UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

FACULTAD DE MICROBIOLOGA
Clulas madre hematopoyticas: funcin,
regulacin y aplicaciones clnicas actuales
Proyecto de Graduacin presentado a la Facultad de Microbiologa como
requisito parcial para optar por el ttulo de Licenciatura en Microbiologa y
Qumica Clnica y grado profesional de Doctorado en Microbiologa y
Qumica Clnica
Mnica Zamora Cruz
CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FACIO
Julio, 2002
Infonne Final de Prctica Dirigida de Graduacin presentado a la
Facultad de Microbiologa de la Universidad de Costa Rica, como requisito
parcial para optar por el ntulo de Licenciada en Microbiologa y
Qumica Clnica y gmdo profesional de Doctotcr en MicroMologz y
Qumica Clnica.
El Tribunal Examinador estuvo integrado por los siguientes miembros:
ves Mora v
Presidente
/
Dr. Wdter ~odrgudz Romero /,
'Dra. Alexandra cavado Romero
DEDICATORIA
A Dios, por permitirme alcanzar esta meta y por todo lo que me ha regalado.
A mi esposa, Alfredo, por su amor y apoyo incondicional.
A mis hijos, Sebastin y Andrs, por ser la luz que me ilumina cada da.
A todos mis familiares y amigos por haberme ayudado durante todo este tiempo.
NDICE GENERAL
...
DEDICATORIA ............................................................................................................................................... 111
NDICE GENERAL ........................................................................................................................................ iv
..
RESUMEN ...................................................................................................................................................... vil
OBJETIVOS ...................................................................................................................................................... 1
.................................................................................................................. PERSPECTIVA HIST~RICA 7
............................................. DEFINICI~N Y CINTICA DE LAS CLUMS MADRE HEMATOPOYTICAS 8
.................................................................................... FACTORES ESPEC~FICOS DE ACCI ~N TARDA
15
........................................................................ FACTORES INESPECFICOS DE ACCI ~N INTERMEDIA 16
...................................... FACTORES QUE INICIAN EL CICLO CELULAR EN PROGENITORES LATENTES 17
......................................................................... APLICACIONES CLNICAS DE LAS HEMOPOYETINAS
18
............................................................................................................................ ERITROPOYETINA 19
. .
................................................................................................................................ Producclon 19
. .
................................................................................................ Lugar y mecanismo de acclon 2 0
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas ...................................................................................... 20
........................................................................................ FACTORES ESTIMULANTES DE COLONIAS 21
. .
............................................................................................................................... Producc~on 2 1
. .
.................................................................................................. Lugar y mecanismo de acclon
22
..................................................................................... Efectos in vivo y aplicaciones clnicas 2 3
.................................................................................................................................................. M-CSF 23
.................................................................................................................................................. G-CSF 23
GM-CSF ............................................................................................................................................... 24
....................................................................................................................................................... IL-3 25
INTERLEUQUINA 1 ........................................................................................................................... 25
. .
Produccron ................................................................................................................................ 25
. .
Lugar y mecanismo de accron ................................................................................................... 26
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas ..................................................................................... 2 7
INTERLEUQUINA 4 ........................................................................................................................... 28
. .
Produccron ................................................................................................................................ 28
. .
Lugar y mecanismo de acclon ................................................................................................... 28
INTERLEUQUINA 5 ........................................................................................................................... 29
INTERLEUQUINA 6 ........................................................................................................................... 29
. .
Produccron ............................................................................................................................. - 29
. .
Lugar y mecanismo de accron .............................................................................................. 30
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas ................................................................................... 30
INTERLEUQUINA 1 1 ......................................................................................................................... 30
KIT-LIGAND O STEM CELL FACTOR ................................................................................................ 31
. .
Produccron ................................................................................................................................ 31
. .
................................................................................................... Lugar y mecanismo de accron 31
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas ................................................................................ 32
FACTORES INHIBIDORES .................................................................................................................. 34
Lactoferrina ............................................................................................................................... 34
Pptido hemoregulador ............................................................................................................. 34
Prostaglandina E ....................................................................................................................... 34
.................................................................. Factor de crecimiento y transformacin p (TGF f l 34
...................................................................... Protena inflamatoria macrofgica 1 a (MIPlcr) 35
................................................................................................................... Interfern y (IFN yl 35
.................................................................................... Factor de necrosis tumoral a (7WF cr) 35
4 . UTILIDAD CLNICA DE LAS CLULAS MADRE: TRANSPLANTE DE CLIJLAS MADRE .. 37
....................................................................... FUENTES DE CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS 3 7
MOVILIZACI~N DE CLULAS MADRE ............................................................................................. 3 9
. .
El fenmeno de movilizacron ..................................................................................................... 40
. .
Protocolos de movilizacron ....................................................................................................... 42
.............................................................................................................. Quimioterapia mielosupresiva 42
....................................... Quimioterapia mielosupresiva + Factores de Crecimiento Hematopoytticos 42
........................................................................................................................ Factores de crecimiento 43
................................................................................................ &COLECCI~N DE CLULAS MADRE 45
. .
Preparacron del donador .......................................................................................................... 45
. .
Recoleccron ............................................................................................................................... 46
. .
.............................................................................. Complicaciones asociadas a la recoleccron 47
Estandarizacin de la medicin de clulas progenitoras ......................................................... 48
PROCESAMIENTO DE LAS CLULAS .................................................................................................. 49
Procesamiento de rutina ........................................................................................................... 49
........................................................................................................... Procesamiento extensivo 49
..................................................................................... CRIOPRESERVACI~N Y ALMACENAMIENTO 50
.......................................................................... Mtodo de DMSO y congelacin programada 50
..................................................... Mtodo de DMSO. hidroxietil y congelacin no controlada 51
................................................................................................... DESCONGELACI~N Y REINFUSIN 51
............................................... UTILIZACIN DEL TRANSPLANTE DE CLULAS MADRE SANGUINEAS 53
........................................................................................................ Experiencia en Costa Rica 55
7 . REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ...................................................................................................... 57
RESUMEN
Zamora Cruz, Mnica.
Clula Madre Hematopoyticas: funcin, regulacin y aplicaciones clnicas actuales.
Proyecto de Graduacin de Microbiologa y Qumica Clnica. San Jos, CR. :
M. Zamora. C. ,2002.
59 h. : 2 il.-21 refs.
Se pretende hacer una investigacin bibliogrfica acerca del papel de las clulas madre en el
mantenimiento del tejido hematopoytico y la importancia de los factores de crecimiento y otras citoquinas en
la regulacin de la proliferacin y maduracin de los progenitores hematopoyticos. Este tema tiene una gran
relevancia, ya que las clulas madre hematopoyticas actualmente tienen un gran potencial como terapia para
diversas enfermedades hematolgicas, ya sea malignas o no.
Para ello se realiz una bsqueda de literatura cientfica relacionada, con el tema en bases de datos
bibliogrficas especializadas y posteriormente se procedi al anlisis de la informacin y elaboracin de un
trabajo escrito. Adems, con el fin de investigar sobre la experiencia en nuestro pas en cuanto a los
transplantes de clulas madre, se entrevist a profesionales de los centros hospitalarios donde actualmente se
utiliza esta terapia.
Esta investigacin confirm la relevancia de los factores estimulantes en la regulacin de la
hematopoyesis y su aplicacin como terapia en la correccin de citopenias congnitas y adquiridas y en la
movilizacin de clulas madre a sangre perifrica. Con esta revisin se destaca la importancia del transplante
de clulas progenitoras hematopoyticas como nica terapia con potencial curativo para pacientes con
leucemia aguda y crnica, mieloma mltiple, linfoma no Hodgkin y sndromes mielodisplsicos. Adems,
hay que destacar que en nuestro pas se est realizando este tipo de transplante desde 1998.
Palabras clave: hematopoyesis, clulas madre hematopoyticas, factores de crecimiento hematopoyticos,
transplante de clulas madre
Director: Dr. Walter Rodrguez Romero
Facultad de Microbiologa, Universidad de Costa Rica
OBJETIVOS
General
Hacer una revisin sobre la funcin, regulacin y aplicaciones clnicas de las clulas
madre hematopoyticas.
Especficos
Definir el origen y las caractersticas de las clulas madre y su funcin en el sistema
hematopoytico.
Describir la regulacin de la proliferacin y la diferenciacin de las clulas madre
hematopoyticas.
Caracterizar los diferentes grupos de citoquinas que actan en la regulacin de la
hematopoyesis, as como la forma en que se producen y su utilizacin en la actualidad.
