inicio del tratamiento con L+R. Se aislaron y caracterizaron los aislados virales y el clonaje del VIH, antes de iniciar el tratamiento y despus de TARGA mediante dilucin limite de los cultivos. Resultados. Tras TARGA observamos un aumento de T-CD4+ acompaada de reconstitucin inmune, una disminucin significativa de la carga viral (CV) y beneficios clnicos. Estudiamos 91 aislados VIH, de 20 muestras nios VIH+ para ver como la TARGA de rescate puede influir sobre el fenotipo de los virus y el sistema inmune. A la entrada del estudio 18 (90%) tenan fenotipo SI. El fenotipo viral cambi a NIS en 17 (84,4%) de los 18 despus de una media de 5.7 meses de TARGA. Los otros 2 nios (10%) tuvieron fenotipo NSI durante todo el estudio. Encontramos resultados similares en los experimentos de clonaje. A la entrada del estudio, en CMSP de 3 nios se aislaron 65 clones y entre estos una mediana de 56 fueron SI y una mediana de 9 NSI. Tras TARGA todos los aislados fueron NSI. La nueva terapia redujo la conversin de fenotipo NSI a SI. Tambin observamos el cambio genotpico de SI a NSI. Conclusin. Nuestros datos sugieren que en nios la terapia de rescate va acompaado de una reconstitucin inmune y produce tanto una disminucin de la CV como un cambio de fenotipo. Al inici del nuevo tratamiento con L+R los virus que usan CXCR4 se suprimen preferentemente. La contribucin a la eficacia clnica de los frmacos anti-VIH puede deberse a cambios en el uso del correceptor. 0707. LA VACUNACIN TERAPUTICA CON UN INMUNGENO VIH-1 INDUCE RESPUESTAS CELULARES ESPECFICAS FRENTE AL VIH-1 TANTO EN PACIENTES VIH-1+ SIN TRATAMIENTO ANTIRETROVIRAL PREVIO COMO EN PACIENTES TRATADOS DE FORMA ESTABLE. E. Fernandez-Cruz, J. Navarro, M.L. Abad, L. Daz, C. Cant, J. Carbone, C. Rodrguez Sainz, M.A. Muoz-Fernandez, S. Moreno, B. Clotet, J. Prez Molina, J.M. Pea, J.M. Gatell, D. Podzamczer, R. Rubio, P. Viciana, J.A. Maradona, R. Blazquez, C. Barros, I. Ocaa, C. Quereda, F. Lopez, E. Ferrer, A. Jou, M. Daz, J. Gonzalez-Lahoz, del grupo STIR-2102 Objetivo. Estudio de las respuestas generadas por inmunizacin cada tres meses con un inmungeno VIH-1 en IFA (INM) en dos grupos de pacientes VIH-1+ sin tratamiento antiretroviral (ART) previo: 1. Pacientes que recibieron ART+INM durante 60 meses (Grupo INM) y 2.Pacientes que recibieron ART+IFA durante 36 meses, y despus ART+INM durante 24 meses (Grupo IFA). Mtodos. Estudiamos los cambios en las subpoblaciones funcionales de linfocitos T en 54 individuos (27 INM, 27 IFA), y su relacin con CD4 y carga viral (CV), las respuestas linfoproliferativas (RLP) y la produccin de citocinas y -quimiocinas frente a antgenos VIH-1.
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Resultados. La vacunacin teraputica increment los linfocitos T de memoria (CD45RO+), activados (CD4+HLA-DR+, CD4+CD38+DR+), y memoria-activados (CD4+CD45RO+DR+, CD8+CD45RO+CD38+) en el grupo INM comparado con el grupo IFA (p<0.05). Encontramos correlacin positiva entre linfocitos de memoria y memoria-activados con CV en el grupo IFA, pero no en el grupo INM. La inmunizacin en los pacientes del grupo IFA indujo un incremento significativo de los linfocitos T de memoria y memoria-activados, y una prdida de correlacin de estas poblaciones con CV. Ambos grupos tenan bajas RLP en el estudio basal (INM, ndice de estimulacin, IE: 2,2 0,4 e IFA IE: 1,7 0,3). La RLP y la produccin de IFN- y MIP-1 se incrementaron significativamente en el grupo INM, alcanzndose una meseta en el M 18 (INM, ndice de estimulacin, IE: 2,2 0,4 e IFA IE: 1,7 0,3IE: 26,1 5,1; IFN-: 983 470 pg/ml; MIP-1: 3308 859 pg/ml), comparado con el grupo IFA (IE: 4,9 1,4; IFN-: 126 66 pg/ml; MIP1-b: 972 564 pg/ml) (p<0.05). Estas respuestas se mantuvieron elevadas hasta el mes 60 en el grupo INM (IE: 21,4 11 IFN-: 1324 588 pg/ml; MIP-1: 11849 4335 pg/ml). La inmunizacin (I) en el grupo IFA indujo un incremento de la RLP (IE pre-I: 4,8 1.3; IE M48: 36 13; IE M60: 27,8 11,8), IFN- (pre-I: 31 16 pg/ml; M48: 137 81; M60: 1176 815pg/ml) y MIP-1 (pre-I: 212102 pg/ml; M48: 48852738; M60: 112066158 pg/ml). Conclusiones. La vacunacin teraputica induce respuestas celulares TH1 frente al VIH-1, independientemente del tratamiento antiretroviral previo. La vacunacin teraputica disminuye la activacin crnica, lo que sugiere que las respuestas de memoria especfica tienen impacto sobre la replicacin viral. 0708. TIMING OF RECONSTITUTION OF TOXOPLASMA GONDII-SPECIFIC T-CELL RESPONSES IN AIDS PATIENTS WITH ACUTE TOXOPLASMIC ENCEPHALITIS FOLLOWING HAART: A PROSPECTIVE LONGITUDINAL STUDY. M. Lejeune1, J.M. Miro1, X. Claramonte1, E. Martinez1, E. Ribera2, J. Arrizabalaga3, J.R. Arribas4, P. Domingo5, D. Podzamczer6, M. Crespo2, M. E. Valls1, F. Garcia1, O. Sued1, E. Lazzari1, J.L. Blanco1, J.M. Gatell1 , T. Gallart1. 1Hospital Clnic-IDIBAPS. Barcelona. 2Hospital de la Vall d Hebrn. Barcelona. 3Hospital Ntra Sra De Aranzazu. San Sebastian. 4Hospital La Paz, Madrid. 5Hospital Sant Pau. Barcelona. 6Hospital de Bellvitge. Barcelona Objectives and methods. Toxoplasmic Encephalitis (TE) is one of the most important opportunistic infections in AIDS patients. There are no data about the timing of the reconstitution of the Toxoplasma gondii(Tg)-specific T-cell immune responses in AIDS patients with acute Toxoplasmic Encephalitis (TE) following HAART. To gain insight about this issue, a prospective multicenter longitudinal study was undertaken, with 26 AIDS patients with acute TE. T-cell subsets, plasma RNA HIV-1 viral load (PVL), and the lymphoproliferative response (LPR) and IFN-gamma production and production of other Th1 and Th2 cytokines to soluble antigen extract of Tg (SATg), LPR to HIV antigens were assessed at baseline (T0) and thereafter at 3 (T3), 6 (T6), 9-12 (T12), and 15-18 (T18) months after starting HAART. The LPR to mitogenic stimuli (CD3+CD28), PHA, PWM) and production of cytokines to these stimuli were also performed. All patients received TE maintenance therapy, and all of them had positive anti-Tg IgG serology. Results. The median (IQR) of CD4+ T-cell counts at T0, T3, T6, T12, and T18 was 5 (3-35), 143 (43-346), 296 (166-455), 195 (76-394), and
301 (191-369) cells/L, respectively. At the same time points: 1) the proportion of cases with plasma HIV VL < 200 copies/mL was 0%, 30%, 50%, 90%, and 83%, respectively; 2) a positive LPR to SATg occurred in 10%, 19%, 25%, 46%, and 83%, respectively; 3) the median (IQR) of INF-gamma production to SATg, an essential cytokine for the control of Tg, was 0 (0-1), 0 (0-74), 0 (0-27), 0 (0-344) and 69 (22-838) pg/mL, respectively. The restoration of a positive LPR to SATg was negatively correlated with the plasma HIV VL and positively correlated with the CD4+ T-cell count (p < 0.001). Conclusion. The results demonstrate that after 15-18 monts of HAART, T-cell responses to SATg were restored in most patients who had an acute TE episode. These data can help to better define when TE maintenance therapy can be stopped in AIDS patients responding to HAART. Posters: 0709-0719 0709. ESTUDIO DE LA RESPUESTA HUMORAL FRENTE A PNEUMOCYSTIS CARINII EN PACIENTES CON FIBROSIS QUSTICA. N. Respaldiza, M.A. Montes-Cano, J. Dapena1, I. Wichmann2, FJ. Medrano, C. de la Horra, C. Gonzlez-Becerra, E. Caldern, J.M. Varela.Servicio de Medicina Interna (UCAMI), 1Unidad de Fibrosis Qustica y 2Servicio de Inmunologa. Hospital Virgen del Roco. Sevilla Introduccin. En los ltimos aos se ha demostrado una elevada prevalencia de infeccin subclnica por Pneumocystis entre pacientes inmunocompetentes con bronquitis crnica. La frecuencia de exposicin a este patgeno en otras enfermedades pulmonares crnicas es an desconocida. Objetivo. Determinar la prevalencia y evolucin de la respuesta de anticuerpos frente a Pneumocystis en sujetos con fibrosis qustica (FQ). Pacientes y Mtodo. Se incluyeron 85 pacientes con FQ y 85 sujetos sanos del mismo rea geogrfica apareados caso a caso. Los 40 primeros pacientes fueron seguidos semestralmente durante un ao. Los sueros se analizaron mediante Western blot (WB), utilizando como antgeno un lisado total de P. carinii y como control positivo un anticuerpo monoclonal comercial (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Se consider como resultado positivo la presencia de una banda de 120 kDa. Resultados. La edad media de los pacientes con FQ fue 16.6 6,6 aos (rango, 1-35), de los cuales 37 (44%) fueron varones. El WB fue positivo en 36/85 (42%) de los pacientes con FQ y en 45/85 (53%) de los controles (p=0.15, Prueba de Chi-Cuadrado). Durante el seguimiento de 40 de los 85 pacientes con FQ la evolucin serolgica fue la siguiente: 17 continuaron siendo positivos, 6 persistentemente negativos, 16 seroconvirtieron y en un caso se objetiv una serorreversin (negativizacin del WB). Conclusiones. 1. La prevalencia de anticuerpos frente Pneumocystis en los pacientes con fibrosis qustica es similar a la encontrada en la poblacin general, lo que sugiere que en ambos grupos la frecuencia de exposicin al patgeno debe ser similar. 2. Nuestros resultados demuestran por primera vez que la respuesta serolgica frente a Pneumocystis no es permanente y que la presencia de anticuerpos especficos podra estar condicionada por exposiciones reiteradas al patgeno. (Proyecto Investigacin 11/01. Consejera de Salud - Junta de Andaluca) & (Eurocarinii Project QLK2-CT-200001369).
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0710. CHANGES IN CD4+ AND CD8+ T-CELL SUBSETS OF HIV-INFECTED CHILDREN DIFFERENTLY CORRELATES WITH VIRAL LOAD AND TCR REARRANGEMENT EXCISION CIRCLES (TRECs). S. Resino, Ph.D., Galan I, Ms.C.; A. Perez, A. Garca, J.M Belln, Ms.C, and M. Muoz-Fernndez, Ph.D, MD. Laboratorio de Inmuno-Biologa Molecular. Hospital General Universitario Gregorio Maran. Madrid Background. The changes in T-cells subsets during HIV-infection depend on a great number of immunological and virological factors, among which the HIV replication and thymic function highlight. Objectives. To investigate, in twenty vertically HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy (HAART), the relationship of peripheral blood T-cell subsets, plasma viral load (VL) and TCR rearrangement excision circles (TRECs) markers. Methods. The HIV-infected children were recruited in 1-year longitudinal retrospective study. We have analyzed the virological and immunological variations taking place (among final and basal visit) during follow-up and determined the relationship between variation of variables by linear regression. Results. The different CD4+ T-cell subsets analyzed had significative association with log10 TRECs, but not with log10 VL. Memory (CD4+CD45RO+HLA-DR+, and CD4+CD45RO+), and activated CD4+ T-cells (CD4+HLA-DR+CD38+, CD4+HLA-DR+CD38-, and CD4+HLA-DR+) had negative association with log10 TRECs. By contrast, CD4+CD45RA+CD62L+, CD4+CD45RA+, CD4+HLA-DRCD38+, and CD4+CD38+ had positive association with log10 TRECs. However, all CD8+ T-cell subsets analyzed only had significative association with log10 VL, but no with log10 TRECs. Interestingly, the association of log10 VL with the different CD8+ T-cells subsets is of opposite sign that the one for CD4+ subsets and log10 TRECs. Memory CD8+ T-cells (CD8+CD45RO+CD38+, and CD8+CD45RO+), activated CD8+ T-cells (CD8+HLA-DR+CD38+, CD8+HLA-DR+, and CD8+CD38+), and effector CD8+ T-cells (CD8+CD28- CD57+, and CD8+ CD57+) had positive correlated with log10 VL. On the other hand, naive CD8+ T-cells (CD8+CD45RA+CD62L+) had negative association with log10 VL. Conclusions. Thus, our study indicate that during HIV-infection with HAART there is not large immune activation of CD4+ Tcells that force driving the progressive decline in CD4+ T-cells. However, HIV produces changes in CD8+ T-cells subsets are therefore most likely related to increased activation and proliferation of T-cells, leading to the dilution of TRECs. 0711. RESPUESTA INMUNOLGICA EN PACIENTES QUE INTERRUMPEN EL TRATAMIENTO CON TARGA TRAS UNA PTIMA RECONSTITUCIN INMUNE Y CONTROL DE LA VIREMIA. E. Seoane, A. Perez, L. Diaz, J.M Belln, S. Moreno, J. Gonzlez, R. Rubio, M A. MuozFernandez, J.C. Lopez Bernaldo de Quiros. Laboratorio de Inmunologa, Hospital U Gregorio Maran, Madrid Objetivos. En la actualidad, es motivo de debate, las estrategias de interrupcin de tratamiento (IT) en pacientes VIH+ que han recuperado la funcin inmunolgica tras el tratamiento con terapia de alta eficacia o TARGA, nuestro objetivo es valorar el impacto clnico e inmunolgico de esta estrategia, en un estudio multicntrico, abierto y aleatorio.
Pacientes y mtodos. 52 pacientes VIH+ de 4 Hospitales de la Comunidad de Madrid. Criterios de inclusin: Linf. T CD4+ >500 cel/mm3 y CV <50 copias/ml, al menos un ao antes; nadir CD4>200 cel/mm3 y no haber tenido sida. Comparamos 41 pacientes en IT, con un grupo control con TARGA, valorando clnica e inmunolgicamente:Respuesta linfoproliferativa, por incorporacin de timidina (3H) a TT, SK, PMW, gag, P24 y PPD; estudio de la funcin tmica mediante cuantificacin de los crculos de excisin del reordenamiento del TCR (TREC) en S.P. por PCR cuantitativa a tiempo real y cuantificacin de la respuesta citotxica (CTL) especfica por ELISPOT de INF-. Resultados. No se detectaron eventos clnicos en los pacientes IT. Se produjo un descenso de los valores de linfocitos T CD4+ en el brazo IT a los inicios, que posteriormente se estabiliza en 650 CD4+/mm3 de media. Se observ una clara asociacin entre el nadir de linfocitos CD4 y valor de los linfocitos CD4 durante el seguimiento en el brazo IT. En el grupo IT se observa un descenso de los TRECs respecto a los valores iniciales y al grupo control. La carga viral aumenta en un primer momento hasta alcanzar un a meseta de 4,4 log de media. En la respuesta linfoproliferativa no se observan diferencias significativas entre ambos brazos excepto en la repuesta a proteinas virales. En los tres primeros meses se observa un aumento de la respuesta CTLs especfica a Gag en el grupo IT respecto al grupo control. Conclusin. En los primeros meses de IT se produce una disminucin del nmero de linfocitos T CD4+ y de TRECs y un incremento de la respuesta especfica al VIH. 0712. DISTRIBUCION DE LA MOLECULA HLA-G EN DIFERENTES SUPOBLACIONES DE CELULAS T CITOTOXICAS EN INDIVIDUOS HIV-1+. M.A. Cabello, M.D. Galiani, M.J. Garcia-Moreno, V.M. Molina, J.M. Lozano, J.M. Kindeln, G. Dueas, R. Solana, M. Santamara, E. Vidal, C. A. Ojeda, J. Pea. Servicio de Inmunologa y Unidad de Infecciosos. Hospital Reina Sofa. Universidad de Crdoba. El tratamiento antiretroviral de gran eficacia (TARGA), no ha conseguido resolver el estado de inmunodeficiencia de los individuos HIV-1+. Es probable que se deba a que los enfermos siguen con un estado de activacin crnica del sistema inmune y una ineficaz capacidad citotxica de sus clulas T CD8 y NK. En este trabajo nos proponemos estudiar si en individuos sanos y en individuos HIV-1+ con tratamiento y sin tratamiento se afecta la distribucin de la molcula tolerognica HLA-G en distintas subpoblaciones de linfocitos citotxicos CD8. Las clulas doble positivas CD8+HLA-G+ han sido analizadas de acuerdo con los marcadores CCR7 y CD45RA que nos permiten diferenciar las diferentes subpoblaciones de clulas T CD8 citotxicas (naive, memoria central, efectoras y memoria efectora). La expresin de HLA-G fue analizada en clulas de sangre perifrica por inmunofluorescencia indirecta en clulas CD8, CD56, CCR7 y CD45RA, usando anti-HLA-G (MEN-G/9; EXBIO, Prague) mediante citometra de flujo, con el citmetro FACSVantage SE (Becton Dickinson). Los resultados obtenidos muestran que el nmero de clulas CD8 que expresan HLA-G, en los individuos HIV-1+ estudiados y con tratamiento TARGA se distribuyen de manera muy desigual en cada uno de los compartimentos estudiados (naive 17%, memoria central 3%, efectoras 62% y memoria efectora 18%). En los controles utilizados en ningn caso aparecen clulas que expresen ms del 6% de HLAG en ninguno de los compartimentos estudiados de clulas T CD8. Se
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presentan estos datos y se discute el posible papel del extraordinario aumento de clulas pertenecientes al grupo de clulas efectoras HLA-G positivas encontradas en individuos portadores de HIV-1 en la patogenia y evolucin de la infeccin por HIV-1. 0713. TECNICA ALTERNATIVA PARA EL FENOTIPAJE DEL VIH. A Garca Segovia, S. Resino, M.J. Serrama, M.A. Muoz Fernndez. Laboratorio de Inmuno-Biologa Molecular. H.G.U. Gregorio Maran Introduccin.En el curso natural de la evolucin de la infeccin por VIH se ha observado una disminucin de TCD4 que se correlaciona con el cambio de cepas no inductoras de sincitios (NSI/R5) a inductoras (SI/X4). Tras la introduccin de las nuevas terapias antirretrovirales de alta eficacia, hemos podido observar, por primera vez una recuperacin cualitativa y cuantitativa del sistema inmune acompaada por un cambio SI a NSI. El mtodo habitual requiere el seguimiento del cultivo durante al menos 28 das y el cocultivo con la lnea celular MT-2 para la cuantificacin de Agp24 y la observacin de sincitios por microscopa. Objetivos. 1. Establecer un mtodo alternativo ms rpido y al menos de la misma eficacia para determinar el fenotipo viral por citometra de flujo; 2. Eliminar la cuantificacin de Agp24. Mtodos. Clulas MT-2 se infectaron durante 48h con VIHPNL 4.3 (MOI=1).2x106 de estas clulas infectadas fueron marcadas n 6M de 5-(6)-{[4-cholomethyl)benzoyl]amino}tetramethylrhodamine (CMTMR) en rojo y 2x106 de clulas MT-2 sin infectar con 6M 5-cholomethylfluorescein diacetate (CMFDA) en verde durante 30.Trs lavar se incubaron durante 45 con medio fresco. Como controles se utilizaron 5x105 de clulas infectadas y 5x105 clulas sin infectar por duplicado. El cocultivo se realiz por duplicado con 5x105 de clulas infectadas ms 5x105 de clulas sin infectar durante 48h. Las clulas se analizaron por citometra de flujo y el sobrenadante se guard para cuantificar Agp24. Resultados. Nuestros resultados preliminares muestran el doble marcaje de los fluorocromos en la formacin de sincitios, existiendo una correlacin entre la formacin de SI y la produccin de Agp24. Conclusiones. La citometra de flujo muestra ser una tcnica fiable y rpida para la determinacin del fenotipo SI del VIH como sustitutivo a la tcnica habitual. Adems, esta tcnica permite eliminar la cuantificacin de Agp24 en el seguimiento de pacientes infectados disminuyendo el coste. 0714. ESTRATEGIA PARA LA DETERMINACIN DE LA SECUENCIA DE INTEGRACIN DEL DNA DEL VIH EN EL DNA CELULAR. G. Fernndez Gmez-Chacn, MA. Muoz Fernndez. Laboratorio de Inmuno-Biologa Molecular. HGU Gregorio Maran Introduccin. Debido a las nuevas terapias antirretrovirales la evolucin natural de la infeccin por VIH ha cambiado drsticamente y es de gran inters conocer la relacin que existe entre en la reconstitucin del sistema inmune y el virus. Las actuales tcnicas de cuantificacin de carga viral y genotipado o fenotipado del virus no son suficientes para predecir la evolucin, sobre todo en pacientes con carga viral indetectable pero que no recuperan CD4. Es importante el poder cuantificar la carga proviral o virus integrado en el DNA celular del paciente, para poder realizar estudios de seguimientos y
conocer la verdadera importancia de la no deteccin de virus circulante. Metodologa y Resultados. La frecuencia y distribucin de la integracin del provirus en el genoma celular no se produce al azar, sino que hay unos sitios preferentes, y otros desfavorables. En el genoma celular hay unas secuencias repetidas, L1H y Alu, que actan como retrotransposones, hecho que es aprovechado por el virus para su integracin en zonas adyacentes, prximas o incluso dentro de ellas. Esto dificulta el diseo de primers para PCR que permitan detectar provirus en clulas. Un primer debe anillar en la zona LTR del virus y otro en la secuencia de DNA celular adyacente a dicha regin. Para poder disear este segundo primer se ha ideado una estrategia para detectar dicha secuencia celular. Tras 8 y 10 horas de infeccin de clulas MT2 en cultivo con virus PNL 4.3 (MOI 2), se extrae y purifica el Complejo de Preintegracin del virus (PIC). Se realiza la reaccin de integracin con dicho PIC y como sustrato, un conjunto de oligonucletidos sintticos con 30 bases aleatorias en su interior y extremos de 20 bases fijas. Por PCR se obtienen los productos de integracin, que tras su secuenciacin y determinacin de la secuencia consenso de integracin se disea el primer para la determinacin de provirus por PCR. Conclusiones. La tcnica se est utilizando en distintas cohortes de pacientes y los resultados se presentarn en el congreso. 0715. CLULAS DENDRTICAS DERIVADAS DE MONOCITOS (CD-DM) COMO ADYUVANTE CELULAR NATURAL DE UNA VACUNA TERAPUTICA ANTI-VIH ADMINISTRADA A PACIENTES. FACTIBILIDAD Y SEGURIDAD. T. Gallart, M. Lejeune, F. Garca, C. Gil, N. Climent, T. Pumarola, JM Mir, JM Gatell. Institut Clinic dInfeccions i Immunologia. Hospital Clnic de Barcelona-IDIBAPS. Barcelona. Para controlar la replicacin vrica (RV) y la consiguiente progresin hacia SIDA, la terapia antiretroviral potente (HAART) debera aplicarse de por vida, una opcin clnicamente inviable. Hay evidencias de que un control inmunitario de la RV dependiente de una ptima respuesta de clulas T CD4, capaz de sostener una respuesta de T CD8+ efectoras, as como capaz de inducir anticuerpos neutralizantes, es posible. Se considera por tanto urgente investigar si combinando HAART con una vacunacin teraputica (VacTer) capaz de inducir tales respuestas, podra conseguir un control de la RV o reducir su magnitud en ausencia de HAART. Nosotros hemos desarrollado un protocolo de VacTer, aprobado por la Agencia Espaola del Medicamento como Producto en Fase de Investigacin, que se halla en la fase final de su realizacin. Consiste en usar CD-DM obtenidas en una simple extraccin venosa de 50-60 ml, y pulsarlas con VIH autlogo, inactivado por calor y concentrado por centrifugacin, obtenido a partir de 3 plasmaferesis (600 ml/cada una) durante una parada de la HAART, inicindose de nuevo esta terapia, y cuando la viremia se controla de nuevo (<50 copias/ml), comenzar las inmunizaciones. Se han tratado a 12 pacientes que iniciaron el HAART con un nmero de T CD4 >500/microL y una viremia > 5.000 VIH RNA copias /ml. Las inyecciones de CD-DM, han sido cinco en total, siendo la primera un blanco (CD-DM no pulsadas)Se realizaron cada seis semanas, mediante inyeccin subdrmica a cuatro cm de la axila. La generacin y pulsado de las CD-DM se hace en condiciones totalmente GMP de grado clnico, implicando el uso de 1% de suero autlogo. La
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presencia de anticuerpos anti-VIH en el suero autlogo, no slo no es perjudicial sino que favorece la captura ms intensa (va Fc receptor) del VIH inactivado y la consiguiente activacin de las CD-DM. Durante las ltimas 20 hrs. de un pulsado antignico de 24 hrs., se aadi IFN-alfa farmacutico para fomentar la mejor activacin de las CDDM. El rendimiento y fenotipo de las CD-DM en la cinco ocasiones fue repetidamente similar y sin diferencias significativas respecto a las CD-DM de individuaos normales (n=27). En cada ocasin se inyectaron entre 2.3-4.5 millones de CD-DM. No hubo ningn efecto adverso, pudindose realizar ambulatoriamente, aunque por seguridad los pacientes permanecieron ingresados 20-24 hrs. Mediante marcaje con radiositpico (Indio) de las CD-DM se pudo demostrar migracin hacia los ganglios axilares. Las respuestas anti-VIH estn en fase de evaluacin as como la dinmica de la virmeia tras la parada de la HAART, al finalizar las inmunizaciones. El uso de CD-DM como adyuvante de una VacTer anti-VIH es totalmente factible, fcil de realizar y segura, pudindose practicar a partir de una simple extraccin venosa, obviando la necesidad de procedimientos agresivos y altamente delicados en cuanto a logstica, como practicar una linfoferesis masiva al inicio, como nica fuente de CD-DM. 0716. EVOLUCIN DE MARCADORES DE ACTIVACIN EN PACIENTES CON SIDA A LO LARGO DEL TRATAMIENTO ANTIRETROVIRAL. R. Garca, S. Raso, M. Fernndez-Guerrero, P. Rivas, M. de Grgolas. Departamentos de Inmunologa y Enfermedades Infecciosas. Fundacin Jimnez Daz. Madrid. Email: rgarcia@fjd.es Antecedentes y objetivos. El objetivo del presente trabajo es estudiar la evolucin de distintos marcadores de activacin en pacientes con SIDA que reciben una triple terapia sin inhibidores de proteasa vrica y valorar si alguno de ellos puede servir como marcador precoz del fracaso teraputico Materiales y mtodos. 36 pacientes con criterios de SIDA que proceden de la policlnica de infecciosas. Todos ellos reciben una medicacin antiretroviral compuesta por 3 anlogos de nuclesidos inhibidores de RT: 3TC,AZT y Abacavir. Determinaciones de CD3, CD4, CD8 y de marcadores de activacin sobre CD4 y CD8 como CD38, CD25, CD95 y HLA-DR, en un citmetro Facs Calibur. Carga viral por Roche Amplicor ultrasensible. Determinaciones basales, 1,2,4,6 y 12 meses. Resultados y conclusiones. A lo largo del tratamiento antiretroviral se produce un descenso de la carga viral de los pacientes que se acompaa de una aumento de CD4, sin que vare la proporcin de clulas de memoria o nave. Los marcadores de activacin, CD38 y HLA-DR decrecen de manera significativa en estos pacientes, mientras que CD25 no vara. As mismo hay un descenso de marcador de apoptosis (CD95)en los primeros tiempos de tratamiento. En los linfocitos CD8 tambin se conserva la proporcin de clulas vrgenes y de memoria, producindose un descenso fundamentalmente de CD38 pero no de clase II y el CD95 desciende en los primeros meses de tratamiento, para volver a elevarse despus. En el tratamiento antiretroviral, la evolucin de marcadores de activacin puede indicar la eficacia del mismo. 0717. ANTICUERPOS ANTI-TRANSGLUTAMINASA EN PACIENTES VIH+ SOMETIDOS A TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL DE ALTA ACTIVIDAD. C. Ruiz de Alegra-Puig, H. Lpez-Escribano, M. Pea, T. Carrera,
F. Ausin, L. Sainz-Rey, M. Lpez-Hoyos. Servicio de Inmunologa, H.U. Marqus de Valdecilla. Santander Introduccin. Uno de los acontecimientos ms tempranos durante la apoptosis celular es la traslocacin de los fosfolpidos de membrana. Por este mecanismo nuevos autoantgenos son presentados al sistema inmune, induciendo la produccin de autoanticuerpos (Acs) como los Acs anticardiolipina. Adems, durante la infeccin por el VIH se induce la expresin de transglutaminasa tisular, un elemento fundamental en la ruta final de la muerte celular programada, y su expresin se correlaciona con el grado de apoptosis linfocitaria. Objetivos. Estudiar la presencia de Acs anti-transglutaminasa en la infeccin por el VIH en relacin con el estadio de la enfermedad y analizar la evolucin de los ttulos durante el tratamiento con tratamiento antirretroviral de alta actividad (TARV). Mtodos. Los Acs anti-transglutaminasa en plasma se midieron mediante ELISA prospectivamente en 341 individuos infectados por el VIH, con un total de 1981 muestras y en distintos estadios de la enfermedad. El punto de corte se calcul a partir de la absorbancia media ms tres desviaciones estandar de 35 adultos sanos usados como controles. Los datos se obtuvieron como ICO (ndices de cut off) obtenidos al dividir cada absorbancia por el punto de corte. Resultados. En los pacientes con carga viral (cv) menor de 3000 copias/ml los Acs, en cuatro tomas consecutivas de unos tres meses de diferencia, aumentan ligeramente: M1=0.59, M2=0.47, M3=0.60 y M4=0.60 (p<0.001 entre M1 y M2). En los pacientes donde la cv es mayor de 3000 copias la evolucin de estos Acs es de: M1=0.75, M2=1.23, M3=0.54 y M4=0.59, (p<0.001 entre M1 y M2). Conclusiones. Los ttulos de Acs antitransglutaminasa en plasma son ms elevados en la infeccin por el VIH cuanto mayor es la cv. Adems, en esos pacientes con mayor cv, el TARV se acompaa de un descenso de los ttulos de Acs antitransglutaminasa paralelo a la supresin de la cv. 0718. DINAMICA DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS T CD4 Y CD8 EN PACIENTES VIH+ CON NIVELES INDETECTABLES DE CARGA VIRAL DURANTE EL TRATAMIENTO CON ANTIRRETROVIRALES. J. Carbone, J. Navarro, C. Rodrguez Sainz, J. Gil, ML Abad, L. Daz, C. Cant, E. Fernndez-Cruz. Servicio de Inmunologa. HGU Gregorio Maran. Madrid La induccin de una reconstitucin inmune completa en pacientes con infeccin por el VIH es una de las prioridades a conseguir tras intervencin teraputica. Objetivos. Monitorizar los cambios que se producen en el porcentaje de distintas subpoblaciones funcionales T CD4 y CD8 de pacientes VIH+ mientras mantienen niveles indetectables de carga viral VIH1 (CV) durante la terapia antirretroviral (TAR). Metodologa. Estudio prospectivo de seguimiento de 12 pacientes VIH+ (edad media: 30 aos, CV media: 23,201 copias/ml, CD4 media: 442 clulas/mm3) sin TAR previa, que tras inicio de TAR, mantienen niveles de CV por debajo de 50 copias/ml. Subpoblaciones linfocitarias: citometra de flujo de tres colores. Determinaciones en el estudio basal y luego cada 6 meses (media de seguimiento: 27 meses). Combinaciones de monoclonales (FITC/PE /PerCP): CD38/DR/CD4, DR/CD45RO/CD4, CD38/ CD45RO/CD8. Cuantificacin de CV: tcnica de RT-PCR (Amplicor Test).
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Resultados. Las cifras de linfocitos T CD4 tras tratamiento aumentaron a 672 clulas/mm3 (p=0.01). Paralelamente al aumento de clulas T CD4 y al descenso de a CV, se observ un patrn de reconstitucin inmunolgica del que destacamos: 1. aumento de clulas T CD4+CD38-DR- (niveles basales vs niveles tras tratamiento de 36 a 48%, respectivamente, p=0.04), CD8+CD45RO+CD38- (30 a 41%, p=0.009) y CD8+CD45RO-CD38- (14 a 28%, p=0.02); 2. disminucin de subpoblaciones CD4+CD38+DR+ (7 a 4%, p=0.03), CD8+HLADR+ (60 a 34%, p=0.0001), CD8+CD38+ (57 a 31%, p<0.0001), CD8+CD45RO+CD38+ (45 a 13%, p<0.0001). Mientras la CV era indetectable (media de seguimiento: 19 meses) se observ: descenso de clulas CD8+DR+ (47 a 33%, p=0.03), CD8+CD38+ (40 a 31%, p<0.05) y CD8+CD45RO+CD38+ (19 a 13%, p=0.04). Conclusiones. El descenso continuado de subpoblaciones activadas T CD8 (CD8+CD38+, CD8+HLADR+ y CD8+CD45RO+CD38+) podra ser indicativo de que estas subpoblaciones representan marcadores de replicacin viral residual cuando la CV se mantiene por debajo de niveles de deteccin en pacientes tratados con antirretrovirales. 0719. FRECUENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A PNEUMOCYSTIS CARINII EN POBLACION GENERAL DE SEVILLA. M. Montes-Cano, N. Respaldiza, M. Valero, A. Medrano2, J.M. Varela, C. de la Horra, N. Ramrez, I . Wichmann1, E. Caldern, F.J. Medrano. UCAMI-Servicio de Medicina Interna, 1Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario Virgen del Roco, 2Zona Bsica de Salud (ZBS) de Utrera Sur y ZBS Montequinto. Sevilla Introduccin. Recientes estudios epidemiolgicos han demostrado una elevada prevalencia de anticuerpos frente a P. carinii en la
poblacin infantil sevillana. Se desconoce si la respuesta serolgica es permanente. La epidemiologa de esta infeccin es escasamente conocida en la poblacin general adulta, siendo nula la informacin en el Sur de Europa. Objetivo. Determinar la prevalencia de anticuerpos frente a Pneumocystis en la poblacin adulta de Sevilla. Pacientes y Mtodo. Se incluyeron 91 sujetos seleccionados aleatoriamente de una muestra representativa de la poblacin adulta de una zona urbana de Sevilla. Se realiz un anlisis comparativo con una muestra no seleccionada de 230 nios en edad escolar de otra zona de Sevilla. Los sueros de cada sujeto se analizaron mediante Western blot (WB), utilizando como antgeno un lisado total de P. carinii y como control positivo un anticuerpo monoclonal comercial (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Resultados. La prevalencia de anticuerpos se muestra en la tabla. No se encontr asociacin entre la positividad del WB y gnero. En la poblacin adulta tampoco se observ asociacin entre la presencia de anticuerpos y los antecedentes de EPOC o tabaquismo. Grupo Adultos Nios p (chi-cuadrado) N 91 230 WB positivo, n (%) 53 (58,2%) 169 (72,5%) 0,008
Conclusiones. 1. Hemos detectado una elevada prevalencia de anticuerpos frente a Pneumocystis en nios y adultos de nuestra zona, hecho que demuestra la amplia penetracin de esta infeccin en nuestro entorno; 2). La menor prevalencia observada en la poblacin adulta sugiere que la respuesta serolgica frente a Pneumocystis no es permanente, y que la presencia de anticuerpos especficos podra estar condicionada por re-exposiciones al patgeno.
Sesion 8: Inmunologa tumoral

