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DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

1.- INTRODUCCIN

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DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

El grupo coliforme, llamado tambin grupo indicador de contaminacin,

est

formado por todas las bacterias aerobias o anaerobias facultativas, gram-negativo,

no formadoras de esporas y con forma de bastn que fermentan la lactosa,
produciendo gas y cido en 48 horas de incubacin a 35 C. Los coliformes
Fecales cuyas especies clsicas, son Escherichia Coli y Enterobacter aergenes ,
fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44 C ( 0,5 ) en 24 horas.
La prueba Estndar para el grupo coliforme puede realizarse mediante una
tcnica de fermentacin de tubos mltiples (a travs de las fases supuestas fase
confirmatorias o prueba completa ), o por la tcnica del filtro de membrana.
En el caso de la tcnica de fermentacin de tubos mltiples, los resultados del
estudio de los tubos y las diluciones replicados se comunican en trminos del
Nmero Mas Probable ( NMP ) de microorganismos existentes. Este nmero basado
en determinadas frmulas de probabilidad, es un clculo de la densidad media de
coliformes de la muestra.
2.- OBJETIVO
Determinar la presencia de Coliformes Totales y Fecales en aguas potables,
naturales, industriales y residuales,

mediante la tcnica del Nmero ms

Probable, usando tubos de fermentacin mltiple.

3.- DEFINICIONES
Esterilizacin: Es el proceso de destruccin de todo organismo vivo, generalmente
mediante el empleo de calor o de un producto qumico.
Nmero mas probable ( NMP): Cantidad de organismos por unidad de volumen
que, de acuerdo con la teora estadstica, produce el resultado analtico observado
con mayor probabilidad que cualquier otra cantidad o bien que produce el resultado

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analtico

observado con la mayor frecuencia. Se expresa como densidad de

organismos por 100 ml. Los resultados se calculan a partir del nmero de hallazgos
positivos de organismos del grupo Coliforme producidos por siembra, realizados con
diluciones decimales mltiples.
Agentes Biolgicos: Microorganismos, incluyendo los genticamente modificados,
cultivos celulares y parsitos humanos, de originar cualquier tipo de infeccin,
alergia o toxicidad.
Microorganismos: Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de reproducirse
o de transferir material gentico.
Cultivo celular: El resultado del crecimiento (in vitro) de clulas obtenidas de
organismos multicelulares.
Aguas Naturales y Residuales contaminadas: Provienen de fuentes superficiales
tales como: ros, arroyos, quebradas, lagunas residuales, plantas de tratamientos
etc.
4.- RESUMEN DEL ENSAYO:
Las muestras de aguas sembradas en Caldo Lauryl Triptose Lactosa Broth son
incubadas a 35 0,5C durante 24 o 48 horas para la realizacin de la prueba
Presuntiva. La siguiente etapa del ensayo corresponde a la prueba confirmativa
usando caldo verde Brillante Lactosa , este medio es selectivo para los miembros del
grupo coliforme y acta como inhibidor de la flora restante y coliformes Fecales en
medio E.C. Broth,

en este medio pueden aislarse haciendo un enriquecimiento

previo despus de la prueba confirmatoria , los coliformes fecales proveniente de

los intestinos de animales de sangre caliente que son los nicos capaces de
sobrevivir a la temperatura de 44 C.

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DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

El resultado se expresa en trminos de nmero ms probable de bacterias

coliformes (NMP en 100 ml de muestra).
5.- NORMAS DE SEGURIDAD:
5.1.- La reduccin de riesgos se realiza aplicando,

medidas seguras de

recoleccin de muestras con recipientes, plenamente identificados y todo el material

es esterilizado en autoclave antes y despus de ser utilizados.
5.2.- Se adoptan medidas de seguridad tanto colectivas como individuales, se les
provee al personal del laboratorio, batas, guantes, para evitar cualquier contacto con
las muestras, mascarillas de proteccin, se utiliza desinfectantes como cloro,
alcohol, antibacteriales para lavarse las manos.
5.3.- Se realizan los cultivos bajo llama en campana para evitar la propagacin
de agentes biolgicos,

estn identificadas el

rea de esterilizacin y de

microbiologa.