Describir la obtencin y las aplicaciones de las clulas madre para el tratamiento de
diferentes enfermedades hematolgicas.
l. EL SISTEMA HEMATOPOYTICO
El tejido hematopoytico es probablemente el ejemplo de tejido de estructura
jerrquica ms estudiado y mejor comprendido. La produccin de clulas maduras
especializadas se mantiene durante toda la vida, con el fin de reemplazar las clulas que se
estn eliminando continuamente. La sntesis celular es del orden de 4 x 10" clulas por da
en un adulto normal. Esta cantidad aumenta en caso de requerimientos patolgicos, como la
destruccin celular aumentada (anemias hemolticas), o por necesidad funcional de clulas
blancas en las infecciones o de eritrocitos, en casos de hipoxia. El aumento en la
produccin celular se realiza de forma rpida y adecuada, y puede mantenerse durante
perodos prolongados de tiempo e incluso, como en el caso de las anemias hemolticas
crnicas, durante toda la vida. (Testa, 1992)
La hematopoyesis aparece primero en el saco vitelino. Conforme el embrin se
desarrolla, el bazo y luego el hgado fetal se convierten en el principal sitio de la
hematopoyesis, desde donde las clulas migran hacia los huesos en desarrollo, los cuales
van a ser el sitio principal de hematopoyesis durante la vida adulta, en el tejido denominado
mdula sea. (Dexter, 1993)
En la mdula sea, se pueden reconocer clulas sanguneas en diferentes estados de
desarrollo, as como clulas ms primitivas que actan como precursores de las diferentes
lneas de clulas maduras. Se sabe que todas estas clulas precursoras se derivan de una
clula comn, la clula madre pluripotencial. (Dexter, 1993)
Las clulas madre hematopoyticas totipotenciales (pluripotentes, stem cell o tronco
comn) comprenden entre el 0,01 y el 0,05% del total de la poblacin de la mdula sea, y
tienen dos caractersticas que las distinguen de las dems clulas heinatopoyticas. La
primera es la capacidad de proliferar para producir nuevas clulas madre y la segunda es la
capacidad de diferenciarse en al menos nueve tipos de clulas maduras altamente
especializadas: eosinfilos, neutrfilos, basfilos, monocitos/macrfagos, plaquetas,
eritrocitos, osteoclastos, linfocitos B y T y fibroblastos. En este proceso, las clulas madre
pluripotenciales producen otras clulas madre llamadas comprometidas u orientadas, las
cuales son capaces de proliferar, diferenciarse y madurar nicamente hacia una lnea celular
en particular (Figura 1).
CFU-GM
Granulocitos
Clula Madre
Pluripotente
CFU-MEE
- .
CFU-E
Plaquetas
1 \
Eritrocitos
CFU-Bas
Progenitor 11-3, EM-CSF
Linfoide
Basfilos
Figura l . Esquema de la hematopoyesis (Tomado de Socolovsky, 1998)
As, la clula madre totipotencial, puede replicarse y permanecer como tal, o bien,
diferenciarse en clulas madre mieloides o linfoides, las cuales pueden proliferar y madurar
hasta dar origen a todas las clulas sanguneas circulantes; adems, son las responsables de
regenerar la hematopoyesis luego de un transplante de mdula sea o de un dao severo en
el sistema por radiacin o tratamiento con agentes quimioterapeticos. Si las clulas madre
estuvieran ausentes, la pancitopenia resultante podra llevar a la muerte. Cuando estn
presentes pero defectuosas, el desarrollo anormal de las diferentes lneas celulares puede
llevar al inicio de enfermedades malignas hematolgicas. (Dexter, 1993)
El proceso de proliferacin y diferenciacin de clulas madre, as como el
crecimiento y desarrollo de clulas hematopoyticas maduras, puede ser modulado al
menos en parte por citoquinas, como por ejemplo los factores de crecimiento. Sin
embargo, las citoquinas no son el nico componente regulador de la hematopoyesis: las
molculas de adhesin tambin juegan un papel importante en las interacciones entre
clulas estromales y hematopoyticas y presumiblemente son un prerrequisito para habilitar
a las clulas hematopoyticas para residir en regiones especficas de la mdula sea y luego
responder a los diferentes estmulos que les llegan. (Dexter, 1993)
Los factores de crecimiento producidos por clulas no hematolgicas (como las del
estroma) o hematolgicas (principalmente linfocitos T y macrfagos) juegan un papel
crucial en la regulacin de la produccin celular y maduracin. Estos factores actan
directamente sobre clulas hematopoyticas blanco despus de unirse a receptores
especficos. Sin embargo, sus acciones indirectas, estimulando cascadas de otros factores
estimuladores o molculas inhibitorias tambin son de suma importancia. (Testa, 1993)
La mdula sea es un tejido altamente estructurado, con diferentes dominios
ambientales en los que se encuentran, en diferentes proporciones, las distintas
subpoblaciones de clulas hematopoyticas primitivas. En esos dominios, las clulas estn
expuestas a influencias reguladoras que van a promover el desarrollo hacia lneas celulares
especficas. As, la hematopoyesis ocurre en asociacin con clulas del estroma, las cuales
producen una serie de citoquinas reguladoras que luego van a actuar directa o
indirectamente en la proliferacin, diferenciacin y maduracin de las clulas
hematopoyticas (Figura 2). Por ejemplo, la interleuquina 1 (IL-1) , la interleuquina 6
(IL-6) y el Factor de Clulas Madre (SCF, Stem Cell Factor) pueden ser detectados en
clulas estromales mantenidas in vitro. Adems, algunos factores estimulantes de colonias
tambin pueden ser producidos por las clulas del estroma, ya sea constitutivamente o en
respuesta a algn tipo de estmulo. El mantenimiento de la proliferacin, diferenciacin y
desarrollo de clulas maduras a partir de las clulas madre requiere del contacto fsico entre
las clulas estromales y las hematopoyticas; si este contacto no se da, la hematopoyesis
declina rpidamente. En diversos estudios se ha observado que molculas de la matriz
extracelular pueden secuestrar factores de crecimiento, y uno de los componentes ms
importantes en este proceso es el heparn sulfato, el cual, aislado de clulas estromales
tiene la capacidad de unirse a IL-3 y GM-CSF y presentarlas a clulas hematopoyticas en
una forma biolgicamente activa. (Dexter, 1993)
Las clulas estromales de la mdula sea son heterogneas, y comprenden:
fibroblastos, clulas reticulares, adipocitos, clulas endoteliales y macrfagos; por esto es
que existe la posibilidad de que estas diferentes poblaciones produzcan o secuestren tipos
especficos de factores de crecimiento. (Dexter, 1993)
En un estudio realizado por Dexter et al se demostr que el factor estimulante de
coloiiias granulomonocticas (GM-CSF) y el factor estimulante de colonias granulocticas
(G-CSF) no estn distribuidos uniformemente en clulas estromales de cultivos de mdula
sea, sino que estn localizados en poblaciones de clulas estromales especficas . Se ha
propuesto la hiptesis de que en la mdula sea, existen ambientes anatmicamente
definidos donde ciertos factores de crecimiento se localizan y ejercen sus efectos sobre las
clulas hematopoyticas totipotenciales, dando origen a lneas celulares especficas. En un
estudio realizado en mdula sea murina se observ que hay clulas multipotenciales que
muestran diversos grados de diferenciacin hacia distintas lneas celulares y se encuentran
en una elevada concentracin en reas bien definidas del tejido. (Dexter, 1993)
Clula hematopoytica
Molculas de la matriz extracelular
Iculas de adhesin
Clula estromal
Factores de crecimiento
Un sistema regulador con mltiples componentes:
1. Clulas estromales heterogneas
2. Factores de crecimiento
3. Molculas de adhesin
4. Molculas de la matriz extracelular
Figura 2. Diagrama esquemtico que muestra la interaccin entre una clula estromal, la
clula blanco y un factor de crecimiento. (Tomado de Dexter, 1993)
Perspectiva histrica
El trmino clulas madre fue utilizado por primera vez en la literatura cientfica en
los aos sesenta. Luego de esto, ha apiecido espordicamente entre los aos setenta y
ochenta, y no fue hasta mediados de los ochenta que llam la atencin de muchos
cientficos, cuando aparecieron las primeras publicaciones acerca del potencial clnico de
las clulas madre sanguneas para restaurar la hematopoyesis en pacientes aplsicos, como
consecuencia de quimioterapia o radioterapia. Sin embargo, la discusin acerca del
significado fisiopatolgico de las clulas madre circulantes empez desde muchos aos
antes. (Fliedner, 1998)
Alexander Maximov, mientras trabajaba en San Petesburgo en 1909, fue el primero
en sugerir que exista una clula madre hematopoytica con la apariencia morfolgica de un
linfocito y que era capaz de migrar a travs de la sangre hasta nichos microecolgicos que
le permitan proliferar y diferenciarse en linajes especficos. En la actualidad, sabemos que
Maximov estaba en lo correcto al sugerir el origen de la hematopoyesis en una clula capaz
de migrar de un sitio de hematopoyesis a otro a travs de la circulacin sangunea y
quedarse en sitios tisulares en los cuales el microambiente conduce a la diferenciacin y
proliferacin de clulas madre hematopoyticas. (Fliedner, 1998)
En los textos hematlogicos de los aos cincuenta se asuma que en la sangre
circulante de individuos saludables no estaban presentes clulas inmaduras. La
hematopoyesis extramedular era considerada como un retorno de ciertos tejidos hacia un
estado embrionario, por lo tanto, patolgico. (Fliedner, 1998)
Aos ms tarde, Fliedner y colaboradores determinaron que normalmente haba
clulas sintetizando ADN en sangre perifrica (Fliedner, 1998). En los aos sesenta Joan
Goodman y George Hodgson publicaron un artculo llamado "Evidencia de Clulas madre
en Sangre Perifrica de Ratones". Este documento, junto con otros del grupo del