Comunicaciones Orales: 0801-0810 0801. LA PERDIDA DE HETEROCIGOSIDAD (LOH), ES EL MECANISMO MS FRECUENTE DE ALTERACIN DE LA EXPRESIN DE HLA EN CARCINOMAS DE COLON. I. Maleno, C. Cabrera, A. Collado1, T. Cabrera, L. Paco, A. Ferrn1 M. Lpez-Nevot, F. Garrido. Servicio de Anlisis Clnicos. 1Unidad de Ciruga Experimental. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. Spain El mecanismo ms frecuente descrito hasta el momento de prdida de expresin de molculas HLA es la prdida de heterocigosidad (prdida de un haplotipo). Nosotros hemos querido comprobar qu porcentaje de tumores de colon presentan esta alteracin. Hemos estudiado 95 tumores de colon con 7 marcadores (STRs) de la regin 6p21.3 y uno para 6q. El DNA se obtuvo mediante microdiseccin de cortes criostticos previamente estudiados con tcnicas inmunohistolgicas. Adems se realiz tipaje genmico de baja resolucin (SSOr) para intentar definir el haplotipo perdido, comparando el patrn de bandas de la mucosa normal con el tumor. Tras el anlisis de LOH de los 95 tumores de colon, encontramos que 42 (44%) de estos carcinomas tenian una perdida haplotpica (Fenotipo II) y de estos el haplotipo HLA pudo ser definido en 27 casos. Estos casos mostraban una perdida total de un alelo en al menos 3 marcadores en 6p. En los otros 15 casos se observ un descenso de entre un 25-50% en uno de los alelos en 3 marcadores; pero por Sso el patrn de bandas en locus A, B C y DR fue normal. 8 casos (8%) mostraron inestabilidad de microsatlites (MSI). La frecuencia de LOH en 6p21.3 en carcinomas de colon es similar a la descrita para carcinomas de laringe y supone en estos dos tipos de tumores de origen epitelial el mecanismo ms frecuente que condiciona alteraciones en la expresin de HLA. 0802. DETECCIN DE ANTICUERPOS NATURALES EN SUEROS HUMANOS FRENTE A CARBOHIDRATOS A10REACTIVOS ASOCIADOS A CANCER DE COLON. L. Molto1, J.I. Tudela1, S. Hernndez2, J. Garca-Asenjo2, J.L. Subiza1. 1Servicios de Inmunologa y 2Anatoma Patolgica Hospital Clnico San Carlos. Madrid La presencia de anticuerpos naturales se ha asociado a una mayor resistencia frente a crecimiento tumoral. En su mayora estos anticuerpos son de clase IgM que reconocen epitopos de naturaleza carbohidrato asociados a clulas tumorales.
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En estudios previos hemos descrito que la expresin de carbohidratos reactivos con el monoclonal A10 en cncer de colon humano es marcador de factor pronstico positivo e independiente de otros marcadores. En este estudio hemos querido valorar la presencia de anticuerpos naturales contra los carbohidratos A10-reactivos que pudieran justificar una mayor resistencia antitumoral en los enfermos con tumores A10+. Para ello se ha analizado la reactividad de sueros de donantes sanos (n=82) frente a carbohidratos reconocidos por A10, as como frente a lneas celulares y piezas quirrgicas derivadas de cncer de colon con diferente grado de expresin del epitopo A10. Resultados. 1. En la mayora de los sueros probados se detecta IgM reactiva por ELISA frente a los carbohidratos de superficie de las clulas murinas de Ehrlich, utilizadas como fuente de carbohidrato A10 reactivo. 2. Dicha reactividad se correlaciona fuertemente con la que se detecta por inmunofluorescencia en cortes de tumores xenognicos a partir de la lnea de cncer de colon humano (HT-29) A10+ . La reactividad sobre cortes de HT-29 es absorbida por los carbohidratos derivados de las clulas de Ehrlich. 3. Sueros seleccionados por su alta reactividad por ELISA son altamente positivos por inmunofluorescencia frente a cortes de cncer de colon humano A10+ (pero no frente a su tejido normal) y negativos frente a especimenes de cncer de colon que no expresan A10. Conclusin. Estos resultados demuestran la existencia de anticuerpos naturales de clase IgM en individuos sanos que reaccionan con carbohidratos asociados al epitopo A10 y que se expresan en el cncer de colon ligados a un mejor pronstico. 0803. PANCREATIC CANCER ESCAPE VARIANTS THAT EVADE IMMUNO-GENE THERAPY THROUGH LOSS OF SENSITIVITY TO IFN-INDUCED APOPTOSIS. A. Arina1 , G. Mazzolini1, I. Narvaiza1, L.A. Martinez-Cruz1,2, M. Barajas1, J.C. Galofr1, C. Qian1, J.M. Mato1,2, J. Prieto1, I. Melero1. 1Gene Therapy Unit. 2Genomic and Proteomic Unit. Dept. of Medicine. University of Navarra. School of Medicine. Pamplona. Spain Combined injections into experimental tumor nodules of adenovirus encoding IL-12 and certain chemokines are capable to induce immune-mediated complete regressions. In this study we found that the combination of two adenoviruses, one encoding IL-12 and other MIP3 (AdCMVIL-12+AdCMVMIP3a) was very successful in treating CT26 derived colon carcinomas. However, in experimental tumors generated from the pancreatic carcinoma cell line Panc02 such combined treatment induces 50% of macroscopic complete regressions, although local relapses within one week are almost constant. We derived cell lines from such relapsing tumors and found that experimental malignancies derived from their inoculum were not amenable to treatment in any case with AdCMVIL-12+AdCMVMIP-3. Importantly, relapsing cell lines were insensitive to in vitro induction of apoptosis by IFNg, in clear contrast with the original Panc02 cells. Comparative analyses by cDNA arrays of relapsing cell lines versus wild type Panc02 were performed revealing an important number of genes (383) whose expression levels were modified more than two-fold. These changes grouped in certain gene ontology categories and should harbor the mechanistic explanations of the acquired selective resistance to IFN. The total loss of the apoptosis-related gene clusterin in escaping cell variants suggests an important role for this protein.
0804. DETECTION OF BREAST CANCER CELLS IN THE PERIPHERAL BLOOD PREDICTS FOR POOR PROGNOSIS. M.J. Serrano1, A. Sirvent1, P. SnchezRovira2, M. Delgado-Rodriguez1, M. Campos1, N. de la Torre1, I. Algarra1, A. Lozano2, J.J. Gaforio1. 1Department of Health Sciences. Faculty of Experimental Sciences. University of Jan. 2Medical Oncology Department. Hospital of Jan. Spain Our study evaluates the prognostic significance of the primary detection of cytokeratin-positive (CK+) cells in the peripheral blood (PB) from breast cancer patients. We analysed the blood from 92 patients. Blood samples (10 ml) were centrifuged using a double density-gradient to recovering the mononuclear cell (MNC) and granulocyte cell (GC) fractions. Subsequently, positive immunomagnetic cell separation was performed to isolating CK+ cells (Miltenyi Biotec). The enriched cell fraction was cytocentrifuged and then immunocytochemically labelled using an anti-cytokeratin antibody. As a first step, we evaluated whether breast tumour cells sediment preferentially with MNC or GC fraction. Venous blood from healthy volunteers were spiked with varying numbers of tumour cells from three human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 or T47D). Our results showed that breast tumour cells sediment with both MNC and GC fractions. We therefore recommend examination of both fractions in all enrichment protocols. CK+ cells in PB were identified in 57 of 92 (62%) patients when MNC and GC fractions were assessed (range of 1 to 61 cells, median 8). No CK+ cells were detected in blood samples of 16 healthy donors. There were significant differences in the presence of CK+ cells according to estrogen receptor expression (p = 0.049), and lymph node status (p = 0.033), but not to the presence of metastases, age, menopausal status, type of patient (neoadjuvant, adjuvant or metastatic), TNM stage, histological type, progesterone receptor expression, c-erbB2 expression, p53 expression, or Ki67 expression. Regarding the relationship between tumour size (T) and the presence of CK+ cells, a borderline significant trend was observed (p = 0.07). The median follow-up of the patients was 21 months and statistical analysis (Kaplan-Meier analysis) revealed that using the method we present, the primary detection of CK+ cells in PB might identify breast cancer patients with poor prognosis. 0805. SECRECION DE FasL y APO2L/TRAIL BIOACTIVOS EN LA SUPERFICIE DE MICROVESCULAS EN EL MELONA HUMANO MelJuSo. M.J. Martnez-Lorenzo1, A. Anel2, M.A. Alava2, C. Diestre1, B. Saez1, MC. Visus1, P. Lasierra1, L. Larrad1. Servicio de Inmunologa. Hospital Clnico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza, E-50009 2Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular, Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza. Zaragoza, E50009. linm@hcu-lblesa.es Las clulas tumorales han desarrollado mecanismos para evadir el control del sistema inmune. Diversos tumores malignos son resistentes a la apoptosis a traves de receptores de muerte y expresin de ligandos como FasL y APO2L/TRAIL. En el caso del melanoma, la expresin de FasL parece correlacionarse con la agresividad del tumor y el mal pronstico. La expresin de FasL ha sido propuesto como un ataque (counterattack) contra el efecto antitumoral de las clulas del sistema inmu-
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ne, aunque algunos autores han indicado que FasL no se expresa en la superficie de esos tumores, como es el caso de las clulas de melanoma. Sin embargo otros factores podran estar implicados, tales como el balance entre forma unida a membrana y forma soluble o la secrecin de ligandos de muerte en la superficie de microvesculas (Martnez-Lorenzo et al. J. Immunol., 1999). Este estudio ha observado la expresin de FasL y APO2L/TRAIL preformado en clulas de melanoma y su secrecin asociado a microvesculas tras activacin del melanoma con PHA o MSH (hormona estimuladora de melanocitos). Se ha comprobado la toxicidad de estas microvesculas contra blastos de linfocitos T humanos. Dichas microvesculas han sido caracterizadas por microscopa electrnica y citometra de flujo. Adems, hemos estudiado por microscopa confocal que el compartimento citoplasmtico donde se encuentran FasL y APO2L/TRAIL es de tipo lisosomal con estructura multivesicular. Finalmente hemos caracterizado que la secrecin de FasL y APO2L/TRAIL de las clulas de melanoma depende de los filamentos de actina y microtbulos. Por tanto, podemos concluir que las clulas del melanoma MelJuSo muestran un mecanismo muy eficaz para el rpido contra-ataque de las clulas activadas del sistema inmune. 0806. RESISTENCIA ESPECIFICA A TERAPIA CON ANTICD20 EN UN PACIENTE CON LINFOMA FOLICULAR. R. Mndez, T. Rodrguez, M. Almagro, G. Salas, M.R. Marin, S. Pedrinacci, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello. Servicio de Anlisis Clnicos. Hospital Universitario Virgen de las Nieves Granada Rituximab es un anticuerpo quimrico que reconoce el antgeno CD20 humano y que se utiliza en el tratamiento de pacientes con linfomas de origen B. El mecanismo por el cual este anticuerpo elimina las clulas tumorales no se conoce exhaustivamente, aunque tanto la activacin del complemento, la actividad ADCC y efectos apoptticos directos han sido propuestos. Probablemente sea la suma de todos estos mecanismos los que producen una rpida e intensa deplecin de clulas B en sangre perifrica de los pacientes. Presentamos un caso de resistencia especfica a esta inmunoterapia entre 15 pacientes que actualmente se encuentran recibiendo este tratamiento. Los linfocitos B del paciente dejaron de expresar aparentemente CD20, pese a la persistencia de clulas CD19/CD10+ en la sangre perifrica. La desaparicin de este antgeno de la membrana puede interpretarse por un fenmeno de cross-reactividad del eptopo reconocido por los anticuerpos, si bien esta poblacin negativa persisti durante algunos meses despus de la retirada del Rituximab. Parece por tanto poco probable, que ste fuera el mecanismo de resistencia, dado el tiempo transcurrido desde la retirada del anticuerpo y la persistencia de clulas CD20- en la sangre perifrica del paciente. Se descart tambin un proceso de inmunoseleccin, dado que esta prdida fue reversible y las clulas leucmicas recuperaron el fenotipo normal. Finalmente nosotros creemos que el mecanismo de resistencia fue la modulacin reversible del antgeno CD20 en la membrana de las clulas B del paciente y no a alteraciones en los mecanismos de citotoxicidad y de ADCC. De hecho el paciente recibi tratamiento posterior con anti-CD52(CAMPATH-1), mostrando una rpida cada de los linfocitos perifricos tanto T como B. 0807. CLULAS PLASMTICAS NORMALES Y TUMORALES EN LA GAMMAPATA MONOCLONAL DE SIGNIFICADO INCIERTO: CAMBIOS EN LA
EXPRESIN DE MOLCULAS DE ADHESIN (CD106 Y CD29 ACTIVADO) Y DE APOPTOSIS (CD95 y Bcl-2), CON NDICE PROLIFERATIVO MANTENIDO (Ki-67 Y BrdU) COMO POSIBLE MECANISMO PATOGNICO. J.A. Garca-Trujillo, N. Villarrubia, L. Snchez, R. Luque, A. Bootello, E. Roldn. Servicio de Inmunologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid La gammapata monoclonal de significado incierto (MGUS) se caracteriza por la presencia de una protena monoclonal srica 3g/dL, normalmente con ausencia de cadenas ligeras en orina, lesiones seas lticas o hipercalcemia, caractersticas stas que definen al mieloma mltiple (MM). En el MGUS se observa la coexistencia de clulas plasmticas (CP) normales (habitualmente ms de un 20% de las CP totales) y tumorales, habitualmente con perfiles antignicos y caractersticas de tamao y granularidad diferentes y fcilmente detectables en los estudios de citometra de flujo. El objetivo de este trabajo ha sido comparar la expresin de diferentes molculas, relacionadas con adhesin, apoptosis y proliferacin, entre ambas poblaciones. Mtodos. Estudio en mdula sea (MO) completa mediante triple marcaje con anticuerpos monoclonales (AcMo) conjugados con diversos fluorocromos. El estudio de la expresin de Bcl-2 y Ki-67 se realiz previa permeabilizacin celular. Para la deteccin de CP BrdU+ las clulas fueron incubadas durante 18 horas en presencia de 60 M BrdU, permeabilizadas e incubadas con un AcMo anti-BrdU-FITC. Resultados. En el MGUS, las CP tumorales expresaron cantidades menores de las molculas de adhesin (CD106 y CD29 activado) que las CP normales. Las CP tumorales en el MGUS muestran una expresin significativamente inferior de CD95 con respecto a las CP normales en estos enfermos; por el contrario, los niveles de Bcl-2 aumentan. La capacidad proliferativa de ambas poblaciones, cuantificada como clulas Ki-67+, o como clulas capaces de incorporar en cultivo BrdU, fue similar. Todos estos datos sugieren que el proceso de malignizacin que conduce a la aparicin de una poblacin monoclonal de CP en MO en pacientes con MGUS se caracteriza por la prdida parcial de anclaje a diferentes protenas de matriz extracelular, as como por la aparicin de un fenotipo compatible con una mayor resistencia a la apoptosis, todo ello sin cambios significativos en la capacidad proliferativa. 0808. MEJORA DE LA EFICACIA ANTITUMORAL DE LA INYECCIN INTRATUMORAL DE CLULAS DENDRTICAS TRANSFECTADAS CON EL GEN DE LA INTERLEUQUINA-12 MEDIANTE LA COMBINACIN CON ANTICUERPOS ANTI-CD137 Y CON ALOANTGENOS. I. Tirapu, A. Arina, I. Gabari, G. Mazzolini, M. Duarte, M. Rodrigo-Garzn, C. Alfaro, E. Feijo, C. Qian, L. Chen1, J. Prieto e I. Melero. Unidad de Terapia Gnica. Centro de Investigacin Mdica Aplicada (CIMA). Universidad de Navarra. Pamplona. 1Department of Immunology. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota (USA) La inyeccin intratumoral de clulas dendrticas modificadas genticamente para producir Interleuquina-12 (IL-12) se ha visto que es capaz de promover una respuesta inmunitaria que erradica tumores subcutneos en varios modelos de cncer en ratn.
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En este estudio se ha tratado de buscar nuevas estrategias que puedan conducir a una mayor eficacia antitumoral. Para ello, las terapias han sido ensayadas en tumores subcutneos derivados de CT26 y MC38, dos lneas de carcinoma de colon de ratn. Estos tumores fueron establecidos unilateral o bilateralmente en ratones singnicos BALB/c y C57BL/6 segn el caso. Las clulas dendrticas (DC) fueron cultivadas a partir de precursores de mdula sea durante 7 das y se transfectaron con un adenovirus recombinante defectivo que porta el gen de la IL-12 de ratn. Estas DC transfectadas fueron inyectadas intratumoralmente y se midi el tamao de los tumores tras el tratamiento. Se estudi la migracin de las DC tras la inyeccin mediante el uso de DC obtenidas a partir de ratones transgnicos EGFP. La magnitud de la respuesta antitumoral fue determinada mediante la cuantificacin por ELISPOT del nmero de linfocitos productores de Interferon-gamma (IFN-gamma). Los experimentos realizados han mostrado que se aumenta la eficacia antitumoral frente al tumor tratado y frente a un tumor lejano cuando se efecta ms de una inyeccin intratumoral de DCIL-12. Se han empleado tambin DC semialognicas, que difieren en un haplotipo de MHC (H-2) con el portador del tumor, y que han demostrado generar una respuesta antitumoral ligeramente ms eficaz que las DC autlogas. La combinacin de la inyeccin intratumoral de DC-IL-12 con la administracin sistmica de un anticuerpo monoclonal anti-CD137 (anti-4-1BB) resulta en un efecto sinrgico que se relaciona con un aumento en el nmero de linfocitos productores de IFN-gamma. La inyeccin repetida de DC-IL-12 semialognicas combinada con anticuerpos anti-CD137 es capaz incluso de erradicar, en algunos casos, tumores bilaterales establecidos durante dos semanas. Estos resultados muestran que la repeticin de dosis, el origen semialognico y la combinacin con anticuerpos anti-CD137 aumentan la eficacia antitumoral de las DC-IL-12 inyectadas intratumoralmente. Estas estrategias son capaces de mejorar la eficacia de un tratamiento antitumoral que ya est siendo probado en un ensayo clnico de fase I. 0809. ANLISIS DE LA SUSCEPTIBILIDAD A CLULAS NK DE UN SUBCLN DE LA LNEA CELULAR K662 RfII (CD32) NEGATIVO. S. Mart, R. Verd, P. GarcaPearrubia1, G. Rubio. Divisin de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Miguel Hernndez, 03550 Sant Joan. Alacant. 1Departamento de Bioqumica. Biologa Molecular B e Inmunologa. Universidad de Murcia Previamente se ha obtenido, mediante sucesivos sortings y clonaje por dilucin lmite, un subcln de K562 que carece de RFcII (CD32). El objetivo es utilizar este subcln, denominado K562.S5, en ensayos de conjugacin y citotoxicidad con clulas NK pretratadas con o en presencia de mAb y sin interferencia de receptor alguno para Fc de inmunoglobulinas. Previamente se ha analizado su capacidad de conjugacin y sensibilidad a la lisis frente a clulas NK y se ha comparado con la lnea parental. Para ello, se han llevado a cabo ensayos de conjugacin a la lnea NK NKL (Robertson), que por su parte tambin expresa niveles bajos/indetectables de RFc, tras marcaje con Ca-AM (NKL) e hidroetidina (las K562) por citometra de flujo. Para los ensayos de citotoxicidad se ha empleando el marcador no radiactivo DioC18 (Molecular Probes) e igualmente anlisis por citometra, utilizando como efectoras clulas NKL y NK de PBMC.
En ensayos de citotoxicidad se ha observado que el subcln S5 es ms sensible a NK de PBMC que las K562 wt y que el subcln S9 (revertiente de expresin baja/moderada de CD32): %citotoxicidad especfica respectiva a R 25:1: 43, 53, 68. Lo que es ms importante, el pretratamiento de las clulas efectoras con el mAb W6/32 no modifica las cifras de lisis obtenidas. El anlisis de las isotermas resultantes de los ensayos de conjugacin a NKL demuestran igualmente que la presencia del anticuerpo monoclonal no modifica significativamente los parmetros max y AUI del subclon S5 (Wilcoxon RS test), al contrario que en las clulas parentales, donde aumentan ms del 30%. Por tanto, el subclon S5 aparenta ser una diana adecuada para ensayos de actividad NK en los que estn involucrados anticuerpos. 0810. BAJA EXPRESIN COORDINADA DE LOS COMPONENTES DE LA MAQUINARIA DE PROCESAMIENTO ANTIGNICO (APM) EN VARIANTES METASTSICAS DEFICIENTES EN MHC DE CLASE I INMUNOSELECCIONADAS POR LINFOCITOS T. M.S. Martnez1, E. Jimnez1, A.GarcaLora1, I.Algarra2, F.Garrido1. 1Servicio de Anlisis Clnicos e Inmunologa. H.U. Virgen de las Nieves. Granada. 2Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad de Jan. Jan En estudios anteriores con el modelo tumoral murino GR9 mostramos que el fenotipo MHC de clase I en las variantes metastsicas depende del estado inmune del huesped: MHC de clase I negativo en ratones BALB/c inmunocompetentes y MHC de clase I positivo en ratones nude inmunodeficientes (nu/nu). Estos resultados muestran que en este modelo tumoral un factor que contribuye a la aparicin de variantes metastsicas MHC de clase I negativas es la inmunoseleccin por clulas T. Con el objetivo de investigar los mecanismos moleculares implicados en el origen de estas variantes metastsicas MHC de clase I negativas en este modelo de fibrosarcoma, analizamos mediante RT-PCR la expresin nivel trascripcional de las molculas H-2 de clase I, 2microglobulina y de los diferentes componentes de la maquinaria de procesamiento antignico (APM) del MHC de clase I. Los ensayos de estabilizacin a 26C en presencia de 2-microglobulina exgena y su posterior anlisis por citometra de flujo mostraron que se recuperaba parcialmente la expresin en superficie de las molculas H-2 de clase I. Anlisis por RT-PCR revel transcripcin normal de molculas de H-2 de clase I y de 2-microglobulina. Los anlisis por RT-PCR semicuantitativa de los diferentes componentes del APM mostraron una baja expresin de las molculas TAP-1, TAP-2, LMP-2, LMP-7, LMP-10, tapasina y calnexina, tanto en el clon B9 como en los ndulos metastsicos derivados de ratones BALB/c inmunocompetentes. Sin embargo, esto no ocurri en las metstasis derivadas de ratones nu/nu, en los que la expresin de estos componentes era normal. Cuando las lneas celulares metastsicas derivadas de ratones inmunocompetentes fueron tratadas con IFN- se recuperaban la expresin de todos estos componentes del APM. En conclusin, estos resultados muestran que la ausencia de molculas H-2 de clase I en superfice en variantes metastsicas derivadas de ratones imnunocompetentes BALB/c, se debe a una falta de expresin coordinada en mltiples componentes de APM.
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Posters: 0811-0823 0811. AUSENCIA DE MUTACIONES EN -2 MICROGLOBULINA Y BAJOS NIVELES TRANSCRIPCIONALES DE -2 MICROGLOBULINA Y CADENA PESADA DE HLA CLASE I EN CARCINOMAS DE VEJIGA CON PRDIDA TOTAL DE EXPRESIN DE MOLCULAS HLA CLASE I. P. Jimnez1, J.M. Romero1, T. Cabrera1, J.M. Cozar1, M. Tallada1, R. Mndez1, R. Marn1, C. Santa Olalla1, F. Ruiz-Cabello1, F. Garrido1. 1Serv. Anlisis Clnicos, 1Serv. de Urologa. H.U. Virgen de las Nieves, Granada. La baja expresin de molculas HLA clase I en tumores humanos es un hecho frecuente, hecho que se ha relacionado con un modo de evasin de las clulas tumorales frente al sistema inmune. En relacin con esto, hemos estudiado el mecanismo por el cual once carcinomas de vejiga, clasificados por inmunohistoqumica como carentes de expresin de molculas HLA de clase I, pierden sta expresin. La prdida total de expresin de molculas HLA de clase I puede deberse a mutaciones en el gen de la 2-microglobulina (2-m); de hecho, este es el mecanismo observado previamente en nuestro laboratorio en carcinomas colorrectales con inestabilidad de microsatlites. Sin embargo, en tumores de vejiga, tras realizar microdiseccin de los nidos tumorales y la secuenciacin del cDNA obtenido, no se detectaron mutaciones en el gen de la 2-m. Adems, estos tumores no mostraban inestabilidad de microsatlites. El siguiente paso fue analizar los niveles de expresin de 2m y cadena pesada mediante PCR cuantitativa a tiempo real, usando el termociclador Light Cycler. Para determinar si exista un bajo nivel transcripcional de estos genes, comparamos la expresin con otros once carcinomas de vejiga en los cuales la expresin de molculas de HLA no estaba alterada. El anlisis estadstico de los datos se realiz con el test de Smirnoff-Kolmogorov, que arroj diferencias significativas en la transcripcin, tanto para 2-m ((p=0.0001) como para cadena pesada (p=0.002). Los resultados obtenidos abogan por un mecanismo general regulador de la transcripcin como principal causa de la prdida total de expresin de molculas HLA de clase I en carcinomas de vejiga. 0812. EL RECEPTOR SOLUBLE DE LA TRANSFERRINA Y LA EXPRESIN DE CXCR3 COMO FACTORES DE PROGRESIN EN LEUCEMIA LINFATICA CRONICA B. E.Ocaa, J.A. Brieva, J.Muoz1. Servicio de Inmunologa, 1Servicio de Hematologa. H.U. Puerta del Mar. Cdiz La leucemia linfoide crnica B (LLCB) es un sndrome linfoproliferativo crnico muy heterogneo en su comportamiento, habindose descrito diversos factores para predecir la evolucin de la enfermedad y decidir la inclusin de los mismos en diversos protocolos teraputicos. Est plenamente aceptado que el patrn difuso medular y el tiempo de duplicacin inferior a 12 meses son factores pronsticos adversos. Estudiamos 21 pacientes diagnosticados de LLCB seguidos por nosotros, analizando diversos parmetros a fin de evaluar su influencia en la progresin de la enfermedad. Pacientes y mtodos. Se incluyeron 21 pacientes (10 mujeres y 11 hombres) con edad media de 72 aos (intervalo 50-91), diagnosticados de LLCB en nuestro servicio con una media de seguimiento
de 78 meses. Los parmetros analizados han sido hematolgicos ( hematometra), bioqumicos ( metabolismos del hierro, -2-microglobulina, CD23s, IL-6, TNF y EPO) y citomtricos ( expresin de CXCR3 e intensidad media de fluorescencia -IMF- de CD5 sobre clulas tumorales CD19CD5 ). Resultados. 16 pacientes fueron asignados al grupo A de Binet, de los cuales 2 recibieron tratamiento ya que mostraron progresin de la enfermedad, y 5 pacientes fueron incluidos inicialmente en el grupo C de Binet recibiendo diferentes tratamientos citostticos. De los parmetros analizados mostraron significacin estadstica entre los dos estadios los leucocitos ( 24387/L vs 55562/L, p < 0.047), TNF (24.3 pg/ml vs 68.7 pg/ml, p<0.002), y el receptor soluble de la transferrina ( 4.07 mg/l vs 7.89 mg/l, p< 0.009). Los niveles de EPO, IL-6 y CD23s no mostraron diferencia significativa. De los datos inmunolgicos destacan la menor positividad (p<0.0001) de las clulas a CXCR3 en los estadios C (49%) frente a los estadios A (84%). Se observa un descenso de la positividad de CD5 cuando el paciente se encuentra refractario a los tratamientos convencionales. Hay una buena correlacin, entre los estadios de Binet, entre el receptor soluble de la transferrina y la positividad al CXCR3. Conclusiones. Aunque la serie es pequea en su nmero parece que los niveles del receptor soluble de la transferrina y la positividad de CXCR3, son parmetros adecuados para valorar el estadio de la LLCB y en nuestra serie ha sido ms definitoria que otros parmetros habituales; no obstante, el aumento del nmero de pacientes incluidos en los estudios aportar datos ms concluyentes en este sentido. 0813. DIFERENTES PATRONES DE CRECIMIENTO E INMUNOGENICIDAD EN VARIANTES METASTSICAS INMUNOSELECCIONADAS O NO POR LINFOCITOS T. M.S. Martnez1, E. Jimnez1, A. Garca-Lora1, I. Algarra2 , F. Garrido1. 1Servicio de Anlisis Clnicos e Inmunologa. H.U.Virgen de las Nieves. Granada. 2Departamento de Ciencias de la Salud.Unversidad de Jan. Jan Nuestros resultados previos en el sistema tumoral murino B9 mostraron que metstasis obtenidas en ratones BALB/c inmunocompetentes mediante inyeccin del clon B9, presentaban un fenotipo H-2 de clase I negativo. Sin embargo, las metstasis obtenidas de ratones BALB/c (nu/nu), con el mismo clon B9, presentaban un fenotipo H-2 de clase I positivo para las molculas Kd, Dd, Ld . Estos resultados muestran que en este modelo tumoral la aparicin de variantes tumorales con distinto fenotipo MHC de clase I depende del estado inmune del husped. Para determinar el comportamiento biolgico de estas metastasis realizamos estudios de crecimiento tumoral local e inmunogenicidad. Inyectamos diferentes lneas metastsicas a nivel subcutneo en la pata, tanto en ratones inmunocompetentes BALB/c como en ratones inmunodeficientes (nu/nu) BALB/c . Los resultados mostraron diferentes patrones de crecimiento local y de inmunogenicidad. Las variantes metastsicas H-2 de clase I positivas derivadas de ratones (nu/nu) crecieron de forma ms lenta, alcanzando un mximo de 5 mm de dimetro despus de 15 das, para posteriormente regresar, siendo rechazadas totalmente a los 25 das. Las clulas H-2 de clase I negativas pertenecientes a variantes metastsicas derivadas de ratones inmunocompetentes crecieron ms rpidamente, alcanzando 14 mm de dimetro en 25 das, y estos tumores no regresaron. Cuando las metastasis H-2 de clase I positivas fue-
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ron inyectadas en ratones nude, estos tumores presentaron crecimiento local y no fueron finalmente rechazados. En conclusin, estos resultados indican que las variantes metastsicas H-2 de clase I positivas son ms inmunognicas que las variantes H-2 de clase I negativas en ratones inmunocompetentes, perdiendo esta inmunogenicidad en ratones nude. 0814. DOS CASOS DE SNDROME HIPEREOSINOFLICO ASOCIADO A CLONOS ANMALOS DE CLULAS T. N. Olivares, P. Echniz, M.D. de Juan, R. Sez, E. Cuadrado. Servicio de Inmunologa. Hospital Donostia. San Sebastin. Guipzcoa Mujer de 64 aos diagnosticada de micosis fungoide hace 12 aos que muestra en sangre perifrica un 7% de linfocitos T anormales (CD3-/CD7-/CD4+/CD2+/CD5+) y un 23% de eosinfilos. Varn de 79 aos con hipereosinofilia (>1,5x 103/mm3) y urticaria generalizada que remite con antihistamnicos. Asmismo, presenta lesiones cutneas en rodilla y adenopata supraclavicular que muestra infiltracin por linfocitos T anmalos con caractersticas de linfoma T indolente. En la sangre perifrica se aprecia un 35% de clulas T anormales (CD3+/CD4-/CD8-/CD2+/ CD5+ /CD57+) demostrndose reordenamiento clonal del TCR. Ambos casos son demostrativos de la asociacin de hipereosinofilia, lesiones cutneas y proliferacin anormal de clulas T que coinciden en el curso clnico de estos pacientes. Las razones que llevan a esta asociacin son discutidas. 0815. CARACTERIZACION DE EXPANSIONES DE PROGENITORES- B POLICLONALES EN MEDULA OSEA. T. Rodrguez Ruiz, R. Mndez Vales, A.R. Lopez Quiones, J. Canton, F. Garrido, Ruiz-Cabello. Servicio de Anlisis Clnicos. Hospital Universitario Virgen de las Nieves Granada La aparicin de expansiones no malignas de progenitores B son frecuentemente observadas en la mdula sea de nios. La caracterizacin inmunofenotpica de estas expansiones es importante dada la similitud morfolgica e inmunolgica con los linfoblastos de leucemia pre-B y por tanto es fundamental distinguir estas clulas de una posible recada leucmica. Hemos encontrado que estas expansiones pueden ser detectadas en una variedad de situaciones clnicas e incluso en la mdula de adultos. Se ha procedido a caracterizar estas clulas mediante inmunofenotipo y anlisis de la regin HV-FR3 de los genes de la Ig mediante PCR para descartar la naturaleza no monoclonal de la expansin. Hemos realizado un anlisis multiparamtrico utilizando los marcadores CD34, CD10, CD19, CD20, CD22, anti kappa y anti lambda. Las caractersticas ms importantes de estos precursores normales de clulas B (hematogonas) desde un punto de vista inmunofenotpico se encuentran en la gradual expresin observada para algunos antgenos como CD20, CD10 y CD22 que revelan la expresin normal de precursores de clulas B y la inexistencia de stop madurativo. CD34 se encuentra presente en un nmero reducido de clulas, as como la expresin de IgS, las cuales muestran siempre un patrn no monoclonal. Otra caracterstica importante es la ausencia de aberraciones en la expresin de antgenos as como localizacin estrictamente medular de estas poblaciones linfocitarias. Estas expansiones celulares no leucmicas, constituyeron en algunos casos las clulas predominantes en la poblacin linfomono-
nuclear de la mdula sea de los pacientes y fueron observadas en dos pacientes adultos con leucemia aguda mieloblstica despus de la quimioterapia, en un paciente en el contexto de una infeccin por citomegalovirus y en dos pacientes con graves alteraciones neuropeditricas de origen desconocido. 0816. OBTENCIN Y CARACTERIZACIN DE UN SUBCLON DE LA LNEA CELULAR K562 RFcII (CD32) NEGATIVO. S. Mart, R. Verd, G. Rubio. Divisin de Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad Miguel Hernndez. 03550 Sant Joan. Alacant La lnea eritroleucmica K562 es la diana de eleccin en ensayos estndar de citotoxicidad mediada por clulas NK. Entre sus caractersticas fenotpicas est la expresin de CD32 como nico receptor para Fc de inmunoglobulinas. La expresin de este RFcII puede interferir en ensayos en los que las clulas NK efectoras estn tratadas con mAb completos o incluso fragmentos F(ab`)2 tericamente purificados. Para obviar estas interferencias, se ha descrito el empleo de aclarubicina, que disminuye transitoriamente la expresin de CD32, aunque su alta toxicidad hace prcticamente inviable su utilizacin. En este trabajo se ha pretendido obtener un subcln de K562 que de manera constitutiva y estable carezca de CD32. Para ello, se han llevado a cabo ciclos de sortings sucesivos de clulas K562 wt con baja expresin de CD32 por Citometra de flujo. Esto es posible ya que al marcar K562 con mAb anti CD32, se observa que esta molcula se expresa con intensidad moderada, con un solapamiento parcial (<2%) con el control isotpico. Finalmente se ha procedido al clonaje por dilucin lmite de varias poblaciones de baja expresin. Esto ha permitido obtener mltiples clones CD32 - que se han caracterizado fenotpica y funcionalmente. Tras ser crecidos a largo plazo, se ha observado la reversin a un fenotipo CD32+ de muy baja expresin (50% IF del wt) en todos excepto en el subcln nombrado como K562.S5. El clon S5 no se marca con los mAb anti CD32 2E1, que reconoce todas sus isoformas, ni FLI8.26. El anlisis de la expresin de otras molculas de membrana muestra que S5 expresa niveles similares de molculas de adhesin implicadas en interacciones con clulas NK, aunque ha perdido, de manera aparentemente irreversible, la expresin de CD45. Esto ltimo se observa tambin en subclones revertientes CD32+. 0817. VARIACIONES EN EL NIVEL DE TRANSCRIPCIN DE HLA-E Y EN LA DISPONIBILIDAD DE BETA2-MICROGLOBULINA PUEDEN DETERMINAR LAS DIFERENCIAS EN LA EXPRESION DE HLA-E EN SUPERFICIE EN EL SISTEMA TUMORAL FM55M1/R22.2. R. Marn Iglesias, F. Ruiz-Cabello, J.M. Romero Noguera, P. Jimenez, S. Pedrinaci, F. Garrido. Hospital Virgen de la Nieves, Anlisis Clnicos. Granada HLA-E se expresa en una amplia variedad de clulas de distinta estirpe histolgica. Sin embargo, la mayora de las veces esta expresin no puede ser detectada en superficie celular. Hemos descrito recientemente que entre otros factores que parecen influir en la baja expresin de HLA-E en la superficie celular estara la disponibilidad de beta2microglobulina y portanto la competicin con las cadenas HLA-ABC clsicas. Hemos observado en el sistema tumoral FM55M1/R22.2 una variacin en los niveles de expre-
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sin en superficie de HLA-E, siendo esta mayor en R22.2, la cual se caracteriza por presentar una delecin que abarca toda la regin 6p, adems de un descenso de la expresin de HLA-B y que lleva a esta lnea a expresar un slo alelo HLA-A. La menor disponibilidad de pptidos procedentes de las cadenas clsicas no es factor crtico para impedir la expresin en superficie de HLA-E en R22.2. Adems,paradjicamente la lnea original FM55 es heterocigota en el residuo 107 que determina el polimorfismo G/R y R22.2 conserva el alelo R de HLA-E que se ha descrito que es menos estable y alcanza con ms dificultad la superficie celular. Hemos querido conocer las causas que justifican la mayor expresin de HLA-E en R22.2 que en FM55. Para ello se determinaron los niveles de mRNA de HLA-E. Se realiz una PCR cuantitativa refiriendo los niveles de expresin frente a GPDH y se determin la expresin comparativa frente a beta2m y cadena pesada HLA-ABC. Nuestros resultados revelaron que mientras el nivel de expresin de los genes de HLA-ABC fue inferior en R22.2, el de HLA-E y beta2m mostraron ser mayores en esta lnea. Estos resultados sugieren que tanto la mayor disponibilidad de beta2m como el mayor nivel de transcripcin de HLA-E encontrado en R22.2 pueden justificar el incremento de expresin en superficie en esta lnea celular. 0818. DIFERENCIAS CUANTITATIVAS EN LOS NIVELES DE EXPRESION DE MOLECULAS HLA DE CLASE I EN LINEAS DE MELANOMA. T. Rodrguez, R. Mendez, R. Marn, L. Paco, J.M. Noguera, F. Ruiz-Cabello, F. Garrido. Servicio de Analisis Clnicos. Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada La alteracin en la expresin de molculas de HLA de clase I es un importante mecanismo de escape de las clulas tumorales al sistema inmune. Aunque la expresin global de antgenos HLA se ha estudiado tanto en lneas tumorales como en tejidos , no existen muchos datos acerca de diferencias cuantitativas en los niveles de expresin de estas molculas en la superficie celular. Es conocido que estos niveles de expresin varan en funcin del tejido histolgico y por este motivo hemos procedido a un anlisis cuantitativo en lneas procedentes de melanomas humanos En este estudio la expresin de las molculas HLA de clase I se ha medido en 31 lneas de melanoma mediante citometra de flujo utilizando un panel de AM monomrficos, locus y alelo especifcos. Aunque gran parte de las lneas presentaron positividad para estos anticuerpos, al comparar el valor del canal medio de fluorescencia para cada anticuerpo se evidenci una notable heterogenidad en la expresin de estas molculas en las lneas estudiadas. Del total de lneas estudiadas, slo una present perdida total de HLA de clase I, mientras que para el resto de las lneas se poda establecer una gradacin en cuanto al nivel de expresin. Se han agrupado las lneas de melanoma en tres grupos de acuerdo con el canal de fluorescencia: de expresin baja (:6-100); de expresin intermedia (101 a 1000); y de alta expresin con valores superiores a 1000. Tambin se han comparado, lneas de alta expresin con aquellas de baja expresin mediante RT-PCR cuantitativa para los genes HLA, y se ha podido constatar un descenso significativo en los niveles de expresin de mRNA especfico para los genes HLA-ABC. Estos resultados ponen de manifiesto diferencias significativas en la expresin total de los antgenos HLA de clase I en una misma estirpe celular neoplsica.
La ausencia completa de estos antgenos, afecta al reconocimiento de CTLs y ha sido demostrado la relevancia que este tipo de alteraciones tienen en los pacientes sometidos a inmunoterapia con pptidos. Por el contrario, no se conocen las implicaciones que estos cambios cuantitativos pudieran tener en relacin a la susceptibilidad NK, que depende del balance de seales positivas y negativas. Es posible que las diferencias cuantitativas encontradas por nosostros en lneas de melanoma obedezcan a alteraciones en mecanismos de regulacin gnica no bien conocidos (todas las lneas con baja expresin excepto una, fueron inducibles por IFN-_) y que han podido seleccionarse durante el desarrollo tumoral. 0819. DOS ALTERACIONES INDEPENDIENTES EN EL GEN DE LA 2M GENERAN PRDIDA TOTAL DE EXPRESIN DE MOLCULAS HLA DE CLASE I. R. Mndez, T. Rodrguez, A. Paschen1, P. Jimnez, J.M. Noguera, D. Schadendorf, F. Ruiz-Cabello, F. Garrido. Servicio de Anlisis Clnicos Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada. 1Skin Cancer Unit German Cancer Research Center. University Hospital of Mannheim. Mannheim. Germany Las alteraciones en la expresin de molculas HLA de clase I han sido descritas como una estrategia de los tumores para la evasin del reconocimiento por mecanismos efectores tales como las clulas T citotxicas. En este paciente con melanoma metastsico, fue detectada una prdida total de la expresin de molculas HLA de clase I en dos lnea celulares derivadas del mismo. La primera lnea celular fue generada de un ndulo regional linftico, diagnosticada conjuntamente con el tumor primario. La segunda fue establecida 8 meses ms tarde de una muestra de efusin pleural, poco antes de morir el paciente. La presentacin antignica no pudo ser restaurada tras el tratamiento con IFN-, pero si tras la transfeccin de la lnea celular, con el cDNA de la 2m, indicando un defecto estructural en este gen. El anlisis de la naturaleza de este defecto revel, que el mismo fue originado al menos por dos eventos diferentes afectando ambas copias del gen de la 2m: una microdelecin de 498 pares de bases en una de las copias, que comprenda el exon 1 y una macrodelecin incluyendo la segunda copia entera del gen de la 2m. Con la ayuda del anlisis de microsatlites para diferentes marcadores del cromosoma 15 se pudo delimitar la macrodelecin. Estudios de FISH tambin indicaron la coexistencia de una variante estructural anormal del cromosoma 15: la lnea presentaba dos cromosomas 15 aparentemente enteros, homocigotos para la microdelecin y un cromosoma 15 con una macrodelecin. La eliminacin de la expresin de la 2 microglobulina puede generar variantes tumorales mas agresivas as como constituir una barrera para la inmunoterapia del cncer. Su incidencia debe ser tomada en cuenta en el desarrollo y diseo de nuevas estrategias inmunoterapeuticas. 0820. ANALISIS CUANTITATIVO DE LA EXPRESIN DEL GEN HLA-E EN LINEAS CELULARES HUMANAS. R. Marn Iglesias, F. Ruiz-Cabello, J.Romero Noguera, T. Rodriguez Ruiz, P. Jimenez Gamiz, R. Mendez Vales, S. Pedrinaci, F. Garrido. Servicio de Anlisis Clnicos, Hospital Virgen de las Nieves, Granada La molcula HLA-E es una molcula HLA de clase I no clsica cuya expresin en superficie est influenciado por mltiples fac-
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tores, entre otros, la afinidad por pptidos el el residuo en la posicin 107 de la molcula (G o R), la disponibilidad de 2-microglobulina. No hay muchos estudios que demuestren expresin en superficie que parece restringirse a clulas de estirpe hematopoyticas pese a la expresin bastante generalizada del gen. En un estudio de nuestro grupo hemos observado que la expresin en tumores humanos se limita a un grupo pequeo de casos con alteraciones muy especficas en los genes HLA-clsicos. En este estudio nos hemos planteado un anlisis cuantitativo de la expresin de HLA en un grupo amplio de lneas tumorales humanas mediante RT-PCR cuantitativa. Se ha clonado un fragmento de PCR procedente de cDNA de HLA-E para realizar las curva estandar que se ha referido a otros genes, B2m, HLAABC, y GPDH. Construimos las curvas mediante el uso de sondas fluorescentes especficas usando el termociclador LightCicler (Roche). Nuestros resultados expresados en copias de HLA-E /copias de GPDH claramente revelan diferencias notables al comparar lneas de distinta estirpe histolgica, as los mayores niveles encontrados se correspondieron con las lneas con diferenciacin monoctica U937 y HL60. Esas discrepancias halladas en cuanto a transcripcin pueden ser responsables de la expresin observada mediante citometra en superficie con AbMo especficos de HLA-E. La expresin de HLA-E en comparacin con los niveles de expresin de los genes HLA-ABC, es menor. Esta significativa menor expresin con respecto a los genes HLA-ABC unido a la menor afinidad por b2-m justifica que la molcula alcance difcilmente la superficie y justificara que la mayora de las lneas tumorales carezcan de niveles detectables de HLA-E en superficie. 0821. LEUCOSIS BLSTICA DE FENOTIPO PROPIO DE CLULA DENDRTICA PLASMOCITOIDE. R. Sez, P. Echniz, N. Olivares, M.D. de Juan, E. Cuadrado. Servicio de Inmunologa. Hospital Donostia. San Sebastin. Guipzcoa Varn de 79 aos que en mayo de 2002 se realiza una biopsia de piel que muestra extensas infiltraciones de linfocitos etiquetadas como clulas NK (CD 56). En sangre perifrica se observa una poblacin de clulas CD3/CD4+/CD56+/CD123+/HLA DR+, fenotipo caracterstico de clulas dendrticas plasmocitoides. El anlisis del reordenamiento de cadena gamma del TCR fue negativo. Los ensayos funcionales fueron negativos para la produccin de perforina, granzima e IFN alfa. Los intentos de activacin con oligonucletidos con motivos CpG capaces de inducir produccin de IFN alfa, no dieron lugar a la produccin de esta citocina. Concluimos que se trata de una leucemia de clulas dendrticas plasmocitoides de tipo inmaduro. 0822. ALTERACIONES FENOTPICAS Y FUNCIONALES DE CLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFRICA EN PACIENTES CON ADENOCARCINOMA GSTRICO: CORRELACIN CON PARMETROS CLNICOS. M. Lpez-Santalla1, A. Valeri Lozano1, M. Prez Blas1, C. Rodrguez de Juan1, N. Aguilera Montilla1, A. Gutirrez2, J. Martn2, I. Lasa2, J.M. Mugerza2, A. Lpez2, L. Garca Sancho2, J.M. Martn-Villa1. 1Inmunologa. Facultad de Medicina. Univ.Complutense.Madrid. 2Servicio de Ciruga General y Digestivo. H. Universitario Prncipe de Asturias (HUPA), Alcal de Henares
Introduccin. En pacientes con cncer hay diversas disfunciones inmunolgicas: expresin de CD3-, equilibrio Th1/Th2, actividad de CTL que pueden facilitar la diseminacin tumoral. Objetivos. Realizar una evaluacin inmunolgica en pacientes con adenocarcinoma gstrico y su relacin con parmetros clnicos. Metodologa. 16 pacientes con adenocarcinoma gstrico fueron clasificados en funcin del estadio, gastrectoma, curabilidad, reseccin, anatoma patolgica y exitus. Se realiz un estudio fenotpico y de proliferacin. Como control se usaron 34 donantes sanos adultos. Para el anlisis estadstico se utilizaron los test de Mann-Whitney, de Chi2 y de Fisher. Resultados. Los pacientes mostraron una menor frecuencia de clulas CD3, CD45, CD4, CD8, CD28, CD3+CD4+ y CD3+CD8+, y una mayor frecuencia de clulas CD86. La respuesta proliferativa fue menor va CD3, CD2+IL2, CD2+PMA, CD2+CD28, PHA, PHA+IL2 y PHA+PMA. La correlacin con los parmetros clnicos mostr una disminucin de clulas CD45 en pacientes con curabilidad C y una menor respuesta a PMA en pacientes con tumor irresecable. Conclusiones. Los resultados obtenidos revelan que los pacientes con adenocarcinoma gstrico muestran una peor situacin inmunolgica. Aquellos pacientes con peor pronstico (curabilidad C y tumor irresecable) presentaron una disminucin en el nmero de clulas CD45 y en la respuesta a PMA. Disfunciones del Sistema Inmune se asocian con una mayor agresividad del proceso tumoral. Se ha recibido una comunicacin con fecha: 18-03-2003 08:10:22 con nmero de entrada:266 0823. INMUNIZACIN CON cDNA: ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI- APO2L/TRAIL. C. Diestre1, A. Anel2, MC. Visus1, M.A. Alava2, B. Saez1, P. Lasierra1, L. Larrad1, M.J. Martnez-Lorenzo1. Servicio de Inmunologa, Hospital Clnico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza. E-50009 2Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular y Celular, Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza. Zaragoza, E50009 linm@hcu-lblesa.es Se ha descrito que la inmunizacin con cDNA en comparacin con protenas purificadas es uno de los mtodos ms efectivos para obtener anticuerpos contra una protena. APO2L/TRAIL (Pitti et al, 1996) es un miembro de la familia de factores de muerte del TNF e induce apoptosis en clulas linfoides y no linfoides. Recientemente AP02L/TRAIL ha sido implicado en inmunidad antitumoral (Cretney et al, 2002) . Para la obtencin del plsmido se utilizaron bacterias E. coli competentes a las que se les introdujo el plsmido por choque trmico. Los conejos se inmunizaron con cDNA. Los conejos se inmunizaron a da 0 y da 30. Una semana despus, se obtuvo el antisuero por sangrado de los conejos. Una vez obtenido el antisuero, ste se analiz por la tcnica de inmunoblotting. Para testar el antisuero se analizaron diferentes lneas celulares (Jurkat, K562, L929) las cuales expresan constitutivamente la protena APO2L/TRAIL. Como control negativo se utilizo el adenocarcinoma HeLa. Asimismo, dicha lnea celular se transfect con el mismo cDNA de APO2L utilizado en la inmunizacin como otro control positivo adicional. Los resultados obtenidos indicaron que la va de inmunizacin ms adecuada fue la intramuscular utilizando 100 g de cDNA. El antisuero obtenido reconoce la protena APO2L humana por inmu-
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noblotting. Este resultado fue comparado con la deteccin de APO2L/TRAIL utilizando anti-APO2L/TRAIL cedidos gentilmente por Avi Ashekenazi (Genentech). Adems, el antisuero reconoce algunas protenas del msculo del propio conejo, pero el reconocimiento de dichas protenas es
muy dbil no interfiriendo en la deteccin de la protena APO2L/TRAIL. La obtencin de antisueros propios anti-APO2L/TRAIL resultar de gran utilidad para el anlisis de clulas en diferentes patologas. Este antisuero permitir reducir el coste de dichos estudios.
Sesion 9: Autoinmunidad y autoinflamacin