6.- MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

6.1 .-Insumos, Materiales y Equipos
6.1.1.-Autoclave con operacin a una temperatura de 121 0,5C
6.1.2.-Tubos de ensayo 16 X 150 mm con tapa de rosca
6.1.3.-Tubos de ensayos 20 X 150 mm con tapa de rosca
6.1.4.-Tubos de Durham para fermentacin.
6.1.5.-Asa de platino de dimetro no menor de 3 mm.
6.1.6.-Mechero a gas o de alcohol.
6.1.7.-Campana para sembrar cultivos.

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DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

6.1.8.-Incubadora bao de mara con regulador de temperatura para operar a 35

0,5C y 44 0,5C
6.1.9.-Gradillas para tubos de ensayos
6.1.10.-Agitadores de vidrio
6.1.11.-Tapabocas
6.1.12.-Micropipeta graduada desde 0,1 ml hasta 1 ml
6.1.13.-Puntillas azules universales
6.1.14.-Guantes de ltex
6.1.15.-Balanza analtica
6.1.16.-Pipetas graduadas de 1 ml, 10 ml
6.1.17.-Frascos con tapa de vidrio de 100 ml
6.1.18.-Refrigerador con operacin entre 2 0,5C a 4 0,5C
6.1.19.-Vasos de precipitado de 1000 ml

6.2 . Reactivos
6.2.1.-Solucin Madre Tampn A: Pese 34 g de Fosfato Monopotsico y disuelva
en 500 ml de agua destilada y ajuste el pH 7,2 +/-0,2 con NaOH 1 N; afore en un
baln de 1000 ml, distribuya en frascos con tapa de 250 ml y esterilice en autoclave
a 121 C por 40 min. La solucin es estable refrigerada por meses, deseche si
presenta turbiedad.
6.2.2.-Solucin Madre Tampn B: Pese 8,10 g de cloruro de magnesio
hexahidratado y disuelva en 500 ml de agua destilada, luego afore en un baln de
1000 ml con agua destilada, distribuya en frascos de vidrio con tapa de 250 ml,
esterilice a 121 C en autoclave durante 40 min. Refrigere, esta solucin es estable
por meses, deseche si observa turbiedad.

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6.2.3.-Solucin Amortiguadora de Fosfatos: Adicione 1,25 ml de la solucin

madre tampn A y 5 ml de la solucin madre tampn B, afore en un baln de 1000
ml con agua destilada, distribuya en volmenes de 9 ml en tubos de ensayo y
esterilice a 121 C.
6.2.4.-Caldo Lactosado: Prepare el medio de fermentacin (concentracin simple)
disolviendo 13 g de Caldo Lactosado en un litro de agua destilada.
Prepare el medio de fermentacin (concentracin doble) disolviendo 26 g de caldo
Lactosado en un litro de agua destilada. Antes de esterilizarlo, colquese en tubos
de fermentacin con un vial invertido una cantidad suficiente de medio para que
cubra este, al menos parcialmente, 10 ml es suficiente. Tambin es posible
prescindir del vial invertido y aadir 0,01 g/l de prpura de bromocresol al medio
presuntivo para determinar la produccin cido,

lo que indicara un resultado

positivo en esta parte de la prueba. Cirrense los tubos con tapones de metal o
plstico resistentes al calor, hgase el medio ( Lactosa Lauryl Triptosa ) con
fuerza suficiente como para aadir 100 ml 10 ml de muestra, la concentracin de
los ingredientes no sea menor que la del medio estndar, preprese conforme a las
directrices de la Tabla 9221:I y 9221: II del Stndard Mtodo.
6.2.5.-Caldo Bilis Verde Brillante: Prepare el medio de fermentacin disolviendo 40
g de caldo lactosado Brillant en un litro de agua destilada. Adicione 10 ml de caldo y
un tubo Durham invertido a cada uno de los tubos de ensayo identificados, tape y
esterilice en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
6.2.6.-Medio EC: Prepare el medio de cultivo disolviendo 37 g de caldo EC en 1000
ml de agua destilada. Coloque 10 ml de caldo y un tubo Durham invertido en cada
uno de los tubos identificados tape y esterilice en autoclave a 121C durante 15
minutos.