laboratorio Brookhaven, dio pie al desarrollo de estudios sobre la fisiologa y fisiopatologa
de las clulas madre sanguneas como un sistema integral de la homeostasis de la
formacin de clulas sanguneas. (Fliedner, 1998)
As, en el libro "Clulas Hematopoyticas" de Metcalf y Moore, en 1970, revisan
toda la informacin que haba hasta el momento con respecto a ese tema. Se reconoci el
hecho de que las clulas madre son de importancia primaria para el desarrollo embrionario
de la hematopoyesis en la mdula sea y en la linfopoyesis en los rganos apropiados y que
juegan adems, un papel fundamental en el mantenimiento de la hematopoyesis en el adulto
en el cual est distribuida a lo largo de todos los huesos. Con su libro, Metcalf y Moore
abrieron la puerta para la investigacin experimental y clnica del papel fisiolgico de las
clulas madre sanguneas y su fisiopatologia. (Fliedner, 1998)
Definicin y cintica de las clulas madre hematopoyticas
El recambio celular del sistema hematopoytico en un hombre de 70 kg de peso se
estima que es cercano a 1 trilln de clulas por da, incluyendo 200 billones de eritrocitos y
70 billones de neutrfilos. Este enorme proceso de renovacin celular est soportado por
una poblacin muy pequefa de clulas de la mdula sea llamadas clulas madre. (Ogawa,
1993)
Las clulas madre y progenitoras, no pueden reconocerse por medios morfolgicos
convencionales. Su existencia se ha demostrado gracias a las tcnicas de cultivo in vitro, las
cuales han permitido comprobar que ciertas clulas, al ser plantadas sobre una matriz
semislida y en presencia de estimulantes determinados, son capaces de proliferar y dar
lugar a la formacin de una colonia. A estas clulas se les ha denominado Unidad
Formadora de Colonias (CFU, Colony Forming Unity), o Clula Formadora de Colonias
(CFC, Colony Forming Cell), ya que est demostrado que las colonias son clonales, es
decir, cada colonia deriva de una nica clula. Estas clulas se identifican por la progenie a
la que dan lugar y se denominan por un sufijo que hace referencia a esta progenie (ej. CFU-
GM: Unidad formadora de colonias granulomonocticas). (Testa, 1992)
En general, el trmino "clulas madre" se refiere a clulas que son capaces de
reconstituir, a largo plazo, el sistema hematopoytico en animales receptores. Por otro
lado, algunas de las clulas que proveen reconstitucin a corto plazo pueden ser llamadas
tambin clulas madre, segn el modelo estocastico que se describir ms adelante.
(Ogawa, 1993)
Las caractersticas principales de estas clulas son:
O Pluripotencialidad, la cual implica que las clulas madre pueden originar todas las
Ineas linfohematopoyticas. Esto se ha demostrado experimentalmente usando
marcadores cromosmicos o clulas con insercin de retrovirus, cuyo destino puede
seguirse por el organismo. Si se inyectan clulas de estas caractersticas a ratones
irradiados puede comprobarse que clones que comprenden todas las lneas
linfohematopoyticas se detectan una vez que el sistema se ha regenerado. Estas
observaciones indican que una clula madre puede recolonizar todo el sistema en el
ratn, y ponen tambin de manifiesto la extensa capacidad de proliferacin de las
clulas madre. (Testa, 1992)
O Capacidad de autorenovacin, la cual asegura que el nmero de clulas madre se
mantenga constante en el tejido a lo largo de la vida normal del individuo, y permite
que se regeneren nuevas clulas para reemplazar las que se han perdido normalmente
por diferenciacin o por mecanismos patolgicos, por ejemplo a consecuencia de los
tratamientos citotxicos. (Testa, 1992)
El concepto de clulas madre ha sido bien establecido, sin embargo, no se ha podido
estudiarlas directamente debido a la ausencia de marcadores especficos para detectarlas.
As, la investigacin de los mecanismos que regulan estas clulas dependen de pruebas
funcionales e indirectas como el ensayo de colonias de bazo, ensayos de cultivo en
suspensin y reconstitucin de ratones letalmente irradiados o genticamente deficientes.
(Ogawa, 1993)
En el estado estacionario, la mayora de clulas madre estn latentes en el ciclo
celular y solamente una pocas suplen todas las clulas hematopoyticas en un momento
dado. Lajtha originalmente propuso el concepto de un verdadero estado de latencia y lo
llam Go. Este investigador propuso que las clulas madre hematopoyticas estn
normalmente en Go y se vuelven activas en el ciclo aleatoriamente, adems, este estado
confiere a las clulas madre tiempo para reparar el ADN, permitiendo el mantenimiento de
la integridad gentica de las poblaciones de clulas madre. Hay numerosos estudios que
apoyan el concepto de la latencia de estas clulas. Evidencia de la quiescencia de los
progenitores primitivos hematopoyticos ha sido obtenida en cultivos de progenitores
humanos. Estos estudios documentaron que los progenitores individuales permanecen
como clulas nicas por dos semanas en cultivo y proliferan en respuesta a la estimulacin
por combinaciones de citoquinas. (Ogawa, 1993)
En 1964, Ti11 et al propusieron un importante modelo de las funciones de las clulas
madre en el cual la decisin de una clula madre para autorreplicarse o diferenciarse se
describe como un proceso estocstieo. Ellos desarrollaron el modelo de "naciiniento y
muerte" para la autorreplicacin y diferenciacin de clulas madre y lo probaron por medio
de una simulacin en computadora basada en la generacin de nmeros aleatorios y
analizando las distribuciones de unidades formadoras de coloiiias en bazo (CFU-S, por sus
siglas en ingls) en colonias de bazo individuales. Basndose en la concordancia entre la
simulacin por computadora y observaciones experimentales, ellos propusieron que la
decisin de una clula madre de diferenciarse hacia una lnea determinada o replicarse es
un proceso estocstico. Los procesos estocsticos se definen como eventos determinados
aleatoriamente, los cuales siguen alguna distribucin o patrn probable, por lo que se
pueden analizar estadsticamente pero no se pueden predecir con precisin. (Ogawa, 1993)
Por su parte, Ogawa et al propusieron que el compromiso de los progenitores
multipotenciales hacia lneas mieloides individuales podra ser tambin un proceso
estocstico. Anlisis citolgicos de colonias derivadas de una sola clula mostraron una
variedad de combinaciones de lneas celulares, consistente con el concepto de que la
diferenciacin de clulas madre es un proceso estocstico. No solamente los tipos de
clulas en las colonias eran diferentes sino tambin el nmero de lneas celulares presentes
en cada colonia. Esta observacin indic que el principio estocstico no solo aplica en el
tipo sino tambin en el nmero de lneas celulares que se expresan durante el proceso de
diferenciacin. (Ogawa, 1 993)
Anteriormente, dos modelos deterministicos heron propuestos como mecanismos
de la diferenciacin de clulas'madre. El primero de ellos es el modelo del microambiente
inductor hematopoytico, el cual supone que hay nichos anatmicos que dirigen la
diferenciacin de progenitores multipotentes hacia una lnea especfica. El otro modelo es
el modelo competitivo, el cual propone la regulacin de la diferenciacin por medio de
factores humorales como la eritropoyetina y factores estimuladores de colonias. (Ogawa,
1993)
Dos mecanismos celulares pueden ser considerados para el modelo estocstico de
diferenciacin. Un mecanismo propone la restriccin aleatoria de lneas celulares en los
progenitores, la caracterstica principal de este modelo es que asume la existencia de
progenitores oligopotenciales. En un mecanismo alternativo una clula pluripotente puede
reproducirse (autorreplicacin) o aleatoriamente puede diferenciarse hacia la expresin de
una sola lnea celular. En contraste con el primer modelo, no se da una restriccin
progresiva del potencial y por lo tanto no hay progenitores oligopotentes; as, la deteccin
de dos o tres lneas en una sola colonia podra ser causada por la presencia de diferentes
progenitores monopotentes. (Ogawa, 1993)
Aunque el proceso estocstico de diferenciacin y los mecanismos de accin de
citoquinas que se discutirn ms adelante proveen una explicacin razonable para la
regulacin de la hematopoyesis, debe notarse que es un modelo basado en estudios de
progenitores aislados en un sistema de cultivo artificial. Es posible que la variacin en los
tipos de colonias pueda ser generada por interacciones de citoquinas durante la formacin
de la colonia. (Ogawa, 1993)
3. REGULACION DE LA HEMATOPOYESIS
La hematopoyesis est estrictamente controlada por factores estimulantes e
inhibidores. Los factores estimulantes o hemopoyetinas regulan la proliferacin,
diferenciacin y maduracin de los progenitores hematopoyticos, mantienen la integridad
de la membrana y la viabilidad celular de elementos maduros e inmaduros, y promueven la
activacin funcional de las clulas sanguneas maduras. Estos factores son en general
glicoprotenas con cadenas polipeptdicas de longitud similar. Los glicsidos son de
composicin variable, no estn involucrados en la actividad biolgica y dificultan la
degradacin de estos factores por accin de enzimas proteolticas, incrementando su vida
media in vivo. Las hemopoyetinas tienen actividad biolgica elevada; sus niveles en sangre
y tejidos en condiciones basales son mnimos, pero hay un incremento rpido de su sntesis
y liberacin despus de hemorragia, infeccin y10 estmulo antignico. Estos factores se
detectan biolgica e inmunoqumicamente como tales y son producidos por un amplio
nmero de clulas como los linfocitos, macrfagos, fibroblastos y clulas endoteliales.