Comunicaciones Orales: 0901-0921 0901. TRANSCRIPCIN DE AUTOANTGENOS NEUROENDOCRNOS EN CINCO TIPOS CELULARES ESTROMALES TMICOS DIFERENTES Y SU RELACIN CON MOLCULAS PERTENECIENTES A DIFERENTES VIAS DE PROCESAMIENTO DE ANTGENO. X. Ferrer-Francesch, L. Sabater, R. Colobran, M.P. Armengol, M. Juan, R. Pujol-Borrell. Unidad de Inmunologa (LIRAD/CTBT). Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona Trnscritos de RNA codificando una a multiplicidad de protenas previamente consideradas como sintetizadas solamente en tejidos perifricos concretos pueden ser detectados en el timo de humanos y roedores (L. Klein 2000, Curr. Opin Immunol, 2000), pero el tipo o tipos celulares responsable de esta expresin promiscua, que puede ser dependiente del tipo de autoantgeno expresado no han sido definitivamente identificados (Pugliese A, J. Clin Invest, 2001) siendo subtipos de clulas dendrticas o subtipos de clulas epiteliales medulares los principales candidatos. Con tal de determinar el tipo/s celular/es responsable/s de esta expresin gnica promiscua hemos ensayado mediante Real-Time PCR la expresin de diferentes autoantgenos clave en enfermedades autoinmunes como la Insulina (INS), Tiroglobulina (TG), el receptor de la hormona tiroidea (TSHR), la protena Bsica de la Mielna (MBP) y la protena proteolipdica (PLP) en diferentes subconjuntos de clulas estromales tmicas obtenidas mediante digestin enzimtica y posterior separacin inmunomagntica y FACS. MR6 y Ep-CAM han sido usados para purificar clulas epiteliales corticales (cTEC) y medulares respectivamente y combinaciones de CD45RA, CD123 y CD83 para tres poblaciones de clulas dendrticas descritas en el timo humano (inmaduras, maduras y plasmacitoides). AIRE (AutoImmune REgulator), un factor de transcripcin altamente expresado en mTEC del timo humano e implicado en APECED (autoimmune-polyendocrinopathy-candidiasis ectodermal dystrophy) ha sido usado como marcador molecular. Anticuerpos para la deteccin de TAP-1, LMPs y proteasoma 20S y contra Ii, HLA-DM; molculas implicadas en el procesamiento de antgeno por las vias del complejo HLA de clase I y de clase II respectivamente, han sido usados en estudios de distribucion y colocalizacin con molculas del complejo HLA y marcadores fenotpicos mediante microscopa confocal digital. 0902. DETECCIN DE CLULAS T AUTOREACTIVAS MEDIANTE MULTIMEROS (TETRMEROS) DE MHC CLASE-II EN UN MODELO MURINO DE EAE. A. Minguela, S. Pastor, C. Vacaro, E.S. Ward. Center for Immunology and Cancer Immunobiology Center, U of Texas. Southwestern Medical Center. Dallas, TX. Servicio de Inmunologa. H. U. Virgen Arrixaca. Murcia Los multmeros (tetrameros) de MHC clase-II son un una herramienta de gran utilidad para detectar linfocitos T CD4+ Ag especficos. Pero a diferencia de los de clase-I, existen controversias en cuanto al modo de utilizacin: tiempo, condiciones de incubacin, estado de activacin de la clula diana, pre-cluster (reagrupamiento) de CD3, deteccin de TCRs con baja afinidad, internalizacin inespecfica del tetrmero, etc. Objetivo y mtodos. Establecer las condiciones ptimas, utilizando un tetrmero de la molcula I-Au murina, a la que se le ha unido un pptido de 9 aa del extremo N-terminal de la proteina bsica de mielina (MBP1-9) murina. Dicho tetrmero es capaz de detectar linfocitos CD4+ autoreactivos para MBP1-9 presentado en I-Au, y que pueden inducir encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Se utilizaron clulas T de ratones trasgnicos para los TCR 172.10 y 1934.4, ambos encefalitognicos y capaces de inducir EAE. El TCR 172.10 presenta una afinidad 4-5 veces superior al 1934.4 lo que nos permiti experimentar, con receptores de alta y baja afinidad. Mediante citometra de flujo y microscopa de fluorescencia, se estudi el efecto de: a) tiempo y temperatura de incubacin; b) pre-cluster de CD3; y c) estado de activacin de la clula diana. Resultados. La temperatura o el pre-cluster de CD3 no parecan afectar la tincin para TCRs de alta afinidad (172.10), pero ambos parmetros fueron decisivos con TCRs de baja afinidad (1934.4). La tincin mejoraba al reducir la temperatura de 37 a 12C, y empeoraba con el pre-cluster de CD3. La tincin a 12C redujo sensiblemente la internalizacin. Por ltimo, el estado de activacin celular no pareca afectar la afinidad del TCR por su ligando, aunque las clulas activadas presentaron una mayor tasa de internalizacin. Conclusin. El grado de activacin de la clula T no parece influenciar la afinidad del TCR por el peptido/MHC. Sin embargo, a la hora de trabajar con TCRs de baja afinidad la temperatura es importante, pues su afinidad aumenta al disminuir esta. 0903. BAJA PROPORCIN DE TRECS (CRCULOS DE ESCISIN DEL RECEPTOR DE CLULAS T) EN EL INFILTRADO LINFOCITARIO DE GLNDULAS AUTOINMUNES DEL TIROIDES. L. Sabater, M.P. Armengol, M.A. Fernndez, M. Juan, R. Pujol-Borrell. Fundaci per a la Recerca Biomdica Germans Trias i Pujol. Universitat Autonoma de Barcelona. LIRAD/CTBT Las enfermedades autoinmunes del tiroides cuyas tres formas principales son la enfermedad de Graves-Basedow (GB), la tiroiditis de Hashimoto (HT) y el mixedema primario son las enfermedades autoinmunes rgano-especficas ms frecuentes. La infiltracin linfo-
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citaria con formacin de folculos linfoides que contienen centros germinales funcionales es una caracterstica de la HT y es muy frecuente en GB. Es en el timo donde se genera el repertorio de clulas T y donde se expresan y tolerizan a antgenos tanto ubicuos como perifricos, constituyendo as un primer nivel de control de la autoinmunidad. El proceso de reordenamiento de los segmentos gnicos que dar lugar al TCR implica la generacin de un subproducto genmico circular (TRECs) que se usa como medida indirecta de la produccin tmica de linfocitos T hacia la periferia. El objetivo de nuestro estudio es elucidar si el infiltrado linfocitario T autoreactivo del tiroides autoinmune est fprmado por clulas recientemente exportadas del timo o si, por el contrario, las clulas T se han expandido y por lo tanto el nmero de TRECs es bajo. Para ello se han separado medienta FACS clulas CD3+ infiltrantes de la glndula y perifricas de pacientes y se ha cuantificado el nmero de TRECs presentes. Tras normalizacin del contenido de DNA genmico mediante cuantificacin por PCR a tiempo Real (PCR-rt) de b-globina con sondas de hibridacin, se determin el nmero de TRECs por el mismo mtodo con sonda Taqman. El nivel de proliferacin de las clulas T infiltrantes se estudi mediante doble marcaje con antiKi67 y anti-CD3 sobre secciones de glndulas con presencia de centros germinales y en suspensin celular por incorporacin de yoduro de propidio. El nmero de TRECs en linfocitos infiltrantes respecto a periferia result inferior tanto para HT como para GD. Adems no hemos podido demostrar una proliferacin clara de las clulas T infiltrantes en los estudiados hasta el momento lo que apuntara que los linfocitos T intratiroidales han sufrido ms divisiones que los perifricos y que stas no parecen tener lugar en la misma glndula y que por lo tanto se dirigiran a la glndula ya como clulas maduras. 0904. SEALIZACIN POR RECEPTORES TOLL: DIFERENCIAS ENTRE LOS LPS DE BRUCELLAS Y LOS DE ENTEROBACTERIAS. C. Garca-Rodrguez1, A. Dueas1, 2, A. Ordua2, M. Snchez Crespo2. 1Instituto de Biologa y Gentica Molecular (Centro Mixto CSICU.Valladolid). Valladolid. 2Hospital Clnico Universitario. Valladolid Los receptores Toll (TLR) juegan un papel importante en la inmunidad innata, siendo TLR-4, junto con las molculas correceptoras CD-14 y MD-2, el receptor para lipopolisacridos (LPS). La unin del ligando al receptor promueve una cascada de sealizacin intracelular que activa factores de transcripcin como NF-B, que a su vez regulan la expresin de genes de mediadores inflamatorios. LPS de enterobacterias como E.coli pueden producir choque endotxico. El LPS del gram-negativo facultativo intracelular Brucella spp produce infecciones con sintomatologa inflamatoria, aunque raramente produce choque endotxico. Con objeto de dilucidar si la diferente respuesta del husped frente a enterobacterias y Brucellas se debe a su mecanismo de unin a receptores Toll, desarrollamos un modelo de reconstitucin ectpica en clulas HEK transfectadas con TLR-4, CD14 y MD-2, y un gen reportero de NF-B acoplado al gen de luciferasa. Se hizo un estudio comparativo del efecto de LPS y lpidos A de diferentes bacterias como E.coli, y otras que presentan reactividad serolgica cruzada, como Brucella melitensis, Brucella abortus, Yersinia enterocolitica, Francisella tularensis y Ochrobactrum anthropi. Estudios de la actividad transcripcional mediada por NF-B indicaron que los LPS
de enterobacterias, como Y. enterocolitica y E. Coli, activan el receptor de TLR-4 en presencia de CD14 y MD-2. Sin embargo, las restantes endotoxinas no activaron el receptor TLR-4. Estas endotoxinas tampoco activaron el receptor TLR-2. Estudios de proteccin de RNasa mostraron un patrn diferente de expresin gnica en respuesta a los diferentes LPS. En el caso de enterobacterias, se indujo la expresin de un nmero mayor de genes de quimoquinas. La diferente estructura de los LPS y la implicacin de otras vas de sealizacin no descritas podra explicar las diferencias en la patogenicidad y respuesta inflamatoria producidas por estos LPS. 0905. LOS LINFOCITOS B INFILTRANTES DE ISLOTE EN RATONES NOD: CLULAS PRESENTADORAS DE ANTGENO CON FUNCIN REGULADORA. M.C. Puertas, J. Carrillo, A. Alba, R. Ampudia, X. Pastor, R. Planas, R. Pujol-Borrell, M. Vives, J. Verdaguer. Unidad de Inmunologia-LIRAD, Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona Introduccin. La Diabetes Mellitus tipo 1 es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destruccin selectiva de las clulas pancreticas por parte de clulas T autorreactivas. Aunque se ha demostrado necesaria la cooperacin de los linfocitos B en el desarrollo de la enfermdad, no se conoce an su papel especfico en la patologa. Objetivo. Caracterizacin fenotpica y funcional de los linfocitos B infiltrantes en islote pancreticos, en ratones NOD. Metodologa. Anlisis fenotpico, mediante citometra de flujo, de los linfocitos B infiltrantes en islotes pancreticos de ratones NOD hembra de 12 semanas de edad, en comparacin con linfocitos B perifricos. Caracterizacin de la respuesta de estas clulas a la estimulacin in vitro. Transferencia adoptiva de las clulas activadas in vitro, a animales receptores pre-diabticos. Resultados. A medida que avanza la insulitis, el porcentaje de linfocitos B aumenta en el infiltrado, a la vez que se detecta una disminucin en la expresin de la molcula CD19 en los mismos, siendo mnima a las 12 semanas de edad. Estas clulas, a su vez, presentan mayor expresin de molculas de MHC de clase I y clase II con respecto a periferia, si bien se observa ausencia de molculas coestimuladoras (B7.1 y B7.2). La estimulacin in vitro con antiCD40+IL-4 produce un incremento en la expresin de B7.2, molculas de MHC, y CD44. Este efecto es mucho ms acusado en los linfocitos B procedentes de infiltrado pancretico que en los linfocitos esplnicos. Tras la transferencia adoptiva de los linfocitos B activados in vitro, stos migran preferentemente a rganos linfoides, siendo tambin capaces de dirigirse de nuevo al infiltrado pancretico. Conclusiones. Los linfocitos B infiltrantes de islote pancretico muestran un fenotipo compatible con una funcin APC con efecto tolerizante, sugiriendo un papel regulador in situ. Este fenotipo puede ser revertido in vitro, con la obtencin de un fenotipo APC activador. 0906. ESPECIFICIDAD ANTIGNICA DE LOS LINFOCTOS B INFILTRANTES DE ISLOTE PANCRETICO EN MODELOS MURINOS DE SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA A LA DIABETES AUTOINMUNE. J. Carrillo, M.C. Puertas-Castro, A. Alba, R. Ampudia, X. Pastor, R. Planas, R. Pujol-Borrell, M. Vives-Pi, J. Verdaguer. Unidad de Inmunologa-LIRAD, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol
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La Diabetes Mellitus Tipo 1 es una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la prdida selectiva de las clulas beta del pncreas, a cargo de linfocitos T autorreactivos. Pese a ser stas las principales responsables de la destruccin de las clulas beta, se sabe tambin que los linfocitos B tienen un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad. El mecanismo de accin de estos lnfocitos B no est completamente comprendido, desconociendose si su actuacin tiene lugar mediante la produccin de autoanticuerpos o comportndose como APC especializadas. Por otra parte, poco se sabe acerca de la especificidad antignica de estas clulas. Objetivo. Determinar la especificidad antignica de los linfocitos B infiltrantes de islote pancretico en el modelo murino susceptibles NOD y 8.3NOD, y resistentes F1(NODxNOR) y 8.3F1(NODxNOR). Metodologa. Generacin de hibridomas mediante la fusin de los linfocitos B infiltrantes de islote de animales NOD, 8.3NOD, F1(NODxNOR) y 8.3F1(NODxNOR) con la lnea de mieloma NS1. Los hbridos viables fueron testados mediante ELISA para determinar su capacidad productora de anticuerpos. Para los positivos, se evalu su especificidad antignica por Inmunofluorescencia sobre criosecciones de 5m de distintos rganos de ratn RAG2-/-NOD. Resultados. De un total de 228 hibridomas generados, 63 son productores de inmunoglobulinas. 47 de ellos reconocen antgenos pancreticos aunque solo 10 de ellos son ICA positivos. Los 37 restantes reconocen antgenos localizados en el tejido exocrino, conductos y posiblemente en clulas de origen neuronal Adems estos antgenos se localizan en otros tejidos no siendo exclusivos del pncreas Conclusiones. Al contrario de lo que cabra esperar, la mayora de los lnfocitos B infiltrantes de islote pancretico tienen especificidad por tejido pancretico exocrino. 0907. CD69 DISMINUYE LA REACTIVIDAD INMUNE A TRAVS DE LA PRODUCCIN DE TGF-1 EN UN MODELO ANIMAL DE ARTRITIS INDUCIDA POR COLGENO. D. Sancho1, M. Gmez-Gutirrez1, F. Viedma1, E. Esplugues2, M. Gordn-Alonso1, M.A. Garca-Lpez1, C. Martnez-A3, P. Lauzurica2, F. Snchez-Madrid1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital de la Princesa. Madrid. 2Departamento de Fisiologa. Universidad de Barcelona. 3Departamento de Inmunologa y Oncologa. Centro Nacional de Biotecnologa CD69 se induce tras la activacin de los leucocitos en los infiltrados inflamatorios, pero su papel fisiolgico es desconocido. Hemos explorado el papel de CD69 en la reactividad inmune mediante el anlisis de un modelo de artritis inducida por colgeno (AIC) en ratones deficientes para CD69 y sus controles wild type. Los ratones CD69-/mostraron una mayor incidencia y severidad de la AIC, desarrollaban esplenomegalia, y la respuesta T y B frente al antgeno (colgeno tipo II) estaba exacerbada. TGF-b1, que es una citoquina antiinflamatoria que acta como protectora en la AIC, mostraba niveles de mRNA y protena reducidos en los focos inflamatorios de las articulaciones de los ratones CD69-/-. La inyeccin local de anti-TGF-b bloqueante aument la severidad de la AIC en ratones CD69+/+, pero no en los animales deficientes para CD69, demostrando la interrelacin de ambas molculas. Ms an, el entrecruzamiento de CD69 con anticuerpos monoclonales in vitro indujo la produccin de TGF- tanto en leucocitos de ratn como en leucocitos sinoviales humanos que expresaban intensamente CD69. En un modelo independiente de AIC en DBA/1, anticuerpos bloqueantes anti-CD69 demostraron el mismo aumento
de la severidad de la artritis que el encontrado en el ratn CD69-/-. Nuestros resultados desvelan que CD69 es una molcula que acta como modulador negativo de la respuesta inmune y la inflamacin a travs de la sntesis de TGF-1, que a su vez regula otras citoquinas proinflamatorias como IL-1 o RANTES. Como ocurre con otras molculas inmunorreguladoras (p.e., CTLA-4), CD69 podra ser una diana de inters para la terapia de enfermedades mediadas por el sistema inmune. 0908. EXPRESIN DE METALOTIONENAS DURANTE EL CURSO CLNICO DE LA EAE. RELACIN CON LOS PROCESOS DE NEURODEGENERACIN Y REGENERACIN. C. Espejo1, M. Penkowa2, M. Demestre1, X. Montalban1, E.M. Martnez-Cceres1,3. 1Unitat de Neuroimmunologia Clnica. Hospital Universitari Vall dHebron. Barcelona. 2Dpt. Medical Anatomy. University of Copenhagen. Copenhagen. 3LIRAD (Laboratori dImmunobiologia per a la Recerca i Aplicacions Diagnstiques). CTBT. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis mltiple, enfermedad crnica y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) mediada por clulas T. Las metalotionenas (MT) son una familia de protenas con caractersticas antioxidantes y neuroprotectoras. En trabajos previos, demostramos que estas protenas se expresan en los infiltrados inflamatorios del SNC durante la EAE y parecen jugar un papel protector, ya que ratones deficientes en MT sufren una EAE ms grave que la cepa control . En este trabajo se analiza el patrn de expresin de MT en el SNC durante el curso clnico de la EAE y se correlaciona con mecanismos de neurodegeneracin y regeneracin que se producen en el SNC. Para inducir la EAE, inmunizamos ratones hembras SJL con pptido 139-151 de la protena proteolipdica. Los ratones se valoraron clnicamente desde el da de la inmunizacin hasta la recuperacin del primer brote clnico. Se obtuvieron muestras de SNC de 5 ratones/grupo en diferentes momentos de la enfermedad: antes del inicio de los signos clnicos; parlisis cola; paraparesia; paraplejia o tetraparesia y durante la remisin, parcial y completa. Se realiz inmunohistoqumica en cortes parafinados del tronco enceflico para cuantificar el nmero de clulas positivas/0,5 mm2 que expresaban MT, al igual que para valorar la infiltracin celular (linfocitos Th1 (CD4), monocitos/macrfagos (F4/80), astrogliosis (GFAP), citocinas proinflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-), antiinflamatorias (IL-10, TGF-), factores crecimiento (bFGF, NGF), desmielinizacin (mediante anticuerpos anti-protena mielnica bsica), dao axonal (precursor protena amiloide, filamentos no fosforilados), estrs oxidativo (nitrotirosina, malondialdehido), apoptosis (TUNEL), y mecanismos de regeneracin como la proliferacin de oligodendrocitos (NG-2, receptor de PDGF) y la formacin de conos neuronales (GAP-43, P-40). Observamos que los marcadores estudiados se podan clasificar en dos patrones de expresin. El primero englobaba a los marcadores de los procesos neurodegenerativos, infiltracin celular, expresin de citocinas proinflamatorias, estrs oxidativo, dao axonal y apoptosis. La expresin de estos marcadores segua el mismo patrn que el curso clnico. El segundo patrn de expresin relacionaba a los marcadores de procesos de regeneracin, factores de crecimiento, proliferacin de oligodendrocitos, citocinas antiinflamatorias y MT. Estos resultados apoyan el efecto beneficioso de las MT en la EAE y sugie-
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ren que estaran participando en los mecanismos de regeneracin que se producen tras la lesin. 0909. HUMAN INTESTINAL CELLS WITH Th1 PENOTYPE AND EPITHELIAL SPECIFICITY IN CELIAC DISEASE: EFFECTOR OR REGULATORY SUBPOPULATIONS? E. Kolkowski1, M. Catlfamo1, L. Mux, D. Botello1, A. Morelli2, D. Jaraquemada1.1Unitat dImmunologia. Universitat Autnoma de Barcelona. Hospital Germans Trias i Pujol. 2Immunologi Unit. Hospital Pitsburg. USA The development of celiac disease, an autoimmune process induced by the exposure to gluten in susceptible individuals, results in the destruction of normal small intestine morphology. The pathology is associated with an increased number of Intraepithelial lymphocytes (IELs) in damaged mucosa.. The physiological function of the IELs in the intestine has not been defined and the role of the expanded T cell population in the celiac disease process is unknown. The aim of the present work was to identify functional and phenotypical features that help us define the possible role of the expanded T cell population in celiac pathogenesis. A panel of 15 T cell clones isolated from celiac biopsies and two from a non-celiac sample were characterized at the functional and phenotypical level. Differential patterns of cytotoxicity against intestinal epithelial cell lines were found, suggesting that at least two different populations of gd cells exist in celiac mucosa. Cytotoxicity by most of the epithelium-reactive clones was TCR-mediated. All clones produced IFN- and TNF- and nonreactive clones also produced IL-10, IL-5 and/or IL-4. The common Th0 chemokine receptor CXCR4 and Th1-related CXCR3 were expressed by all clones but proinflamatory chemokine receptor CCR5 was only expressed by low or non-reactive T cells. Our results suggest a heterogeneous role of cells expanded in the celiac mucosa that may be constiuted by a mixed population of effectors and regulatory cells. In addition, that the specific ephitelial recognition by T cells from celiac mucosa may involve stress related ligands other than the so far described for the delta 1 population in other intestinal mucosa inflammatory situations. 0910. TRASTORNOS AUTOINFLAMATORIOS ASOCIADOS A MUTACIONES DEL GEN CIAS1/PYPAF1/NALP3. J. Yage1, J.I. Arstegui1, A. Aldea1, F. Argelles2, P. Tejado2, M.A. Gonzlez-Enseat3, C. Arnal4, C. Modesto4, F. Rius1, S. Plaza1, J. Vives1. 1Servei dInmunologa, Institut Clnic dInfeccions i Immunologia (ICII). Hospital Clnic. Barcelona. 2Servicio de Pediatra. Hospital Virgen de la Macarena. Sevilla. 3Servicio de Pediatra. Hospital Sant Joan de Deu. Barcelona. 4Servicio de Reumatologa Peditrica. Hospital de la Vall dHebron. Barcelona Recientemente se ha relacionado a la protena criopirina con la va de transduccin de seales pro-inflamatorias debido a su papel en la regulacin de la activacin del factor de trascripcin NFB mediante estudios in vitro. La criopirina presenta un dominio pirina, que la relaciona desde el punto de vista estructural con la protena pirina/marenostrina responsable de la Fiebre Mediterrnea Familiar. Esta protena esta codificada por el gen denominado CIAS1/PYPAF1 /NALP3 que ha sido localizado en la regin 1q44. En estudios previos se ha demostrado que dicha regin presenta un desequilibrio de ligamiento con los loci asociados a diversos sndromes hereditarios de fie-
bre peridica como la Urticaria Familiar inducida por el Fro (FCAS/FCU) y el sndrome de Muckle Wells (MWS), ambas con herencia autosmica dominante. Tras la clonacin de este gen se han identificado diferentes mutaciones asociadas tanto a FCU, a MWS, o a una forma de solapamiento entre ambos sndromes y al sndrome neonatal inflamatorio multisistmico (CINCA/NOMID). En esta comunicacin presentamos los estudios del gen CIAS1 realizados en 3 familias espaolas afectas de sndromes hereditarios de fiebre peridica. Dos de ellas presentaban un cuadro clnico compatible con FCAS/FCU. En una de estas, con 4 generaciones afectadas, se identifico la presencia de la mutacin L305P en el gen CIAS1, que ya haba sido descrita previamente en una familia franco-canadiense afecta por FCAS/FCU. En la segunda familia afecta por FCAS/FCU, con individuos de al menos 2 generaciones enfermos, se identifico una nueva mutacin R488K en el exn 3 del gen CIAS1, no descrita previamente. En la tercera familia se estudio una paciente afecta por el sndrome CINCA, sin historia familiar previa de la enfermedad y se identifico la mutacin D303N, previamente descrita. Adicionalmente, se han identificado en la poblacin espaola 2 nuevos polimorfismos del gen CIAS1/PYPAF1 /NALP3 no asociados a enfermedad: L411L (transicin 1231C>T) y Q703K (transversin 2107 C>A). 0911. SINDROME PERIODICO ASOCIADO AL RECEPTOR 1 DEL TNF (TRAPS): DESCRIPCIN DE UNA NUEVA MUTACIN Y VALORACIN DEL TRATAMIENTO CON AGENTES BLOQUEANTES DEL TNF. J.I. Arstegui1, P. Sols2, A. Aldea1, P. Bahllo2, F. Rius1, T. Cantero2, S. Plaza1, S. Gmez2, J. Vives1, J. Yage1. 1Servei dInmunologa, Institut Clnic dInfeccions I Immunologia (ICII). Hospital Clnic. Barcelona. 2Servicio de Pediatra. Hospital Universitario. Valladolid Los sndromes hereditarios de fiebre peridica (HPFS) constituyen un subgrupo dentro de las enfermedades autoinflamatorias, caracterizadas por fenmenos inflamatorios en ausencia de base infecciosa o autoinmune, tanto humoral como celular. El sndrome TRAPS engloba todos aquellos HPSF, que cursan con herencia autosmica dominante y en los que se han identificado mutaciones en el gen TNFRSF1A, que codifica para el receptor 1 del TNF, tambin denominado CD120a o p55. Como en todos los HPSF, el pronstico de la enfermedad viene determinado por la aparicin o no de amiloidosis. Presentamos el caso de un varn de 12 aos de edad, sin historia familiar, que desde los 5 padece crisis inflamatorias de unos 814 das de duracin, con una periodicidad de 2-3 crisis anuales. En ellas se observa fiebre, un exantema eritematoso centrfugo que afecta a tronco, abdomen y EESS, conjuntivitis bilateral, intensas mialgias, artralgias, dolor abdominal y vmitos. En el anlisis de la secuencia genmica del gen TNFRSF1A se detecto la transicin G>A en la posicin 194 del cDNA, que constituye la primera base del exn 3 de dicho gen. El estudio del mRNA del gen TNFRSF1A mediante RT-PCR no identifico ni ausencia de expresin del alelo mutado ni alteraciones del splicing normal. No fueron identificadas mutaciones adicionales ni en el gen MEFV ni en el CIAS1/PYPAF1/NALP3. La cuantificacin de la forma soluble del TNFR1 proporciono valores bajos en periodos asintomticos y normales durante las crisis. A pesar del tratamiento con Etanercept, una protena de fusin que acta bloqueando el TNF, la inflamacin subclnica persisti, como lo demuestran los valores anormalmente elevados de VSG, Protena C Reactiva y SAA-1. Debido a los elevados niveles de esta ultima pro-
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tena y el genotipo alfa / alfa de la protena SAA-1 detectado en nuestro paciente, de mayor susceptibilidad al desarrollo de amiloidosis, se instauro adems el tratamiento con colchicina, cuyo efecto es impedir el desarrollo de la misma a largo plazo. 0912. A 12 MONTH FOLLOW-UP STUDY OF EXVIVO SPONTANEOUS AND INDUCED APOPTOSIS IN LYMPHOCYTES FROM MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS TREATED WITH INTERFERON BETA-1B. H. Barcenilla1, D. Daz1, C. Castrillo2, A. Prieto1, G. Revilla1, P. Prieto1, V. Sualdea1, M. lvarez-Mon1, A. Garca-Merino4 for the GENIO II group. 1Universidad de Alcal. Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Shering AG.3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Spain. 4Servicio de Neurologa. Clnica Puerta de Hierro. Universidad Autnoma. Madrid. Spain Background. There is evidence of an abnormal regulation of apoptosis in multiple sclerosis (MS). It has been hypothesized that one of the mechanisms by which interferon beta-1b (IFN-1b) could exert its effect in MS is by modifying the apoptotic rate of lymphocyte subpopulations. Objectives. To quantify and describe changes in apoptosis occurrence in peripheral blood lymphocytes (PBLs) from multiple sclerosis patients before treatment and along 12 months of IFN-1b therapy. Methods. Blood samples from 45 patients with relapsing-remiting and secondary-progressive MS were analyzed in a central laboratory at baseline and after 1, 6 and 12 months of IFN-1b therapy. PBLs were purified and characterized using monoclonal antibodies and the FACScalibur analyzer. Apoptotic index (AI) was calculated for T-cells expressing CD3, CD4, CD8 and CD45RO/RA antigens, and for B-cells expressing CD19 and CD5 antigens. The AI was determined after 24 hours of culture under two conditions: spontaneously and after phytohemagglutinin induction. A variance analysis and the Studentt test for multiple comparisons were applied for comparison of AI among different subgroups and considered significant when p<0.05. Results. Both spontaneous and mitogen-induced AI showed a significant reduction in all subsets except for CD19+ cells. Changes in spontaneous AI were already significant from month 1 in all but CD3+CD8+ and CD45RA+CD8+ (both significant from month 6) and CD45RO+CD8+ and CD5CD19+ subsets (significant after 12 months). Changes in PHA-induced AI were significant on month 1 in all but CD3+CD8+ cells (significant after month 6). Conclusions. Our results show that IFN-1b therapy not only does not increase lymphocyte apoptosis in MS but, instead, it causes a robust, steady and consistent reduction of the proportion of cells that suffer apoptosis in this exvivo short term culture. This reduction is observed for both spontaneous and mitogen induced apoptosis. 0913. RELAPSING-REMITTING AND SECONDARYPROGRESSIVE MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS PRESENTED AN INCREMENT OF SPONTANEOUS AND MITOGEN-INDUCED APOPTOSIS IN SEVERAL LYMPHOCYTE SUBSETS. H. Barcenilla1, D. Daz1, C. Castrillo2, A. Prieto1, P. Prieto1, G. Revilla1, V. Sualdea1, M. lvarez-Mon1,3, A. Garca-Merino4 for the GENIO II group. 1Universidad de Alcal, Alcal de Henares. Madrid. Spain. 2Shering AG. 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Spain. 4Servicio de Neurologa. Clnica Puerta de Hierro. Universidad Autnoma. Madrid. Spain
Background. Dysregulation of lymphocyte apoptosis has been reported in multiple sclerosis (MS), but there are no studies regarding the incidence of apoptosis in specific lymphocyte subpopulations of these patients. The currently used apoptotic index (AI) measures the presence of apoptosis in a phenotypically defined cell population. Objectives. To quantify spontaneous and induced apoptosis in lymphocytes of MS patients with regard to a control population of healthy individuals. Methods. Peripheral blood mononuclear cells from 48 interferon-naive patients with relapsing-remitting and secondary progressive MS and 12 healthy controls were purified and characterized in a Cscalibur analyzer using monoclonal antibodies. The AI was calculated for T-cells expressing CD3, CD4, CD8 and CD45RO/RA antigens and for B-cells expressing CD19/CD5 antigens. These AI were determined after 24 hour culture under two conditions: spontaneously and after phytohemagglutinin induction. Comparisons between MS patients and healthy controls were carried out using the non parametric Mann-Whitney test and considered significant when p<0.05. Results. A significant increase in spontaneous ex vivo apoptosis was found in peripheral blood lymphocytes from MS patients. This increase occurred in T-cells and was observed in the CD4+ subpopulation for the CD45RA+ and CD45RO+ subsets, as well as in the CD8+ subpopulation for the CD45RA+ and CD45RO+ subsets.There was also observed a increase of spontaneous apoptosis in the CD19+CD5+ B-cells subset but not in the CD19+CD5- B-cells. Similar increases in AI were found in mitogen induced apoptosis. Conclusions. We have found an impressive increase of apoptosis in spontaneous and mitogen induced apoptosis within several T-cell subsets of MS patients. For B-cells, apoptosis was increased only in the CD19+CD5+ subset. 0914. LA SNTESIS INTRATECAL DE IgM ES UN FACTOR DE MAL PRONSTICO EN LA ESCLEROSIS MLTIPLE. M.C. Sdaba1, J. Masjuan2, P. Gonzalez-Porqu1, J.C. lvarez Cermeo2, E. Roldan1, J. Plaza2, A. Bootello1, L.M. Villar1. Servicios de 1Inmunologa y 2Neurologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid Objetivo. Seguimiento de 29 pacientes con esclerosis mltiple (EM) remitente-recidivante entre 5 y 16 aos para evaluar si la sntesis intratrecal de IgM implica un peor pronstico en esta enfermedad. Materiales y mtodos. Se realizaron bandas oligoclonales (BOC) de IgG e IgM en muestras pareadas de LCR y suero por medio de isoelectroenfoque e inmunodeteccin. Se monitoriz la evolucin clnica de los pacientes y se evalu el tiempo de conversin a EM secundaria progresiva, el tiempo transcurrido para alcanzar un EDSS de 6, el porcentaje de pacientes con una EM benigna, y los cambios en el EDSS Resultados. Durante el seguimiento, el 70,8% de los pacientes con sntesis intratecal de IgM convirtieron a EM secundaria-progresiva. Ninguno de los pacientes sin sntesis intratecal de IgM convirti a EM secundaria-progresiva (p=0.0009). Al final del estudio el 63,6% de los pacientes con sntesis intratecal de IgM alcanzaron un EDSS de 6, mientras que ninguno de los pacientes sin sntesis intratecal de IgM alcanz valores de EDSS de 3 (p=0.003). Cuando se analizaron los pacientes con EM benigna, el 82% no tenan sntesis intratecal de IgM. Todos los pacientes con EM de mala evolucin tenan sntesis intratecal de IgM. Al final del estudio la media de EDSS fue de 4.64 en los
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pacientes con sntesis intratecal de IgM y 1.31 en los que no tenan sntesis intratecal de IgM (p=0.02). Conclusin. La presencia de bandas oligoclonales en el lquido cefalorraquideo es un marcadar de mal pronstico en la EM 0915. CARACTERIZACION FENOTIPICA Y FUNCIONAL DE LOS LINFOCITOS DE LA MUCOSA COLONICA EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. L. Snchez1, F. Bermejo2, A. Lpez-San Romn2, E. Roldn1, A. Bootello1, G. Roy1. Servicios de 1Inmunologa y 2Gastroenterologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid Introduccin. Aunque la patogenia de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) an no est aclarada, los estudios actuales indican una alteracin en la regulacin inmune intestinal en la que los linfocitos T y las citocinas jugaran un importante papel. Objetivos y mtodos. 1. Analizar por citometra de flujo diversas caractersticas fenotpicas y funcionales de los linfocitos infiltrantes de la mucosa colnica en la Colitis Ulcerosa (CU), n=20, y la Enfermedad de Crohn (EC), n=7, en comparacin con controles sanos, n=15. 2. Determinar la frecuencia y perfil de clulas productoras de citocinas (IFN-gamma, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10) de la mucosa intestinal de pacientes con EII. Resultados. La mucosa de pacientes con CU y EC presenta un aumento de los linfocitos infiltrantes, con una mayor expresin de marcadores de activacin respecto a los controles, mantenindose una distribucin similar de las subpoblaciones linfocitarias en ambas patologas. La produccin de citocinas, tanto por los linfocitos colnicos de los pacientes con EII como por los de los controles, muestra un perfil proinflamatorio. No se detectan variaciones significativas en la proporcin de linfocitos productores de IL-2, TNFalfa, o IFN-gamma entre los distintos grupos clnicos, excepto un ligero aumento de IL-2 en la CU. Las citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) fueron prcticamente indetectables tanto en los pacientes con EII como en los controles. Conclusiones. No se observan diferencias cualitativas en la distribucin de subpoblaciones linfocitarias en la EII. La mucosa colnica, tanto sana como afecta de EII, muestra un predominio de clulas proinflamatorias. 0916. UTILIDAD DE LA DETERMINACIN DE LOS ANTICUERPOS ANCA, ASCA, ACC y ACP EN PACIENTES CON EII. R. Rodrguez1, O. Merino2, M. Sans2, M. Pealva2, J.M. Piqu2, J. Pans2, O. Vias1. 1Gastroenterologa Hospital Clinic. Barcelona 2Inmunologa Hospital Clinic. Barcelona Introduccin. La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) incluye la Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU). Estas enfermedades son frecuentes en nuestro medio, son de etiologa desconocida y se caracterizan por la presencia de inflamacin crnica intestinal. El diagnstico diferencial entre stas dos entidades tiene implicaciones teraputicas i pronsticas importantes, pero las tcnicas convencionales (endoscopia, histologa) no permiten diferenciar un 1020% de los casos. Objetivos. Estudiar la utilidad de la determinacin srica de anticuerpos anti-clulas caliciformes (ACC) y anti-clulas pancreticas (ACP) para el diagnstico de pacientes con sospecha de EII y en la diferenciacin entre EC y CU.