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6.2.7.-Indicador Bromocresol Prpura: prepare 0,01 g/l, disuelva primero en 10

ml de NaOH 0,1 N y luego agregue al caldo lactosado.
7.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
7.1.-Muestreo
Las muestras para el anlisis bacteriolgico, se deben tomar en frascos bien
lavados y esterilizados, en su interior aadir, previo a la esterilizacin, 0,1 ml de
Na2SO4 ( Tiosulfato de Sodio ) al 10 % por cada 120 ml de muestra con el propsito
de neutralizar la accin del cloro que pudiera contener la muestra, cubriendo
adems el tapn del frasco hasta el cuello con papel Aluminio.
El anlisis bacteriolgico de la muestra debe practicarse inmediatamente
despus de su recoleccin, de no ser as debe refrigerarse a 4 C , si hay que
transportarla que no exceda el lapso de 6 horas para ser analizada. En caso extremo
solo si se trata de agua potable se podr analizar en un lapso de 24 horas.
7.2.-Prueba presuntiva para Aguas potables
7.2.1.- Coloque una serie de cinco tubos de fermentacin de 20 ml, previamente
esterilizados,

con 10 ml de caldo lactosado (concentracin doble), con 1 tubo

Durham invertido, prescinda

de los viales invertidos aadiendo 0,01 g/l de

bromocresol prpura al medio presuntivo para determinar la produccin de cido,

con cambio de color de morado a amarillo claro,

lo que indicara un resultado

positivo de coliformes totales.

7.2.2.- Coloque 2 series de cinco tubos de fermentacin de 20 ml, previamente
esterilizados, cada uno con 10 ml de caldo lactosado (concentracin simple) con un
tubo Durham invertido, agregando indicador bromocresol prpura.

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7.2.3.- Agite la muestra vigorosamente 25 veces o ms y luego Inocule la primera

serie de 5 tubos de concentracin doble con 10 ml de muestra, la segunda serie de
concentracin simple con 1 ml de muestra y la tercera serie (concentracin simple)
con 0,1 ml de muestra. Incube durante 24 horas a la temperatura de 35 0,5 C;
examine cada tubo al cabo de este tiempo y si no se ha producido gas examnelos
nuevamente al cabo de 48 horas.
7.2.4.- La formacin de alguna cantidad de gas o reaccin cida (turbiedad) o
cambio de color por fermentacin de morado a amarillo claro en cualquier tubo de
las series dentro de las 24- 48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva.
7.2.5.-La ausencia de gas y de turbiedad ni cambio de color, por reaccin cida
en los tubos al cabo de 48 horas de incubacin constituye una prueba presuntiva
negativa.
7.3.-Aguas Naturales y Residuales contaminadas
7.3.1.- Para este tipo de muestra se inoculan una serie de tubos con adecuadas
diluciones decimales de la misma, teniendo en cuenta la densidad bacteriana mas
probable,

en cada uno de los tubos de ensayos se agrega 9 ml de la solucin

amortiguadora de fosfatos tome tres o mas, de acuerdo a la cantidad de diluciones,

que vaya a efectuar y haga diluciones inoculando 1 ml de muestra al primer tubo de
ensayo, al dcimo (0,10) tomando 1 ml del tubo de ensayo anteriormente inoculado,
centsimo (0,01) tomando 1 ml del segundo tubo de ensayo inoculado, milsimo
(0,001), tomando 1 ml del tubo anterior y as sucesivamente, hasta lograr una serie
de tubos donde se obtengan resultados negativos de coliformes totales.
7.3.2.- Coloque tres series de 3 tubos y Inocule cada serie de tubos con 1 ml de
las tres ltimas diluciones que se le realizaron a la muestra original
7.3.4.- Ver procedimiento de aguas potables puntos 7.2.4 y 7.2.5

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7.3.5.- El clculo del NMP se realiza multiplicando el valor obtenido en la tabla por el
valor de la penltima dilucin.

7.4.- Prueba confirmativa de coliformes totales para Aguas Potables, Naturales,

Industriales y Residuales
7.4.1.- Encienda el mechero de gas o alcohol para mantener una atmsfera estril y
esterilice el asa de platino hasta el rojo y deje enfriar. Mezcle el tubo de fermentacin
positivo con un movimiento rotatorio.
7.4.2.-Tome los tubos por su base, tanto el de fermentacin positivo como el de bilis
verde brillante que va a ser inoculado, sostngalos con la mano izquierda y destape
ambos con la derecha. Flamee la boca de los tubos y rpidamente introduzca el asa
en el tubo de fermentacin positivo, ahora psese el asa al tubo de bilis verde
brillante que va a ser inoculado, realice esta operacin dos veces.
7.4.3.-Flamee de nuevo la boca de los tubos y tpelos. Esterilice el asa e Incube los
tubos inoculados del caldo lactosado bilis verde brillante a 35 ( 0,5) C por 48
horas.
7.4.4.-La presencia de turbiedad y de gas en el tubo Durham invertido del tubo de
fermentacin dentro de las 48 horas de incubacin constituye una prueba
confirmativa positiva.
7.5.-Prueba de Coliforme Fecal (medio EC)
7.5.1.- Coloque los tubos esterilizados en bao de agua a 44,5 0,5 C durante
media hora antes de usarse. Inocule el contenido de los tubos positivos en la prueba