(Malaspina, 1 992)
La mayor parte de los factores estimulantes fueron identificados por su capacidad de
inducir la formacin de colonias hematopoyticas in vitro (CFS, colony-stimulating
factors). La eritropoyetina es la nica hemopoyetina que desde su descubrimiento
demostr un efecto in vivo. En cuanto a las otras, en particular los CSFs, slo exista
evidencia in vitro. El factor limitante fue hasta hace poco su escasa disponibilidad y pureza
a causa de la baja eficiencia de las tcnicas de aislamiento y purificacin. El clonaje de los
genes que codifican estos factores y la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica han
permitido la disponibilidad de grandes cantidades de hemopoyetinas recombinantes. Esto a
su vez ha llevado a demostrar que estas citoquinas tienen un efecto in vivo. Las
investigaciones in vivo se hicieron inicialmente. en roedores y despus en primates, tanto en
condiciones fisiolgicas como de estrs inducidas por quimioterapia, irradiacin o
transplante de mdula sea. Los estudios en primates han servido como modelo preclinico
para establecer las dosis, frecuencia de administracin y toxicidad en seres humanos.
(Malaspina, 1 992)
Algunos factores son primordialmente estimuladores o inhibidores, mientras que
otros tienen funciones ms complejas en la proliferacin hematopoytica. Por ejemplo la
interleuquina 4 ha demostrado tener actividad estimuladora e inhibidora. Algunos factores
tienen acciones ms all del sistema hematopoytico, por ejemplo los efectos pleiotrpicos
de la interleuquina 6 que envuelven el sistema inmune, heptico y renal. Otro aspecto por
tomar en cuenta es que afectan a clulas en diferentes etapas, como es el caso de G-CSF,
que estimula la maduracin de progenitores de neutrfilos mientras que tambin puede
actuar sobre progenitores multipotentes primitivos. Adems de los efectos sobre los
progenitores, muchas citoquinas son capaces de activar funciones de leucocitos y
monocitos maduros. (Ogawa, 1993)
Un concepto importante con respecto a la regulacin por citoquinas es que hay una
redundancia funcional significativa entre las citoquinas, particularmente en las que actan
en etapas tempranas. Hay varias observaciones que apoyan la aseveracin de que hay
redundancia entre los reguladores hematopoyticos, como son la presencia de acciones
proliferativas en comn, el espectro comn de acciones biolgicas, subunidades
compartidas entre receptores y la coexpresin de receptores para diferentes reguladores en
las clulas individuales. (Metcalf, 1993)
Los factores estimulantes involucrados en el desarrollo y activacin funcional de los
elementos mieloides son: la eritropoyetina (Epo), el factor estimulante de colonias
granulocticas (G-CSF), el factor estimulante de colonias monocticas (M-CSF), el factor
estimulante de colonias granulociticas-monocticas (GM-CSF), la interleuquina 1 (IL-1), la
interleuquina 3 (IL-3) o multi-CSF, la interleuquina 4 (IL-4), la interleuquina 5 (IL-5), la
interleuquina 6 (IL-6), la interleuquina 9 (IL-9), la interleuquina 11 (IL-1 l), el Factor de
Clulas Madre (SCF, Stem Cell Factor) o ligando de la protena codificada por el oncogen
kit (KL, kit-ligand). Adems, otros factores que actan como inhibidores en estadios tardos
de la hematopoyesis tienen tambin efectos estimuladores en otros estadios, como por
ejemplo el Factor Inhibidor de Leucemia (LIF, Leukemia Inhibitory Factor), el Factor de
Transformacin y Crecimiento P (TGF P, Transforming Growth Factor P), Factor de
Necrosis Tumoral a y P (TNFa y P, Tumoral Necrosis Factor), y la Protena Inhibidora de
Macrfagos (MIP- 1, Macrophage Inhibitor Protein 1). (Malaspina, 1992)
Los factores de crecimiento se pueden dividir en tres categoras: (1) los que actan
en etapas tardas y son especficos de una lnea celular, (2) los que actan en etapas
intermedias y no son especficos de una lnea celular y (3) factores que afectan a los
progenitores latentes primitivos. (Ogawa, 1993)
Factores especficos de accin tarda
La mayora de estos factores intervienen en la proliferacin y maduracin de
progenitores comprometidos. La eritropoyetina es un regulador fisiolgico de la
eritropoyesis, el M-CSF y la IL-5 son considerados como especficos para
macrfagos/monocitos y eosinfilos, respectivamente. El G-CSF regula la proliferacin y
maduracin de progenitores de neutrfilos, aunque tambin acta sobre progenitores
primitivos, como se discutir en detalle ms adelante. (Ogawa, 1993)
Factores inespecficos de accin intermedia
Estos factores intervienen en la proliferacin de progenitores multipotentes pero
solamente cuando ya han salido de Go. Incluyen IL-3, GM-CSF e IL-4.
IL-3 por s solo parece que no interviene en las etapas finales de la hematopoyesis.
Estudios realizados por Ogawa et al indican que el grado de respuesta de progenitores
multipotentes murinos hacia IL-3 decrece conforme se diferencian y maduran. Lpez et al,
reportaron que progenitores hematopoyticos humanos tambin pierden su respuesta a IL-3
conforme se diferencian hacia neutrfilos. Estos resultados apoyan el concepto de que los
efectos hematopoyticos de IL-3 estn restringidos a los progenitores en etapas intermedias
del desarrollo hematopoytico y que no apoyan los procesos en lneas celulares
restringidas, con la posible excepcin de basfilos y mastocitos. (Ogawa, 1993)
GM-CSF originalmente fue descrito como una citoquina especfica para
granulocitos y macrfagos, pero estudios posteriores demostraron la ausencia de
especificidad de esta citoquina. En humanos, hay varios reportes que muestran que las
poblaciones blanco del GM-CSF se superponen con aquellas de la IL-3 e incluyen
progenitores no comprometidos. El descubrimiento de la identidad entre la subunidad P del
receptor humano para IL-3 y la subunidad P del receptor humano de GM-CSF apoyan el
concepto de que ambas citoquinas tienen funciones similares. (Ogawa, 1993)
IL-4 tambin parece pertenecer a este grupo de factores no especficos que regulan a
los progenitores multipotenciales. Por la posicin intermedia de las clulas blanco de IL-3,
GM-CSF e IL-4, estas molculas pueden interactuar efectivamente con factores de accin
tarda en la produccin de clulas ms maduras as como con factores que inician en ciclo
celular en progenitores latentes. Se ha postulado que la produccin de estos factores se
acelera slo en el caso de que haya una citopenia seria. (Ogawa, 1993)
Factores que inician el ciclo celular en progenitores latentes
Ogawa et al, encontraron que IL-6, G-CSF, IL-11, SCF e IL-1 actan
sinergsticarnente con IL-3 apoyando la formacin de colonias derivadas de progenitores
hematopoyticos latentes murinos. Originalmente, estos investigadores propusieron que el
efecto de estos factores es diminuir la duracin de Go en los progenitores primitivos.
Estudio ms recientes indican que esos factores activan el ciclo celular en progenitores
latentes. Estudios acerca de los mecanismos de transduccin de sefales de citoquinas
proveen explicaciones bioqumicas acerca de las similitudes en las funciones de IL-6, G-
CSF e IL- 1 l . (Ogawa, 1993)
Un factor que parece ser nico es SCF, el cual acta sinergsticamente con los
dems factores, adems de que tambin puede interactuar con factores de accin tarda en
particular con la eritropoyetina. (Ogawa, 1993)
Se ha demostrado que IL-3 y GM-CSF mantienen la supervivencia de los
progenitores primitivos hematopoyticos en Go, apoyando el concepto de que se requieren
factores para que los progenitores primitivos sobrevivan en el estado de latencia. (Ogawa,
1993)
Aplicaciones clnicas de las hemopoyetinas
El uso clnico de las hemopoyetinas ha despertado gran inters ya que tiene
potencialmente un gran nmero de aplicaciones:
1. Como terapia de reemplazo en el tratamiento de citopenias secundarias a un dficit
cuantitativo o cualitativo de hemopoyetina, por ejemplo, la utilizacin de
eritropoyetina en pacientes con insuficiencia renal crnica.