Comparar la eficacia diagnstica de la determinacin de estos anticuerpos con los anticuerpos anti-citoplasma de neutrfilos (ANCA) y anti-Saccaromyces cerevisiae (ASCA). Determinar si la utilizacin combinada de estos anticuerpos incrementa la precisin en el diagnstico. Ver si la determinacin de estos anticuerpos guarda alguna relacin con el fenotipo de la EC o con la extensin en la CU. Mtodos. Pacientes incluidos en el estudio: Para la determinacin de ANCA y ASCA: 40 controles y 132 pacientes con EII (81 CU y 51 EC). Para ACC y ACP: 10 controles y 71 pacientes con EII (30 CU y 41 EC). Mtodo de determinacin de los anticuerpos: La determinacin de ANCA mediante inmunofluorescencia indirecta sobre leucocitos polimorfonucleares, fijados en un porta. La determinacin de ASCA tipo IgG e IgA mediante tcnicas de Elisa (Palex Medical SA). Y la determinacin de ACC y ACP tipo IgG e IgA mediante tcnica de inmunofluorescencia indirecta (Euroimmun). Resultados. Diagnostico diferencial control/eii (%) ANCA (0) ASCA (7) ACC (0) CTR 0 IgA IgG IgA IgG 7 0 0 0 ANCA (20) EII 20 IgA 30 IgG 21 IgA IgG 20 31 IgA 7 IgG 25 ASCA (40) ACC (35)
ACP (0) IgA 0 IgG 0
ACP (25)
Diagnostico diferencial cu/ec (%) ANCA (40) ASCA (17) CTR IgA IgG 40 15 3 ANCA (8) EII 8 IgA 39 IgG 33 ASCA (54)
ACC (46) IgA 37 IgG 40
ACP (20) IgA 3 IgG 20
ACC (26) IgA 7 IgG 21
ACP (29) IgA 9 IgG 29
Conclusiones. La determinacin de estos marcadores serolgicos puede ser til para la deteccin de pacientes con sospecha de EII y para el diagnstico diferencial entre CU de EC, aunque estn limitadas por su baja sensibilidad. En la CU las determinaciones serolgicas mas tiles son el ANCA y ACC IgA. y en la EC la mejor determinacin serolgica es ANCA(-) / ASCA (+). Sin embargo la determinacin de ACC o ACP no son tiles para diferenciar subgrupos de pacientes con diferente curso clnico, y su combinacin con ANCA o ASCA no mejora la precisin diagnstica de estas pruebas. 0917. POLIMORFISMOS GENTICOS DE LA IL-10 EN LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL HUMANA. ASOCIACIN CON LA PRODUCCIN DE ANTICUERPOS. P. Castro, A. Surez, L. Mozo, R. Alonso, J. de la Vega, L. Lpez- Rivas, C. Gutirrez. Servicio de Inmunologa. Hospital Central de Asturias. Servicio de Digestivo.
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Hospital de San Agustn de Avils Departamento de Biologa Funcional. Universidad de Oviedo La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se caracteriza por una respuesta inmune desproporcionada a la flora normal del aparato digestivo, en la que los niveles de IL-10 juegan un papel esencial controlando la respuesta inflamatoria. Los niveles de esta citocina muestran importantes variaciones interindividuales genticamente controladas por polimorfismos presentes en su promotor. En este trabajo analizamos tres polimorfismos en las posiciones -1082(A/G), -819(C/T) y -592(C/A) mediante PCR a tiempo real hibridando con sondas especficas para cada mutacin marcadas con fluorforos. Comparamos las frecuencias genotpicas, haplotpicas y allicas en poblacin sana y pacientes con EII en sus dos manifestaciones clnicas, enfermedad de Crohn(EC) y colitis ulcerosa (CU). Igualmente analizamos la presencia de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCAS), anticitoplasma de neutrfilo (ANCA) o anti-pancreticos (PAB), por IFI o ELISA, en relacin con el polimorfismo en la posicin -1082. No encontramos diferencias significativas entre las frecuencias polimrficas en poblacin sana y pacientes con EII, bien analizados en conjunto o, independientemente, pacientes con CU o EC, aunque observamos una tendencia hacia una baja frecuencia del haplotipo bajo productor (ATA), en los pacientes con CU. Sin embargo, el alelo -1082*G, asociado con alta produccin de IL-10, parece condicionar la evolucin de la EII, ya que su frecuencia se encontr significativamente disminuida en pacientes positivos para cualquiera de los anticuerpos estudiados (p= 0.034) en comparacin con pacientes serolgicamente negativos. Es ms, la ausencia de este marcador gentico condicionara la aparicin de ANCA en pacientes con CU, ya que al comparar su frecuencia en pacientes ANCA+ y ANCA- se encontr una disminucin estadsticamente significativa en los positivos para estos anticuerpos (p = 0.027). Estos resultados indican que los niveles de IL-10, aunque no condicionaran la aparicin de la EII, s parecen influir en la evolucin de la misma. 0918. ANTICUERPOS ANTI-CITRULINA, APLICACIN CLNICA EN NUESTRO MEDIO. O. Vias1, A. Gomez2, Y. Machuca1, . Mojico1, G. Salvador2, MA. Romera1, L. Rubio1, Teresa Prez3, Isabel Haro3, ngels Hernndez1, Rosa Rodriguez1, Lourdes Places1, Carles Serra1, Raimon Sanmart2 y Guadalupe Ercilla1. 1Servei dImmunologia de lInstitut dInfeccions i dImmunologia (ICII) de lHospital Clnic de Barcelona, 2Servei de Reumatologia de lIstitut Clnic de lAparell Locomotor (ICAL) de lHospital Clnic de Barcelona, 3Departament de qumica de pptids i protenes, IIQAB-CSIC de Barcelona La Artritis Reumatoide (AR), con una prevalencia del 2%, es una enfermedad crnica que actualmente se considera grave. Recientemente diversos trabajos han demostrado el inters de los anticuerpos anti-citrulina (ACit) para el diagnstico de la AR por ser altament especficos, a diferencia del factor reumatoide (FR), y relativamente sensibles. Algunos trabajos indican una relacin con factores pronstico. Objetivos. 1. Anlisis de la especificidad y la sensibilidad de los ACit para el diagnstico de AR en nuestro medio. 2. Comparacin de los mtodos ELISA con pptido cclico citrulinado (CCP) de 1 y de 2 generacin. 3. Evaluacin de los ACit durante el primer ao de evoluci en la AR.
Material y mtodos. Se determin la presencia de anticuerpos ACit mediante inmunofluorescncia sobre esfago de rata (AKA, mtodo propio), mediante ELISA con CCP de 1 (CCP1) y de 2 (CCP2) generacin (Eurodiagnstica RA Immunoscan), el FR por nefelometra, y el epitopo reumatoide (ER) mediante genotipage HLA DRB1 por secuenciacin directa de DNA. Los pacientes seleccionados se diagnosticaron segn los criterios de la ACR. Resultados. 1. La determinacin de ACit en 326 pacientes mediante CCP1 fue positiva en 107 de los pacientes diagnosticados de AR (90/159 de los pacientes AR FR+) y en 4 del grupo de artropatas no AR. La sensibilidad de la prueba fue del 52,9% para la AR (54,7% AR FR+ y 37,2% para AR FR-) con una especificidad del 96,6%. 2) Para comparar CCP1 y CCP2 se determinaron ACit en 60 pacientes afectos de AR (criterios de ACR) de corta evolucin (<2 aos) en el momento de inclusin en un protocolo clnico de seguimiento y tratamiento. Los resultados (en %) se muestran en la siguiente tabla: AR FR+ AKA+ 62 66 CCP1+ 61 67 CCP2+ 77 89 p (CCP1/CCP2) < 0.001 < 0.001 Total AR FR46 39 36 AR AR AR ER+ AKA+ AKA65 (100) (0) 62 89 14 81 93 55 n.s. < 0.001 n.s. n.s.
La correlacin entre CCP1 y CCP2 presenta un coeficiente de correlacin de Pearson r=0,67 p<0,001. 3) En 31 pacientes con AR de corta evolucin (81% mujeres, 68% FR+, edad al inicio 50,8+/-15,4 aos, meses de evolucin al inicio 11+/-7,3 meses) los ACit resultaron positivos en 22 pacientes (71%) al inicio, y en 24 pacientes (77%) al cabo de un ao. Los ACit se negativizaron en un 2% de los pacientes al final del ao, mientras que se evidenci positivacin en un 8%. Sasimismo, se observ una disminucin de los ttulos medios de ACit al ao de seguimiento en comparacin con los valores basales (605+/651 frente a 316+/-406; p=0,009). Los ttulos de ACit solo aumentaron en 2 pacientes. Conclusiones. 1. La determinacin de ACit es una prueba sensible, especfica, fcil de estandarizar y que, por lo tanto, puede ser til en el diagnstico de la AR en la prctica habitual. 2. El kit de 2 generacin CCP2 es significativamente ms sensible que el de 1 generacin el grupo de paciente con AR de corta evolucin, especialmente en los pacientes AR FR+, y en las AR ER+. 3. Los ACit se pueden positivizar tardiamente en pacientes con AR de inicio reciente. Pero los ttulos de ACit descienden significativamente al cabo de un ao de instaurar el tratamiento modificador de la enfermedad (DMARDS). En la actualidad estamos analizando si los cambios en ttulos de ACit se correlacionan con la respuesta teraputica. 0919. EVALUACIN DE UN SISTEMA DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI-ISLOTES PANCRETICOS (AICA). L.A. Garca Astudillo, J. Crespo del Pozo, M. Lpez Hoyos. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. Santander Introduccin. La diabetes Mellitus tipo I (DM I) es una enfermedad asociada a fenmenos autoinmunes generados contra las clulas beta del pncreas. Los anticuerpos (Acs) anti-GAD, anti-IA2 y anti-
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islotes pancreticos han demostrado ser una herramienta de gran valor diagnstico, debido a su elevado valor predictivo positivo. Objetivos. Determinar la sensibilidad y especificidad de AICA en el diagnstico de DMI con un kit de inmunofluorescencia y compararlas con la determinacin de Acs anti-GAD y anti-IA2. Mtodos. Se estudiaron 204 pacientes: 68 DM I adultos, 68 celiacos y 68 adultos con patologa tiroidea de carcter autoinmune. Se determin la presencia de AICA mediante inmunonofluorescencia indirecta (IFI) (Biosystem) y la presencia de Acs anti-GAD y antiIA2 mediante radioinmunoensayo (Medipan). Resultados. La sensibilidad de AICA en pacientes diabticos fue del 22%, mientras que la de los Acs anti-GAD fue del 48% y la de los Acs anti-IA2 del 29%. La sensibilidad combinada de Acs anti-GAD e -IA2 fue del 58% y la sensibilidad combinada de los tres fue del 65%. La especificidad de AICA fue del 100%. Al considerar los pacientes con DMI hubo slo correlacin significativa entre AICA e IA2 (p<0.05). Conclusiones. La sensibilidad de AICA y de las otras dos especificidades fue menor que la descrita, aunque con una especificidad del 100%. La baja sensitibilidad podra estar relacionada con un peor control de la enfermedad y una mayor destruccin de clulas beta, como se ha descrito recientemente. Su empleo aislado parece no ser suficiente para la deteccin de DMI. La correlacin significativa entre los AICA y los Acs anti-IA2 sugiere que los AICA detectados mediante IFI se dirigen preferentemente frente al enzima IA2. 0920. ANTICUERPOS ANTI-TRANSGLUTAMINASA EN EL SNDROME DE ACEITE TOXICO (SAT). E.M Romo Pasamar1, D. Oliver Miarro1, MA. Nogales Morn2, Maravillas Izquierdo Martnez2, Sara Luengo1, MJ. Marn1, B. Baonza1, E. Paz Artal1. 1Servicio de Inmunologa y 2Unidad SAT. Hospital 12 de Octubre. Madrid En mayo de 1981 aparecieron en Espaa los primeros casos de una enfermedad desconocida hasta ese momento. Los estudios clnicos, patolgicos y epidemiolgicos permitieron atribuirla a la ingesta de aceite adulterado comercializado sin los adecuados controles sanitarios. La enfermedad debut de forma aguda con sintomatologa pulmonar y neurocutnea, mialgias y eosinofilia, pero un gran nmero de casos se ha cronificado, presentando una afectacin sistmica en cierto modo similar a las enfermedades del tejido conectivo de etiopatogenia autoinmune (fundamentalmente sndromes esclerodermiformes). La fase intermedia de la enfermedad se caracteriz por una acusada prdida de peso. Los estudios inmunolgicos en la fase aguda revelaron, entre otras alteraciones, un incremento policlonal de IgG, aumento de IgE y anticuerpos antinucleares. En la etapa crnica se detectaron tambin anticuerpos anti-msculo liso y estriado. Estudios posteriores de asociacin a HLA revelaron que la fase crnica del SAT presenta susceptibilidad gentica asociada a antgenos tanto de clase I como de clase II. En el contexto de un estudio amplio sobre enfermedad celaca, se seleccionaron otras enfermedades como grupos de contraste. As, se investig la presencia de anticuerpos anti-transglutaminasa en una poblacin elegida al azar de pacientes crnicos afectados por el SAT. Los resultados iniciales sugieren que la prevalencia de dichos anticuerpos en estos pacientes es superior a la de la poblacin normal. Se discuten las implicaciones de estos resultados en relacin con: 1. La etiopatogenia de tipo inmunolgico de la enfermedad celaca, su frecuente asociacin con entidades autoinmunes como la
diabetes tipo I o tiroiditis, su susceptibilidad gentica asociada a HLA y su frecuente presentacin en formas subclnicas o silentes que impiden en muchos casos una deteccin precoz, y 2. La evolucin de los pacientes crnicos de SAT. 0921. PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A ANTGENOS ENDOMETRIALES EN EL SUERO DE RATAS CON ENDOMETRIOSIS. I. Velasco1, E. Fuster2, R. Bermejo3, MJ. Ramos1, F. Quereda1,3, A. Campos4. 1Divisin Ginecologa y Obstetricia, 2Instituto de Bioingeniera. Universidad Miguel Hernndez. 3Hospital Clnico de San Juan. 4Centro de Transfusiones de Alicante. Introduccin. La aparicin de endometriosis se asocia con un sistema inmune alterado incapaz de eliminar el tejido endometrial ectpico, sin saber si esto es causa o consecuencia del proceso. El suero de estas pacientes presenta autoanticuerpos frente a antgenos endometriales, por lo que algunos autores sostienen que la endometriosis es de naturaleza autoinmune. Objetivo. Determinar mediante Western Blot la presencia de anticuerpos antiendometriales en el suero de ratas con endometriosis y caracterizar los antgenos correspondientes. Metodologa. Se utilizaron 10 ratas Wistar de 12 semanas de edad. En 5 de ellas se indujo endometriosis mediante el mtodo de Jones, que consiste en implantar fragmentos de endometrio en la pared peritoneal del animal. Un mes despus de la induccin se extrajo suero, las vesculas endometrisicas y el endometrio eutpico. Como muestras control se obtuvo suero y endometrio de 5 ratas sanas. Cada tejido fue homogeneizado y separado por electroforesis en gel de poliacrilamida, transferidos a membrana de nitrocelulosa e incubados con suero control o el suero de rata con endometriosis. Para el revelado se utiliz fosfatasa alcalina. Resultados. En el suero de ratas sin endometriosis no existen anticuerpos antiendometriales. Tanto en el endometrio eutpico como en la vescula endometrisica existen protenas que son reconocidas por el suero de ratas con endometriosis, siendo la reaccin ms intensa con las pertenecientes a la vescula. Dichos antgenos son de 28, 32, 36 y 38 Kd. Conclusiones. Existen anticuerpos frente a tejido endometrisico en el suero de ratas con endometriosis que reconocen el tejido endometrial eutpico, bien por reaccin cruzada, bien por responder contra haptenos naturales endometriales asociados a un carrier presente en el tejido peritoneal. Los antgenos endometriales observados son variables entre las diferentes ratas analizadas, igual que sucede en mujeres con endometriosis. (Con ayuda del FISS 99/0981) Posters: 0922-0929 0922. ESTUDIO DE MEDIADORES DE INFLAMACIN EN BIOPSIAS DE PACIENTES CON ENFERMEDAD CELIACA POR RT-PCR. A.J. Len, J.A. Garrote, A. BlancoQuirs, C. Calvo1 L. Fernndez-Salazar2, E. Arranz. rea de Pediatra e Inmunologa-IBGM, Universidad de Valladolid. Servicios de 1Pediatra y 2Digestivo. Hospital Clnico de Valladolid Introduccin. la enfermedad celiaca es una intolerancia al gluten que cursa con inflamacin intestinal, atrofia vellositaria e hiperplasia de criptas. A diferencia de la enfermedad inflamatoria intesti-
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nal (Crohn y colitis ulcerosa), no se producen ulceraciones en la mucosa, por lo que resulta de gran inters conocer las diferencias en los mediadores que conducen a esas situaciones. Objetivos. estudio de la expresin de mediadores Th1 y otras molculas relevantes en biopsias intestinales, tanto en celiacos como en controles sanos. Metodologa. se estudiaron un total de 23 biopsias de intestino delgado procedentes de pacientes celiacos peditricos (8), celiacos adultos (8) y controles (7). Se extrajo RNA de las muestras y se estudi la expresin mediante RT-PCR de: IL-12(p35), IL-12(p40), IFNg, IL-15, IL-18, IL-23(p19), TNFa, TGFb, transglutaminasa tisular (tTG) y estromelisina-1(MMP-3). Se realiz semicuantificacin por densitometra, comparando la expresin frente a las muestras control. Resultados. hemos comprobado la expresin de IFNg, IL-15, IL-18, IL-23, TNFa, TGFb, y tTG, tanto en muestras de pacientes como en controles, pudiendo haber diferencias en los niveles de expresin. Asimismo, no hemos detectado la expresin de IL-12 ni de MMP-3. Conclusiones. a diferencia de otros procesos inflamatorios Th1, en la enfermedad celiaca hay aumento de IFNg en ausencia de IL-12, lo que sugiere un importante papel de otras citocinas IL-15, IL18 e IL-23, resultando este ltimo de gran inters por haber sido descrita recientemente y de la que hay pocos datos en inflamacin intestinal. 0923. IMPLICACIN DEL GENOTIPO DE LA IL-10 EN LA SUSCEPTIBILIDAD Y MANIFESTACIONES INMUNMOLGICAS DEL LES. P. Lpez1, A. Surez1, L. Mozo2, P. Castro2, C. Gutirrez1,2. 1Departamento de Biologa Funcional. Area de Inmunologa. Universidad de Oviedo. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Central de Asturias Estudios previos han demostrado que la elevada variacin interindividual en la produccin basal e inducida de IL-10 est genticamente regulada por tres polimorfismos localizados en las posiciones -1082 (G/A), -819 (C/T) y -592 (C/A) de su promotor. Estos polimorfismos se han asociado con susceptibilidad a determinadas patologas autoinmunes, aunque los estudios realizados en el LES han mostrado resultados contradictorios. En este trabajo nos propusimos determinar la posible implicacin del genotipo de la IL-10 en la susceptibilidad al LES o en sus principales manifestaciones inmunolgicas. Para ello se realiz un registro de los pacientes de LES presentes en Asturias en los que se analiz la presencia de autoanticuerpos frente a dsDNA, SSa, SSb, Sm, RNP y cardiolipina. Mediante amplificacin por PCR e hibridacin con sondas aleloespecficas se determin el genotipo del promotor de la IL-10 en los pacientes y en la poblacin sana. En los pacientes asturianos de LES se confirma la baja prevalencia de Ac frente a RNP y Sm descrita en otros estudios con pacientes caucasoides. Es destacable, sin embargo, su asociacin con un diagnstico temprano, siendo su prevalencia significativamente mayor en los pacientes diagnosticados durante la infancia que en los diagnosticados a partir de los 50 aos. El sexo femenino se asocia preferentemente con Ac frente a SSa, mientras que los varones se asocian con una mayor edad al diagnstico. Los pacientes presentan una frecuencia ms elevada que la poblacin control del genotipo alto productor de IL-10 (GCC/GCC). Sin embargo los bajos productores tienen una frecuencia significativamente mayor de anticuerpos frente a SSa, RNP y Sm y una edad de diagnstico ms temprana. En resumen, el genotipo -1082AA se asocia con una mayor presencia de autoanticuerpos y
una aparicin temprana de la enfermedad, mientras que -1082GG se asocia con una mayor susceptibilidad al LES en pacientes con diagnstico tardo. 0924. BIOCOMPATIBILIDAD DE MATERIALES DE CIRCULACIN EXTRACORPOREA RECUBIERTOS CON FOSFORILCOLINA. M. J. Marn, M. J Bartolom, M. Pea, P. Barreda1, M. Calvo1, F. de la Fuente1, M. Lpez Hoyos. Servicios de Inmunologa y 1Unidad de Perfusin. Hospital Universitario Marqus de Valdecilla. Santander Introduccin. El contacto de la sangre con superficies no endoteliales de los circuitos de circulacin extracorpreo (CEC), utilizados en ciruga cardiaca, induce una respuesta inflamatoria. Este fenmeno involucra diversos mediadores de inflamacin, entre los que se encuentran citocinas, factores del complemento y reactantes de fase aguda. Para disminuir la respuesta inflamatoria derivada de la bioincompatibilidad de los CEC se estn utilizando circuitos recubiertos con fosforilcolina. Objetivo. Comparar la biocompatibilidad de CEC recubiertos con fosforilcolina, respecto de los materiales clsicos, midiendo diferentes componentes de la respuesta inflamatoria. Materiales y metodos. Se incluyeron 3 grupos de pacientes segn el tipo de recubrimiento de los circuitos utilizados. Grupo A: sin recubrimiento; grupo B: con recubrimiento de fosforilcolina y grupo C: con recubrimiento de fosforilcolina y eliminacin de la sangre aspirada. Los parmetros analizados fueron: PCR, haptoglobina, fibringeno e IL-6. En cada paciente se realizaron 6 mediciones en sangre arterial: al inducir la anestesia (t0), al clampar la aorta (t1), al desclampar (t2) y a los 20 minutos, 24 y 48 horas despus de la CEC (t3, t4, t5). RESULTADOS: Si bien los niveles sanguneos de reactantes de fase aguda en el grupo A fueron ms elevados que en B y C, las diferencias no fueron estadsticamente significativas. La IL-6 aument rpidamente e hizo un pico en t3 en los 3 grupos, observndose en este momento una diferencia significativa (p=0.016) entre el grupo A y los grupos B y C. Conclusiones. Las concentraciones de IL-6 srica, el parmetro ms precoz y el que mejor refleja la activacin leucocitaria demuestra que los circuitos recubiertos con fosforilcolina son ms biocompatibles que los circuitos clsicos. Adems, la eliminacin de la sangre aspirada del campo es una prctica que disminuye an ms la respuesta inflamatoria. 0925. ANTI-DESMOGLEINS 1 AND 3 AUTOANTIBODIES DISTINGUISH CLINICAL PHENOTYPE IN PEMPHIGUS. B. Santamara, J.L. Ruiz-Tscar, A. Garca Segovia, S. Snchez-Ramn, R. Surez Fernndez1, C. Bueno1, E. Fernndez-Cruz, M. Rodrguez-Mahou. Departments of Immunology and 1Dermatology, H.G.U. Gregorio Maran. Madrid Introduction. Pemphigus foliaceus (PF) and pemphigus vulgaris (PV) are autoimmune blistering diseases due to loss of cell-cell adhesion in epidermis and mucous membranes caused by autoantibodies (AA) against the extracellular domain of desmosomal cadherin desmoglein (Dsg) 1 and 3. PF is characterised by skin erosions that result from blisters within the granular layers of epidermis, whereas PV develop blisters and erosions in skin and mucoses due to acantholysis in the basal and suprabasal layers of the epithelium.
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Objetives. 1. To determine the specificity of Dsg-1 and Dsg-3 AA for pemphigus; 2. to determine the titre of anti-Dgs 1 and 3 patients with PF anf PV; and 3. to correlate anti-Dgs 1 and anti-Dgs 3 AA with clinical activity and phenotype (skin vs mucous involvement). Methods. We studied 25 patients with pemphigus attended in our hospital, with clinical, histological, and direct and indirect immunofluorescence (IIF) confirmation. As control groups, 25 serum samples from patients with diverse dermatological conditions other than penphigus were also analysed. IIF was used to detect AA against the intercellular spaces of the epidermis. Anti-Dsg-1 and Dsg-3 AA were studied in parallel by using ELISA. Results. anti-Dsg 1 and 3 AA exhibited a 100% specificity for PV and PF. Both AA were negative in all patients without clinical activity (but in 1 patient). Anti-Dsg 1 AA correlated with PF and PV with limited cutaneous involvement, whereas Dsg 3 AA correlated with mucous involvement in PV. Both AA were positive in cases of mucocutaneous activity. Conclusion. Dsg 1 and Dsg 3 AA enable to differentiate between both types of pemphigus, which is not possible with IIF. A much better correlation between disease activity and anti Dsg-1 and Dsg-3 AA values compared to IIF titre was observed. Dsg 1 and Dsg 3 AA used together provides an specific, sensitive and quantitative diagnostic test for detecting PF and PV, with strong correlation to clinical phenotype activity. 0926. DETECTION OF ANTI-dsDNA ANTIBODIES IN SLE PATIENTS BY TWO DIFFERENT METHODS: RELATION WITH DISEASE STATUS. J.L. Ruiz-Tscar, S. Toro, B. Santamara, A. Garca Segovia, S. SnchezRamn, F.J. Lpez-Longo1, E. Fernndez-Cruz, M. Rodrguez-Mahou. Departments of Immunology, and 1Rheumatology. H.G.U. Gregorio Maran. Madrid. Spain Introduction. Systemic Lupus Erythematosus (SLE) is an inflammatory multy-systemic autoimmune disease characterized by arthritis, muscle pain, weakness, malar rash, sun-sensitivity, fever, anaemia and others. Anti-dsDNA antibodies (abs) and anti-Sm abs are of particular relevance, as they are higly specific for SLE and are included in the ACR criteria for diagnosis. Objetive. To compare two different methods (classical ELISA vs EliATM) for the detection of anti-dsDNA abs. Methods. 118 sera of patients (pts) with definitive SLE (ACR criteria) and a control group (80 pts with R Arthritis or Arthrosis) were analyzed. For 103/118 the disease status Active/Inactive (A/I) is known and calculations were carried out for this group. Information about Nephritis/NonNephritis (N/NN) is available in all pts. Results. A better correlation of the two methods is achieved with A-SLE compared to I-SLE (Pearson: r = 0.8 vs 0.6). In I-SLE lower titers are found by both methods with more pts remaining positive in the ELISA. A good postitive/negative concordance is found in A-SLE with N. 6/36 I-SLE with NN pts are found positive by ELISA and clearly negative by EliATM. Sensitivities found for ELISA vs EliATM were: A-SLE: 82.9% vs 65.9%; I-SLE: 48.4% vs 38.7%. The ELISA doesnt differentiate between N-SLE and NN-SLE pts (Sensitivity: 60.7% vs 61.3%; EliATM: 55.4% vs 43.5%). The specifity is >90% for both tests. Conclusion. The results confirm a high sensitivity for both tests in A-SLE. In I-SLE patients, where the portion of high avidity anti-dsDNA abs is expected to be lower, are less often found positive in EliATM compared to ELISA. A similar situation can be stated with
respect N/NN-SLE. In conclusion, when it comes to the detection of dsDNA abs, the EliATM is a step ahead in the attempt to find a detection system, with high specfity and a good correlation to disease activity. As a standarized, automated system with high reproducibility, it is also ideally suited for follow-up disease activity. 0927. ANTICUERPOS CONTRA EL PEPTIDO CICLICO CITRULINADO. C. Serrano1, L. El Ouaamari2, M. Alcalde2, C. Seoane1, O. Snchez-Pernaute2, P. Palomino2. Servicio de 1Inmunologa y 2Reumatologa Fundacin Jimnez Daz. Madrid La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune de etiologa desconocida, caracterizada por la produccin de factor reumatoide (FR). Recientemente se han detectado protenas citrulinadas en las articulaciones afectadas. La presencia en el suero de anticuerpos dirigidos contra estos residuos podra constituir un nuevo marcador de la enfermedad. Objetivo. Estudiar la utilidad de los anticuerpos contra el pptido sinttico cclico citrulinado (a-CCP) para discriminar rasgos clnicos y/o analticos en un grupo de pacientes con AR. Pacientes y mtodos. Se reclutaron 35 pacientes consecutivos diagnosticados de AR segn los criterios del Colegio Americano de Reumatologa. Se realiz un estudio transversal valorando: 1. Tiempo de evolucin y curso de la enfermedad; 2. Afectacin radiogrfica y extraarticular; 3. Marcadores de actividad y presencia de FR. Los a-CCP IgG se determinaron mediante enzimoinmunoensayo en los sueros de los pacientes y en 15 controles (10 voluntarios sanos y 5 pacientes con otras enfermedades autoinmunes). El anlisis de los datos se realiz con el programa estadstico SPSS. Resultados. a) 26/35 pacientes fueron positivos para a-CCP y 25/35 para el FR. 5 pacientes fueron a-CCP-/FR-, 5 a-CCP+/FR- y 4 a-CCP-/FR+. La sensibilidad de los a-CCP y del FR en los pacientes fue del 74% y del 71%, respectivamente, existiendo una buena correlacin entre ambos (p=0.003). La especificidad de los a-CCP fue del 100%. b) La presencia o no de a-CCP no se asoci a diferencias en el curso e la enfermedad, el tiempo de evolucin, alteraciones radiolgicas, afectacin extraarticular, marcadores de actividad inflamatoria o ANAS en suero. C) Los ttulos de a-CCP fueron ms elevados en las formas erosivas de la enfermedad (155 25) que en las formas no erosivas (113 22) (p<0.005). Conclusiones. 1. La determinacin combinada de los a-CCP y el FR permiti detectar el 86% de nuestras AR lo que, unido a la especificidad que mostraron los a-CCP, permitira agilizar el diagnstico de AR en la prctica clnica. 2. La asociacin observada entre los ttulos de a-CCP y la presencia de erosiones sugiere que los niveles de aCCP podran emplearse como marcador pronstico de la enfermedad. 0928. FIRST REPORT ON ASSOCIATION BETWEEN ANTICYCLIC CITRULLINATED PEPTIDE AND ANTI-SA AUTOANTIBODIES IN RHEUMATOID ARTHRITIS. A. Garca Segovia, J.L.Ruiz Tscar, B. Santamara, S. Snchez-Ramn, S. Toro, F.J. Lpez Longo1, J.J. Rodrguez-Molina, E. Fernndez-Cruz, M. RodrguezMahou. Departments of Immunology, and 1Rheumatology, H.G.U. Gregorio Maran. Madrid. Spain Introduction. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease with a prevalence of 1%. Rheumatoid factor (RF) is used
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as a non-specific marker for RA. Several autoantibodies (AA) have become candidates as diagnostic markers for RA: antiperinuclear factor/antikeratin/antifilaggrin/anti-citrullinated peptide (CCP), antiSa, and anti-heavy chain binding protein/p68 AA, with >90% specificity. Objectives. 1. To determine the sensibility and specificity of serum anti-CCP AA; 2. to ascertain the prevalence of anti-CCP AA in anti-Sa positive (Sa+) vs (Sa-), and in RF+ vs RF-; 3. to determine if positive results for anti-Sa and RF are associated with high titres(HT) of anti-CCP AA in RA patients. Methods. 56 patients with active RA (ACR criteria; 28 Sa+ and 28 Sa-) and a control group of 28 patients (11 systemic lupus erythematosus, 11 osteoarthritis, 6 fybromialgia) were tested. The CCP IgG assay is performed using synthetic CCP enzyme immunoassay (EuroDiagnostica Inmunoscan RA, Medeon, Sweden). The cut-off level of anti-CCP AA was 25 U/ml. Anti-Sa AA were determined by in-house immunoblotting using human placenta antigen. RF was measured by Nephelometry. Results. Sensitivity, specificity and positive predictive value of anti-CCP AA was 92.8, 93.7 and 96.5%, in RA group; increasing to 100, 93.7 and 98.1% in Sa+ group. The prevalence of anti-CCP AA was significantly higher in RF+, whereas no significant differences were observed between Sa+ and Sa- groups. Significant correlations were found in RF+ and Sa+ with HT of anti-CCP. Anti-CCP + patients trend towards presenting more bone erosions, worse radiological degree and ESR>50mm. Conclusion. The presence of RF is related to more prevalence and HT of anti-CCP AA. Anti-Sa AA are associated with HT of antiCCP AA. There is a trend in patients with HT of anti-CCP AA of presenting worse clinical features and prognosis. Given that anti-CCP AA might be useful as an early predictive clinical and prognostic marker of RA. 0929. FRECUENCIA DE GASTRITIS AUTOINMUNES Y SINDROMES POLIGLANDULARES AUTOINMUNES EN LAS DEFICIENCIAS DE VITAMINA B12. L. Delgado, E. Ocaa, J.A. Brieva, C. Rodrguez, J. Muoz1. Servicios de
Inmunologa y 2Hematologa. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz Las deficiencias de vitamina B12 han aumentado significativamente y se producen a edades ms tempranas en nuestro medio. En 63 pacientes remitidos a la consulta de hematologa por macrocitosis con/sin anemia y que presentaban dficit de vitamina B12, se analiz la frecuencia de gastritis crnica y otras enfermedades autoinmunes asociadas, adems de la respuesta al tratamiento. Pacientes y mtodos. Se estudiaron 25 varones y 38 mujeres con edades comprendidas entre los 31 y 88 aos. Se realiz historia clnica y exploracin fsica, hemograma, determinacin de vitamina B12, folatos, pepsingeno, gastrina srica, homocistena, autoanticuerpos (AAc) (clulas parietales, factor intrnseco, tiroideos, corteza adrenal, fosfolpidos etc.), estudio radiolgico digestivo, endoscopia y biopsia gstrica. Resultados. Solamente el 36% de los pacientes mostraron anemia. Se detectaron dos picos de afectacin a 406 y a 787 aos, con predominio mujer/hombre (1,3/1). Se definieron 2 grupos de pacientes: el 64% mostraban hipergastrinemia y descenso de pepsingeno (Grupo I) y el 36 % tenan pepsingeno y gastrina normales (Grupo II). El grupo I present atrofia gstrica (87%), AAc anti-clulas parietales gstricas (91%), AAc anti-factor intrnseco (53%), y enfermedades autoinmunes asociadas (70%) que incluan enfermedad tiroidea autoinmune, diabetes mellitus, celiaqua, SAF, AR, etc, por lo que estos pacientes podan clasificarse dentro del grupo de las gastritis crnicas autoinmunes y/o sndromes poliglandulares autoinmunes. Los pacientes del grupo II correspondan a pacientes gastrectomizados (56%) o ancianos con ingesta deficiente. En los pacientes de este grupo no se detectaron enfermedades autoinmunes asociadas. Los pacientes del grupo I necesitaron terapia sustitutiva continua con vitamina B12 mientras que los del grupo II slo requirieron terapia cclica. Conclusiones. La deficiencia de vitamina B12, an sin alteraciones hematimtricas llamativas, es una anomala en alza entre la poblacin joven, que en gran parte de los casos se debe a gastritis crnica autoinmune y que requiere terapia sustitutiva continua. Esta patologa se asocia frecuentemente a otras enfermedades autoinmunes, lo que justifica un escrutinio en estos pacientes para descartar su existencia.
Sesion 10: Migracin celular: molculas de adhesin, quemoquinas y sus receptores