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presuntiva, que hayan mostrado alguna cantidad de gas o un fuerte crecimiento

durante las 48 horas de incubacin en la prueba confirmativa.
Se puede realizar simultaneamente, la inoculacin de los tubos positivos en medio
de verde brillante, para la prueba confirmativa y el medio EC

para coliformes

Fecales, para acortar el tiempo de obtencin de los resultados. De los tubos de

lactosa positivos, inocule tubos con medio EC utilizando asa de alambre de 3 mm de
dimetro, realizando, el mismo procedimiento de la prueba confirmativa desde 7.4.1
hasta 7.4.3 Incube en bao de agua incubadora, a 44,5 0,5 C durante 24 horas.
7.5.2.- La presencia de turbiedad y de gas en el tubo Durham invertido del tubo de
fermentacin dentro de las 24 horas de incubacin se considera una reaccin
positiva que indica la presencia de organismos coliformes de origen fecal.
8.- CLCULOS
Clculos y registros del NMP (nmero ms probable) la tabla 1 nos muestra las
diferentes combinaciones para 5 tubos positivos y la tabla 2 para 3 tubos positivos
usando las siguientes diluciones: (10 ml, 1 ml, 0.1 ml) y (0,1 ml, 0.01 ml, 0.001 ml)
Ejemplos: Observe los siguientes ejemplos que le servirn de orientacin y busque
los resultados en la tabla N 1 y 2

de Anexos,

de acuerdo a la combinacin de

tubos que us.

Ejemplo

10 ml

1 ml

0.1 ml

Combinacin de

Indice de

0/5

0/5

1/5

tubos positivos
0- 0-1

NMP/100 ml
2

Ejemplo

1 ml

0.1 ml

0.01ml

0.001 ml

Combinacin de

Indice de

5/5

5/5

2/5

0/5

tubos positivos
5-2-0

NMP/100 ml
50 x 100

5/5

4/5

2/5

0/5

5-4-2

220 x10

0/5

1/5

0/5

0/5

0-1-0

2 x 10

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Ejemplo

1 ml

0.1 ml

0.01ml

0.001

Combinacin de

Indice de

5/5

3/5

1/5

ml
1/5

tubos positivos
5-3-2

NMP/100 ml
140 x 10

5/5

3/5

2/5

0/5

5-3-2

140 x 10

Ejemplo
Para 3 Tubos

0.1 ml
3/3

0.01 ml
1/3

0.001 ml

Combinacin de
tubos
3-1-1

1/3

Indice de
NMP/100 ml
75 x100

9.- PRECISIN
A menos que se analicen una gran cantidad de muestra la precisin en los tubos
de fermentacin es lamentablemente baja.

Por ejemplo aun cuando la muestra

contenga 1 organismo coliforme/ml al menos 37% de 1 ml de muestra se espera que

den resultados negativos
10.- EXPRESIN DE RESULTADOS
En la tabla N 1 y N 2 se muestran las combinaciones de tubos positivos
mas probables. Si aparecen combinaciones poco probables con una frecuencia
superior al 1 por 100, hay que pensar que la tcnica es inadecuada o que no se
ha cumplido por completo el supuesto estadstico en que se basa el clculo del
NMP . El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras
combinaciones de tubos o diluciones puede calcularse mediante la sencilla
frmula de Thomas.
5 tubos de dilucin
N tubos positivos x 100
NMP/100 mL =
( mL de muestra en todos tubos negativos) x (mL de muestra en todos tubos positivos)

11.- ANEXOS

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Tabla 1.- (Tabla 9221; V) -Estndar Mtodo edicin 17, donde se ve el ndice de
NMP y lmites de aceptacin 95 % para distintas combinaciones de resultados
positivos cuando se usan diluciones de 5 tubos: (10 ml-1 ml-0,1 ml)
Combinacin
de Tubos
Positivos
0-0-0
0-0-1
0-1-0
0-2-0