2. Incrementar el pool de progenitores hematopoyticos de modo que sea posible
utilizar dosis ms elevadas de agentes citotxicos.
3. Acelerar la regeneracin del tejido medular despus de tratamientos mieloablativos
(quimioterapia y10 irradiacin) o transplante de mdula sea.
4. Correccin de citopenias congnitas y adquiridas.
5. Activacin funcional de clulas maduras.
6. En el tratamiento de leucemias agudas, ya sea induciendo la diferenciacin de
blastos leucmicos en clulas maduras funcionales, o bien, estimulando el trnsito
de clulas leucmicas en estado no proliferativo hacia un estadio proliferativo,
volvindolas as ms susceptibles a agentes citotxicos.
7. En la movilizacin de clulas madre a sangre perifrica para su uso en transplante.
(Dexter, 1993)
Eritropoyetina
La eritropoyetina es una glicoprotena que regula los estadios tardos de la
produccin eritroide. Es producida principalmente por el rin y el hgado. La sntesis y
secrecin de Epo est controlada por un sistema de receptores de membrana que funciona
como sensor especfico de la presin de oxgeno tisular. (Malaspina, 1992)
Produccin
El rin es la principal fuente de Epo. Los niveles de Epo en pacientes anmicos
con uremia severa son muy bajos, pero despus del transplante renal aumentan
considerablemente como consecuencia de un incremento en la sntesis y liberacin de la
hormona, lo cual a su vez lleva a una normalizacin del hematocrito. ( Malaspina, 1992)
El hgado es otro rgano productor de Epo, pacientes anfiicos con anemia severa
no tienen completa ausencia de Epo plasmtica. Animales nefrectomizados bilateralmente
desarrollan anemia y tienen niveles muy bajos de Epo, los cuales decaen despus de
hepatectoma total. (Malaspina, 1 992)
Estudios recientes han mostrado que tambin los macrfagos de mdula sea
producen Epo. Cuando estas clulas son expuestas a niveles de oxgeno de 3,5% liberan
una glicoprotena que estimula la formacin de colonias eritroides, sin necesidad de Epo
exgena. Los macrfagos medulares poseen adems sensores para la presin de oxgeno y
expresan el gen de la Epo. (Malaspina, 1992)
Los mecanismos intracelulares que intervienen en la sntesis de Epo renal
involucran la ciclooxigenasa y el AMP cclico. Niveles bajos de la presin de oxgeno
tisular activan la ciclooxigenasa, la cual produce en la mdula renal un incremento de
prostaglandinas, principalmente la PGE2. La PGE2 induce la liberacin en la corteza renal
de AMPc, que a su vez activa una proteinquinasa responsable del incremento de Epo a
travs, posiblemente, de la fosforilacin de un precursor de la eritropoyetina. (Malaspina,
1992)
Lugar y mecanismo de accin
La Epo acta sobre la mdula sea en forma selectiva, estimulando la proliferacin
y diferenciacin de la serie eritroide a partir de un progenitor menos diferenciado. La Epo
estimula la proliferacin y diferenciacin de los progenitores eritroides tardos (CFU-E), y
no tiene efecto directo, pero se requiere para completar la diferenciacin de precursores
eritroides ms primitivos (BFU-E). Adems, favorece la proliferacin de proeritroblastos y
eritroblastos basfilos y su transformacin al estadio ortocromtico, incrementa la sntesis
de ARN en clulas eritroides, disminuye el tiempo de trnsito medular de clulas eritroides
con denucleacin temprana de eritroblastos e induce la movilizacin de reticulocitos a
sangre perifrica a las 24 horas post-tratamiento. ( Malaspina, 1992)
Con respecto a los hechos que se desencadenan post-interaccin ligando-receptor y
que llevan a la transcripcin, la Epo no actuara directamente difundindose hasta al ncleo,
sino que sera indirectamente, a travs de un factor intracelular que actuara como segundo
mensajero. Dentro de los posibles segundos mensajeros se ha propuesto el AMPc, GMPc y
un factor de naturaleza polipeptdica inactivado por tripsina, siendo el ms aceptado el
tercero. La Epo, al actuar sobre la membrana citoplasmtica, inducira la produccin de
esta protena intermediaria, la cual interacta con el ncleo estimulando la transcripcin.
En suma, la estimulacin de la sntesis de ARN es el primer hecho nuclear, seguida de la
produccin de ADN, la divisin celular y la maduracin con sntesis de hemoglobina.
(Malaspina, 1992)
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas
Las investigaciones iniciales con Epo se centran en pacientes anmicos con niveles
hgj?jna de EVO endhgenn como en aquellos con insuficiencia renal ornicn. Varios cstudios
han establecido claramente el valor teraputico de la Epo en el tratamiento de este tipo de
anemia y su mnima toxicidad. Tambin es capaz de revertir la anemia originada por un
efecto txico directo sobre los progenitores eritroides por drogas como el AZT, usado en el
tratamiento del SIDA. La Epo tambin mejora la anemia en ciertos pacientes con sndromes
mielodisplsicos con anemia y niveles endgenos altos de Epo. (Malaspina, 1992)
Factores estimulantes de colonias
El nombre de factores estimulantes de colonias (CSF, Colony Stimulating Factors)
fue dado a un grupo de glicoprotenas que inducen la formacin de colonias granulocticas
y monocticas a partir de clulas medulares que no son identificables morfolgicamente.
Estas clulas progenitoras estn, por lo tanto, ya comprometidas en un proceso de
diferenciacin celular especfico. Este grupo de citoquinas que comparten mltiples
caractersticas biolgicas y bioqumicas son: el G-CSF, el M-CSF, el GM-CSF, y la IL-3 o
multi-CSF. (Malaspina, 1992)
Produccin
En condiciones fisiolgicas, los monocitos, macrfagos, los fibroblastos y las
clulas endoteliales del estroma medular son los responsables fundamentales de la
produccin de los CSFs. Otras clulas que tienen ARNm especfico para los CSFs son los
linfocitos B y T y algunas clulas epiteliales. La sntesis basa1 es muy baja,
independientemente del tipo de clula productora, pero en condiciones de estrs hay un
incremento de la transcripcin y traduccin, obtenindose un aumento de hasta 1 000 veces
los niveles basales. Los agentes estimulantes son endotoxinas bacterianas para fibroblastos
y clulas endoteliales, y antgenos especficos para linfocitos. Los agentes activantes
actan a veces indirectamente, estimulando la liberacin de IL- 1, la cual a su vez estimula
la produccin de CSFs. ( Malaspina, 1992)
El G-CSF es producido por monocitos, fibroblastos y clulas endoteliales al ser
estimuladas con IL-1 o TNF. El M-CSF es producido fundamentalmente por monocitos. El
GM-CSF es producido por monocitos, fibroblastos, clulas endoteliales y linfocitos T de
distintos rganos al ser activados por IL-1 o TNF. La IL-3 es producida por linfocitos 1'
estimulados por la IL- 1 o TNF. (Malaspina, 1992)
Lugar y mecanismo de accin
La disponibilidad, por una parte, de formas recombinantes de CSFs y, por otra, de
mejores tcnicas de aislamiento y purificacin de progenitores hematopoyticos, ha
permitido delinear ms claramente el sitio de accin de los diferentes CSFs. Estos factores
no slo estimulan la proliferacin, diferenciacin y maduracin de los progenitores
mieloides, sino que tambin mantienen la integridad de la membrana y la viabilidad celular
de elementos maduros e inrnaduros, y promueven la activacin funcional de las clulas
maduras. La activacin funcional es un proceso rpido y se revierte en ausencia del factor
estimulante. En granulocitos, los CSFs aumentan la capacidad de ingestin y el consumo
de oxgeno, con la correspondiente produccin de superxido y posterior incremento de la
actividad citoltica. En macrfagos, activan la capacidad fagocitica, con aumento de la
sntesis de radicales oxigenados txicos por la va de activacin de la NADPH oxidasa y
fosfolipasa A2 de membrana, y prolongan el perodo citotxico. ( Malaspina, 1992)
El G-CSF estimula la produccin de neutrfilos. En experimentos con clulas
medulares no separadas y en presencia de Epo, el G-CSF induce la formacin de colonias
derivadas de BFU-E y CFU-mixtas, mientras que, en experimentos con preparaciones
celulares altamente enriquecidas con progenitores hematopoyticos, slo se forman
colonias neutrofilicas, lo que indica que la accin de G-CSF sobre BFU-E y CFU-mixtas es
indirecta. (Malaspina, 1992)
El M-CSF humano estimula la neutropoyesis por mecanismos indirectos,
estimulando la produccin de otros CSFs. El M-CSF acelera la maduracin de monocitos
en macrfagos; en particular, induce la produccin de interfern y de activador de
plasmingeno. (Malaspina, 1992)
El GM-CSF estimula, sobre todo, la produccin de neutrfilos y
monocitos/macrfagos y, menos intensamente, la de eosinfilos. Adems, estimula la
proliferacin y diferenciacin de progenitores eritroides ms primitivos (BFU-E) y
megacariocticos (CFU-Mk), los cuales requieren, para completar su maduracin, la
participacin de otros factores. Este efecto sobre varias lneas celulares indica que el GM-
CSF acta sobre un progenitor menos diferenciado. El GM-CSF estimula la sntesis y
liberacin de otras citoquinas, como TNF y IL-1. (Malaspina, 1992)
La IL-3 tiene un efecto equivalente al del GM-CSF y adems estimula la produccin
de mastocitos. La IL-3 ejerce su accin sobre progenitores hematopoyticos ms
primitivos, cercanos a la clula madre pluripotente, mientras que la IL-1 acta posiblemente
sobre la clula madre. (Malaspina, 1992)
Una falta de regulacin en la produccin de CSFs puede inducir efectos
perjudiciales que favorecen el desarrollo tumoral.