Comunicaciones Orales: 1001-1010 1001. EXPRESIN Y FUNCIONALIDAD DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS EN NEOPLASIAS DE CLULAS B. S. Lpez-Giral, N.E. Quintana, M. Sala-Valds, M. AlfonsoPrez, V. Gmez G de Soria, J.M. Fernndez Raada, Muoz Cecilia. Departamentos de Inmunologa y Hematologa. Hospital de la Princesa. Madrid Objetivo. Estudio de la capacidad migratoria e invasiva de las neoplasias de clulas B. Mtodos. Anlisis por citometra de flujo de la expresin de los receptores de quimiocinas implicados en la migracin de clulas B en muestras de pacientes con diferentes neoplasias B. Resultados y Conclusiones. Linfomas pregerminales expresan altos niveles de CCR7 y CXCR5. La disminucin de CCR7 y alta expresin de CXCR5 caracterizan a linfomas foliculares y marginales. Tumores postgerminales expresan bajos niveles de ambos mientras que bajos niveles de CXCR5 y la negatividad de CCR7 caracterizan a las neoplasias con diferenciacin plasmactica. Las leucemias agudas son negativas para ambos receptores. Por tanto, la expresin de CCR7 y CXCR5 se correlaciona de forma inversa con el estado de diferenciacin de las neoplasias de clulas B maduras. El mismo anlisis realizado en los correspondientes equivalentes celulares normales sugiere que los patrones de expresin en clulas neoplsicas parecen ser una caracterstica derivada de su clula de origen y no el resultado de una transformacin oncognica.
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El estudio funcional se centr en CCR7, principal responsable de la entrada de los linfocitos en el ganglio linftico. As, los altos niveles de CCR7 observados en leucemia linftica crnica B (LLC-B) y linfoma del manto concuerdan con el carcter diseminado de estas patologas. Observamos que la capacidad migratoria de las clulas LLC en respuesta a los ligandos de CCR7 es muy variable, sin poder demostrar correlacin entre dicha capacidad y la presencia de linfadenopata en los pacientes. En conclusin, las neoplasias de clulas B mantienen los patrones migratorios fisiolgicos de clulas B, los cuales determinan, al menos en parte, la invasividad de dichos tumores. 1002. DROGAS ANTICANCERGENAS DE ORIGEN MARINO DESORGANIZAN LA DISTRIBUCIN DE DIFERENTES COMPONENTES DEL CITOESQUELETO E INHIBEN LA MIGRACIN CELULAR. V. Castilla, M. Pozo, R. de Nicols, J. Egido, J. Gonzlez-Cabrero. Unidad de Investigacin. Laboratorio de Patologa Vascular. Fundacin Jimnez Daz. Universidad Autnoma. Madrid Numerosos compuestos qumicos purificados recientemente procedentes de invertebrados marinos presentan un amplio espectro de acciones biolgicas. Algunos de estos productos han alcanzado fases muy avanzadas de desarrollo preclnico debido a su gran potencial teraputico como drogas antitumorales. Entre ellos se encuentran ecteinascidina 743 (ET-743, Yondelis), aplidina y espisulosina (ES-285). La estructura y funcin del citoesqueleto juegan un papel clave en el mantenimiento y modulacin de la morfologa celular e integridad tisular. La regulacin del citoesqueleto es clave en procesos patolgicos derivados de la disfuncin en la migracin celular, en las respuestas inmune e inflamatoria y en la metstasis tumoral. En este trabajo hemos estudiado el efecto de dichas drogas anticancergenas sobre la distribucin de protenas representativas de elementos estructurales del citoesqueleto, como F-actina de los microfilamentos, -tubulina de los microtbulos y vimentina de los filamentos intermedios. Hemos demostrado, mediante faloidina que en clulas endoteliales humanas ET-743, aplidina y ES-285 a concentraciones de 1M durante 2hr o 100nM durante 18hr desorganizan completamente las fibrillas de F-actina. Estudios de inmunocitoqumica tambin demostraron que las tres drogas son capaces de eliminar la estructura de la -tubulina y desorganizar la distribucin de la vimentina. La F-actina del citoesqueleto es esencial en la migracin celular. Mediante ensayos de quimiotaxis hemos demostrado que ET-743, aplidina y ES-285, a concentraciones de 50nM durante 30min, inhiben drsticamente (70-80%) la migracin de clulas vasculares de msculo liso inducida por el factor quimioatractante PDGF-BB. Nuestros estudios sugieren claramente que las drogas estudiadas, adems de poseer acciones antiproliferativas y antitumorales, podran ser unas terapias eficaces en fenmenos de inflamacin vascular crnica. 1003. ALTA VARIABILIDAD PARA UNA NICA QUIMIOCINA: 5 VARIANTES DE CCL4 (MIP-1). R. Colobran, P. Adreani, Y. Ashhab, O. Domnguez, P. Caro, R. Pujol, M. Juan. LIRAD (Laboratori dImmunobiologia per a la Recerca i Aplicacions Diagnstiques), SSR-CTBT, HUGTIP, UAB. Ctra de Canyet s/n. 08916 Badalona. Barcelona Las quimiocinas constituyen una superfamilia de pequeos polipptidos (8-14 kDa) con capacidad quimioatrayente que contro-
lan selectivamente la adhesin y activacin de muchos tipos de poblaciones y subpoblaciones leucocitarias. La complejidad que existe en la red de relaciones que forman las quimiocinas se debe, principalmente, a los constantes solapamientos funcionales entre sus miembros y a los diferentes sistemas de generacin de variantes altamente homlogas que implican procesos de duplicacin y fusin gnica, splicing alternativo y proteolisis post-traduccional. La quimiocina CCL4 (MIP-1) es un ejemplo paradigmtico debido a la existencia de diversas iso- y aloformas. Concretamente CCL4 est codificada por dos loci genticos (A y B), surgidos posiblemente por duplicacin, que difieren solamente en un aminocido a nivel de la protena madura. Adems el locus B presenta un polimorfismo que provoca la formacin de una protena truncada. Su distribucin poblacional muestra un 27% de heterocigotos y un 3% de homocigotos (un 30% total). Estudios recientes de nuestro laboratorio han demostrado que los dos loci de esta quimocina expresan una variante originada por splicing alternativo que excluye el segundo exn en la formacin del mRNA (MADSP y MBDSP). La existencia de estas 5 variantes que se engloban genricamente dentro del nombre de CCL4, plantea dos lineas bsicas de trabajo: a) Estudiar las diferencias funcionales entre las diferentes variantes existentes de CCL4 a partir de la clonacin y expresin recombinante de estas protenas y b) Analizar como se distribuye su expresin utilitzando un diseo experimental desarrollado en nuestro laboratorio que incluye RT-AFLP y Real-Time PCR. Adems de completar la descripcin de las variantes de CCL4, ya iniciada anteriormente en este mismo congreso, los primeros resultados de estas dos aproximaciones incluyen ensayos de quimiotaxis y los porcentajes de expresin de las diferentes variantes de CCL4 en distintas subpoblaciones leucocitarias y bajo diferentes situaciones estimulatorias. En conjunto este trabajo es un ejemplo de como partiendo de un nico gen existen mecanismos para generar diferentes molculas con potencialidad para ejercer funciones distintas. 1004. DROGAS ANTICANCERGENAS DE ORIGEN MARINO DISMINUYEN LA EXPRESIN DE MOLCULAS DE ADHESIN ENDOTELIAL. M. Pozo, V. Castilla, R. de Nicols, J. Egido y J. Gonzlez-Cabrero. Unidad de Investigacin. Laboratorio de Patologa Vascular. Fundacin Jimnez Daz. Universidad Autnoma. Madrid Los organismos invertebrados marinos producen una enorme diversidad de compuestos qumicos con un amplio espectro de acciones biolgicas. Recientemente se han caracterizado algunos de estos productos como drogas antitumorales con gran potencial teraputico, encontrndose actualmente en fases muy avanzadas de ensayos preclnicos. Entre ellos se encuentran ecteinascidina 743 (ET-743, Yondelis), aplidina y espisulosina (ES-285). La respuesta del organismo al cncer presenta con frecuencia paralelismos con fenmenos de inflamacin crnica, siendo el endotelio vascular una de las estirpes celulares ms implicadas en ambos procesos patolgicos. Adems, ciertas clulas tumorales pueden interaccionar con molculas de adhesin durante el proceso de metstasis. Este estudio analiza los efectos de dichas drogas anticancergenas en la adhesin de la lnea de leucemia monoctica aguda THP1 sobre una monocapa de clulas endoteliales humanas, as como la expresin de molculas de adhesin. Hemos observado que clulas endoteliales preincubadas con ET-743 durante 30min y posterior esti-
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mulacin con IL-1 durante 24hr redujo significativamente la adhesin de clulas THP-1 de manera dependiente de la dosis, llegando a un 70% de inhibicin a una concentracin de 100nM de dicha droga. Mediante citometra de flujo tambin hemos demostrado que la preincubacin de clulas endoteliales con ET-743 y Aplidina disminuy drsticamente la expresin de VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina en clulas endoteliales activadas con IL-1 durante 24 o 4hr. El compuesto ES-285 no logr modificar la expresin de dichas molculas de adhesin. Adems de las potentes propiedades antitumorales descritas hasta el momento, las drogas estudiadas muestran unos prometedores efectos antiinflamatorios. El estudio de nuevas estrategias teraputicas que incluyan procesos de inhibicin de la expresin de molculas adhesin endotelial, podran colaborar en la prevencin de la formacin de metstasis y progresin tumoral. 1005. PAPEL DEL RECONOCIMIENTO CXCR4-SDFI- EN LA MIGRACIN DE LAS CLULAS PLASMTICAS HUMANAS CIRCULANTES. I. Gonzlez-Garca, G. Jimnez, J A. Brieva. Servicio de Inmunologa y Unidad de Investigacin. Hospital Universitario Puerta del Mar. Cdiz Las clulas plasmticas (CP) son heterogneas en cuanto a su nivel madrativo y funcional. Las CP se forman en los rganos linfoides secundarios tras el estmulo antignico y, en parte, emigran por la circulacin hacia rganos de deposito definitivos, como la mdula sea. Pocos das despus de la inmunizacin de humanos, se observa en la sangre (S) la aparicin transitoria de CP, lo que constituye un modelo para el estudio de la fase circulante de estas clulas, en el que poder analizar los mecanismos de alojamiento de las mismas en los rganos de depsito. Las CP de S (CD19 CD38+++) no expresan CCR2, 3, 4, 5, 7, 9, CXCR2, 5 y 6, detectndose slo parcialmente CXCR3 y CXCR4. La expresin de este ltimo receptor, sin embargo, aumentaba hasta hacerse positiva en la mayora de las CP tras una pre-incubacin de las CP de una hora a 37C. Se pas por tanto a explorar la capacidad de migracin de las CP de S a SDF1a, ligando de CXCR4, en un sistema transwell y mediante citometria de flujo, observndose un ndice de migracin de 2,5 veces sobre el control a una concentracin de quemoquina de 1 g/ml (n = 6; p<0.003). Esta actividad no ocurra cuando se usaba TECK, y se inhiba completamente cuando se trataban las clulas con un Ac anti-CXCR4 bloqueante, o mediante aadir al medio Ac anti-SDF1 bloqueante. Estos datos indican que las CP humanas circulantes expresan CXCR4 y migran a SDF1, sugiriendo la posibilidad de que este mecanismo est involucrado en el alojamiento de las CP circulantes en los rganos de depsito. 1006. PATRN DE EXPRESIN DE MOLCULAS DE ADHESIN EN LAS DISTINTAS ETAPAS MADURATIVAS DE LA SERIE ERITROIDE DE MDULA SEA HUMANA: REGULACIN Y ALTERACIONES EN DIFERENTES PATOLOGAS. N. Villarrubia1, J.A. Garca-Trujillo1, J.L. Velasco2, J. Campos1, L. M. Villar1, A. Bootello1 y E. Roldn1. Servicios de 1Inmunologa y 2Hematologa. Hospital Ramn y Cajal. Madrid Introduccin. La expresin de varias molculas de adhesin en eritroblastos de mdula sea (MO) humana se ha relacionado con su tendencia a permanecer en este microambiente. Sin embargo, su regulacin en las diferentes fases de la maduracin eritroide, as como
su implicacin en la liberacin de clulas eritroides inmaduras a sangre perifrica (SP) en diferentes patologas, es en gran medida desconocido. Objetivos. 1) Descripcin del patrn de expresin de molculas de adhesin en eritroblastos de MO en las diferentes fases madurativas de la serie eritroide; 2. mecanismos de regulacin de dichas molculas; 3. alteraciones en su expresin en diferentes patologas y 4. correlacin entre dichas alteraciones y la presencia en SP de formas eritroides inmaduras. Materiales y mtodos. Deteccin de eritroblastos con AcMo anti-CD71 en muestras de MO y de SP; deteccin de CD106 y de la forma activada de CD29 con los clones 1G11 y HUTS21, respectivamente. Los reticulocitos se detectan como clulas CD45-, Naranja de Tiazol+ y los eritrocitos como clulas glicoforina+ con FSC y SSC bajos. Resultados. Los eritroblastos de MO expresan CD29 activado y CD106 en condiciones fisiolgicas, con una expresin mxima en la fase del proeritroblasto y regulndose negativamente en fases ms maduras, desapareciendo totalmente en reticulocitos y hemates circulantes. La expresin de la forma activada de CD29 depende de un factor soluble presente en suero, an no caracterizado. Los eritroblastos de MO de enfermos con sndrome mielodisplsico expresan niveles anormalmente bajos de CD29 activado y de CD106, alteraciones que se asocian con la presencia de precursores eritroides en SP. Conclusiones. CD106 y la forma activada de CD29 se expresan a diferentes niveles en las distintas fases madurativas de la serie eritroide. La ausencia total o parcial de estas molculas se asocia con diseritropoyesis y salida de formas inmaduras a SP, lo que posiblemente indica que juegan un papel en la localizacin de estas clulas en el microambiente medular. 1007. LAS TETRASPANINAS CD9, CD81 Y CD151 SE ASOCIAN A LAS MOLCULAS ENDOTELIALES DE ADHESIN VCAM-1 E ICAM-1 POTENCIANDO SU FUNCIN ADHESIVA DURANTE LA EXTRAVASACIN LINFOIDE. O. Barreiro, M. Ynez-M, M D. Gutirrez-Lpez, C. Cabaas, F. Snchez-Madrid. Servicio de Inmunologa, Hospital Universitario de la Princesa. C/ Diego de Len 62, 28006 Madrid. Espaa Las molculas endoteliales de adhesin VCAM-1 e ICAM-1 participan en la formacin de la estructura tridimensional de anclaje, sustentada por el citoesqueleto de actina, que permite la adhesin firme del leucocito al endotelio y que es necesaria para la correcta consecucin del proceso de transmigracin endotelial. Tratando de estudiar la contribucin relativa de ICAM-1 y VCAM-1 a la formacin de dicha estructura adhesiva, hemos observado que ambas molculas se relocalizan a la zona de interaccin con el leucocito de manera independiente de ligando. La colocalizacin y copresentacin de VCAM-1 e ICAM-1 ocurre de manera independiente de su dominio citoplsmico, sugiriendo que la asociacin tiene lugar a travs de los dominios extracelular o transmembrana. Sin embargo, la unin de VCAM-1 e ICAM-1 al citoesqueleto de actina es necesaria para la adecuada formacin de la estructura tridimensional de anclaje. Las tetraspaninas parecan posibles candidatos responsables de la copresentacin de estas molculas dado que son capaces de asociarse a protenas transmembrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas a travs de su segundo loop extracelular. Miembros de esta familia como CD9, CD81 y CD151 se expresan en endotelio y colocalizan con VCAM1 e ICAM-1 en la estructura endotelial de anclaje. Adems, CD9 y
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CD151 coprecipitan con ICAM-1 y VCAM-1 en condiciones de extraccin suaves. Finalmente, la inhibicin de la asociacin lateral con las tetraspaninas conlleva una disminucin en la capacidad adhesiva de VCAM-1 e ICAM-1. En conclusin, las tetraspaninas forman microdominios proticos de membrana en los que se concentran protenas de adhesin. De esta manera se consigue potenciar su presentacin y aumentar, por ende, su funcin adhesiva para facilitar e incrementar la eficiencia de la extravasacin leucocitaria. 1008. PAPEL DE LA MOLCULA EFECTORA DE RHOA, MDIA, EN LA REGULACIN DEL CITOESQUELETO Y LA MIGRACIN DE LOS LINFOCITOS. M. PrezMartnez, M. Vicente-Manzanares, M. Rey, M. Ynez-Mo, J. R. Cabrero, O. Barreiro y F. Snchez-Madrid. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario de La Princesa. C/ Diego de Len N 62, C.P. 28006, Madrid La regulacin de la polimerizacin de actina es fundamental para muchas de las funciones de los linfocitos T, incluida la migracin. En este trabajo se demuestra que la molcula efectora de RhoA, mDia, se induce durante la activacin de los linfocitos T in vitro, y se expresa en los infiltrados linfocitarios de enfermedades inflamatorias. mDia se localiza en el frente de avance de los linfoblastos T polarizados, en el rea adyacente al lamelipodio frontal, en el cual tambin se concentra su protena efectora, profilina. Un mutante activado de mDia tambin se localiza en el frente de avance de clulas T polarizadas e induce la acumulacin de F-actina en esta estructura. La activacin de mDia induce un incremento de la actina polimerizada, la cual bloquea la polimerizacin de actina inducida por quimioquinas. Por otro lado, la polimerizacin de actina inducida por mDia es parcialmente dependiente de la integridad de los microtbulos, pero no se modula por Rac1. Finalmente, la sobreexpresin de mDia, da como resultado un descenso de la motilidad de clulas T tanto espontnea como dirigida por quimioquinas. En conjunto, nuestros resultados demuestran que RhoA est involucrado en el control del equilibrio entre F-actina y G-actina a travs de mDia, y que este equilibrio es crtico para las respuestas migratorias de las clulas T. 1009. EFECTO DEL TRATAMIENTO CORTICOIDEO TPICO SOBRE EL INMUNOFENOTIPO Y LA EXPRESIN DE RECEPTORES DE QUIMIOQUINAS EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA DE PACIENTES ASMTICOS. J. Barbarroja1, A. Prieto1, E. Reyes1, H. Barcenilla1, D. Daz1, E. San Antonio1, A. Ruz2, J. Flores2, F. Canseco1,2, M. lvarez de Mon1,3. 1Dpto. de Medicina UAH, 2Servicio de Neumologa HUPA, 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Madrid Antecedentes. Se desconoce el posible efecto del tratamiento corticoideo sobre las alteraciones inmunofenotpicas y de expresin de quimiorreceptores en linfocitos de sangre perifrica de pacientes con asma. Mtodos. Se estudi el inmunofenotipo de linfocitos T y B de sangre perifrica en 24 pacientes asmticos y en 11 controles sanos no fumadores de edades similares. Los pacientes asmticos se clasificaron en tres grupos de tratamiento: pacientes sin corticoides (n = 6); pacientes hasta 1000 g/da de fluticasona (n = 12); y pacientes con dosis mayores de 1000 g/da (n = 6).
Resultados. Los pacientes sin tratamiento presentan aumentos en la poblacin CD4+CD45RO-CD28+ y en la expresin del quimiorreceptor CXCR3 en la poblacin CD8+CD25+ y del CCR6 en las poblaciones CD4 y CD8 recientemente activadas, CD8+CD25+ y CD8+CD25+ brillantes. En pacientes hasta 1000 mg/da se observa aumento de las poblaciones efectoras CD4+CD28-CD57+ y CD4+CD45RO+CD28-CD57+, y en la expresin del quimiorreceptor CXCR3 en la poblacin citotxica CD8+CD28+ y del CCR5 en linfocitos T, CD4+CD28+, CD8+CD28+, CD8+CD25+ y CD8+CD25+ brillantes, aunque con disminucin de la expresin de CCR2 en los linfocitos T. Con las dosis mximas se observa disminucin de las poblaciones CD4+, CD8+CD45RO+, linfocitos T y clulas T killer, con aumento en la expresin del quimiorreceptor CXCR3 en las poblaciones CD4+, CD4+CD45RO+ y CD4+HLA-DR+, y del CCR6 en CD4+, CD4+CD45RO+, CD4 recientemente activadas, CD4+CD28+, CD4+CD25+ y CD4+CD25+ brillantes. Conclusiones. El tratamiento corticoideo disminuye de forma dosis dependiente el porcentaje de las clulas efectoras y memoria, as como la expresin del quimiorreceptor CCR5 sin conseguir alterar la sobreexpresin del CCR6 de varias subpoblaciones linfocitarias. Adems, el tratamiento a dosis mximas induce tambin disminuciones significativas que afectan a los linfocitos T y a los CD3+CD56+. 1010. LA ACTIVACIN DE LA INTEGRINA 41 CON Mn2+ O CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-1 TS2/16 RESULTA EN UNA DIFERENTE REORGANIZACIN DEL CITOESQUELETO EN CLULAS T. A. Maqueda1, J.V. Moyano1, D. Gutirrez-Lpez2, C. Cabaas2, . Garca Pardo1. 1Dpto. de Inmunologa. Centro de Investigaciones Biolgicas. CSIC. Madrid. Espaa y 2Instituto de Farmacologa y Toxicologa. CSIC-UCM. Madrid, Espaa (A. Maqueda y J.V. Moyano contribuyen por igual a este trabajo) La integrina 41, una de las principales integrinas en linfocitos, puede ser regulada por agentes externos como el Mn2+ y el Anticuerpo Monoclonal anti-1 TS2/16, los cuales mimetizan el efecto de estmulos fisiolgicos. Con anterioridad, hemos descrito que en clulas Jurkat el Mn2+ y el TS2/16 median adhesin celular, a travs de la integrina 41, al fragmento de fibronectina FNIII4-5, que comprende el dominio Hep III. Esta adhesin a FN III4-5 requiere la cooperacin de proteoglicanos de tipo condroitn-sulfato cuando la integrina a4b1 es activada con Mn2+, pero no con TS2/16, lo que sugiere diferentes formas de activacin/ que las formas de activacin son diferentes. Hemos estudiado en clulas Jurkat la morfologa del citoesqueleto tras la activacin de la integrina 41 y su adhesin a FN III45, as como a otros 2 fragmentos de Fibronectina que tambin unen 41: los fragmentos H0 y H89. Con /Sobre los 3 sustratos el tratamiento con Mn2+ induce una morfologa polarizada, mientras que el tratamiento con TS2/16 resulta en /induce una morfologa celular redondeada y extendida./spreading. El tratamiento con Chondroitinasa inhibe parcialmente el patrn morfolgico inducido por la activacin con Mn2+, pero no con TS2/16, donde no tiene efecto alguno. Adems, la activacin de RhoA por LPA o por transfeccin con V14RhoA, suprime por completo las elongaciones citoplasmticas inducidas por el Mn2+, dando lugar a una clula contrada y redondeada. Por el contrario, la respuesta inducida por el TS2/16 no se ve afectada por RhoA, lo que sugiere que la activacin por TS2/16 puede producir la mxima activacin de RhoA.
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De hecho en ensayos de Pull-Down, TS2/16, pero no el Mn2+,regula positivamente la actividad de RhoA . Estos resultados indican que el Mn2+ y el TS2/16 inducen diferentes procesos post-adhesin y demuestran que la respuesta mediada a travs de la integrina 41, puede estar regulada claramente por estmulos especficos. Posters: 1011-1023 1011. EXPRESIN DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS EN LINFOCITOS B HUMANOS DE SANGRE DE CORDN UMBILICAL. E. Ocaa, J.A. Brieva. Servicio de Inmunologa. Hospital Puerta del Mar. Cdiz Introduccin. Los linfocitos B (LB) humanos de cordn umbilical (CU) se caracterizan por ser clulas naive (CD27-, IgM+/IgD+), pero no se conoce el patrn de expresin de receptores de quimiocinas ( RQ ) y su capacidad quimiotctica . En este trabajo se analiza la expresin de RQ en LB CD5+ y CD5- tanto de sangre perifrica (SP) como de CU. Materiales y mtodos. Se utilizaron muestras de SP de adultos y de sangre de CU. Se separaron las clulas mononucleares mediante gradiente de densidad (Ficoll), y se analiz sobre la poblacin CD19+ la expresin de RQ (CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6) mediante citometra de flujo utilizando Ac. monoclonales especficos. Para realizar los estudios de quimiotaxis se utiliz la tcnica de rosetas con hematies de carnero para eliminar la poblacin de linfocitos T. La quimiotaxis se realiz usando pocillos Transwell de 5 m de dimetro y contando las clulas que haban migrado mediante citometria de flujo. Resultados. Los LB de CU expresaban nicamente CXCR4 y CXCR5, a diferencia de los de SP que eran CXCR4+, CXCR5+ y parcialmente CXCR3+. Adems la intensidad media de fluorescencia ( IMF ) de la expresin de CXCR4 era significativamente mayor en LB CU que en LB SP. Cuando se analiz la expresin de RQ en LB CD5+ y CD5- de CU no se detect ninguna diferencia, pero en el caso de LB SP se observ que slo los LB CD5- eran CXCR3+ y adems estos eran LB memoria, CD27+. Puesto que los LB CU eran CXCR3-, se estimularon con SAC y SAC+IL-2 para ver si eran capaces de expresar dicho receptor, encontrndose que tras 24h de estimulacin aproximadamente el 50% de los LB CU lo expresaban. Se analiz la capacidad quimiotctica a SDF-1, encontrndose que el ndice de migracin respecto al control de los LB CU era superior al de LB SP (2.1 vs 1.3 ; p < 0.02) , lo cual puede deberse a la mayor expresin de CXCR4 encontrada en dichas clulas. Conclusiones. 1. Los LB de CU slo expresan CXCR4 y CXCR5. 2. Los LB de SP de adultos difieren en que adems de estos dos receptores , expresan parcialmente CXCR3. Esto ltimo est restringido a una fraccin de LB CD27+ (memoria). Sin embargo, la estimulacin mitognica de los LB de CU inducen la expresin de CXCR3 sobre stas clulas 3. La mayor IMF de CXCR4 en LB CU se traduce en una mayor respuesta quimiotctica a su ligando SDF-1. 1012. EXPRESIN DE LA 1 INTEGRINA (CD29) EN TUMORES ANIMALES. ANALISIS MEDIANTE MICRODISECCION LASER, PCR CUANTITATIVA E INMUNOHISTOQUIMICA. G. Esteso1, A. Jimnez-Marn1, N. Yubero1, J. Ords2, A. Moreno1, J. Martn de las Mulas2, D. Llanes1, J.J. Garrido1. 1Departamento de Gentica y
Departamento de Anatoma y Anatoma Patolgica Comparada. Facultad de Veterinaria. Universidad de Crdoba