NMP/
100 ml

95% de Confianza
Inferior
Superior

Combinacin
de Tubos
Positivos

NMP/
100 ml

95% de Confianza
Inferior
Superior

<2
2
2
4

1,0
1,0
1,0

10
10
13

4-2-1
4-3-0
4-3-1
4-4-0

26
27
33
34

12
12
15
16

65
67
77
80

1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0

2
4
4
6
6

1,0
1,0
1,0
2,0
2,0

11
15
15
18
18

5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-1-0
5-1-1
5-1-2

23
30
40
30
50
60

9,0
10
20
10
20
30

86
110
140
120
150
180

2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-3-0

4
7
7
9
9
12

1,0
2,0
2,0
3,0
3,0
5,0

17
20
21
24
25
29

5-2-0
5-2-1
5-2-2
5-3-0
5-3-1
5-3-2

50
70
90
80
110
140

20
30
40
30
40
60

170
210
250
250
300
360

3-0-0
3-0-1
3-1-0
3-1-1
3-2-0
3-2-1

8
11
11
14
14
17

3,0
4,0
4,0
6,0
6,0
7,0

24
29
29
35
35
40

5-3-3
5-4-0
5-4-1
5-4-2
5-4-3
5-4-4

170
130
170
220
280
350

80
50
70
100
120
160

410
390
480
580
690
820

4-0-0
4-0-1
4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-2-0

13
17
17
21
26
22

5,0
7,0
7,0
9,0
12
9,0

38
45
46
55
63
56

5-5-0
5-5-1
5-5-2
5-5-3
5-5-4
5-5-5

240
300
500
900
1600
1600

100
100
200
300
600

940
1300
2000
2900
5300

Tabla 2.- NMP y lmites de confianza 95 % para varias combinaciones de resultados

positivos cuando se usan diluciones de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml. Para 3 Tubos de dilucin
Combinacin de tubos
Positivos

NMP/ 100 ml

95% de Confianza
Inferior
Superior

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CDIGO

01

LICPIS-03

MMmmff
ffLIIPFQ
02:

DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

0-0-0
0-0-1
0-1-0
1-0-0
1-0-1
1-1-0
1-1-1
1-2-0
2-0-0
2-0-1
2-1-0
2-1-1
2-2-0
2-2-1
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3

<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
2400

<0,5
<0,5
<0,5
1
1
3
3
1
3
3
7
4
10
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150

9
13
20
21
23
36
36
36
37
44
89
47
150
120
130
380
210
230
380
380
440
470
1300
2400
4800

Tomada de APHA 1996

Nota: Esta tabla se puede utilizar para diluciones 0,1 -0.01-0,001, el resultado del
NMP de la tabla se multiplica por la penltima dilucin

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MMmmff
ffLIIPFQ
02:

DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

Fig.1.-

Fig.2.-

Fig. 1 y 2.- Preparacin de los tubos de fermentacin para realizar inoculacin en la determinacin de
prueba presuntiva de coliformes totales en muestras de agua potable

Fig.- 3

Fig. 4.-

Fig. 5.-.

Fig. 6.-

Fig. 3., 4, 5, y 6 .- Tcnica de preparacin de diluciones e inoculacin de los tubos de fermentacin

para realizar determinacin de la prueba presuntiva de coliformes totales en muestras de agua
residual.

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10 - 09 01

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MMmmff
ffLIIPFQ
02:

DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

Fig. 7.- Despus de la inoculacin en tubos de fermentacin estos son llevados a incubar en bao de mara por
48 horas para la prueba presuntiva de coliformes totales

Fig. 8..-Preparacin de incubacin de tubos de fermentacin que resultaron positivos en la fase presuntiva a la
fase confirmativa de coliformes totales.

12. - REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

APHA, AWWA WPCF. (1995). Standard Methods for the Examination of

Water and Wastewater. 19th Edition. SM 9921 B Standard Total Coliform
Fermentation Technique

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MMmmff
ffLIIPFQ
02:

DETERMINACIN DE COLIFORMES EN AGUAS

Norma Venezolana

COVENIN N 3558: 2000 Riesgos Biolgicos.

Medidas de Higiene ocupacional

Norma Venezolana COVENIN 3047-93- Agua Potable. Mtodo de

Determinacin del Nmero mas probable de Bacterias Coliformes.

Norma Venezolana COVENIN 2634:2002- Aguas naturales, industriales y

residuales. Definiciones.

Realizado por: Prof: Ing. Antonio Seijas- Universidad Catlica Andrs Bello
Guayana

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