Los progenitores, precursores y clulas maduras tienen receptores especficos de
membrana para cada uno de estos CSF, encontrndose ms de un tipo de receptor por
clula. El nmero de receptoreslclula es alrededor de 100-500, y se necesita un nmero
bajo de sitios ocupados (10%) para desencadenar la respuesta biolgica. No existe
competencia entre los CSFs para ocupar un mismo receptor, pero hay interaccin entre el
receptor ocupado y el libre. (Malaspina, 1992)
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas
M-CSF
La forma natural del M-CSF humano fue el primer factor de crecimiento utilizado en
pacientes cancerosos con leucopenia post-quimioterapia y su administracin endovenosa
induce una aceleracin de la neutropoyesis sin afectar las otras lneas celulares, incluyendo
los monocitos. Este efecto in vivo del M-CSF es probablemente indirecto, ya que no tiene
efecto sobre las clulas progenitoras pero estimula la sntesis y liberacin de otros CSFs.
(Malaspina, 1992)
G-CSF
La administracin de G-CSF, en individuos con mdula sea intacta o modificada, se
traduce en un incremento del nmero de neutrfilos en sangre perifrica, el cual es dosis
dependiente, efecto que se revierte al suspender el tratamiento. La toxicidad ms notable
del G-CSF es dolor seo, que es tambin dosis dependiente. Igualmente, en pacientes con
neutropenias congnitas o secundarias a infecciones, la administracin de G-CSF
incrementa el nmero y la actividad funcional de neutrfilos, favoreciendo as la resolucin
de la infeccin. El tratamiento con G-CSF acelera la recuperacin hematolgica de
pacientes con tumores slidos tratados con quimioterapia intensiva solamente o transplante
autlogo de mdula sea. La administracin de G-CSF a pacientes con sndromes
mielodisplsicos sin exceso de blastos causa un incremento de neutrfilos sin aumentar la
proporcin de blastos. En leucemia mieloide aguda reduce la duracin de la neutropenia
post-quimoterapia de induccin sin riesgo de estimulacin de blastos residuales.
(Malaspina, 1992)
GM-CSF
La administracin de GM-CSF a individuos con mdula intacta o modificada causa un
aumento de neutrfilos, eosinfilos y monocitos en sangre perifrica. El efecto secundario
ms notable asociado con esta citoquina es tambin dolor seo, el cual es dosis
dependiente. En pacientes con neutropenias congnitas y adquiridas, el GM-CSF induce
neutrofilia, eosinofilia y monocitosis. En pacientes con SIDA que tienen neutropenia
severa asociada, ya sea a la infeccin o secundaria al tratamiento antiviral, el uso de
GM-CSF permite continuar estos tratamientos. En pacientes con aplasia medular, el GM-
CSF produce una mejora del nmero de leucocitos, pero slo en aquellos pacientes que
tienen progenitores hematopoyticos residuales. El uso de esta citoquina tambin acelera la
recuperacin de neutrfilos, eosinfilos y monocitos en pacientes tratados con
quimioterapia intensiva solamente y trasplante autlogo o alognico. El GM-CSF tambin
rcviertt las ~iiupenias de pacientes con sindromes mielodisplsicos (SMD). El tratamiento
con GM-CSF en pacientes con SMD induce incremento de neutrfilos, eosinfilos,
monocitos; en algunos casos, de linfocitos; en raros casos, de plaquetas y lo que es ms
notable, en ciertos casos causa un incremento de blastos, ofreciendo incluso un cuadro
franco de leucemia aguda. (Malaspina, 1992)
IL-3
La administracin de IL-3 a roedores, primates y humanos con mdula sea normal o
patolgica causa un incremento en el nmero de neutrfilos, eosinfilos, basfilos,
reticulocitos y plaquetas. Esta respuesta es generalmente menos marcada y ocurre ms
tarde en comparacin con la que es inducida por G-CSF o GM-CSF, lo cual refleja su
accin sobre un progenitor ms primitivo. (Malaspina, 1992) Sin embargo, no hay
condicin bien establecida para la utilizacin de IL-3 in vivo. En combinacin con G-CSF,
GM-CSF y Epo, puede ser usada en casos de fallo en transplante de mdula sea y hasta el
momento no ha demostrado beneficio significativo en el tratamiento de enfermedades
malignas hematolgicas como la leucemia mieloide aguda o los sndromes
mielodisplsicos. (Eder, 1997)
Interleuquina 1
Originalmente, se le describi como un factor soluble de naturaleza polipeptdica
liberado por macrfagos activados, que tena capacidad pirgena y, posteriormente, se le
adjudicaron otras funciones como el efecto sinergstico con la fitohemaglutinina en la
proliferacin de timocitos, resorcin del cartlago, aumento del catabolismo muscular,
induccin de neutrofilia y, recientemente, actividad de hemopoyetina. (Malaspina, 1992)
Produccin
Los monocitos/macrfagos, que son la fuente principal de IL-1 in vivo, han servido
como clulas modelo para los estudios de produccin de IL-l. En general, no existe IL-1
preformada, su produccin activa requiere la transcripcin del ARNm especfico. El
fenmeno inicial en este proceso es la interaccin ligando-receptor de membrana. La unin
a los receptores de membrana lleva a la activacin de una proteinkinasa, responsable del
incremento del ARNm especfico de IL-l. El primer producto del proceso de traduccin de
IL-1 es un precursor de 3 1 Kd para cada tipo de IL-l. En contraste con la fonna a, que
permanece asociada a la membrana en su mayor porcentaje, la forma p es secretada. El
mecanismo de secrecin incluye un proceso de formacin de poros en la membrana
plasmtica y es dependiente del antgeno IaDR de membrana, sea la produccin de IL-1
inducida por endotoxinas o por antigenos especficos. (Malaspina, 1992)
La produccin de IL-1 es inhibida por un gran nmero de agentes
inmunosupresores, infecciones virales as como por el interfern y (IFN y) y el
Transfonning Growth Factor P (TGF P). (Malaspina, 1992)
La lista de clulas productoras de IL-1 incluye queratinocitos, clulas del epitelio
corneal, linfocitos B estimulados, linfocitos granulares grandes, clulas gliales, clulas
endoteliales, neutrfilos, clulas mesangiales, fibroblastos y lneas celulares transformadas,
como las leucemias monociticas murinas P388D1 y5774 y humanas ThP-1, U.937 y clulas
derivadas de melanomas. (Malaspina, 1992)
Lugar y mecanismo de accin
La IL-1 no induce la formacin de colonias hematopoyticas in viro, pero hace que
una subpoblacin celular sea sensible a los factores estimulantes de colonias. La IL-1
induce a la clula madre pluripotente a diferenciarse en estadios que expresan receptores
para factores estimulantes que actan ms tardamente. La IL-1 tambin estimula la
hematopoyesis indirectamente induciendo la produccin y liberacin de otras
hemopoyetinas como el GM-CSF, el G-CSF, el M-CSF, la IL-6 a partir de las clulas del
estroma medular (fibroblastos y clulas endoteliales). Adems, la IL-1 estimula la
produccin de inhibidores de la hematopoyesis como el interfern P, TNF y
prostaglandinas, en particular PGE2. A dosis sensibilizantes y no saturantes de IL-1, la
estimulacin de inhibidores generalmente ocurre como fenmeno secundario cuando el
primario de la produccin de factores estimulantes ha alcanzado su pico. (Malaspina, 1992)
Se ha atribuido a la IL-1 una multitud de otras funciones que, en la mayor parte de
casos, se producen indirectamente a travs de otras citoquinas que tienen funciones ms
especficas, siendo raros los ejemplos de efecto directo. (Malaspina, 1992)
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas
La administracin de IL-1 a roedores, primates y pacientes cancerosos post-
quimioterapia causa aumento en el nmero de neufrfilos y monocitos. Este efecto
estimulante se observa solamente cuando la IL-1 se administra durante un corto perodo de
tiempo; la administracin continuada durante varios das causa el efecto opuesto: citopenia.