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Las molculas de adhesin no slo se expresan de forma anormal en los tumores, sino que adems participan activamente en el crecimiento y desarrollo de stos. Por esta razn, su estudio y caracterizacin deber contribuir significativamente a la comprensin de algunos de los mecanismos que emplean las clulas tumorales y que pudiesen tener importancia no slo en el diagnstico como marcadores de malignidad, sino tambin en el tratamiento, al permitir inhibir los procesos relacionados con la progresin del tumor. Entre las molculas de adhesin, las integrinas son los receptores responsables de las interacciones clula-clula y clula-matriz extracelular, siendo estos procesos de adhesin cruciales en la generacin de metstasis. En el presente trabajo, hemos empleado la microdiseccin lser para llevar a cabo un estudio de la expresin de la 1 integrina (CD29) a nivel de ARNm mediante PCR cuantitativa. Los resultados fueron posteriormente validados mediante inmunohistoqumica con un anticuerpo policlonal especfico. El estudio fue llevado a cabo en dos modelos de tumores animales: melanoma porcino y carcinoma de mama canino. En el melanoma, observamos una sobreexpresin de la 1 integrina con respecto al nivel de expresin observado en el tejido no tumoral. Este aumento de expresin se observ tanto a nivel de ARNm, como a nivel de protena y estaba relacionado con la aparicin en el tejido canceroso de gran nmero de melanocitos tumorales expresando CD29. Esta relacin entre transformacin tumoral y aumento de expresin de CD29 hacen de esta integrina un buen candidato para su consideracin como marcador tumoral en melanoma. En el tumor mamario canino fue evidenciado un descenso en la expresin de la b1 integrina relacionado con un aumento de la malignidad del tumor. As, con respecto a su expresin en la mama normal, se observ un descenso del nivel de expresin de CD29 en el adenoma mamario, un tumor benigno, y una prctica desaparicin de la expresin en el carcinoma, grado mximo de malignidad de este tipo de tumor. 1013. REGULACIN DEL TRFICO DE MT1-MMP POR CAVEOLAS EN CLULAS ENDOTELIALES HUMANAS. B.G. Glvez, S. Matas-Romn, M. Yez-M, M. VicenteManzanares, F. Snchez-Madrid, A.G. Arroyo. Departamento de Inmunologa, Hospital Universitario de la Princesa, C/ Diego de Len 62, 28006 Madrid, Spain. e-mail: bggalvez@hotmail.com. Tln: 915202334. La matrix extracelular regula la metaloproteasa de membrana MT1-MMP y la actividad de esta proteina se ha demostrado ser importante para la migracin celular y la angiognesis. Nuestro estudio demuestra que las caveolas, dominios de membrana implicados en sealizacin y trfico celular, son la principal va de internalizacin de MT1-MMP en clulas endoteliales humanas (CEs). MT1-MMP interacciona con caveolina-1 y ambas proteinas colocalizan en estructuras mtiles de CEs junto con integrinas avb3. Adems, MT1-MMP y caveolina-1 son capaces de viajar juntas en las CEs utilizando videomicroscopa confocal; sin embargo, tras la activacin de RhoA ambas proteinas se disocian y MT1-MMP relocaliza a los contactos celulares y se bloquea su internalizacin. La integridad de caveolas se requiere para la correcta localizacin, activacin, y funcin de MT1-MMP durante la migracin celular, invasin y formacin de capilares. Por
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tanto, las caveolas constituyen un nuevo mecanismo para la regulacin de MT1-MMP en clulas endoteliales durante la angiognesis. Adems, el trfico de MT1-MMP mediado por caveolas esta regulado por la actividad de RhoA. 1014. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE LA PROTENA PRIN (PrP, CD230) EN PLAQUETAS Y LEUCOCITOS PORCINOS MEDIANTE EL EMPLEO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES. G. Paos Adillo1, D. Llanes Ruiz1, A. Moreno Lpez1, M-S Syn2. 1Unidad mixta UCO-CSIC de Marcadores Genticos Moleculares de Animales Domsticos y de Compaa. 2School of Medicine. Cleveland. Ohio Tras la aparicin de la encefalopata espongiforme bovina y de su variante humana a mediados de la dcada de los 90. el inters por el estudio de las encefalopatas espongiformes se ha acrecentado enormemente. Especial atencin ha recibido el estudio de la etiologa y patogenia de este tipo de trastornos, que se ha relacionado con la acumulacin en las neuronas de una forma alterada de la PrP (CD230), una protena presente en diversos tejidos en condiciones fisiolgicas. En este estudio se aborda el estudio de la expresin de PrP en clulas del sistema inmune porcino. La especie porcina se caracteriza por ser una de las pocas especies domsticas en que no se ha descrito una patologa del tipo de las encefalopatas espongiformes, por lo que el estudio de la expresin de PrP en cerdo podra tener inters por la posible relacin entre la distribucin y expresin tisular de este marcador y la patogenia de dichas patologas. Mediante el empleo de tres anticuerpos monoclonales desarrollados frente a PrP bovino (8B4, 8H4 y 7A13), y recurriendo a la citometra de flujo y al inmunoblotting, se estudi la expresin de PrP en plaquetas y leucocitos porcinos en comparacin con la expresin en pequeos rumiantes. Los resultados obtenidos permitieron concluir que los anticuerpos empleados reconocan especficamente el homlogo porcino de PrP en inmunoblotting sobre lisados enceflicos, pero que las plaquetas y leucocitos porcinos no expresaban en sus membranas dicho marcador, al contrario que las especies usadas como control. Esta peculiaridad en la expresin de PrP en la especie porcina podra tener relacin con la inexistencia de encefalopata espongiformes en esta especie y podra abrir nuevas vas en el estudio de la patogenia de este tipo de trastornos. 1015. LA GLIOTOXINA INHIBE LA HIPERPLASIA NEOINTIMAL Y LA EXPRESIN DE LA PROTENA QUIMIOATRACTANTE DE MONOCITOS-1 EN LA CARTIDA DE RATA DESPUS DE ANGIOPLASTIA. M. Pozo, R. de Nicols, J. Egido, J. Gonzlez-Cabrero. Unidad de Investigacin. Laboratorio de Patologa Vascular. Fundacin Jimnez Daz. Universidad Autnoma. Madrid La gliotoxina es un metabolito de origen fngico con propiedades inmunomoduladoras, inhibiendo la proliferacin y activacin de linfocitos T y B, y del factor de transcripcin NF-B. Nuestro grupo ha demostrado que la gliotoxina inhibe la adhesin de la lnea monoctica THP-1 a una monocapa de clulas endoteliales activadas con IL1b, mediante la inhibicin de las molculas de adhesin ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina. En este trabajo hemos observado que la gliotoxina es capaz de inhibir la migracin de clulas de msculo liso vascular de rata frente al estmulo quimiotctico PDGF-BB, siendo de un 95% a una con-
centracin de 200ng/ml y del 40% a 50ng/ml despus de 2hr de incubacin. Adems la gliotoxina es capaz de desorganizar los microfilamentos de F-actina y la distribucin de los filamentos intermedios de vimentina. El modelo inflamatorio de dao endotelial en la cartida de rata inducido por embolectoma est caracterizado por la migracin y proliferacin de clulas musculares desde la media hacia la ntima, y la expresin de citoquinas como la protena quimioatractante de monocitos-1 (MCP-1). Hemos demostrado que el tratamiento diario con gliotoxina a dosis de 200 y 400g/kg/da durante 10 das disminuy drsticamente el dao vascular y la relacin neontima/media un 42% (0.550.26 [p<0.0001]) y un 90% (0.090.07, [p<0.0001]) respectivamente con respecto a los no tratados (0.940.18). Tambin hemos demostrado que la gliotoxina a dosis de 400g/kg/da reduce significativamente la expresin de ARN de MCP-1 hasta un 40% (controles 0.773 u.a. vs tratados 0.479 u.a. [p<0.05]). En conjunto, estas observaciones demuestran que algunos potentes agentes inmunosupresores, como la gliotoxina, modulan favorablemente la respuesta al dao vascular, ofreciendo la posibilidad de una aproximacin teraputica para prevenir la restenosis clnica despus de una angioplastia, en parte a travs de una accin sobre el sistema inflamatorio. 1016. EL CIDO URSLICO INHIBE LA MIGRACIN DE CLULAS DE MSCULO LISO VASCULAR Y LA HIPERPLASIA NEOINTIMAL DESPUS DE ANGIOPLASTIA. M. Pozo, V. Castilla, C. Gutirrez, R. de Nicols, Je. Egido, J. Gonzlez-Cabrero. Unidad de Investigacin. Laboratorio de Patologa Vascular. Fundacin Jimnez Daz. Universidad Autnoma. Madrid Los triterpenoides pentacclicos son compuestos naturales que se encuentran ampliamente distribuidos en los vegetales. Poseen una toxicidad muy baja y desde antiguo se conocen sus propiedades antiinflamatorias y anticancergenas, usndose en la medicina tradicional asitica. Representantes de este tipo de compuestos son el cido urslico (AU), cido oleanlico (AO) y cido betulnico (AB). El presente trabajo est diseado para estudiar el efecto de los triterpenos sobre la migracin de las clulas vasculares de msculo liso (rVSMC) y en un modelo inflamatorio de dao endotelial en la cartida de rata inducido por embolectoma, caracterizado por la migracin y proliferacin de clulas musculares desde la media hacia la ntima. La incubacin de las rVSMC durante 4hr con 50M de AU, AO o AB inhibi significativamente la quimiotaxis inducida por PDGFBB en un 75%, 65% y 45% respectivamente. Se sabe que la integridad del citoesqueleto es crucial para permitir la motilidad y proliferacin celular. As, hemos demostrado que las tres drogas son capaces de eliminar la disposicin radial caracterstica de la -tubulina de los microtbulos y de desorganizar la estructura y distribucin de los filamentos intermedios de vimentina. En ensayos in vivo hemos demostrado que la administracin intraperitoneal diaria de cido urslico a dosis de 2 y 6 mg/kg/da durante 10 das despus de inducir el dao por baln disminuy significativamente la lesin vascular y la relacin neontima/media un 46% (0.510.24 [p<0.0001]) y un 78% (0.210.21, [p<0.0001]) respectivamente con respecto a los no tratados (0.940.18). Estos resultados demuestran que los triterpenoides pentacclicos pueden regular de manera significativa la migracin de clulas vasculares y la distribucin de distintos elementos estructurales del citoesqueleto, mostrndose como agentes antiinflamatorios con un
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potencial valor teraputico en el dao vascular en situaciones de aterosclerosis y restenosis. 1017. REGULACIN DE LA EXPRESIN DE MT1-MMP EN MONOCITOS HUMANOS POR ADHESIN A FIBRONECTINA O A CLULAS ENDOTELIALES. S. Matas-Romn, B. G. Glvez, A. G. Arroyo. Departamento de Inmunologa. Hospital Universitario de la Princesa. Madrid El reclutamiento de monocitos de sangre hacia los tejidos es clave en la respuesta inflamatoria; durante este proceso es necesario que los monocitos atraviesen tanto el endotelio vascular como la membrana basal subyacente. Sin embargo, an no se conoce el mecanismo especfico por el cual los monocitos migran al foco inflamatorio. La metaloproteinasa de matriz de membrana MT1-MMP es importante en la proteolisis de la matriz as como en la activacin de otras metaloproteinasas como MMP-2. Se ha descrito previamente cmo MT1MMP se induce en monocitos activados con lipopolisacrido. Nosotros hemos observado que la adhesin de monocitos humanos a fibronectina induce la expresin y la actividad de MT1-MMP. Dicha induccin parece depender de la unin a fibronectina va integrinas 4. Adems, hemos detectado un aumento de la expresin en membrana de MT1-MMP cuando los monocitos se adhieren a una monocapa de clulas endoteliales activadas o sin activar. Estos datos muestran que la expresin de MT1-MMP en monocitos humanos est regulada por la adhesin a componentes de la matriz extracelular y/o al endotelio vascular, lo cual sugiere que esta proteinasa podra desempear un papel importante en la migracin de monocitos. 1018. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DE RECEPTORES DE QUIMIOCINAS EN PACIENTES CON ESCLEROSIS MLTIPLE DURANTE EL EMBARAZO. C. Lpez, M. Comabella, M. Tintor, X. Montalban. Unitat de Neuroinmunologa Clnica. Hospital Universitari Vall dHebron. Barcelona La esclerosis mltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crnica del sistema nervioso central mediada por clulas T autorreactivas de fenotipo Th1. Las quimiocinas son un grupo de citocinas que intervienen en el reclutamiento de clulas a los sitios de inflamacin. Algunos receptores de quimiocinas, como el CCR5 y el CXCR3, se han implicado en la patogenia de la enfermedad. Durante el embarazo las pacientes con EM presentan una disminucin en la actividad de la enfermedad, sobretodo durante el tercer trimestre. Este efecto beneficioso del embarazo podra deberse a cambios en la expresin de receptores en las clulas del sistema inmune. Los objetivos propuestos para este trabajo fueron los siguientes: 1. Estudiar la expresin de los receptores de quimiocinas CCR4, CCR5, CCR3, CXCR3 y CXCR4 en linfocitos T, clulas NK, linfocitos B y monocitos de pacientes con EM durante el embarazo. 2. Estudiar la expresin de IL-10 e IFN- en linfocitos T CD4+ durante el embarazo en pacientes con EM. El estudio longitudinal se llev a cabo en 10 pacientes EM antes del embarazo y durante el mismo en los siguientes periodos: primero, segundo y tercer trimestres y en los 6 meses post-parto. La expresin de los receptores de quimiocinas CCR4, CCR5, CCR3, CXCR3 y CXCR4 se analiz por citometra de flujo, y la expresin de citocinas se estudi mediante PCR a tiempo real.
Se observ una disminucin estadsticamente significativa en la expresin de CXCR3 en el segundo trimestre del embarazo en linfocitos T CD8+ y CD4+. Por el contrario, la expresin de CXCR4 estaba aumentada de forma estadsticamente significativa durante el tercer trimestre del embarazo en linfocitos T CD8+ y CD4+. Finalmente se observ un aumento del cociente Th2/Th1 durante el embarazo y una disminucin del mismo en el periodo post-parto. Los cambios observados en la expresin de receptores de quimiocinas, con disminucin de CXCR3, receptor expresado en linfocitos Th1, y aumento de CXCR4, receptor asociado a linfocitos Th2, podran contribuir al efecto beneficioso del embarazo en la actividad de la EM. 1019. ALTERACIONES DE EXPRESIN DE CCR2, CXCR3 Y CCR6 EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA EN PACIENTES ASMTICOS ALRGICOS. J. Barbarroja1, A. Prieto1, E. Reyes1, H. Barcenilla1, P. Prieto1, V. Sualdea1, A. Ruz2, J. Flores2, F. Canseco1,2, M. lvarez de Mon1,3. 1Dpto. de Medicina UAH, 2Servicio de Neumologa HUPA, 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Madrid Antecedentes. Nuestro grupo ha demostrado la existencia de alteraciones inmunofenotpicas y de expresin de quimiorreceptores en linfocitos de sangre perifrica de pacientes con asma. Mtodos. Se estudi el inmunofenotipo y la expresin de quimiorreceptores de linfocitos T y B de sangre perifrica en 24 pacientes asmticos (9 alrgicos y 15 no alrgicos) y en 11 controles sanos no fumadores de edades similares para relacionar sus alteraciones con la etiologa del asma. Resultados. Las poblaciones de linfocitos CD4 y CD8 recientemente activados (CD45RA+CD45RO+) y la poblacin T killer (CD3+CD56+) se encuentran disminuidas en estos pacientes con respecto a los alrgicos y a los controles. Se observ un aumento en la expresin del CXCR3 en la poblacin citotxica CD8+CD28+, una disminucin de la expresin de CCR2 en la subpoblacin NK, y una expresin significativamente mayor de CCR6 en linfocitos T killer de asmticos alrgicos respecto a no alrgicos y a controles. La expresin de quimiorreceptores en pacientes no alrgicos es similar a la poblacin control. Comparando asmticos entre s, se observ una disminucin significativa del porcentaje de la poblacin activada CD8+CD25, y una expresin aumentada de CCR6 en las poblaciones T killer y CD8+CD25+ brillantes en asmticos alrgicos respecto a los no alrgicos. Conclusiones. Las tcnicas de citometra de flujo demuestran que los asmticos alrgicos presentan un inmunofenotipo similar a los controles no fumadores aunque con diferencias en la expresin de algunos quimiorreceptores. En asmticos no alrgicos, las alteraciones se encuentran en el fenotipo, manteniendo una expresin de quimiorreceptores similar a la de los controles. Adems existen diferencias en el inmunofenotipo y en la expresin del quimiorreceptor CCR6 en algunas poblaciones de asmticos alrgicos con respecto a los no alrgicos. 1020. ALTERACIONES EN LA EXPRESIN DE QUIMIORRECEPTORES CCR2 Y CXCR3 EN POBLACIONES LINFOCITARIAS DE SANGRE PERIFRICA EN PACIENTES ASMTICOS. J. Barbarroja1, A. Prieto1, E. Reyes1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, J. Flores2, A. Ruz2, F. Canseco1,2, M. lvarez de
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Mon1,3. 1Dpto. de Medicina UAH, 2Servicio de Neumologa HUPA, 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Madrid. Antecedentes. La expresin de receptores de quimioquinas por los leucocitos es un elemento esencial en los procesos de infiltracin de los tejidos inflamados. Las tcnicas de citometra de flujo han mostrado su utilidad para detectar alteraciones en la expresin de quimiorreceptores en poblaciones linfocitarias de pacientes con procesos inflamatorios. Objetivos. Caracterizar las alteraciones en la expresin de quimiorreceptores por los linfocitos de sangre perifrica de pacientes asmticos. Mtodos. Se estudi mediante tcnicas de citometra de flujo de cuatro colores la expresin de los quimiorreceptores CCR2, CCR5, CCR6, CXCR3 y CXCR4 en linfocitos T y B de sangre perifrica de 24 pacientes asmticos y de 11 controles sanos no fumadores de edades similares. Resultados: No se encontraron alteraciones en la expresin de los quimiorreceptores CXCR4, CCR5 y CCR6. Para el receptor CXCR3 slo se encontr aumento significativo en las poblaciones T memoria CD4+CD45RO+ y citotxica CD8+CD28+. No se encontr alteracin en la expresin del quimiorreceptor CCR2 salvo disminucin de expresin en linfocitos T y en clulas NK. Conclusiones. Las tcnicas de citometra de flujo demuestran la existencia de alteraciones en la expresin de algunos quimiorreceptores en los linfocitos de sangre perifrica de los pacientes asmticos. stas afectan a algunas poblaciones memoria y citotxica para CXCR3, y a algunas poblaciones principales para CCR2. 1021. ALTERACIONES INMUNOFENOTPICAS Y DEL QUIMIORRECEPTOR CCR5 EN POBLACIONES DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFRICA EN PERSONAS FUMADORAS. J. Barbarroja1, A. Prieto1, E. Reyes1, H. Barcenilla1, P. Prieto1, G. Revilla1, J. Monserrat1, A. Ruz2, J. Flores2, F. Canseco1,2, M. lvarez de Mon1,3. 1Dpto. de Medicina UAH, 2Servicio de Neumologa HUPA, 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Madrid Antecedentes. Las tcnicas de citometra de flujo han mostrado su utilidad para detectar alteraciones en la composicin inmunofenotpica de procesos inflamatorios de diversa etiologa. Objetivos: Caracterizar las alteraciones inmunofenotpicas y de expresin de quimiorreceptores en fumadores respecto a no fumadores. Mtodos: Se estudi el inmunofenotipo de linfocitos de sangre perifrica en 11 personas fumadoras y en 11 no fumadoras de edades similares. Mediante tcnicas de citometra de flujo de cuatro colores se determinaron los antgenos CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD57 y HLA-DR. As mismo se determin la expresin de los receptores de quimioquinas CCR2, CCR5, CCR6, CXCR3 y CXCR4 en subpoblaciones de linfocitos T y B. Resultados: En cuanto al inmunofenotipo se encontraron disminuciones significativas que afectan a varias subpoblaciones de linfocitos CD8 (CD8+, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RO+ y CD8+CD45RO+CD28-), de CD4 (CD4+CD28- y CD4+CD45RO+CD28-) y a clulas T killer (CD3+CD56+) en fumadores con respecto a no fumadores. En cuanto a quimiorreceptores se observ una disminucin de expresin de CCR5 en varias subpoblaciones de linfocitos CD8 (CD8+, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RO+, CD8+CD45RA+CD45RO+ y CD8+CD28+), en linfocitos T y en clulas T killer, en fumadores en relacin a no fumadores. Adems hay una
sobreexpresin del quimiorreceptor CXCR3 en linfocitos B (CD19+) y CD4+HLA-DR+, del CXCR4 en la poblacin CD4+CD25+, y del quimiorreceptor CCR6 en las clulas T killer en personas fumadoras. Conclusiones: Las tcnicas de citometra de flujo demuestran la existencia de alteraciones inmunofenotpicas en los linfocitos de sangre perifrica de personas fumadoras con respecto a no fumadoras. Estas alteraciones afectan a las poblaciones CD4, clulas T killer y sobretodo a las CD8. En cuanto a los quimiorreceptores se altera la expresin de varios, destacando sobretodo la disminucin del CCR5 en algunas subpoblaciones de CD8 de personas fumadoras. 1022. CARACTERIZACIN DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL FRENTE A CD5 PORCINO. G. Paos Adillo, D. Llanes Ruiz, A. Moreno Lpez. Unidad mixta UCO-CSIC de Marcadores Genticos Moleculares de Animales Domsticos y de Compaa. Crdoba Dado el creciente inters de la especie porcina, sea como especie de abasto, como modelo experimental o como posible donante de rganos para el xenotraplante, el estudio de su sistema inmune ha cobrado gran importancia en los ltimos aos. Para llevar a cabo muchos de estos estudios son necesarios reactivos como los anticuerpos monoclonales frente a marcadores de membrana leucocitarios. En este estudio se aborda la caracterizacin de una anticuerpo monoclonal frente a CD5 porcino, una glicoprotena de membrana de 60-65 kDa de peso molecular que se expresa en timocitos, linfocitos T y una subpoblacin de linfocitos B. Esta glicoprotena pertenece a la superfamilia SRCR (scavenger receptor cysteine-rich), presentando 3 dominios SRCR en su porcin extracelular, y aparece asociada a TCR y BCR, entre otros marcadores de membrana. Las funciones que desempea CD5 no han sido an completamente elucidadas, pero se sabe que interviene en el control y regulacin de las respuestas linfocitarias, tanto en clulas B como T. Como resultado de una fusin llevada a cabo en nuestro laboratorio con esplenocitos de un ratn Balb/c inmunizado con PBMC porcino se obtuvo el hibridoma GP2D8, que produca un anticuerpo monoclonal que reconoca especficamente en citometra de flujo una subpoblacin de linfocitos. Mediante diversas tcnicas, que incluan la citometra de flujo con dos fluorocromos frente a una batera estndar de anticuerpos contra marcadores leucocitarios porcinos, la Inmunoprecipitacin, el inmunoblotting y el bloqueo epitpico frente a 1H6/8 (un anticuerpo frente a CD5 porcino), se caracteriz el anticuerpo GP2D8 como un anti-CD5 porcino que reconoca especficamente el eptopo CD5a, nico descrito en esta especie hasta la fecha. 1023. AUMENTO DE LOS NIVELES SERICOS DE EOTAXINA E IL5 EN LA ESTRONGILOIDIASIS HUMANA. A. Mir1,2, R. Igual2, D. Benahmed1., M.J. Moreno2, S. Rull2, R. Borrs1. Unidad Mixta de Investigacin Facultad de Medicina-Hospital Clnico Universitario de Valencia1 y Hospital Francisco de Borja de Ganda2 Strongyloides stercolaris es un parsito nematodo de los humanos que causa diferentes formas clnicas de enfermedad. La mayora de personas infectadas permanecen asintomticas pero en situaciones de inmunosupresin se pueden producir estados de hiperinfeccin de pronstico muy grave. Recientes trabajos en roedores han puesto de manifiesto la importancia de la interleucina 5 (IL5) en la inmunidad frente a strongyloides. IL5 est implicada en la regulacin intestinal de
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la parasitacin, impidiendo el establecimiento del parsito en el intestino delgado. Probablemente este efecto es debido a la induccin de la produccin de eosinfilos. Se conoce muy poco acerca de los mecanismos que regulan su migracin a pulmn e intestino. El papel central que desempean los eosinfilos en la patogenia de la estrongiloidiasis permite hipotetizar que las citocinas implicadas en la produccin y migracin de eosinfilos, participan en la patognesis de la enfermedad. Nos planteamos en este estudio valorar la expresin de los mediadores selectivos del eosinfilo, eotaxina e IL5, en pacientes con estrongiloidiasis. Se ha determinado los niveles de IL5 y eotaxina por un mtodo inmunoenzimtico en el suero de 66 pacientes con estrongiloidia-
sis crnica y en un grupo control de 40 personas sanas. Tambin se ha medido la eosinofilia perifrica y los niveles de IgE en los pacientes. Los resultados muestran un aumento significativo de eotaxina (p<0.001) en el grupo de pacientes en relacin al grupo control. IL5 fue detectada en el suero del 63% de pacientes y slo en el 8% de personas sanas. Todos los pacientes tenan eosinofilia perifrica y la mayora presentaba niveles elevados de IgE. Este estudio pone de manifiesto la participacin de eotaxina e Il5 en la estrongiloidiasis humana y apoya la hiptesis de que los mediadores selectivos de eosinfilos participan en la respuesta inmunitaria frente a strongiloides y pueden estar implicados en la patogenia de la enfermedad.
Sesion 11. Linfocitos T y NK: funcin efectora y apoptosis