Este fenmeno es mediado por inhibidores de la hematopoyesis, particularmente el TNF,
cuya produccin es estimulada por la propia IL-l. Un aspecto importante en cuanto al uso
in vivo de esta citoquina es que a dosis altas tiene efectos colaterales muy severos tales
como hipotensin, shock y muerte, que son mediados por otros factores cuya produccin es
estimulada por esta citoquina tan pleiotrpica. Sin embargo, la IL-1 es de inters
teraputico por su efecto directo en la clula madre hematopoytica pluripotente y su
capacidad de inducir la sntesis y liberacin de otras hemopoyetinas. Tiene un gran
potencial en el tratamiento de problemas caracterizados por disminucin masiva de la
reserva de clulas madre. (Malaspina, 1992)
Interleuquina 4
IL-4 es una glicoprotena producida por linfocitos T que fue originalmente descrita
como un coestimulante de la proliferacin de linfocitos B no activados, por lo cual se le
llam "B cell growth factoryy (BCGF). Ms tarde se demostr que induce la expresin de
molculas de clase 11 del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en linfocitos B no
activados. En las clulas mieloides, la IL-4 acta como coestimulante del G-CSF, Epo y la
IL- 1, en la formacin de colonias granulocticas, eritroides y mixtas respectivamente. En
cultivos de mdula sea a largo plazo, IL-4 estimula la proliferacin de progenitores
primitivos e inhibe la de progenitores tardos. Este ltimo efecto no es mediado por accin
directa de la IL-4 sobre los progenitores ni tampoco a travs de la induccin de la
produccin de inhibidores como el IFN y, TNF, o TGB P. (Malaspina, 1992)
Produccin
La principal fuente de IL-4 son las clulas T, preferentemente las CD4+ activadas.
Otra fuente importante son los mastocitos. (Malaspina, 1992)
Lugar y mecanismo de accin
El receptor para la IL-4 se halla presente sobre las clulas T, By mastocitos,
macrfagos, la mayora de clulas eritroides y mieloides, fibroblastos, y clulas epiteliales.
El nmero de receptores por clula es generalmente bajo. La activacin de las clulas By as
como de las T, aumenta su expresin. La IL-4 por s misma tambin aumenta la expresin
del receptor. (Malaspina, 1992)
La naturaleza de los signos bioqurnicos desencadenados por la unin del ligando
con su receptor no es del todo conocida. El dominio citoplasmtico es de fundamental
importancia en la transmisin de la seal, la cual sera mediada por la fosforilacin de
tirosina. (Malaspina, 1992)
Interleuquina 5
La IL-5 estimula la produccin de colonias eosinofilicas por clulas medulares,
favorece la supervivencia in vitro y estimula la actividad funcional de eosinfilos. La IL-5
induce a los progenitores eosinofilicos a proliferar y diferenciarse en eosinfilos maduros,
pero no interviene en la produccin de dichos progenitores. La prdida del antgeno CD34
se correlaciona con la adquisicin de la susceptibilidad a la accin de la IL-5. La IL-5
incrementa la actividad citoltica antitumoral de los eosinfilos de sangre perifrica y la
produccin de anin superxido. (Malaspina, 1992)
Interleuquina 6
La IL-6 es una glicoprotena producida por una amplia variedad de clulas y acta
en varios tejidos; tiene una actividad multifuncional que regula la respuesta inmune, las
reacciones de fase aguda y la hematopoyesis.
Produccin
La IL-6 es producida por linfocitos T y B, monocitos, fibroblastos, queratinocitos,
clulas endoteliales, astrocitos, clulas del estroma medula, clulas mesangiales y
neutrfilos humanos estimulados con GM-CSF e IFN a. Tambin es producida por clulas
tumorales derivadas de mielomas e hipernefroma, lneas celulares T transformadas, lneas
monocitoides, lneas carcinomatosas de pulmn y vejiga y lneas derivadas de glioma y
astrocitoma. A diferencia de la produccin de IL-6 por monocitos, la produccin por parte
de los linfocitos T requiere la presencia de monocitos, mitgenos o estimulacin antignica.
(Malaspina, 1992)
Lugar y mecanismo de accin
En la mielopoyesis acta sobre la clula madre pluripotente estimulando su trnsito
de la fase Go a la fase G1. Esto explica la accin sinrgica con la IL-3, existiendo la
posibilidad de que tambin aumente la expresin de los receptores para la IL-3 en los
progenitores multipotentes. La IL-6 aumenta el nmero de colonias megacariocticas
estimuladas por la IL-3. Adems, tiene accin antagnica con el G-CSF sobre la
formacin de colonias (CFU-GM). La IL-6, junto con la IL-1 y el TNF, regula la
produccin de las protenas de fase aguda por parte de los hepatocitos. (Malaspina, 1992)
El receptor especfico para la IL-6 es expresado sobre clulas linfoides y no
linfoides en concordancia con sus propiedades multifuncionales. (Malaspina, 1992)
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas
La administracin de IL-6 recombinante humana a ratones y primates estimula la
mielopoyesis causando un aumento significativo del nmero de neutrfilos, glbulos rojos,
plaquetas y tambin de linfocitos. (Malaspina, 1992)
Interleuquina 11
Como la IL-6, la IL-11 tiene actividad sinrgica con la IL-3 en la estimulacin de
progenitores muy primitivos. El mecanismo sera abreviando la duracin de la fase Go del
ciclo celular. En presencia de la IL-3, la IL-11 estimula la formacin de colonias
megacariocticas. (Malaspina, 1992)
Kit-ligand o Stem Cell Factor
El SFC tiene la capacidad de estimular clulas progenitoras hematopoyticas muy
primitivas. En las clulas normales existe un proto-oncogen denominado c-kit que codifica
un receptor con actividad de tirosinkinasa. El receptor de esta molcula ha sido
denominado kit-ligand. El ligando del receptor c-kit es codificado por un gen denominado
Steel que regula tambin el desarrollo de clulas pigmentarias, germinales y
hematopoyticas. (Malaspina, 1992)
El ligando del producto del protooncogen c-kit se aisl como una molcula soluble y
fue descrito como Stem Cell Factor (SCF), y c-kit ligand (KL). El receptor codificado por
el c-kit es un glicoprotena que est estructuralmente relacionada con el receptor para el
M-CSF y el receptor para el platelet-derived growth factor. (PDGF). (Malaspina, 1992)
Produccin
SCF es producido constitutivamente por clulas endoteliales y fibroblastos. Los
queratinocitos en piel normal y clulas epiteliales del intestino tambin lo producen, y la
protena SCF puede ser detectada en el timo y otros sitios. (Broudy, 1997)
Lugar y mecanismo de accin
Estudios in vitro han demostrado que SCF acta sobre las clulas madre
hematopoyticas y clulas progenitoras; su accin es directa acelerando su entrada en el
ciclo celular. (Broudy, 1997)
El SCF no induce colonias hematopoyticas por si solo, pero lo hace en presencia
de otras hemopoyetinas. Este efecto estimulatorio es ms notable sobre una pequea
subpoblacin de clulas CD34+ que no expresan antgenos asociados con el linaje linfoide
ni mieloide. Esta poblacin CD34+lin- es ms primitiva que la CD34+, no forma colonias
en presencia de G-CSF, GM-CSF, o IL-3, pero cuando estos factores se combinan con el
SCF, estas clulas CD34+lin- producen numerosas colonias. El SCF, adems, provoca un
aumento en el tamao de las colonias mixtas (CFU-GEMM) y eritroides (BFU-E) en
presencia de Epo y de las colonias granulocito-macrofgicas (CFU-GM) estimuladas con
GM-CSF o G-CSF, lo cual sugiere que el SCF promueve la regeneracin y expansin de
las clulas progenitoras que responden a estas citoquinas dentro de las colonias
individuales. (Malaspina, 1 992)
Efectos in vivo y aplicaciones clnicas
La administracin de SCF a babuinos causa un incremento de granulocitos,
reticulocitos y plaquetas. (Malaspina, 1992)
Se ha utilizado clnicamente en la movilizacin de clulas madre de mdula sea a
sangre perifrica ya que in vitro ejerce efectos potenciadores con factores de crecimiento
hematopoyticos que actan directamente. (To, 1997)
Cuadro l. Principales factores estimulantes de la hematopoyesis
Factor Fuente Clula Blanco Efectos in vivo en la hematopoyesis
EPO Clulas CFU-E Estimula proliferacin y
yuxtaglomerulares diferenciacin de serie eritroide
renales, de Kuffer
y macrfagos
IL-5 Linfocitos T Linfocitos B, Estimula proliferacin de
eosinfilos progenitores eosinofilicos
M-CSF Monocitos Macrfagos, Estimula neutropoyesis por
neutrfilos mecanismos indirectos
Acelera maduracin de monocitos
GM-CSF Linfocitos T, Neutrfilos, Estimula produccin de neutrfilos y
monocitos, clulas macrfagos, monocitos/macrfagos y en menor
endoteliales, eosinfilos, clula grado eosinfilos
fibroblastos progenitora Estimula proliferacin y
multipotente, diferenciacin de BFU-E Y CFU-Mk
megacariocito Estimula sntesis y liberacin de
otras citoquinas
IL-3 Linfocitos T Neutrfilos, Equivalente a GM-CSF
macrfagos, Estimula produccin de mastocitos
eosinfilos,
megacariocitos,
mastocitos, clula
progenitora
multipotente
IL-4 Mastocitos y Linfocitos B, T y Coestimulante de G-CSF, Epo e IL-1
linfocitos T mastocitos
G-CSF Monocitos, Neutrfilos, Estimula produccin de neutrfilos
fibroblastos, macrfagos
clulas endoteliales
IL- 1 Mono1 macrfago, Clula madre Induce a la clula madre a
neutrfilos, diferenciarse
fibroblastos, Induce produccin y liberacin de
endoteliales, cl. otras hemopoyetinas
dendriticas, Estimula produccin de inhibidores
epiteliales, de la hematopoyesis
mesangiales
IL-6 Monocitos, Linfocitos B, T, Accin sinrgica con IL-3
Linfocitos T, neutrfilos y clula
fibroblastos y madre
clulas epiteliales
IL- 1 1 Cl. endoteliales Clula madre Accin sinrgica con IL-3
SCF Clulas Clula madre Estimula proliferacin de
endoteliales y progenitores hematopoyticos
fibroblastos primitivos
Factores inhibidores
El conocimiento actual sobre los inhibidores de la hematopoyesis es menos
satisfactorio que el de los factores que la inducen, aunque se ha descrito una serie de
sustancias con accin inhibidora, la cual raramente es selectiva.