Comunicaciones orales: 1101-1112 1101. CORRELACIN ENTRE LA EXPRESIN DE LAS VARIANTES DE KIR2DL5 Y LA CAPACIDAD DE UNIN DE SU PROMOTOR A FACTORES DE TRANSCRIPCIN DE LA FAMILIA CBF/AML. N. Gmez-Lozano, C. Vilches. Hospital Universitario Puerta de Hierro. Madrid Los KIR (Killer-cell Ig-like receptors) regulan la respuesta de las clulas NK a travs del reconocimiento de molculas de clase I del MHC. El gen KIR2DL5 codifica para un miembro de esta familia cuya expresin es variable: mientras que en algunos individuos se expresa en clones de clulas NK, en otros se comporta como un pseudogn silente. La explicacin a estas diferencias de expresin podra encontrarse en su promotor, que muestra un alto grado de diversidad. En particular, los individuos con una forma silente del gen comparten una mutacin en un sitio potencial de unin a CBF/AML (Core Binding Factor/Acute Myeloid Leukemia). La familia CBF/AML incluye factores de transcripcin heterodmericos cuya subunidad a est codificada por tres genes (AML-1, -2 y -3), que poseen un dominio conservado de reconocimiento del ADN denominado Runt Homology Domain. Estos factores estn implicados en la leucemognesis, la osteognesis y en el desarrollo y funcin de diversos linajes hematopoyticos. Por tanto, es posible que los polimorfismos en la secuencia diana potencial para CBF/AML en la regin promotora de KIR2DL5 puedan determinar su capacidad de expresin. Partiendo de esta hiptesis, hemos caracterizado la capacidad de unin de la familia AML al promotor de KIR2DL5. Mediante ensayos de retraso en gel, hemos observado la unin de estos factores exclusivamente a las variantes transcritas de KIR2DL5. Los experimentos de super-retraso sugieren que AML-2 o AML-3, pero no AML-1, podran ser las subunidades que reconocen al promotor de KIR2DL5 en las clulas NK. Los estudios funcionales que estamos llevando a cabo permitirn determinar la importancia de estos factores para la expresin del gen KIR2DL5. 1102. GENERACIN DE FORMAS SOLUBLES DE KIR2DL5 PARA LA IDENTIFICACIN DE SU LIGANDO. E. Estefana, C. Vilches. Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Puerta de Hierro Los KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors) constituyen una familia de receptores con capacidad de regular la actividad citotxica de las clulas NK, a travs del reconocimiento de molculas de HLA de clase I. KIR2DL5 es un miembro de esta familia descrito recientemente, siendo nuestro objetivo la identificacin de su ligando utilizando formas solubles del receptor. La afinidad de los KIR por el MHC es similar a la del TCR y parece independiente de la glicosilacin de ambos, motivos por los que hemos planteado dos abordajes. Por un lado, la produccin en sistemas eucariticos de protenas de fusin de KIR2DL5 con el Fc de la IgG1. Actualmente estamos optimizando la expresin de estas construcciones, que han sido eficaces con otros KIR. Por otro lado la generacin de tetrmeros a partir de monmeros producidos en E. coli, un mtodo utilizado con xito en el anlisis de la interaccin TCR-MHC. Para su generacin, hemos fusionado la porcin extracelular de los KIR a una secuencia de biotinilacin en su extremo C-terminal. Para asegurar un alto nivel de expresin, hemos adaptado los diez primeros codones a la maquinaria traduccional de E. coli. Mediante este sistema, hemos purificado KIR2DL5 a partir de cuerpos de inclusin con un elevado rendimiento y hemos conseguido su solubilizacin y plegamiento. La protena plegada ser biotinilada para despus ser tetramerizada y marcada con derivados de la estreptavidina. La mayor avidez terica de una molcula con cuatro lugares de unin respecto a formas monomricas o dimricas, justifica el uso de tetrmeros. Sin embargo, los KIR-Fc tienen en teora una glicosilacin apropiada, que, aunque no parece importante en otros KIR, se desconoce si podra serlo en KIR2DL5. Todo ello justifica emplear ambas estrategias en paralelo con la finalidad de identificar su ligando. En ambos mtodos utilizamos como controles KIR2DL1 y KIR2DL2, cuyos ligandos son conocidos. 1103. LA MOLECULA CD1d INHIBE LA ACTIVIDAD CITOTOXICA DE CELULAS NK EN HUMANOS. Y. Campos-Martn, M. Gmez del Moral, E. MartnezNaves. Dpto. Inmunologa, Facultad de Medicina de la U.C.M., Madrid El sistema CD1 codifica varias protenas pertenecientes a la familia MHC de clase I no clsicas que pueden dividirse en dos grupos. Las de grupo I: CD1-a,-b y c presentan lpidos bacterianos a clulas T y se ha descrito que pueden inhibir la actividad citotxica de clu-
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las NK en humanos. Las de grupo II: CD1d presentan antgenos (GalCer) a clulas NKT en humanos y ratn y se ha descrito que pueden inhibir la actividad citotxica de clulas NK en ratn. Objetivo. Investigar si la molcula CD1d inhibe la actividad citotxica de clulas NK en humanos. Metodologa. Como clulas diana utilizamos la lnea L721.221 (HLA clase I negativa) transfectada con el vector psRaNeo (Mock.221) y un transfectante de CD1d humano que generamos en nuestro laboratorio (CD1d.221). Tambin se utiliz como control un transfectante de HLA-B48 (B48.221). Cmo clulas efectoras utilizamos: 1. Clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC) activadas con IL2, 2. Clulas CD56+ aisladas de PBMC, 3. Lneas celulares T CD8+ inmortalizadas con Herpesvirus Saimiri (HVS), con actividad NK y 4. La lnea celular NKL. La actividad citotxica se midi por el test estndar de liberacin de 51Cr o mediante el test no radiactivo de deteccin de LDH en sobrenadante. Resultados. Todas las clulas efectoras mostraron citotoxicidad natural frente a la lnea Mock.221. Esta citotoxicidad se vio disminuida de forma significativa en todos los casos frente a la lnea CD1d.221 y B48.221. La especificidad en la inhibicin de la citotoxicidad se comprob mediante el uso del anticuerpo monoclonal CD1d42 anti-CD1d humano. En presencia de este anticuerpo se observ un aumento en el porcentaje de lisis especfica. Tambin estudiamos el efecto de un ligando especfico de CD1d: -GalCer. En presencia de este compuesto no se observaron cambios significativos en los porcentajes de lisis respecto a los ensayos estndar. En consonancia con este resultado los tetrmeros de CD1d cargados con -GalCer no tieron en citometra de flujo las clulas efectoras, aunque s lo hacen, como es esperable, con clulas NKT. Nuestros resultados indican que CD1d inhibe la actividad citotxica, sobre la lnea L721.221, de clulas con actividad NK en humanos. Esta inhibicin podra deberse a un receptor que reconoce CD1d cargado con un ligando diferente de -GalCer. 1104. ESTUDIO FENOTIPICO Y FUNCIONAL DE CTLs MELAn-A ESPECFICOS ESTIMULADOS IN VITRO. J.G. Casado, O. DelaRosa, E. Peralbo, R. Soto1, L. Rioja1, J. Pea, R. Solana, R. Tarazona2. Departamento de Inmunologa y 1Servicio de Ciruga Plstica, Hospital Universitario Reina Sofa, Crdoba, 2rea de Inmunologa, Departamento de Fisiologa, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cceres, Espaa. rtarazon@unex.es Melan-A26-35 constituye uno de los eptopos mas frecuentemente reconocido por los CTLs especficos de antgenos de melanoma. Se ha observado que un porcentaje elevado de individuos sanos presentan CTLs especficos frente a Melan-A26-35. Los objetivos de este trabajo han sido estudiar fenotpica y funcionalmente las poblaciones de CTLs Melan-A especficos en individuos sanos en relacin con el balance de seales de inhibicin-activacin de la citotoxicidad mediadas por la expresin de receptores NK y molculas coestimuladoras. El anlisis fenotpico de las poblaciones de CTLs especficos frente a Melan-A se realiz mediante citometra de flujo multiparamtrica utilizando tetrmeros comerciales que presentan el antgeno Melan-A en el contexto de HLA-A*0201. Se determin la expresin de molculas coestimuladoras, receptores NK y de marcadores de activacin/diferenciacin en los CTLs Melan-A especficos. Posteriormente, se realiz la expansin in vitro de los CTLs Melan-A especficos con el pptido Melan-A en presencia de IL2 e IL7.
El estudio de los CTLs especficos del antgeno Melan-A en PBLs de individuos sanos analizados en condiciones basales mostr una alta expresin de las molculas CD27 y CD28. Tras la estimulacin in vitro no se observaron diferencias significativas en su expresin. El anlisis de la expresin de receptores NK en estas clulas es baja tanto en condiciones basales como tras la estimulacin in vitro. Por otro lado, estos CTLs especficos en reposo presentan un fenotipo virgen que cambia a fenotipo efector/memoria cuando son estimulados in vitro en presencia de IL-2 e IL-7. En los estudios funcionales realizados con los CTLs Melan-A especficos hemos observado que estas clulas adquieren la capacidad de secretar IFN-gamma cuando son estimuladas in vitro. Adems, estas clulas tienen actividad citotxica y secretan IFN-gamma en respuesta a clulas de melanoma. El modelo de estimulacin in vitro de este trabajo nos permite el estudio funcional de la expresin de receptores inhibidores y de molculas coestimuladoras en la lisis de clulas tumorales mediada por linfocitos T especficos. 1105. ESTUDIO DE LA LONGITUD DE TELOMERO EN LAS DIFERENTES POBLACIONES LINFOCITARIAS DE INDIVIDUOS ANCIANOS. O. DelaRosa, E. Peralbo, J.G. Casado, J. Pea, R. Tarazona, R. Solana. Department of Cellular Biology, Physiology and Immunology, Faculty of Medicine, Reina Sofa University Hospital, Crdoba, Spain E-MAIL: olgadelarosa37@hotmail.com Introduccin. Estudios previos han confirmado el descenso en la expresin de CD28 en linfocitos T de ancianos, asociado a un incremento de la expresin de algunos marcadores NK en la poblacin CD28- de individuos ancianos. Objetivo. Estudio de la longitud de telmero en las diferentes poblaciones de linfocitos T en funcin de la expresin de CD28 as como en clulas NK tanto en individuos jvenes como en ancianos sanos. Metodologa. Mediante hibridacin in situ de fluorescencia (flow FISH) se determin la longitud relativa de telmero (LRT) de las poblaciones CD3+CD28+, CD3+CD28- y NKRESULTADOS: Los resultados mostraron que tanto en individuos jvenes como en ancianos, la poblacin CD3+CD28- de linfocitos T presentaba LRT que la poblacin CD3+CD28+, siendo estas diferencias significativas. Sin embargo exista un descenso de la LRT tanto en la poblacin CD3+CD28+ como en la poblacin CD3+CD28-asociado al envejecimiento. Asimismo se observ que la poblacin de clulas NK presentaba un descenso de la LRT asociado al envejecimiento de la misma forma que las poblaciones de clulas T. Adems los anlisis de la poblacin NK mostraron que la LRT de esta poblacin era similar a la LRT de la poblacin CD28+ tanto en individuos jvenes como en ancianos. Conclusiones. Vistos los resultados podemos afirmar que la medida de la longitud de telmero en las diferentes poblaciones es un mtodo adecuado para determinar el estado de senescencia replicativa de estas clulas. El proceso de senescencia replicativa, que ocurre en la mayora de las clulas somticas humanas, podra estar relacionado con la prdida del telmero tanto en individuos ancianos como en jvenes. As podemos confirmar que la longitud de telmero es un buen marcador de envejecimiento celular y del estado de replicacin que presentan las diferentes poblaciones linfocitarias, asociando la menor longitud de telmero con las poblaciones celulares que han sufrido activacin antignica de forma ms intensa y/o continuada.
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1106. EFECTO RELAJANTE DE LA INTERLEUQUINA-10 EN LAS CLULAS DECIDUALES ESTROMALES. M. Kimatrai , R. Muoz Fernndez, I. Tirado, E. Garca Olivares. Unidad de Inmunologa, Facultad de Medicina, Universidad de Granada La decidua es el tejido materno en ntimo contacto con el trofoblasto fetal. Es en este tejido donde se producen mecanismos inmunolgicos que conducen a la aceptacin del embrin por la madre en el embarazo normal o al rechazo del trofoblasto durante el aborto espontneo. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que las clulas deciduales estromales (DSC, decidual stromal cells) presentan un fenotipo equivalente al de los miofibroblastos, clulas que expresan alfaSM-actina y que tienen actividad contrctil. En el presente trabajo observamos mediante la tcnica de contractilidad en geles, que citoquinas Th1, como la IL-2 induce contractilidad de las DSC, mientras que citoquinas Th2 como la IL-10 relaja las DSC. Teniendo en cuenta que las citoquinas Th2 predominan en el embrarazo normal, mientras que las Th1 se incrementan en el aborto espontneo, los resultados del presente trabajo confirman la intervencin de las DSC en los mecanismos inmunolgicos que conducen, en unos casos al embarazo normal y en otros al aborto espontneo. 1107. EL GEN A238-L, UN HOMLOGO VIRAL AL IB-, REGULA LA EXPRESIN DE TNF-, iNOS Y COX-2 EN CLULAS JURKAT. A. Gonzlez , V. Vila, C. Hurtado, M.L. Nogal, M.L. Salas, A.L. Carrascosa, M. Fresno, Y. Revilla. Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa. Universidad Autnoma. Campus de Cantoblanco. Madrid Ciertos virus, como el de la peste porcina africana, han seleccionado genes que son claves para su interaccin con la clula infectada. Estos genes, codificados por el propio agente infeccioso, presentan en ocasiones claras mejoras con respecto al gen celular al cual son homlogos. Este es el caso del gen A238L, un homlogo estructural y funcional del IB-, el cual inhibe al factor de transcripcin NFB, pero tambin al NFAT. Utilizando clulas jurkat transfectadas establemente con el A238L, y cotransfectadas con construcciones plasmdicas conteniendo un gen reportero bajo el control de distintos promotores, tales como el de TNF-, iNOs y COX-2, hemos demostrado que el gen viral modula, en mayor o menor medida, la expresin de estos genes. Este efecto ha sido confirmado en ensayos de cambio en la movilidad electrofortica (EMSA), as como revertiendo el efecto observado por transfeccin de plsmidos de expresin de NFB y NFAT. Asimismo, construcciones plasmdicas conteniendo mutaciones especficas en las distintas cajas NFB y NFAT de los promotores de dichas molculas, ha permitido un estudio ms profundo acerca de las secuencias especficas controladas por el gen A238L. La produccin de molculas inflamatorias, tales como el TNF, iNOS o la COX-2, constituyen un potente mecanismo antiviral que podra ser regulado por el VPPA a travs de la expresin del gen A238L. El control de la expresin de dichas molculas durante la infeccin viral ser abordado prximamente utilizando clulas susceptibles y un mutante de deleccin que carece del gen A238L.
1108. APOPTOSIS EN LINFOCITOS DE PACIENTES CON LA ENFERMEDAD DE PARKINSON. M. Mestre, M. Calopa*, J. Bas, y E. Buendia. Servei dlmmunologia y Servei de Neurologia*, Hospital Universitari de Bellvitge. Barcelona En estudios anteriores demostramos que los pacientes con Parkinson (EP) presentan una disminucin en el nmero de linfocitos, principalmente CD4CD45RA que se correlaciona con un aumento de las clulas T CD4CD25. Estas alteraciones podrian explicarse en trminos de apoptosis de linfocitos activados con participacin de Fas. Con el fin de evaluar la existencia de un aumento en la apoptosis de linfocitos en la EP se incluyeron 21 pacientes (edad 60,2 9 SD) y 17 controles (edad 59,6 13 SD). Las subpoblaciones linfocitarias se determinaron mediante citometra de flujo, as como la apoptosis espontnea y la inducida por PHA, que se evalu en subpoblaciones de linfocitos T mediante incubacin con anexina-V. Hemos observado diferencias en la expresin de Fas de las clulas CD4CD25 (p=0,0235) y CD4CD45RA (p=0,0470) en sangre perifrica entre los pacientes con EP y controles. La mayor expresin de Fas en las clulas CD4CD25 se correlaciona con un porcentaje superior de clulas CD4CD45RA y CD4CD45RO apoptticas (0,7584; p=0,004 y 0,6074; p=0,036, respectivamente), y con un menor valor absoluto y porcentaje de clulas CD4CD45RA (-0,7943; p=0,001 y 0,7709; p=0,001 respectivamente). El aumento en la expresin de Fas en clulas CD4CD45RA T se correlacionan con los valores absolutos y porcentaje de CD4CD45RA (-0,8725; p <0,001 y -0,7613; p=0,002 respectivamente). Por otro lado, los pacientes mostraron porcentajes superiores de apoptosis espontnea in vitro en las clulas CD4, principalmente CD4CD45RA (p=0,0014). Los resultados indican que en la EP los linfocitos presentan una susceptibilidad aumentada a la apoptosis, lo que puede explicar la disminucin de subpoblaciones celulares T y sugieren que en la EP existe un proceso sistmico capaz de inducir apoptosis linfocitaria. 1109. FUNCIN DE CD70 EN LINFOCITOS T: MECANISMOS DE PROTECCIN FRENTE A APOPTOSIS. E. Caparrs, E. Aguado, P. Aparicio. Depto. Bioqumica, Biologa Molecular B e Inmunologa. Facultad de Medicina. Universidad de Murcia CD70 es una protena de tipo II, miembro de la familia TNF y presente el linfocitos T y B activados. Experimentos previos realizados en clones citotxicos han demostrado que esta molcula es capaz de estimular la actividad citoltica de estos clones. En el presente estudio se analiza en mayor profundidad las funciones biolgicas de CD70 en linfocitos T. En cuanto a la cascada de sealizacin intracelular, se ha observado que la estimulacin a travs de CD70 induce la fosforilacin de la MAPK Erk, as como de Akt, implicada en la ruta de bloqueo de apoptosis. Igualmente, el entrecruzamiento de CD70 induce la fosforilacin de PLC-1. Adems, la localizacin de CD70 en GEMs tras activacin ha puesto de manifiesto su papel como molcula transductora de seales. La generacin de distintos transfectantes estables en clulas Jurkat, con diversas mutaciones en la cola intracitoplsmica de CD70 ha permitido averiguar ms sobre la funcin de esta protena. Por ensayos de induccin de apoptosis con distintos agentes, tales como estaurosporina o anticuerpos frente a CD95, hemos podido comprobar su papel de proteccin frente a apoptosis. Asimismo se ha comprobado la importancia para esta funcin de un motivo para la enzima casen kinasa I, presente en la parte citoplsmica de CD70.
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1110. SURVIVAL RATE AND GROWTH RATE: FLOW CYTOMETRY INDICATORS TO CHARACTERIZE THE KINETIC OF RESPONSE OF T LYMPHOCYTES. A. Prieto1, D. Daz1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, J. Barbarroja1, E. Perucha1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service. University Hospital Prncipe de Asturias. Alcal de Henares, Madrid. Spain Background. The study of in vitro T cell responses presents difficulties because the responses of individual T cells are neither homogeneous nor synchronic and also because the role of apoptosis has been underestimated for long time. Objective. To study both apoptosis and growth of mitogen stimulated T cells we applied ratiometric methods of T cell enumeration by flow cytometry. Materials and methods. T cells were enumerated by a ratiometric method based on the addition of a known quantity of fluorescent microbeads. This technology has been developed in our laboratory and has an extraordinary potential for the in vitro study of relationships between processes of cell proliferation and differentiation. To study the changes of the absolute numbers of cells in culture we developed two indicators: one to measure the proportion of cells which survived to the initial apoptotic phase and another to measure the net growth of the surviving cells. These indicators are Survival rate (SR) and the growth rate (GR). The SR measures the fraction of original cells that survive after the initial phase of predominant apoptosis. GR measure the relative increase in cell number (net growth) with respect to the original number of surviving cells after apoptotic phase. These measurements were performed after polyclonal stimulation with either lectin phytohemmaglutin or with antiCD3 and antiCD28 antibodies bound to polystiren microbeads. Results. SR and GR allow to compare responses of different subsets to policlonal stimulation. We found that the SR of CD4+ T cell was significantly higher than of CD8+ T cells but GR of CD8+ T was significantly higher than of CD4+ T cells. Conclusions. Thanks to this flow cytometry ratiometric method of cell enumeration we can measure the exact number of cells in each moment, and how many cells have suffered apoptosis. 1111. DETERMINATION OF SURVIVAL RATE AND GROWTH RATE ALLOWS THE STUDY OF BOTH PROAPOPTOTIC AND ANTIAPOPTOTIC EFFECTS OF IL-2. A. Prieto1, D. Daz1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. Del Amo1, * I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital Prncipe de Asturias, Alcal de Henares, Madrid, Spain Background. Several works have demonstrated that IL-2 is required not only for proliferation of mitogen activated T cells but also for their activation induced cell death. Therefore, IL-2 could lead T cells in different stages to outcomes so opposite as cell growth and apoptosis. Material and Methods. T cells labelled with CFSE were cultured and enumerated using ratiometric methods of flow cytometry.
The measurements were performed after polyclonal stimulation with either lectin phytohemmagglutin (PHA) or microbeads coated with antiCD3 and antiCD28 antibodies. PHA stimulation induces a suboptimal production of IL-2 that could be corrected by exogenous IL-2 (eIL-2). In contrast, microbead stimulation induces higher levels of IL-2 production. Results. Survival rate measurements demonstrate that during the trhee first days of culture eIL-2 induces significant apoptosis which was observed in both resting cells and undivided blasts from CD3+CD4+ and CD3+CD8+ subsets. eIL-2 also induces apoptosis in cells stimulated with microbeads coated with antiCD28 and antiCD3 antibodies but the proapoptotic effect was lesser. On the other side we observed that eIL-2 increased the number of T cells after 7 days of culture. Growth rate measurements demonstrated that eIL-2 increases the growth of T cells stimulated with PHA.This effect was also observed in microbeads stimulated T cells. Conclusions. after polyclonal stimulation IL-2 first induce apoptosis in the two first days of culture and later induces net growth of proliferating blasts. The differences in both apoptosis and growth between cultures with or without eIL-2 were greater in lectin stimulated cultures in which the endogenous production of IL-2 is lesser than in microbeads stimulated cultures and consequently the differences between cultures with and without eIL-2 are greater. After polyclonal estimulation, IL-2 should produce opossed effects on apoptosis of undivided resting cells and proliferating blasts. 1112. MICRO-BALLS, A TECHNICAL PREREQUISITE FOR THE DETERMINATION OF THE TRUE INCIDENCE OF APOPTOSIS . D. Daz1, A. Prieto1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital Prncipe de Asturias, Alcal de Henares, Madrid, Spain Background. Current flow cytometry methods of apoptosis measurement do not enumerate the apoptotic cells. Objective. To determine the systematic errors in the measurement of the occurrence of apoptosis whitin cell subsets. Materials and methods. To study the loss of CD3, CD5, CD8, CD4 and CD28 leucocyte differentiation antigens (LDA) on apoptotic cells. LDA+ purified populations were obtained by negative sorting and cultured for 24 h. in complete medium, phytohemagglutinin (PHA) or staurosporin (ST). Apoptosis was measured using annexin V, 7amino-actinocmycin D and antibodies. The cells that maintained their LDA expression, those which lose it and those which suffered fragmentation into apoptotic bodies were enumerated. The Apoptotic Rate (AR), an indicator which determines the proportion of LDA+ cells which suffered apoptosis with respect to the original number of LDA+ seeded cells, was calculated and compared with the Apoptotic Index (AI) of the LDA+ cell population which is the proportion of apoptotic cells over the cells that remain identifiable as LDA+. Results. Under all experimental conditions assayed, apoptotic cells from all subsets underwent loss of their LDA and suffered cell fragmentation, both processes were maximal when apoptosis was induced by PHA. For almost the antigens in almost conditions assayed, more than 20% of the apoptotic cells completely lost the expression of their LDA. The differences between AI and AR were signifi-
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cant in all subsets and conditions assayed. The apoptosis incidence was always underestimated by AI (over 50% except for CD4) and more markedly for spontaneous apoptosis. Conclusions. Current methods of quantification of occurrence of apoptosis without cell enumeration markedly underestimate the incidence of apoptosis due to both apoptotic cell fragmentation into apoptotic bodies and also to their loss of LDAs. Therefore, these current flow cytometry methods do not measure the true incidence of apoptosis within cell subsets. Posters: 1113-1115 1113. CARACTERIZACION DE LINFOCITOS T CD4+ CD57+ DE SANGRE PERIFRICA EN INDIVIDUOS SANOS. D. Martnez2, R. Chvez1, D. Aguilar2, E. Zenteno1, R. Lascurain1, M. Jimnez2. Departamento de Investigacin Bioqumica. INER. 1Departamento de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNAM. 2Departamento de Investigacin de Enfermedades Heredo-degenerativas. INER En aos recientes se ha reportado que una pequea subpoblacin de Linfocitos T CD4+ que coexpresa el marcador CD57 se encuentra aumentada en ciertas patologas crnicas, como en la artritis reumatoide. Sin embargo, esta subpoblacin ha sido pobremente caracterizada y no se conoce cabalmente la funcin que cumple en la respuesta inmune, aunque la expresin del marcador CD57 en los Linfocitos T se ha asociado con respuestas inmunes tardas, sobre todo con una respuesta de tipo Th2.. Debido a esto, para nosotros es de importancia caracterizar esta subpoblacin adecuadamente, a fin de establecer su posible papel biolgico. El objetivo de este estudio consisti en determinar si la subpoblacin de Linfocitos T CD4+ CD57+ de sangre perifrica de individuos sanos se encuentra protegida o no contra la apoptosis. Para esto lo primero que se hizo fue separar los Linfocitos mediante el marcaje con anticuerpos unidos a perlas magnticas que reconocen estas 2 molculas de superficie, y retenerlos mediante columnas magnticas. Una vez que se cuantific la poblacin purificada, se procedi a extraer el RNAm y a obtener el cDNA mediante la tcnica de RT-PCR, con el propsito de determinar la relacin existente en la expresin de los genes anti-apoptticos BCL-XL y BCL-2 y el gen apopttico BAX, y de igual manera se caracteriz la expresin intracelular de las protenas producto de estos genes. En la subpoblacin CD4+ CD57+, se obtuvieron transcritos para el gen BCL-XL, responsable de la proteccin a apoptosis (tambin descrito en clulas T de memoria), a diferencia de los Linfocitos T CD4+ CD57-, donde se obtuvieron transcritos para el gen BCL-2. En ambas poblaciones hubo expresin de BAX, tanto de transcritos como de la protena. 1114. CONTRIBUTION OF CD3 TO T-CELL RECEPTOR REGULATION AND SIGNALING IN HUMAN MATURE T LYMPHOCYTES. N. Rossi1, P. S. Torres1, D.A. Zapata1, A. Pacheco-Castro1, J.L. RodrguezFernndez2, C. Cabaas2, .R. Regueiro1. 1Inmunologa, and 2Bioqumica y Biologa Celular, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, Madrid CD3 proteins may have redundant as well as specific contributions to the intracellular propagation and final effector responses
of TCR-mediated signals at different checkpoints during T-cell differentiation. We report here on the participation of CD3 in the activation and effector function of human mature T lymphocytes at the antigen recognition checkpoint. Following TCR/CD3 engagement of human CD3-deficient T cell lines, and despite their lower TCR/CD3 surface levels compared to normal controls, mature T-cell responses such as protein tyrosine phosphorylation and the regulation of expression of several cell surface molecules, including the TCR/CD3 itself, were either normal or only slightly affected. In contrast, other physiological responses like the specific adhesion and concomitant cell polarization on ICAM-1-coated dishes were selectively defective, and activation-induced cell death was increased. Our data indicate that CD3 contributes essential specialized signaling functions to certain mature T cell responses. Failure to generate appropriate interactions may abort cytoskeleton reorganization and initiate an apoptotic response. 1115. THE EXPRESSION OF CD45 ISOFORMS IS DIFFERENT ON T CD4 AND T CD8 SUBSETS OF POLICLONALLY STIMULATED T CELLS. E. Perucha1, P. Prieto1, A. Prieto1, D. Daz1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital Prncipe de Asturias, Alcal de Henares. Madrid. Spain Background. The patterns of expression of CD45 isoforms can be used to identify nave, effector and memory T cells within T CD4 and T CD8 cell subsets. Material and Methods. The modulation of the surface expression of CD45 isoforms on mitogen stimulated CD4 and CD8 T cells was studied by flow cytometry. Policlonal stimulation was performed with antiCD3 and antiCD28 antibodies coated microbeads. The cells were enumerated by a ratiometric flow cytometry methods and their expression of CD45 isoforms was studied. Growth rates (GR) of both subsets were measured. Results. We found that the GR of T CD8 cells were significantly higher than those observed on CD4 T cells. The phase of cell growth after polyclonal stimulation was longer for CD8 T cells than for CD4 T cells. CD4 T cells first change to double positive phenotype but after five days tends to change to CD45RO+ phenotype. CD8 T cells remained with double positive phenotype until 7 or even 11 days, several days more than their CD4 T counterparts. When CD45RO+ cells from CD4 or CD8 subsets were sorted and polyclonally stimulated again an increase of the expression of the CD45RA isoform expression per individual cell was observed in both subsets. Conclusions. The polyclonal activation induces synthesis of both CD45 isoforms in both T CD4 and T CD8 cells which results in the initial increase of expression of both isoforms and acquisition of double positive phenotype. From day 3 to day 5 the phenotype of CD4+ T cells changes to single CD45R0+ whereas CD8+ T cells remain with double positive phenotype. After this phase of intense cell proliferation the production of CD45 switches to predominant CD45RO production in CD4+ T cells increasing the quantity of CD45RO expression per individual cell while that of CD45RA decreases causing transition to memory phenotype. The transition from double positive to single CD45R0+ T cells is delayed in CD8+ T cells even to 11 days of culture.
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1116. ALTERACIONES INMUNOFENOTPICAS DE POBLACIONES DE LINFOCITOS T CITOTXICOS Y MEMORIA DE SANGRE PERIFRICA EN PACIENTES ASMTICOS. J. Barbarroja1, A. Prieto1, E. Reyes1, H. Barcenilla1, D. Daz1, J. Flores2, A. Ruz2, F. Canseco1,2, M. lvarez de Mon1,3. 1Dpto. de Medicina UAH, 2Servicio de Neumologa HUPA, 3Servicio de ESI/Oncologa HUPA. Alcal de Henares. Madrid Antecedentes. Las tcnicas de citometra de flujo han mostrado su utilidad para detectar alteraciones en la composicin inmunofenotpica de pacientes con distintos procesos inflamatorios de diversa etiologa. Objetivos. Caracterizar las alteraciones inmunofenotpicas en pacientes asmticos. Mtodos. Se estudi el inmunofenotipo de linfocitos de sangre perifrica en 24 pacientes asmticos y en 11 controles sanos no fumadores de edades similares. Mediante tcnicas de citometra de flujo de cuatro colores se determinaron los antgenos CD3, CD4, CD8, CD19, CD25, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD57 y HLA-DR. Resultados. No se encontraron diferencias significativas en las principales poblaciones linfocitarias de pacientes asmticos y controles (CD3, CD4, CD8 y CD19). Tampoco se encontraron diferencias significativas en las poblaciones novatas y memoria definidas por la expresin de isoformas en la poblacin CD8. En cambio se encontr una disminucin estadsticamente significativa en las poblaciones de linfocitos CD4 memoria (CD4+CD45RO+) y linfocitos CD4 y CD8 recientemente activados (CD45RA +CD45RO+). As mismo se observ en los pacientes asmticos una disminucin significativa en la poblacin de linfocitos T que expresan el antgeno asociado con funcin citotxica CD56 (clulas T killer). Conclusiones. Las tcnicas de citometra de flujo demuestran la existencia de alteraciones inmunofenotpicas en los linfocitos de sangre perifrica de los pacientes asmticos. Estas alteraciones afectan a las poblaciones CD4 y CD8. Incluyen disminucin de clulas memoria y recientemente activadas, as como aumento de la poblacin T citotxica. 1117. APOPTOSIS INDUCES A EARLY LOSS OF EXPRESSION OF LEUCOCYTE DIFFERENTIATION ANTIGENS ON APOPTOTIC LYMPHOCYTES. D. Daz1, A. Prieto1, H. Barcenilla1, G. Revilla1, P. Prieto1, J. Monserrat1, V. Sualdea1, J. del Amo1, I. Ranz1, M. lvarez Mon-Soto1,2. 1Department of Medicine, CSIC R&D Associated Unit University of Alcal, Alcal de Henares, Madrid, Spain. 2Immune System Diseases and Oncology Service, University Hospital Prncipe de Asturias, Alcal de Henares, Madrid, Spain Background. The levels of expression of leukocyte lineage antigens (LDA) are modulable. Decrease in the expression of some LDA on apoptotic lymphocytes has been reported. Objective. We asked whether the loss of LDA is a common feature of apoptotic lymphocytes and whether some lymphocytes can loss completely their LDAs. Materials and methods. To study the loss of CD3, CD5, CD8, CD4 and CD28 LDAs on apoptotic cells, LDA+ purified populations were obtained by sorting and cultured for 24 hours in complete medium, phytohemagglutinin (PHA) or staurosporin (ST). The inci-
dence of apoptosis was measured by flow cytometry using annexin V, 7-amino-actinocmycin D and antibodies. By the addition of an internal standard of microbeads we enumerated both the cells that maintained their LDA expression, those which lose it and these which suffered fragmentation into apoptotic bodies. Results. For each LDA+ subset studied the occurrence of apoptosis was always higher in cells that partially or totally lost the expression of their LDA than in the cells which maintained its levels. The kinetics of loss of LDA expression on apoptotic lymphocytes were fast for CD8 and CD28 antigens, which lost more than 80% in the early stage of apoptosis, and slow for CD3, CD5 and CD4 antigens and in the case of CD3 and CD5 was dependent of the stimulus used. The loss of LDA expression was not due to a partial loss of the cell membrane by early apoptotic cells because, in the early stages of apoptosis, CD3+ and CD5+ cells suffered a decrease in the FSC signal without parallel loss in its LDA. Conclusions. The loss of expression of LDA by apoptotic cells is a common feature of apoptotic lymphocytes. Under all the conditions of induction of apoptosis assayed, a relevant fraction of apoptotic lymphocytes completely lost their expression of LDA. The different kinetic patterns of loss of expression of each LDA suggest that this loss of expression is not a passive feature of the apoptotic process. 1118. ANLISIS DE LA ACTIVIDAD CITOTXICA DE CLULAS NKT V24+ V11+ EXPANDIDAS IN VITRO. E. Peralbo1, O. de la Rosa1, Y. Campos-Martn2, JG Casado1, R. Tarazona1, E. Martnez Naves2, R. Solana1. 1Dpto. de Inmunologa. Hospital Universitario Reina Sofa. Crdoba. 2Unidad de Inmunologa. Facultad de Medicina de la UCM. Madrid Introduccin. Las clulas NKT, definidas en ratones y humanos, son clulas Tab que coexpresan receptores NK y un TCR constituido por una cadena a invariable, que en humanos se denomina V24JQ y est asociada preferentemente a la cadena V11. Este TCR reconoce a la molcula CD1d, que presenta antgenos glucolipdicos como la a-galactosilceramida (-GalCer), un potente activador de las clulas NKT. Estas clulas producen IL4 e IFN- tras su activacin y tambin presentan actividad citotxica frente a lneas celulares tumorales. Objetivos. Establecer un modelo de expansin in vitro de clulas NKT V24+ V11+ de sangre perifrica humanas que permita estudiar el papel de la interaccin TCR-CD1d, as como de la presencia del -GalCer, en la actividad citotxica de estas clulas en un modelo que utiliza como clulas diana la lnea celular humana 721.221. Metodologa. Para establecer los cultivos de clulas NKT V24+ V11+, PBMCs de donantes sanos fueron estimulados in vitro con -GalCer e IL2 durante 14 das. A continuacin las clulas NKT V24+ V11+ fueron aisladas por separacin inmunomagntica, y mantenidas en cultivo con IL2 reestimulando cada 7 das con clulas 721.221-CD1d+ incubadas con -GalCer e irradiadas. Las clulas NKT expandidas fueron utilizadas en ensayos de lisis empleando como dianas las lneas celulares 721.221 transfectada con CD1d y 721.221 Mock (sin transfectar). Resultados. Las clulas NKT V24+ V11+ cultivadas de donantes diferentes no mostraron actividad citotxica frente a las clulas 721.221 Mock, pero s frente a las clulas 721.221-CD1d+ y 721.221CD1d+ incubadas con -GalCer, aunque stas fueron ms sensibles a la lisis (lisis>80%) que las clulas 721.221-CD1d+ sin incubar con GalCer.
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Conclusiones. La actividad citotxica de las clulas NKT V24+V11+ frente a la lnea celular 721.221 es dependiente de la interaccin TCR-CD1d, y la presencia del ligando -GalCer incrementa la citotoxicidad de las clulas NKT en este modelo. 1119. MODIFICACIN DEL PATRN DE SECRECIN DE INTERLEUQUINAS POR CRRY/P65. G. Ojeda, J.M. Rojo, A. Jimnez-Periaez, A. Snchez y P. Portols. C.N. Microbiologa (Insto. Salud Carlos III) y Centro de Investigaciones Biolgicas (CSIC) Durante la activacin del linfocito T CD4+, la sealizacin mediada por molculas coestimuladoras expresadas en la membrana, conduce a la secrecin de distintas linfoquinas que determinan la diferenciacin de la clula naive hacia fenotipos Th1, Th2 o incluso Treguladoras/supresoras. Aunque son numerosas las descripciones de molculas de membrana capaces de modificar la diferenciacin de las clulas naive existe un gran desconocimiento de los factores y seales capaces de desviar el proceso de diferenciacin hacia uno u otro sentido, afectando al balance final de la respuesta inmune. Desde hace varios aos es conocida la implicacin de receptores de complemento CR1 y CR2 en la coestimulacin de linfocitos B. Nosotros hemos descrito que otros miembros de la misma familia, Crry/p65 murino y CD46 humano son capaces de coestimular linfocitos T CD4+. Este hecho es de gran importancia, por ser estas molculas receptores de diversos patgenos humanos de lo que se deriva el posible hecho de la modulacin de la respuesta inmune por patgenos. La ligacin de Crry en presencia de anti-CD3 activa notablemente la proliferacin de los linfocitos T CD4+, aunque no se detecta un incremento de IL2, principal factor de crecimiento de estas clulas, secretada en los cultivos ni a nivel intracelular. En los cultivos coestimulados se detecta un incremento de la expresin de la cadena a del receptor de IL2 que puede justificar un consumo elevado de esta IL y una menor deteccin en el medio. La secrecin de IL4 y de IL5 estn notablemente incrementadas en los cultivos coestimulados por anti-Crry, indicando una desviacin de la diferenciacin de la poblacin hacia fenotipo Th2. Este incremento es mas claro a tiempo mas corto de coestimulacin, adelantndose la secrecin de IL4 en los cultivos coestimulados por anti-Crry . Al mismo tiempo, no se detectan modificaciones en la secrecin de IFN. Las seales procedentes de Crry potencian las emitidas por el complejo TCR/CD3 que conducen a la fosforilacin de quinasas
como ZAP-70 y sustratos como ERK en la ruta de MAPK; pero adems, en clulas Th2, activan selectivamente la ruta de Jun quinasa que conduce a la fosforilacin de JunK2, y no la de p38. Anlisis en linfocitos T CD4+ de ratones reporter NFAT-luciferasa indican que estas seales conducen a la activacin del factor de transcripcin NFAT. Estas seales conducen a un claro incremento de IL4 y de IL5 secretados por lneas Th2 y linfocitos T CD4+ de bazo, pero no aumentan significativamente IL10. Es decir, las seales coestimuladoras emitidas por Crry incrementan selectivamente ciertas vas de sealizacin, conduciendo a una modificacin selectiva del patrn de ILs secretado que puede modular las caractersticas de la respuesta inmune resultante. 1120. INDUCCIN DE APOPTOSIS EN CLULAS TROFOBLSTICAS POR LINFOCITOS DE LA DECIDUA HUMANA. R. Muoz Fernndez , M. Kimatrai, I. Tirado, E. Garca Olivares. Unidad de Inmunologa, Facultad de Medicina. Universidad de Granada La decidua es el tejido materno en ntimo contacto con el trofoblasto fetal. Es en este tejido donde se producen mecanismos inmunolgicos que conducen a la aceptacin del embrin por la madre en el embarazo normal o al rechazo del trofoblasto durante el aborto espontneo. Nuestro grupo ha demostrado recientemente que los linfocitos de la decidua humana inducen apoptosis de las clulas del trofoblasto fetal. Esto determina que en el embrazo normal se produzca un control de la invasin trofoblstica en la decidua, mientras que en el aborto espontneo esta actividad se intensifica, lo que implica la eliminacin del trofoblasto. En el presente trabajo confirmamos estos datos presentando signos morfolgicos de apotosis en clulas trofoblsticas tratadas con linfocitos deciduales. Estos signos eran especialmente abundantes cuando se utilizaron linfocitos procedentes de aborto espontneo; sin embargo cuando se emplearon linfocitos de decidua normal observamos frecuentes signos de apoptosis en estos linfocitos. Estos resultados sugieren que existe una interrelacin linfocitos deciduales-trofoblasto que determina la apoptosis en un sentido o en otro, bien de linfocitos cuya consecuencia es la tolerancia materno-fetal en el caso del embarazo normal, bien del trofoblasto, cuya consecuencia es la eliminacin del embrin en el aborto espontneo.
Sesion 12: Polimorfismos No-MHC y su asociacin con enfermedades

Comunicaciones Orales: 1201-1212 1201. POLIMORFISMO DEL GEN PARP EN PACIENTES ESPAOLES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Y ARTRITIS REUMATOIDE. F. Aguilar Silva, B. Torres, M. Garzn, Y. Vega, MP Bermudo, A Garca1, J. SnchezRomn2, M.F. Gonzlez-Escribano, A. Nez-Roldn. Servicios de Inmunologa y 1Reumatologa, 2Unidad de Colagenosis. HHUU Virgen del Roco. Sevilla. Introduccin. La regin cromosmica 1q41-42 es una de las candidatas a la susceptibilidad al lupus eritematoso sistmico (LES) y a la artritis reumatoide (AR) segn los resultados obtenidos en diferentes estudios de ligamiento. Dentro de esta regin se encuentra el gen PARP cuyo producto es una enzima nuclear que interviene en la reparacin del DNA. El gen PARP podra por tanto estar implicado en la susceptibilidad al LES y la AR. Se ha descrito un polimorfismo de repeticin (CA)n localizado en la regin promotora del gen. Objetivo. Estudiar la posible influencia del polimorfismo de repeticin (CA)n en la susceptibilidad al LES y AR en poblacin espaola. Material y mtodos. Se incluyeron en el estudio 276 pacientes que cumplan los criterios de la ACR para el LES, 141 pacientes diagnosticados de AR segn los criterios de la ACR y 194 controles. El estu-
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dio se realiz mediante PCR utilizando un primer con marcado con fluorocromo, electroforesis capilar y anlisis del tamao de los fragmentos utilizado Genescan 672. Resultados. La frecuencia de individuos portadores del alelo de 93 pb se encontr incrementada entre los pacientes con LES con respecto a los controles (33% vs. 24.1%; p=0.04; p(c)>0.05; OR 1.55; 95% CI 1.0-2.4); mientras que la frecuencia de individuos portadores del alelo de 95 pb se encontr disminuida en este mismo grupo de pacientes (4.4% vs. 11%; p=0.006; p(c)>0.05; OR 0.37; 95% CI 0.17-0.81) No se encontraron diferencias significativas en la distribucin de frecuencias de los alelos entre pacientes con AR y controles. Conclusin. El gen PARP podra estar involucrado en la susceptibilidad al LES en nuestra poblacin. 1202. HAPLOTIPOS CONSERVADOS DEL PROMOTOR DEL GEN DE LA poli(adp)RIBOSA POLIMERASA (PARP) DETERMINAN LA SUSCEPTIBILIDAD A LA ARTRITIS REUMATOIDE. M. Pascual1, R. Cliz2, M.A. Ferrer2, A. Balsa3, D. Pascual-Salcedo3, J. Martn1. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra, CSIC, Granada. 2Reumatologa, Hospital Virgen de las Nieves, Granada. 3Hospital Universitario La Paz, Universidad Autnoma, Madrid Nuestro objetivo consisti en analizar la posible asociacin de la totalidad del polimorfismo descrito en la regin promotora del gen de la poli(ADP) ribosa polimerasa (PARP) con la susceptibilidad a padecer artritis reumatoide (AR) para lo cual se desarroll un estudio de asociacin caso-control que inclua 213 pacientes de AR y 242 individuos sanos que fueron genotipados para el polimorfismo descrito en el promotor del gen de la PARP consistente en; una repeticin CA, un motivo poly(A)n y tres mutaciones puntuales (C410T, C1362T y G1672A). Adicionalmente se analizaron 58 familias espaolas con uno o ms hijos afectos. Tras el completo genotipaje de las cohortes de pacientes de AR e individuos control se detect la existencia de un total desequilibrio de ligamiento (DL), establecindose la existencia de dos nicos haplotipos PARP; el haplotipo A (410T-[A]10-[CA]10-12-1362C, que siempre porta alelos CA cortos, aquellos con 10-12 repeticiones/83-87 bp) y el haplotipo B (410C-[A]11-[CA]13-20-1362T, que inequvocamente incluye repeticiones CA largas, 13-20 repeticiones/89-101 bp). Para la variacin G1672A, la ms prxima al sitio de inicio de la transcripcin, todas las repeticiones CA se encontraron en DL con el nucletido G, con la nica excepcin del alelo de 93 bp, que siempre apareci en combinacin con 1672A, no pareciendo formar parte de los haplotipos conservados descritos. Al analizar la distribucin haplotpica y genotpica de los haplotipos A y B definidos, el haplotipo B estaba incrementado de forma estadsticamente significativa en los pacientes de AR en comparacin con los individuos sanos (P= 0.01 OR 1.42, 95% CI= 1.061.91). La distribucin general de los genotipos entre pacientes y controles mostr una desviacin significativa (P= 0.04, test de la Chicuadrada). As mismo, se observ un efecto significativo de dosis en relacin a la predisposicin a la enfermedad en los individuos portadores del haplotipo B. Dentro del haplotipo B el alelo PARP CA de 97 bp estaba incrementado de manera significativa en los enfermos de AR en comparacin con los controles sanos (P= 0.003, Pc< 0.05, OR= 2.17, 95% CI= 1.27-3.72). En el estudio familiar, los haplotipos descritos como conservados segregaron siempre como un bloque completo.
Nuestros resultados demuestran la existencia de 2 nicos haplotipos conservados del promotor del gen de la PARP en la poblacin de estudio. Estos haplotipos modulan la susceptibilidad gentica de la AR y pueden considerarse como nuevos marcadores de predisposicin a la enfermedad. 1203. RELACIN ENTRE LOS POLIMORFISMOS EN LA METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA, RESPUESTA IN VITRO AL MTX Y EVOLUCIN CLNICA DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE DE INICIO. P. Sabina, F. Arrribas, M. Pascual1, J. Martn1, M.E. Miranda, A. Balsa, E. MartnMola, G. Fontn, D. Pascual-Salcedo. Servicios de Inmunologa y Reumatologa. Hospital La Paz.Madrid. 1CISC. Granada Introduccin. Se ha descrito una disminucin de los niveles de TNF en el lquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide (AR) tras el tratamiento con metotrexato (MTX). A pesar de que el mecanismo de accin del MTX es desconocido, la inhibicin de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) podra estar implicada. Se han descrito dos polimorfismos en este enzima, A1298T y C677T, que parecen condicionar la respuesta clnica. Objetivo. Determinar si el genotipo presente en la enzima MTHFR est relacionado con la inhibicin de la produccin de citocinas in vitro y con la respuesta clnica in vivo. Material y Mtodos. Se estudiaron 41 pacientes con AR de inicio. La sangre de 27 pacientes y 27 controles se diluy 1/10 en medio libre de LPS y se cultiv en presencia de CD3 + CD28 con y sin MTX durante 4 das. El efecto del MTX fue revertido con cido folnico. Los niveles de TNF, IFN e IL-6 fueron cuantificados por ELISA. Los polimorfismos en la MTHFR fueron determinados mediante RFLP-PCR en los 41 pacientes y los 27 controles. El efecto clnico del MTX fue evaluado mediante el ndice de actividad de la enfermedad (DAS) a los 6 meses. Resultados. 1. La produccin de citocinas tras estmulo con aCD3 y aCD28 fue menor en los pacientes que en los controles sanos (p<0,05). 2. El MTX a 40 ng/ml inhibi significativamente la produccin de IFN, TNF e IL-6 de las clulas T estimuladas. 3. Los individuos homozigotos A1298A responden a menores dosis de MTX (p<0,05). 4. Los individuos homozigotos T677T mostraron una mejora clnica ms acusada.(p<0,05). Conclusiones. El MTX inhibi la produccin de citocinas por las clulas T estimuladas. Las mutaciones en el gen de la MTHFR estuvieron asociadas con una mayor respuesta al frmaco tanto en el estudio in vitro como en el estudio clnico, aunque las posiciones implicadas son diferentes. 1204. UN MISMO ALELO DEL GEN IL-10 SE ASOCIA A LA ARTRITIS REUMATOIDE Y A LA ESCLEROSIS MLTIPLE. A. Martnez 1, A. Rubio 1, M. FernndezArquero 1, V. de las Heras 2, D. Pascual-Salcedo 3, A. Balsa 4, X. Montalbn 5, R. Arroyo 2, E.G. de la Concha 1. 1 Servicio de Inmunologa Clnica y 2 Servicio de Neurologa del Hospital Clnico San Carlos, Madrid, 3 Servicio de Inmunologa y 4 Servicio de Reumatologa del Hospital La Paz, Madrid, y 5 Servicio de Neuroinmunologa del Hospital Vall dHebrn, Barcelona Introduccin. La IL-10 es una citoquina antiinflamatoria que regula procesos implicados en la patologa de diversas enfermedades
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autoinmunes. Los polimorfismos descritos en este gen podran alterar los niveles de expresin de esta citoquina y ser por tanto factores de susceptibilidad a dichas enfermedades. Objetivo. Estudiar los polimorfismos del gen de la IL-10 en dos importantes enfermedades autoinmunes, la artritis reumatoide (AR) y la esclerosis mltiple (EM), tanto en estudios caso-control, como en anlisis de desequilibrio de transmisin (TDT) en familias. Materiales y mtodos. En este estudio se han incluido 290 enfermos de AR, (230 para estudio caso-control y 60 tros para TDT), 300 enfermos de EM (236 para caso-control y 64 tros) y 357 controles sanos de Madrid. Adicionalmente tenamos 100 EM-PP y 101 controles sanos de Barcelona. Se estudiaron los microsatlites IL-10G e IL-10R y las tres posiciones polimrficas del promotor -1082, -819 y 592, mediante PCR con primers marcados con flurocromos seguida de electroforesis capilar y PCR especfica de alelo con comprobacin en gel de agarosa respectivamente. Resultados. El alelo 12 del microsatlite IL-10G es el nico que se asocia a la AR (18% vs 9% en controles; OR=2.19, p=0.001). Tambin era transmitido ms frecuentemente al hijo enfermo desde progenitores heterozigotos (10T vs 5 NT). Los datos para todas las AR eran OR=2.08 y p=0.002. Este mismo alelo Il-10G12 se asocia a la EM (15%; OR=1.77, p=0.02), y tambin se transmite ms a los hijos enfermos (14T vs 11NT). En una muestra adicional de enfermos con la forma progresiva de la enfermedad, tambin era mayor la frecuencia del alelo IL-10G12 (14%) que en el grupo control correspondiente (11%), aunque en este caso no se obtuvo significacin estadstica. Los datos para el total de las EM eran OR=1.79 y p=0.005. Para el conjunto de todas las muestras analizadas en este estudio los valores eran OR=1.88 y p=0.0007. Por el contrario, en ninguna de las muestras se observ asociacin significativa con los alelos del promotor de la IL-10. Conclusin. El alelo IL-10G12 es un marcador comn de susceptibilidad a dos importantes enfermedades autoinmunes de tipo Th1. La mutacin etiolgica marcada por este alelo se desconoce, pero no parece corresponder a ninguna de las tres posiciones polimrficas del promotor -1082, -819, -592. 1205. ASOCIACIN DE LOS POLIMORFISMOS DE DIVERSAS CITOCINAS CON LA TUBERCULOSIS EN CANTABRIA. A. Garca Martn, P. Sanchez-Velasco, C. Ruiz de Alegra Puig, F. Ausn Ortega, F. Leyva-Cobin. Departamento de Inmunologa, Hospital Universitario Marqus de Valdecilla, Santander Introduccin. Diversos estudios sugieren que deben existir condicionantes genticos que influyen en la patognesis de la tbc. La produccin de citocinas es un factor clave en el control de la respuesta inflamatoria postinfeccin y en la eliminacin de M.tbc. Su secreccin parece estar regulada geneticamente, por lo que algunos polimorfismos de genes de varias citocinas podran estar asociados con la respuesta inmune frente a dicha enfermedad. Objetivos. Analizar si diversos polimorfismos de algunas citocinas estn asociados con tbc en Cantabria. Pacientes y mtodos. 108 pacientes con tbc (cultivo BK y/o PCR +) fueron comparados con 96 donantes de sangre (controles). Se analizaron los polimorfismos para IL-1 (pos-889), IL-1 (pos-511 y +3962), IL-1R (pst 1 1970), IL-1RA (mspa 1 11100), IL-4R (pos+1902), IL-12 (pos 1188), IFN- (pos UTR 5644), TGF- (codon 10 y 25), TNF (pos 308 y 238), IL-2 (pos 330 y +166), IL-4 (pos 1098, -590 y 33), IL-6 (pos-174 y nt 565), IL-10 (pos-1082, -819 y 592).
Resultados. Las asociaciones para los genotipos de cada citocina que resultaron significativas fueron: IL-1 CT (p<0.05, OR:3.3), IL-1 CT/CT (p<0.01, OR:0.1), IL-1RA CT (p<0.05, OR:2.5), TGF- CC/CC (p<0.01, OR:19.7) y CT/Cg (p<0.01), IL-12 AA (p<0.05, OR:0.43) y CA (p<0.05, OR:2.69), TNF- gg/gg (p<0.01, OR:0.35) y gg/Ag (p<0.01, OR:5), IL-2 Tg/Tg (p<0.01, OR:0.28), IL-4 TT/CC/CC (p<0.01, OR:0.24) y TT/TC/TC (p<0.01, OR: 15). Conclusiones. Nuestro estudio revela la asociacin de diversos polimorfismos de citocinas proinflamatorias como IL-1, y TNF con la tbc. Tambin se observa asociacin significativa de algunos genotipos de citocinas clsicamente TH-2 como IL-4, y TGF- con la enfermedad. Finalmente es destacable la inversin en las frecuencias genotipcas entre la variante homozigota AA (asociada con resistencia) y la heterozigota CA (asociada con susceptibilidad) en el estudio de IL-12 (citocina esencial en la respuesta inmune frente M.tbc). 1206. LECTINA DE UNIN A MANOSA (MBL): PAPEL FRENTE AL VIH Y LA TUBERCULOSIS. M.I. GarcaLaorden1, M.J. Pena2, J. Caminero3, F. lamo4, M.I. Campos2, A. Garca-Saavedra1, C. Rodrguez-Gallego1. Servicios de 1Inmunologa, 2Microbiologa, 3Neumologa, 4U de Investigacin. Hptal. de Gran Canaria Dr. Negrn. Las Palmas G.C. Introduccin. La MBL es una protena srica que reconoce carbohidratos especficos sobre la superficie de determinados microorganismos, promoviendo su fagocitosis y activando la va lectin-dependiente del complemento. Se ha sugerido un papel de la MBL en la infeccin por VIH y que las altas frecuencias observadas de genotipos no productores de MBL podran deberse a su ventaja frente a la infeccin por patgenos intracelulares, como las micobacterias. Mtodos. Se analizaron los alelos del gen de la MBL en 615 pacientes adultos con VIH, 106 de los cuales haban padecido tuberculosis (TBC), y un grupo control de 344 individuos no relacionados sanos. El tipaje se realiz con tcnicas de PCR. Resultados.La frecuencia de genotipos bajo/no productores (LXPA/0+00) de MBL fue menor en pacientes VIH que en controles (13.7% versus 20.1%; P= 0.01). Las edades medias al diagnstico de VIH fueron menores en asociacin con alelos 0 (P=0.033) que con los A, as como con genotipos A0 o 00 (P= 0.022) y, no significativamente, en bajo/no productores (P= 0.071). La frecuencia de alelos 0 fue mayor en los VIH sin TBC que en los VIH con TBC (25% vs 18.4%; P= 0.046), al igual que la frecuencia de genotipos A0+00, aunque no significativamente (44.4% vs 34.0%; P= 0.061). Al comparar las frecuencias gnicas y genotpicas entre el grupo VIH sin TBC y el grupo control, se apreciaron frecuencias ms bajas, aunque no significativas, del genotipo bajo/no productor (14.5% vs 20.1%; P= 0.052). El resto de genotipos no mostraron diferencias. Sin embargo, al comparar el grupo VIH con TBC con el grupo control se observaron menores frecuencias de alelo 0 (18.4% vs 27.3%, P= 0.009), genotipos A0+00 (34.0% vs 44.4%; P= 0.025) y bajo/no productores (10.4% vs 20.1%; P= 0.028). Conclusiones. En adultos, el dficit de MBL no predispone a la infeccin por VIH, aunque s se asocia a una edad de diagnstico ms temprana. Frente a la infeccin por micobacterias, el defecto de MBL puede jugar un papel protector. 1207. ASOCIACION ENTRE POLIMORFISMOS EN LA MOLECULA CD45 Y LA INFECCION POR VIH. J. Gil, J.L. Ruiz-Tscar, C. Rodrguez-Sainz, A. Hernndez, J. Carbone, J.L. Vicario1, F. Garca-Snchez1, R Lillo1,
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P. Torres2, E. Fernndez-Cruz. Servicio de Inmunologa. Hospital General Universitario Gregorio Maran. Madrid. Servicio de Histocompatibilidad1 y Hemoterapia2. Centro de Transfusin CAM. Madrid. Antecedentes. La glicoprotena CD45 expresa mltiples isoformas generadas por splicing alternativo, dos de ellas estrechamente asociadas con la adquisicin de memoria inmunolgica (CD45RA en los linfocitos T naive y CD45RO sobre linfocitos T memoria circulantes). Se ha descrito un polimorfismo por cambio de un nucletido (single nucleotide polymorphism, SNP) en el exn 4 del gen CD45, la transversin C77G, que interfiere con el splicing de esta molcula produciendo persistencia de la expresin de CD45RA y coexpresin anormal de ambas isoformas en los linfocitos T memoria. La frecuencia de SNPs en CD45 en la poblacin sana espaola y en pacientes con patologas infecciosas no ha sido estudiada. Objetivo. Anlisis de la asociacin de SNPs en CD45 con la infeccin VIH. Metodologa. 517 donantes sanos del Centro de Transfusin de la CAM y 128 pacientes VIH positivos del Hospital Gregorio Maran. Anlisis de la coexpresin de CD45RA y CD45RO en linfocitos T circulantes por citometra de flujo de 3 y 4 colores (Becton&Dickinson). Amplificacin del exn 4 del gen CD45 por PCR, purificacin y secuenciacin de los fragmentos amplificados (Applied Biosystems 377). Estadstica: clculo de las prevalencias en el grupo sano y de pacientes VIH positivos, y test X2 para la asociacin entre polimorfismos CD45 y enfermedad. Resultados. 6 / 517 (1,16%, I.C: 0,47-2,63) donantes sanos y 6 / 128 (4,68%, I:C: 1,91-10,35) pacientes VIH positivos presentaron el patrn de splicing anormal en CD45. La diferencia en las frecuencia del grupo de pacientes VIH positivos comparada con la encontrada en los sujetos sanos es significativa (X2: 6,99 p<0,01). Conclusiones y discusin. SNPs en CD45 estn presentes en una muestra de poblacin espaola, siendo su prevalencia inferior a la descrita en otras poblaciones sanas europeas y norteamericanas estudiadas y mayor que la encontrada en poblaciones africanas. Su asociacin con la infeccin VIH puede indicar un factor de susceptibilidad para esta infeccin o influir en la evolucin de la infeccin una vez establecida. 1208. POLIMORFISMO EN EL PROMOTOR DE XIDO NTRICO SINTASA INDUCIBLE EN BRUCELOSIS HUMANA. G. Orozco1, E. Snchez1, A. Caballero2, M.J. Bravo2, J.D. Colmenero3, A. Alonso2, J. Martn1. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez-Neyra. CSIC. Granada, Espaa. 2Servicio de Inmunologa. Hospital Carlos Haya. Mlaga, Espaa. 3Unidad de Enfermedades Infecciosas. Hospital Carlos Haya. Mlaga, Espaa La brucelosis es una infeccin zoontica producida por bacterias intracelulares del gnero Brucella. Una de las principales formas de defensa frente a patgenos consiste en la produccin de xido ntrico (NO) por la xido ntrico sintasa inducible (iNOS).El gen de iNOS presenta en su promotor un microsatlite consistente en un nmero variable de repeticiones CCTTT. sta variacin parece estar asociada a la regulacin de la transcripcin del gen. El objetivo de este trabajo fue estudiar la posible contribucin del polimorfismo del microsatlite CCTTTn del gen de iNOS al desarrollo de la brucelosis.
Nuestro estudio incluy 71 pacientes de brucelosis y 100 individuos sanos como controles. Se determinaron los genotipos CCTTTn mediante un mtodo basado en PCR, con marcaje fluorescente. Las muestras se analizaron usando el software Genescan 672. Se encontraron 9 alelos diferentes (8-16 repeticiones CCTTT). Los alelos ms frecuentes fueron el de 12 (32.5%) y 13 (21.5%) repeticiones. Comparando la distribucin allica total entre pacientes y controles se encontr una diferencia significativa (P = 0.03, mediante test c2 de una tabla de contingencia 2 x 9) Se observ una tendencia a la proteccin frente a brucelosis en el alelo de 9 repeticiones (1.4% pacientes vs 7.5% controles; P = 0.01, OR = 0.18, 95% CI 0.03-0.78) que result no significativa tras aplicar la correccin de Bonferroni. Adems, el alelo de 13 repeticiones se encontr con mayor frecuencia en pacientes sin formas focales de brucelosis que en pacientes con formas focales (P = 0.03), pero esta diferencia no result significativa. Nuestros datos sugieren que el polimorfismo del microsatlite CCTTTn del gen de iNOS no posee un efecto importante en la suceptibilidad a la infeccin por Brucella, aunque la tendencia hacia la proteccin que ha sido detectada indica que sera de inters un posterior estudio con un nmero mayor de individuos. 1209. MUTACIONES H63D y C282Y EN EL GEN HFE Y PROGRESIN DE LA FIBROSIS EN PACIENTES CON HEPATITIS CRNICA POR VIRUS C. M.A. MontesCano, M. Romero-Gmez, F. Aguilar, B. Torres , V.M. Castellano-Megias, L. Gmez-Izquierdo, J. AguilarReina, M. F. Gonzlez-Escribano, A. Nez-Roldan. Servicio de Inmunologa, Servicio de Digestivo y Servicio de Anatoma Patolgica. Hospital U.Virgen del Roco y Hospital de Valme. Sevilla Introduccin. En la actualidad existe controversia sobre el papel que juegan diferentes genes en la progresin de la fibrosis en pacientes con hepatitis crnica C. En este sentido se han estudiado varios polimorfismos en genes candidatos como Nramp1, TNFa y ms recientemente mutaciones en el gen HFE. Objetivo. Aportar informacin sobre la posible interaccin entre las mutaciones H63D y C282Y del gen HFE y la progresin de la fibrosis en pacientes con hepatitis C de nuestro entorno. Material y mtodos. Se incluyeron 223 pacientes (143 hombres y 80 mujeres) con hepatitis crnica C, no tratados previamente con antivirales. Segn el ndice de Scheuer obtenido del estudio de la biopsia heptica, los pacientes se agruparon en dos categoras, grupo 1: F0F2 (ausencia de fibrosis-fibrosis moderada) y grupo 2: F3-F4 (fibrosis severa-cirrosis). El estudio de las mutaciones en el gen HFE se realiz mediante un sistema de PCR-ARMS. Resultados. Encontramos diferencias significativas en la distribucin de genotipos de la mutacin H63D entre ambos grupos de pacientes (c2 tabla de 3x2, p=0.003). Esta diferencia se deba a un incremento de individuos con genotipo DD entre pacientes del grupo 2 (11.1% vs. 2.4% entre pacientes del grupo 1, p=0.01, OR=5.98, 95% CI 1.43-28.76). No se encontraron diferencias significativas en la distribucin de los genotipos de la mutacin C282Y. Conclusin. La presencia en homozigosis de la mutacin H63D en el gen HFE puede influir en la progresin de la fibrosis en pacientes con hepatitis crnica por virus C.
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1210. REGIONES GENTICAS IMPLICADAS EN EL SNDROME DEL ACEITE TXICO (SAT). V. del Pozo, B. Crdaba, S. Gallardo, C. Arribas1, E. Llanes, E. Lpez, E. Civantos, P. de Andrs2, M. Posada3, C. Lahoz. Dpto Inmunologa, Fundacin Jimnez Daz. Madrid. 1CISATER. Instituto de Salud Carlos III. Madrid Antecedentes. El SAT es una enfermedad multisistmica debida a la ingestin de aceite de colza desnaturalizado con un 2% de anilina. Desde un punto de vista inmunolgico, hay datos que apuntan a una activacin de clulas T (TH2). En la fase aguda de la enfermedad, estos pacientes mostraban eosinofilia y altos niveles en suero del sIL-2R. Adems, en necropsias de fallecidos por el SAT, se observ un incremento del antgeno HLA de clase II, DR2. Tambin se constat una alta prevalencia en mujeres y tanto la respuesta clnica, como la evolucin de la enfermedad difera incluso dentro de miembros de una misma familia (con exposicin al agente causal presumiblemente similar). Estos datos sugieren que el SAT es una enfermedad multifactorial probablemente dependiente de la interaccin entre el tiempo y la cantidad de aceite ingerido, as como, de la presencia de factores adyuvantes no especficos en individuos susceptibles genticamente. Objetivos. Localizar en los cromosomas 5 y 6 (elegidos basndonos en los hallazgos inmunolgicos) posibles loci con elementos genticos claves para el desarrollo del SAT. Mtodos. El estudio se dise como caso-control ciego apareado (n=322): 135 pacientes del SAT y como controles no afectados, 99 miembros de la familia y 98 amigos. Los sujetos fueron genotipados para 42 marcadores (10 cM de resolucin) en los cromosomas 5 y 6 (22 microsatlites en el 5 y 20 en el 6). La distribucin de alelos de cada locus analizado en afectados vs no afectados se examin por Regresin Logstica Condicional con SAS (versin 6.12). Resultados y Conclusiones. Cinco regiones del cromosoma 5 y 7 del 6, mostraron diferencias significativas en la frecuencia allica y/ homozigosidad, comparando pacientes y controles. Algunas de estas regiones estn relacionadas con el cluster de citocinas en el cromosoma 5 y con el HLA en el 6, ambos loci tericamente implicados en el SAT. Estos estudios sugieren la importancia de los factores genticos en el desarrollo de una enfermedad debida a un agente txico, en el que los factores ambientales tambin estn implicados. 1211. FRECUENCIAS ALLICAS Y DISPARIDAD PREDECIBLE RECEPTOR-DONANTE PARA CUATRO ANTGENOS MENORES DE HISTOCOMPATILBILIDAD HA-1, HA-2, HA-8 Y HB-1 EN POBLACIN ESPAOLA. M.J. Avils, M. AlonsoNieto, A. Balas, F. Garca-Snchez, R. Lillo, A. lvarezDoval, L. Zarapuz, J.L. Vicario. Histocompatibilidad, Centro de Transfusin de Madrid Los antgenos menores son pptidos inmunognicos derivados del procesamiento de protenas endgenas polimrficas, presentados por molculas de HLA de clase I y II. La expresin de estos antgenos puede estar restringida a ciertos tejidos, a diferentes estados de diferenciacin, o bien ser ubicua, presentando restriccin por determinadas molculas HLA. Se ha demostrado que su presentacin puede desarrollar una fuerte respuesta de clulas T del donante en trasplante de progenitores hematopoyticos HLA idnticos, siendo antgenos diana en las reacciones injerto contra tumor y enfermedad de injerto
contra husped (EICH). El objetivo del estudio es calcular la frecuencia genotpica y la disparidad predecible entre parejas receptor-donante para los antgenos menores HA-1, HA-2, HA-8 y HB-1, siendo analizados en una poblacin sana espaola de origen caucasoide y, en el caso del antgeno menor HA-1, sobre una serie de parejas receptordonante hermanos HLA idnticos. El mtodo empleado en este anlisis ha sido PCR-SSP en el caso de la distincin entre los alelos HA2V/M y HA-8R/T y, PCR-RFLP para la distincin de los alelos HA-1H/R y HB-1H/Y. Frecuencia allica HA-1H HA-1R HA-2M HA-2V HA-8R HA-8P HB-1H HB-1Y 37,54% 62,46% 19,23% 80,77% 41,80% 58,20% 77,00% 23,00% Frecuencia genotpica HA-1H/H HA-1H/R HA-1R/R HA-2M/M HA-2M/V HA-2V/V HA-8R/R HA-8R/P HA-8P/P HB-1H/H HB-1H/Y HB-1Y/Y 12,63% 37,54% 49,83% 4,81% 29,81% 65,38% 19,20% 45,20% 35,60% 60% 36% 4%
Disparidad predecible HA-1H * 13.22% HA-1R 7.56% HA-2M 11.95 HA-2V* 2.33% HA-8R* 12.64% HA-8P 14.68% HB-1H* 3.29% HB-1Y* 12.85% * Alelo inmunognico La probabilidad conjunta de tener un antgeno menor inmunognico (entre los 4 sistemas estudiados) diferente en una pareja de hermanos sera del 44%, que debera reducirse al menos a la mitad debido a la restriccin por parte del MHC. Aunque estos antgenos menores se han asociado al desarrollo de EICH, podran utilizarse para la obtencin in vitro de clulas CD8 especficas, como tratamiento adoptivo celular anti-tumor. Posters: 1212-1215
1212. ESTUDIO DE LOS POLIMORFISMOS DE LOS GENES TOLL-LIKE RECEPTOR 2 Y 4 EN LA ARTRITIS REUMATOIDE. E. Snchez1, G. Orozco1, R. Caliz2, J. Martn1. 1Instituto de Parasitologa y Biomedicina Lpez Neyra, CSIC, Granada. 2Seccin de Reumatologa. Hospital Virgen de las Nieves. Granada Introduccin. Los receptores Toll-Like son una familia de receptores que tienen un papel principal en la iniciacin de la respuesta
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celular innata. Diez receptores Toll-like (TLRs) han sido identificados en mamferos (TLR1-TLR10). Los TLR2 y TLR4 son activados por determinados componentes de la pared celular bacteriana. Los TLR2 y 4 activan al factor nuclear NF-B e inducen la expresin de citoquinas inflamatorias y molculas coestimuladoras, sugiriendo que los TLRs humanos participan en la respuesta innata y sealan la activacin de la inmunidad adaptativa, y por lo tanto pueden ser importantes en enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide (AR). Objetivo. Investigar la posible relacin de los polimorfismos de TLR2 (Arg677Trp y Arg753Gln) y TLR4 (Asp299Gly y Thr399Ile) con la susceptibilidad a la AR. Mtodos. El estudio incluy 224 pacientes de AR y 199 controles sanos. El tipaje de estos polimorfismos se hizo por mtodos de PCR-RFLP, usando las enzimas de restriccin Pst I y Hpa II para TLR2 y Hinf I y Nco I para TLR4. Resultados. No se encontraron diferencias estadsticamente significativas entre pacientes de AR y controles sanos para ninguno de los polimorfismos del gen TLR4. Adems el gen TLR2 no era polimrfico en nuestra poblacin. TLR4 Frecuencias genotipicas Asp/Asp 203 (90%) 172 (86%) Thr/Thr 202 (90%) 173 (87%) Asp/Gly 21 (9%) 25 (13%) Thr/Ile 22 (10%) 24 (12%) Gly/Gly 0 2 (1%) Ile/Ile 0 2 (1%)
Material y mtodos. El estudio se realiz en 276 pacientes que cumplan los criterios de la ACR para el LES, 141 pacientes diagnosticados de AR segn los criterios de la ACR y 194 controles sanos mediante un sistema de PCR-RFLP. Resultados. No se encontraron diferencias significativas en la distribucin de frecuencias genotpicas entre pacientes (LES y AR) y controles. Conclusin. La insercin de citosina en posicin 3020 del gen NOD2 no est implicada en la susceptibilidad al LES ni a la AR en nuestros pacientes. 1214. POLIMORFISMOS EN EL GEN CTLA-4 EN PACIENTES ESPAOLES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO. F. Aguilar Silva, B. Torres, M. Garzn, Y. Vega, M.P. Bermudo, J. Snchez-Romn1, M.F. GonzlezEscribano, A. Nez-Roldn. Servicio de Inmunologa y 1Unidad de Colagenosis. HHUU Virgen del Roco. Sevilla Introduccin. Una de las regiones candidatas propuestas en estudios de ligamiento realizados en familias con pacientes diagnosticados de lupus eritematoso sistmico (LES) es regin cromosmica 2q33. Dentro de esta regin se encuentra el gen CTLA-4 cuya expresin se induce en las clulas T activadas. La unin de la molcula de CTLA-4 con sus ligandos (B7.1 y B 7.2) regula la activacin de las clulas T por lo que esta molcula podra contribuir a la generacin de tolerancia perifrica. Tanto por su localizacin como por su funcin el gen CTLA-4 podra estar implicado en la susceptibilidad al LES. Existen varios polimorfismos descritos en este gen. Objetivo: Estudiar la posible influencia los polimorfismos 1722 (C/T), -318 (C/T) y +49 (A/G) del gen CTLA-4 en la susceptibilidad al LES en poblacin espaola. Material y mtodos. El estudio se realiz en 276 pacientes que cumplan los criterios de la ACR para el LES y 194 controles sanos mediante un sistema de PCR-ARMS. Resultados. No se encontraron diferencias significativas en la distribucin de las frecuencias genotpicas entre pacientes y controles para ninguno de los polimorfismos estudiados. Conclusin. Los polimorfismos en localizados en las posiciones 1722, -318 y +49 del gen CTLA-4 no estn implicados en la susceptibilidad al LES en nuestros pacientes. 1215. ESFEROCITOSIS HEREDITARIA ASOCIADA A HEMOCROMATOSIS HEREDITARIA: DESCRIPCIN DE UN CASO EN UNA FAMILIA ESPAOLA. M.A. Montes-Cano1, F. Rodrguez-Muoz2, R. FrancoOsorio3, A. Nez-Roldn1, M.F. Gonzlez-Escribano1. 1Servicio de Inmunologa. Hospital Universitario Virgen del Roco. Sevilla 2Servicio de Digestivo y 3Servicio de Hematologa. Hospital Punta de Europa. Algeciras. Cdiz Introduccin. La esferocitosis hereditaria (EH) es la causa ms frecuente de anemia hemoltica congnita. La herencia es autosmica dominante con clnica poco severa en un 80% de los casos, el resto son formas recesivas que cursan con cuadros de anemia hemoltica intensa. La hemocromatosis hereditaria (HH) origina una alteracin del metabolismo del hierro que se traduce en acmulos de este metal en diferentes rganos. La herencia es autosmica recesiva y afecta fundamentalmente a varones. La sintomatologa suele aparecer entre la 5 y la 6 dcada de la vida. Hay diferentes tipos genticos de HH, sien-
aa 299 AR (n= 224) Control (n= 199) aa 399 AR (n= 224) Control (n= 199)
Conclusin. En este trabajo se investig por primera vez la relacin del polimorfismo de los genes TLR2 y TLR 4 con la artritis reumatoide. Nuestros datos sugieren que los polimorfismos de ambos TLRs parecen no tener un efecto relevante en la susceptibilidad a la AR. 1213. ESTUDIO DE LA INSERCIN 3020c EN EL GEN NOD2 EN PACIENTES ESPAOLES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Y ARTRITIS REUMATOIDE. B. Torres, F. Aguilar Silva, M. Encarnacin, M. Garzn, E. Snchez, M.G. Villar, A. Garca1, J. Snchez-Romn2, M.F. Gonzlez-Escribano, A. Nez-Roldn. Servicios de Inmunologa y 1Reumatologa y 2Unidad de Colagenosis. HHUU Virgen del Roco. Sevilla Introduccin. La regin cromosmica 16q12 ha sido propuesta como candidata en la susceptibilidad al lupus eritematoso sistmico (LES) y a la artritis reumatoide (AR) a partir de los estudios de ligamiento. Dentro de esta regin se encuentra el gen NOD2, cuyo producto, interviene tanto en el reconocimiento de patgenos como en la apoptosis. De manera que tanto por la localizacin del gen como por la funcin de la protena que codifica, el gen NOD2 podra estar implicado en la susceptibilidad al LES y la AR Se han descrito variantes de este gen, algunas de las cuales se han relacionado con la enfermedad de Crohn. Una de estas variantes consiste en una insercin de citosina en la posicin 3020 (3020c) cuyo producto es una protena truncada que tiene alterado el lugar de reconocimiento de patgenos. Objetivo. Estudiar la posible influencia de la variante 3020c en la susceptibilidad al LES y AR en poblacin espaola.
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INMUNOLOGA
do el ms frecuente el ligado al gen HFE. La mutacin C282Y en el gen HFE en homozigosis y los heterozigotos C282Y/H63D se relacionan con el desarrollo de la enfermedad. Objetivo. Estudio de una familia donde coexisten EH y HH. Pacientes y mtodos. Familia compuesta por abuelos paternos (I-I, I-II), padres (II-I, II-II) y 2 hijos varones (III-I, III-II). El abuelo paterno (I-I), su hijo (II-I) y uno de los nietos (III-II) fueron diagnosticados de EH en base a la deteccin de esferocitos y disminucin de la resistencia osmtica eritrocitaria (ROE). Adems, II-I de 44 aos de edad, present repetidas alteraciones en el metabolismo del hierro no debidas factores ambientales, por lo que se sospech una HH. Se realiz un estudio gentico de las mutaciones C282Y y H63D
en el gen HFE a todos los miembros de la familia mediante PCRARMS. Resultados. El paciente con EH y HH era doble heterozigoto para los exones 2 y 4 del gen HFE siendo el nico miembro de la familia que presentaba junto con la EH esta condicin para HFE. Conclusiones. Primer caso de coexistencia de EH y HH descrito en una familia espaola. El efecto sinrgico de la EH que incrementa la eritropoyesis y la absorcin intestinal de hierro y la condicin de doble heterozigoto en HFE, puede ser causa del desarrollo precoz de HH. El escrutinio sistemtico de mutaciones para el gen HFE en pacientes con trastornos hematolgicos permite instaurar un tratamiento precoz y prevenir las graves complicaciones asociadas a la HH.
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Indice de Autores
A Toro A. 122 Abad M.L. 127, 128, 132 Adreani P. 152 Aebischer T. 101 Aguado E. 96, 161 Agudo-Ibez L. 123 Aguilar D. 163 Aguilar F. 168 Aguilar Silva F. 165, 170 Aguilar-Reina J. 168 Aguilera I. 120, 122 Aguilera Montilla N. 140 lamo F. 167 Alarcn A. 90 Alava M.A. 134, 140 Alba A. 142 Albar J.P. 114 Alcalde M. 150 Alcover A. 95 Aldea A. 144 Alemany J.M. 107, 122 Alfaro C. 135 Alfonso-Prez M. 151 Algarra I. 134, 136, 137 Almagro M. 135 Almirall E. 92 Alonso A. 168 Alonso C. 121 Alonso R. 146 Alonso-Nieto M. 119, 169 lvarez A. 92 lvarez A.J. 90, 93 lvarez Cermeo J.C. 145 lvarez de Mon M. 154, 157, 158, 164 lvarez Domnguez C. 104, 112 lvarez I. 118 lvarez Mon-Soto M. 99, 100, 101, 162, 163,164 lvarez M.R. 122 lvarez R. 107 lvarez-Doval A. 169 lvarez-Lpez M.R. 94, 95, 119, 122, 125 lvarez-Mon M. 145 lvarez-Santana M.C. 90 Alves H. 124, 126 Allende L.M. 89, 94 Ampudia R. 142 Anel A. 134, 140 Aparicio P. 105, 161 Arcas R. 125 Argelles F. 144 Arias M.T. 111 Arina A. 134, 135 Arizn J.M. 123 Arman M. 97 Armengol M.P. 141 Arnaiz-Villena A. 109, 110 Arnal C. 144 Arnal F. 121 Arnaud J. 95 Arstegui J.I. 144 Arranz E. 148 Arribas C. 169 Arribas J.R. 129 Arrizabalaga J. 129 Arroyo A.G. 155, 157 Arroyo R. 166 Arribas F. 166 Ashhab Y. 152 Ausin F. 132 Ausin Ortega F. 124, 167 Avils 169 B Baeza M.L. 113 Bahllo P. 144 Baixeras E. 114 Balas A. 166, 169 Ballesteros N. 123, 124 Baonza B. 148 Barahona F. 108 Barajas M. 134 Barbarroja J. 100, 154, 157, 158, 162, 164 Barcenilla H. 99, 100, 101, 145, 154, 157, 158, 162, 163, 164 Barreda P. 149 Barreiro O. 153, 154 Barros C. 128 Barroso S. 90, 93 Bartolom M.J. 149 Bas J. 161 Beitia J.M. 113 Belln J.M. 128, 130 Benahmed D. 158 Bendandi M. 114 Benito J.M. 127 Bermejo F. 146 Bermejo Martn J.F. 112 Bermejo R. 148 Bermudo M.P. 165, 170 Bernal-Ramos A. 125 Bertran J.M. 92 Blanco J.L. 129 Blanco-Gelaz M.A. 107, 117 Blanco-Quirs A. 148 Blanch A. 91 Blzquez R. 128 Bofill M. 9299 Bootello A. 135, 145, 146, 153 Borrs F.E. 99 Borrs R. 158 Botello D. 144 Bravo M.J. 168 Brieva J.A. 103, 106, 137, 151, 153, 155 Buenda E. 161 Bueno C. 149 C Caballero A. 168 Cabaas C. 153, 154, 163 Cabello Creus A. 108 Cabello M.A. 126, 130 Cabrera C. 133 Cabrera C.M. 108 Cabrera T. 108, 133, 137 Cabrero E. 128 Cabrero J.R. 154 Cacho J.L. 120, 121 Caldern E. 129, 133 Caldern E. Cliz R. 166, 169 Calopa M. 161 Calvo C. 148 Calvo J. 97 Calvo M. 149 Calleja S. 94 Cambronero R. 89 Caminero J. 167 Camino X. 127 Campillo-Marquina J.A. 94 Campos A. 148. Campos J. 153 Campos M. 134 Campos M.I. 167 Campos-Caro A. 103, 106 Campos-Herrero M.I. 90 Campos-Martn Y. 159, 164 Canseco F. 154, 157, 158, 164 Cantero T. 144 Cantisn S. 123, 124, 125 Cant C. 127, 128, 132 Cantn J. 138 Caelles M. 98 Caparrs E. 161 Caragol I. 92 Carbone J. 127, 128, 132, 167 Crdaba B. 113, 116, 169 Caro P. 152 Carrasco Marn E. 104, 112 Carrasco Y.R. 98 Carrascosa A.L. 161 Carrera T. 132 Carrillo J. 142 Casado J.G. 108, 160, 164 Casamitjana N. 118 Casanova J.L. 90 Casas C. 93 Castan S. 105 Castellano-Megias V.M. 168 Castilla V. 152, 156 Castrillo C. 145 Castro M J. 123 Castro P. 146, 149 Castro-Henriques A. 124, 126 Catlfamo M. 144 Caubn J. 111 Cemborain A. 109 Centeno A. 120 Civantos E. 113, 116, 169 Claramonte X. 129 Clemente J. 89, 94 Climent N. 131 Clotet B. 128 Cockerill P. N. 97 Colmenero J.D. 168 Colobran R. 118, 141, 152 Collado A. 133 Comabella M. 157 Conejero L. 113 Contreras B. 102, 110 Cooper M.D. 102 Corb A.L. 114 Cortegano M. 97 Cozar J.M. 137 Crespo del Poz J. 147 Crespo M. 129 Cuadrado E. 127, 138, 140 Cun S. 102, 110 Chvez R. 163 Chen L. 135 Chilln S. 115 Chowdhary V. 116 D Dapena J. 129 David C.S. 116 de Andrs B. 97, 104 de Andrs P. 169 de Grgolas M. 132 de Gracia J. 92 de Gracia X. 92 de Jos M.I. 128 de Juan M.D. 127, 138, 140 de la Calle H. 121 de la Concha E.G. 116, 121, 166 de la Fuente A. 119 de la Fuente F. 149 de la Horra C. 129, 133 de la Mata M. 124 de la Rosa O. 164 De la Sen M. 115 De la Sen M.L. 126 de la Torre N. 134 de la Vega J. 146 de las Heras V. 166 de Nicols R. 152, 156 de Pablos P. 89 del Amo J. 99, 100, 101, 162, 163, 164 del Pozo V. 113, 169 del Rey M.J. 123 DelaRosa O. 108, 160 Delgado Cervio E. 93 Delgado J. 102 Delgado L. 151 Delgado-Rodrguez M. 134 Demestre M. 143 Daz D. 99, 100, 101, 145, 154, 162, 163, 164 Daz L. 127, 128, 130, 132 Daz M. 128 Daz T. 120 Daz-Espada F. 102 Daz-Rubio M. 116 Diestre C. 134, 140 Domnech N. 120 Domingo P. 129 Domnguez Cobos A. 110 Domnguez O. 152 Domnguez-Perles R. 99 Duarte M. 135 Dueas A. 142 Dueas G. 108, 126, 130 Durntez A. 102, 110 E Echniz P. 127, 138, 140 Echeverra A. 104 Egido J. 152, 156 Ehninger G. 101 El Hakeh J. 92 El Ouaamari L. 150 Encarnacin M. 170 Ercilla G. 147 Escribese M.M. 96 Escudero E. 96 Espaol T. 89, 92 Espejo C. 143 Esplugues E. 143 Estefana E. 159 Esteso G. 155 Etxagibel A. 91 Etxagibel A. 92, 93
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F Fabregat V. 111 Faner R. 118 Feijo E. 135 Fernandes J. 124, 126 Fernndez Arquero M. 111 Fernndez C. 103 Fernndez E. 119 Fernndez Franco L. 116 Fernndez Gmez-Chacn G. 131 Fernndez M.A. 141 Fernndez Mastache E. 103 Fernndez Raada J.M. 151 Fernandez-Arquero M. 116 Fernndez-Arquero M. 121, 166 Fernndez-Cruz E. 127, 128, 132, 149, 150, 168 Fernndez-Guerrero M. 132 Fernndez-Morera J.L. 106, 117 Fernndez-Salazar L. 148 Ferreira A. 89, 116 Ferreira Cerdn A. 93 Ferrer E. 128 Ferrer J. 92 Ferrer M.A. 166 Ferrer-Francesch X. 141 Ferrn A. 133 Fieschi C. 90 Flores J. 154, 157, 158, 164 Fontn Casariego G. 93 Fontn G. 89, 91, 116, 166 for the GENIO II group 145 Formoso M.J. 121 Fowlkes B.J. 98 Francs A. 90, 126 Franco E. 120, 122 Franco-Osorio R. 170 Frecha C. 95, 114 Fresno M. 96, 161 Fuentes D. 117 Fuster E. 148 G Gabari I. 114, 135 Gaforio J.J. 134 Galn I. 128, 130 Galiani M.D. 130 Galofr J.C. 134 Glvez B.G. 155, 157 Gallardo S. 113, 116, 169 Gallart T. 129, 131 Gambn F. 102, 115 Garca A. 130, 165, 170 Garca Astudillo L.A. 147 Garca F. 129, 131 Garca J.A. 119 Garca M. 123 Garca Martn A. 124, 167 Garca Olivares E. 105, 161, 165 Garca Pardo . 154 Garca R. 132 Garca Rodrguez M.C. 89, 93, 116 Garca Sancho L. 140 Garca Segovia A. 131, 149, 150 Garca Toscano M. 95, 114 Garca-Alonso A. 122 Garca-Alonso A.M. 94, 95, 119, 122, 125 Garca-Asenjo J. 133
Garca-Calatayud M.C. 95 Garca-Czar F.J. 101 Garca-Fernndez S. 107 Garca-Laorden M.I. 90, 167 Garca-Lpez M.A. 143 Garca-Lora A. 136, 137 Garca-Marco J. 110 Garca-Merino A. 145 Garca-Moreno M.J. 108, 126, 130 Garca-Paredes J. 116 Garca-Pearrubia P. 105, 136 Garca-Rodrguez C. 142 Garca-Saavedra A. 90, 167 Garca-Snchez F. 167, 169 Garca-Trujillo J.A. 135, 153 Garrido F. 108, 133, 135, 136, 137, 138, 139 Garrido J.J. 155 Garrote J.A. 148 Garzn M. 165, 170 Gaspar M.L. 97, 104 Gatell J.M. 128, 129, 131 Gentil M.A. 122 Gil C. 131 Gil J. 127, 132, 167 Gimferrer I. 111 Gmez A. 147 Gmez de la Concha E. 111 Gmez del Moral M. 159 Gmez G de Soria V. 151 Gmez M. 119, 121 Gomz P. 97 Gmez S. 144 Gmez-Casado E. 109, 110 Gmez-Gutirrez M. 143 Gmez-Izquierdo L. 168 Gmez-Lozano N. 159 Gngora R. 102 Gonzlez A. 161 Gonzlez C. 120, 121 Gonzlez E. 112 Gonzlez F. 102, 110 Gonzlez Fernndez A. 103 Gonzlez J. 130 Gonzlez L. 123 Gonzlez M. 123 Gonzlez R. 123, 124, 126 Gonzlez S. 106, 107, 123 Gonzlez-Becerra C. 129 Gonzlez-Cabrero J. 152, 156 Gonzlez-Enseat M.A. 144 Gonzlez-Escribano M.F. 165, 168, Gonzlez-Fernndez . 102, 115 Gonzlez-Garca I. 153 Gonzlez-Lahoz J. 128 Gonzlez-Mangado N. 113 Gonzlez-Porqu P. 145 Gonzlez-Rivera M. 128 Gonzalo P. 97, 104 Gordn-Alonso M. 143 Gozalbo Lpez B. 108, 111 Granados J. 109 Granell R. 119 Gual Garca L. 116 Guerra N. 107, 122, Guerra-Prez N. 94, 95 Guillen S. 89 Gurbindo M.D. 128 Gutirrez A. 140
Gutirrez C. 146, 149, 156 Gutirrez-Lpez D. 154 Gutirrez-Lpez MD. 153 Guzman C. 93 H Habermann I. 101 Haro I. 147 Hermida M. 120 Hernndez A. 147167 Hernndez M. 92 Hernndez S. 133 Hernndez-Caselles T. 105 Hernndez-Daz G. 90 Hernndez-Pacheco G. 109 Hurtado C. 161 I Iglesias-Alzueta J. 91 Igual R. 158 Inogs S. 114 iguez M.A. 96 Iribarren J.A. 127 Izcue A. 104 Izquierdo Martnez M. 148 J Jaraquemada D. 144 Jarque D. 119 Jimnez C. 119 Jimnez E. 136, 137 Jimnez G. 153 Jimnez Gamiz P. 139 Jimnez J. 107 Jimnez J.L. 96, 128 Jimnez M. 163 Jimnez P. 108, 137, 139 Jimnez-Marn A. 155 Jimnez-Periaez A. 97, 165 Jord J. 102 Jou A. 128 Juan M. 118, 141, 152 Juli M.R. 92 K Kiani A. 101 Kimatrai M. 105, 161, 165 Kindeln J.M. 126, 130 Kolkowski E. 144 Krawczyk M. 107 L Laforsch S. 101 Lagarda L. 93 Lahoz C. 113, 116, 169 Lara J.M. 93 Larrad L. 134, 140 Lasa I. 140 Lascurain R. 163 Lasierra P. 134, 140 Lauzurica P. 143 Lazzari E. 129 Lejeune M. 129, 131 Lemos C. 121 Len A.J. 148 Len J.A. 128 Len V.J. 120, 121 Leyva-Cobin F. 109, 124, 167 Lillo R 167, 169
Lindroth K. 103 Lobato J.J. 115 Logean A. 118 Lpez Hoyos M. 147 Lpez A. 140 Lpez Bernaldo de Quiros J.C. 130 Lpez C. 157 Lpez de Castro J.A. 117, 118 Lpez E. 113, 116, 169 Lpez F. 128 Lpez Hoyos M. 149 Lpez Longo F.J. 150 Lpez P. 149 Lpez Quiones A.R. 138 Lpez- Rivas L. 146 Lpez Trascasa M. 91 Lpez-Cabrera M. 97 Lpez-Daz de Cerio A. 114 Lpez-Escribano H. 132 Lpez-Giral S. 151 Lpez-Hoyos M. 132 Lpez-Larrea C. 106, 107, 117, 123 Lpez-Longo F.J. 150 Lpez-Nevot M. 133 Lpez-San Romn A. 146 Lpez-Santalla M. 109, 110, 140 Lpez-Trascasa M. 90 Lpez-Vzquez A. 117, 123 Lorenzo I. 119 Losada B. 94 Losada-Fernndez I. 110 Lowy E. 109, 110 Lozano A. 134 Lozano F. 97, 111 Lozano J.M. 108, 126, 130 Lucas-Gramajo P. 109 Luengo S. 148 Luque R. 135 Llanes D. 155 Llanes E. 116, 169 Llanes Ruiz D. 156, 158 M Machuca Y. 147 Madrazo J.L. 93 Magadn S. 102, 115 Malavasi F. 98 Maleno I. 133 Malissen B. 96 Malissen M. 96 Mampaso F. 96 Mancebo B.E. 89 Maez R. 120 Maqueda A. 154 Maradona A. 128 Marco FM. 115 Marcos M. 97 Marcos M.A.R. 104 Marn C. 108 Marn Iglesias R. 138, 139 Marn L. 107, 119, 122 Marn L. 94, 95, 122, 125 Marn M.J. 148, 149 Marn M.R. 135 Marn R. 137, 139 Mart M. 117 Mart S. 136, 138 Martn Bjar M.T. 110 Martn de las Mulas J. 155
173
Martn F. 95, 114 Martn J. 112, 140, 166, 168, 169 Martn-Donaire T. 110 Martnez A. 116, 121, 166 Martnez A.C. 143 Martnez D. 163 Martnez E. 129 Martnez M.S. 136, 137 Martnez Naves E. 108, 111, 164 Martnez-Borra J. 106, 117, 123 Martnez-Cceres E.M. 143 Martnez-Cruz L.A. 134 Martnez-Florensa M. 105 Martnez-Garca P. 95 Martnez-Laso J. 109, 110 Martnez-Lorenzo M.J. 134, 140 Martnez-Naves E. 159 Martnez-Pomar N. 91, 92, 93 Martnez-Saavedra M. 90 Martn-Fernndez J.M. 95, 113 Martn-Mola E. 166 Martn-Mosquero C. 113 Martn-Villa J.M. 109, 110, 140 Mas V. 111 Masjuan J. 145 Matamoros N. 91, 92, 93 Matas-Romn S. 155, 157 Mato J.M. 134 Mazzolini G. 114, 134, 135 McQuaid A. 92 Medina F. 103 Medrano A. 133 Medrano F.J. 129, 133 Melero D. 97, 104 Melero I. 114, 134, 135 Mellado M.J. 128 Mndez J. 121 Mndez R. 135, 137, 139 Mndez Vales R. 138, 139 Mendoza J.L. 116 Merino J. 104 Merino O. 146 Mestre M. 161 Miguelsanz M.A 126 Mijiyawa M. 117 Mil J. 93 Minguela A. 119, 122, 125, 141 Minguet S. 104 Mnguez Y. 119 Mir A. 158 Miranda M.E. 166 Miras M. 119 Mir J.M. 129, 131 Mir M. 123-125 Mittelbrunn M. 96 Modesto C. 144 Mojico A. 147 Molina A. 96, 102, 115 Molina I.J. 95, 114 Molina V.M. 130 Molto L. 133 Monserrat J. 99, 100, 101, 158, 162, 164 Montalban X. 143, 157, 166 Monteagudo M.D. 105 Monteiro M.S. 124, 126 Montes M.A. 93, 107, 122 Montes O. 107, 122 Montes-Ares O. 94, 95, 119, 125
Montes-Cano M.A. 129, 133, 168, 170 Montes-Casado M. 94, 95, 125 Montoro J.A. 119 Montserrat V. 117 Morales P. 123 Mora-Lpez F. 103, 106 Morelli A. 144 Moreno A. 155 Moreno C. 104 Moreno Lpez A. 156, 158 Moreno M.J. 158 Moreno S. 128, 130 Moscard F. 119 Moscoso I. 120 Moscoso J. 109, 110 Moyano J.V. 154 Moya-Quiles M.R. 119, 122, 125 Moya-Quiles R. 94, 95, 107 Mozo L. 146, 149 Mugerza J.M. 140 Muoz A. 99 Muoz C. 115, 126, 151 Muoz Fernndez M.A. 96, 128, 130, 131 Muoz Fernndez R. 105, 161, 165 Muoz J. 137, 151 Muoz P. 98 Muoz-Saa I. 91, 92, 93 Muro M. 94, 95, 107, 119, 122, 125 Mux L. 144 N Naranjo M. 99 Narvaiza I. 134 Navarro J. 127, 128, 132 Navarro M.C. 98 Navarro M.L. 128 Navarro M.N. 98 Nogal M.L. 161 Nogales Morn MA. 148 Noguera J.M. 139 Nez-Cruz S. 96 Nez-Roldn A. 90, 93, 120, 122, 165, 168, 170 Nusspaumer G. 98 O Ocaa E. 137, 151, 155 Ocaa I. 128 Ojeda A. 126 Ojeda C.A. 130 Ojeda G. 65, 97 Olivares N. 127, 138, 140 Oliveira G. 124, 126 Oliver Miarro D. 148 Ords J. 155 Ordua A. 142 Orozco G. 168, 169 Ortega C. 95, 114 Ortega M. 113 Ortego N. 98 Osorio E. 124, 126 P Paco L. 133, 139 Pacheco A. 95 Pacheco-Castro A. 113, 163 Pacho A. 123
Palomino P. 113, 150 Palou E. 111, 118 Pans J. 146 Panizo C. 114 Paos Adillo G. 156, 158 Park M.L. 98 Parrado A. 119 Parrilla P. 99, 119 Pascual Campo M. 93 Pascual D. 125 Pascual M. 112, 166 Pascual-Salcedo D. 166 Paschen A. 139 Pastor F. 104 Pastor S. 141 Pastor X. 142 Pastor-Vivero M.D. 94 Paule P. 94 Pavn E. 98 Paz Artal E. 148 Peces-Barba G. 113 Pedrinacci S. 135 Pedrinaci S. 138, 139 Pelluch A. 115 Pena M.J. 167 Penkowa M. 143 Pea J. 108, 123, 124, 125, 126, 130, 160 Pea J.M. 128 Pea M. 132, 149 Pea Macarro C. 104 Pea R. 99 Pea S. 116 Pealva M. 146 Pea-Macarr C. o 112 Peuelas-Rivas G. 99 Peralbo E. 108, 160, 164 Prez A. 128, 130 Prez Blas M. 140 Prez Molina J. 128 Prez Rosado A. 111 Prez T. 147 Prez-Aciego P. 102, 110 Prez-Blas M. 109, 110 Prez-Castellano M.T. 91, 93 Prez-Chacn G. 102, 110 Prez-Lpez M.J. 122, 122 Prez-Martnez M. 154 Prez-Oliva A.B. 105 Pertega S. 121 Perucha E. 100, 162, 163 Piqu J.M. 146 Places L. 147 Planas R. 142 Planelles D. 119 Plaza J. 145 Plaza S. 144 Podzamczer D. 128, 129 Pons J. 92, 93 Portols P. 97, 165 Posada M. 116, 169 Pozo M. 152, 156 Pozo V. 116 Prat Arrojo 110 Prieto A. 99, 100, 101, 145, 154, 157, 158, 162, 163, 164 Prieto J. 114, 134, 135 Prieto P. 99, 100, 101, 145, 157, 158, 162, 163, 164
Puertas M.C. 142 Puertas-Castro M.C. 142 Puig N. 119 Pujalte F. 91, 93 Pujol R. 118, 152 Pujol-Borrell R. 141, 142 Pumarola T. 131 Q Qian C. 134, 135 Quereda C. 128, 148 Quintana N.E. 151 Quintanilla-Cecconi A.M. 105 R Raga S. 92 Ramrez N. 104, 133 Ramirez P. 99 Ramn de los Toyos J. 106 Ramos J.T. 128 Ramos M. 118 Ramos M.J. 148 Ramos V. 89 Rangel C. 93 Ranz I. 99, 100, 101, 162, 163, 164 Rao A. 101 Raso S. 132 Reales E. 103, 106 Regueiro J.R. 95, 113 Regueiro R. 163 Reith W. 107 Relloso M. 114 Renedo Chico B. 104, 112 Resino S. 128, 130, 131 Respaldiza N. 129, 133 Revilla G. 99, 100, 101, 145, 157, 158, 162, 163, 164 Revilla Y. 161 Rey M. 154 Reyes E. 154, 157, 158, 164 Ribera A. 118 Ribera E. 129 Richelme M. 96 Richelme S. 96 Rioja L. 160 Rius F. 144 Rivas P. 132 Rocha E. 114 Roche O. 91 Rodrigo L. 106, 117, 123 Rodrigo-Garzn M. 135 Rodrguez C. 151 Rodrguez Corts M. 110 Rodrguez de Juan C. 140 Rodrguez R. 119, 121, 146, 147 Rodrguez Ruiz T. 138, 139 Rodrguez Sainz C. 127, 128, 132, 167 Rodrguez T. 135, 139 Rodrguez-Barbosa J.I. 99 Rodrguez-Calvillo M. 114 Rodrguez-Fernndez J.L. 163 Rodrguez-Gallego C. 90, 167 Rodrguez-Mahou M. 149, 150 Rodrguez-Molina J.J. 150 Rodrguez-Muoz F. 170 Rodrguez-Prez J.M. 109 Rodrguez-Rodero S. 106, 123 Rognan D. 118
174
Rojo J.M. 97, 165 Rojo P. 89 Roldn E. 135, 145, 146, 153 Romn C. 123, 124, 125 Romera MA. 147 Romero J.M. 137 Romero Noguera J.M. 138, 139 Romero-Gmez M. 168 Romo Pasamar E.M 148 Rosado S. 110 Rosique-Romn J. 95 Rossi N. 95, 163 Roy G. 146 Rubio A. 166 Rubio G. 136, 138 Rubio L. 147 Rubio M. 113 Rubio R. 128, 130 Rueda B. 112 Ruiz A. 154, 157, 158, 164 Ruiz de Alegra Puig C. 124, 132, 167 Ruiz Tscar J.L. 149, 150, 167 Ruiz-Cabello F. 108, 135, 137, 138, 139 Rull S. 158 S Sabater L. 141 Sabina P. 166 Saboya M.A. 91 Sdaba M.C. 145 Sez B. 134, 140 Sez R. 127, 138, 140 Sainz-Rey L. 132 Salas G. 135 Salas M.L. 161 Sala-Valds M. 151 Salcedo I. 103 Salmern J. 98 Salvador G. 147 San Antonio E. 154 Sanal O. 95 Snchez A. 165 Snchez B. 89, 90, 93 Snchez Crespo M. 142 Snchez E. 168, 169, 170 Snchez Gordo F. 110 Snchez J. 105
Sanchez J.I. 89 Snchez L. 135, 146 Snchez M. 115 Snchez P. 121 Sanchez-Bueno F. 119, 122 Snchez-Ibarrola A. 104 Snchez-Madrid F. 96, 99 143, 153, 154, 155 Snchez-Prez M. 102, 107 Snchez-Pernaute O. 150 Snchez-Ramn S. 149, 150 Snchez-Romn J. 165, 170 Snchez-Rovira P. 134 Sanchez-Sols de Querol M. 94 Snchez-Velasco P. 109, 124, 167 Sancho D. 99, 143 Sancho J. 98 Sanjuan I. 102, 115 Sanmart R. 147 Sans M. 146 Santa Olalla C. 137 Santamara B. 149, 150 Santamara M. 95, 108, 114, 126, 130 Santana M. 97 Santiago J.L. 121 Sanz G.F. 119 Sanz M.A. 119 Sastre B. 113 Schadendorf D. 139 Schwartz O.M. 98 Segun Q. 107 Segundo C. 103 Segura A. 115 Sempere J.M. 115 Seoane C. 150 Seoane E. 130 Seoane Reula E. 112 Serra C. 147 Serrama M.J. 131 Serrano C. 105, 113 Serrano M.J. 134 Sesma L. 118 Setin Baranda F. 108 Silvera C. 109 Sirvent A. 134 Solana R. 108, 125, 126, 130, 160, 164 Sols P. 144 Soro P.G. 104 Soto C. 105
Soto R. 160 Soto-Garca M.A. 94 Sualdea V. 99, 100, 101, 145, 157, 162, 163, 164 Surez A. 146, 149 Surez B. 123 Surez E. 102 Surez Fernndez R. 149 Subir D. 105 Subiza J.L. 133 Sued O. 129 Ser L. 119 Syn M.S. 156 T Tallada M. 137 Tarazona R. 108, 160, 164 Teixeira J.F. 124, 126 Tejado P. 144 Tejedor R. 96 Thrasher A. 114 Tintor M. 157 Tirado I. 105, 161, 165 Tirapu I. 114, 135 Toms J.F. 105 Toribio M.L. 98 Toro A. 107, 119, 121, 122 Toro S. 150 Tormey V.J. 92 Torres B. 165, 168, 170 Torres P. 168 Torres P.S. 95, 163 Torrs P. 115 Trpaga J. 123 Trojanowska M.E. 97 Tudela J.I. 133 U Urcelay E. 116, 121 Ursa . 96 V Vacaro C. 141 Valds M. 125 Valeri Lozano A. 140 Valero M. 133 Valladares M. 102, 115 Valls M.E. 129 Varela J.M. 129, 133
Varela P. 94 Vargas J.A. 102, 110 Vargas-Alarcn G. 109 Vzquez-Bermdez M.F. 90 Vega Y. 165, 170 Velasco I. 148 Velasco J.L. 153 Verdaguer J. 142 Verd R. 136, 138 Vicario J.L. 119, 167, 169 Vicente-Manzanares M. 154, 155 Viciana P. 128 Vidal E. 126, 130 Vidal-Bugallo J.B. 95 Vidaller A. 92 Viedma F. 143 Vigil P. 116 Vila E. 119 Vila V. 161 Vilches C. 159 Villar L.M. 145, 153 Villar M.G. 170 Villarrubia N. 135, 153 Villasevil E.M. 95 Vias O. 146, 147 Visus MC. 134, 140 Vives J. 97, 111, 144 Vives M. 142 Vives-Pi M. 142 W Ward E.S. 141 Webster D. 92 Wichmann I. 90, 120, 122, 129, 133 Y Yage J. 144 Ynez-M M. 96, 153, 154, 155 Yubero N. 155 Z Zamora J. 109, 110 Zapata D.A. 95, 163 Zarapuz L. 169 Zrate C. 92 Zenteno E. 163, Zubeldia J.M. 113 Zubiaur M. 98 Ziga J. 109
175

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Volumen 22 Suplemento 1 Mayo 2003

XXIX CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAOLA DE INMUNOLOGA Cdiz Del 27 al 30 de mayo de 2003

Libro de Comunicaciones y Posters

Vol. 22, Supl. 1, Mayo 2003

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Sesin 01. Inmunodeficiencias

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Sesin 02. Linfocitos T: precursores, TCR y activacin

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Sesin 03. Linfocitos B y otras clulas del sistema inmune

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Sesin 04: MHC: estructura y funcin

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Sesin 5. Inmunoterapia y terapias emergentes

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Sesion 06. Aplicaciones del MHC e inmunologa del transplante

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Desconocida M Poliquistosis F Glomerulonefritis M Desconocida M

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Sesion 07: HIV y SIDA

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