Lactoferrina
Cuando est saturada por hierro inhibe indirectamente la granulopoyesis al
bloquear la liberacin de monocinas. Es una protena liberada a partir de los grnulos
secundarios de los granulocitos. (Testa, 1992)
Pptido hemoregulador
Inhibe la proliferacin de las CFU-GM, pero es altamente inestable. Su producto de
oxidacin es un dmero con actividad opuesta, que estimula las colonias
granulomonocticas. Parece lgico pensar que los granulocitos, a travs de su fuerte
capacidad xido-reductora, son capaces de mantener un equilibrio entre el monmero y el
dmero, lo que causa una rpida modulacin de la granulopoyesis. (Testa, 1992)
Prostaglandina E
Inhibe tambin la proliferacin de las CFU-GM. Los monocitos son las clulas que
las producen, lo que sugiere que es tambin un mecanismo de autoregdacin. (Testa, 1992)
Factor de crecimiento y transformacin p (TGF 0
Se localiza en los grnulos alfa de las plaquetas y parece que ejerce un papel de
auto-control al inhibir las CFU-Mk y tambin las BFU-E, las CFC-GM y las CFU-GEMM.
(Testa, 1992)
Recientemente se ha demostrado que el Factor Plaquetario 4 inhibe la proliferacin
y diferenciacin de los megacariocitos. Este factor, localizado en los grnulos alfa, podra
tambin ejercer un papel de autoregulacin de la megacariocitopoyesis. (Testa, 1992)
Protena injlamatoria macrofgica 1 a (MIPI a)
Inhibe la entrada de las CFU-S en ciclo celular, pero no acta regulando el ciclo
celular de clulas ms maduras. (Testa, 1992)
Interfern 7 (IFN y)
Tiene efecto inhibidor directo sobre la mielopoyesis e inhibe las CFU-GEMM, las
CFU-GM y las BFU-E. (Testa, 1992)
Factor de necrosis tumoral a (TNF a)
Inhibe fundamentalmente a la CFU-GM, pero tambin acta sobre progenitores
mixtos y eritroides. Adems, parece aumentar la proliferacin en estadios muy tempranas
de diferenciacin. (Testa, 1992)
La mayora de los factores inhibidores a los que se ha hecho referencia no son
reguladores especficos del sistema hematopoytico. En general, tienen efectos
pleiotrpicos en diversos sistemas del organismo, y es concebible que algunas de sus
acciones ms importantes puedan ejercerse de manera indirecta a travs de complejos
circuitos reguladores. (Testa, 1992)
Cuadro 2. Factores inhibidores de la hematopoyesis
Factor Fuente Efecto
Lactoferrina Granulocitos Bloquea liberacin de monocinas
Pptido hemoregulador Granulocitos Inhibe proliferacin de CFU-GM
Prostaglandina E Monocitos Inhibe proliferacin de CFU-GM
TGB P Plaquetas Inhibe proliferacin de CFU-M., BFU-E,
CFU-GM, CFU-GEMM
MIP a Macrfagos Inhibe entrada de CFU-S al ciclo celular
IFN y Linfocitos T Inhibe proliferacin de CFU-GM, CFU-Mix
y BFU-E
TNFa Macrfagos Inhibe proliferacin de CFU-GM
El transplante de clulas progenitoras hematopoyticas se ha aplicado ampliamente
en el tratamiento de fallo medular y sindromes mielodisplsicos, y en el rescate
hematolgico de pacientes que reciben quimioterapia a altas dosis para una gran variedad
de enfermedades hematolgicas.
Fuentes de clulas madre hematopoyticas
Las principales fuentes de clulas madre hematopoyticas que se han utilizado son:
el cordn umbilical, las clulas embrionarias y la sangre perifrica. Otra fuente que est en
estudio es la sangre fetal.
La sangre de cordn umbilical es una rica fuente de clulas hematopoyticas ya que
su contenido de clulas madre se asemeja al de la mdula sea. (Cairo, 1997).
La utilizacin de clulas madre derivadas de cordn tiene varias ventajas como su
disponibilidad inmediata (2 semanas, mientras se hacen las pruebas de compatibilidad), el
riesgo de transmisin de enfermedades infecciosas es muy bajo y no existe riesgo para el
donador en cuanto a la recoleccin. (Cairo, 1997).
Las desventajas que presenta esta fuente son:
La recuperacin inmunolgica y hematolgica despus del transplante puede tardar
ms por la disregulacin de factores de crecimiento en el neonato.
Existe alto riesgo de transmisin de un desorden gentico.
Se obtiene un nmero insuficiente de clulas pluripotentes para receptores adultos, por
lo que slo se puede utilizar para pacientes peditricos; esto puede dificultar el
procesamiento para disminuir clulas tumorales o linfocitos T, ya que durante ste hay
prdidas importantes de clulas.
Hay riesgo de contaminacin microbiana ya que el mtodo de recoleccin es abierto.
(Cairo, 1997)
Recientemente, bancos de sangre de cordn en los Estados Unidos y Europa han
abierto a los padres la posibilidad de criopreservar sangre de cordn umbilical de sus bebs,
para su utilizacin en caso de una futura enfermedad. (Cairo, 1997)
Otra fuente de clulas madre son las clulas embrionarias. Estas son clulas
pluripotentes derivadas de embriones no implantados, que tienen la habilidad de ser
mantenidas en cultivo indefinidamente como clulas indiferenciadas, y adems tienen la
capacidad de diferenciarse. (Kauhan, 200 1)
Estas clulas proveen una poblacin inicial ilimitada para el estudio del desarrollo
de la hematopoyesis, ya que los estudios contemporneos han sido confinados al uso de
tejido hematopoytico primario como la mdula sea, la sangre perifrica o la sangre de
cordn urnbilical como poblacin inicial. (Kaufinan, 200 1)
La diferenciacin in vitro de las clulas madre embrionarias puede tener
importantes implicaciones teraputicas, incluyendo la derivacin de eritrocitos y plaquetas
para transfusiones y de clulas madre hematopoyticas para transplante. Como stas
pueden expandirse sin limite aparente, los productos derivados de ellas podran ser creados
en grandes cantidades. Las clulas madre hematopoyticas de origen embrionario podran
incrementar la disponibilidad y efectividad del transplante. Trabajos recientes realizados en
ratones sugieren que estas clulas permiten regeneracin a largo plazo de la hematopoyesis
incluso en el transplante alognico. (Kaufinan, 2001)
Las clulas progenitoras hematopoyticas circulantes en sangre fetal pueden ser el
blanco para terapia gnica intrauterina en desrdenes hereditarios hematopoyticos y
metablicos, y podran permitir el desarrollo de tcnicas diagnstico no invasivo prenatal,
por medio de la expansin de progenitores hematopoyticos fetales presentes en sangre
materna. Adems, se est estudiando la posibilidad de utilizarlas como fuente de clulas
para transplante. (Campagnoli, 2000)
La fuente de clulas madre que ms se ha utilizado es la sangre perifrica, por
medio de la movilizacin, es decir, el proceso por el cual se da la migracin de estas clulas
desde la mdula sea hasta el torrente sanguneo.
Movilizacin de clulas madre
El primer estudio preclnico al respecto fue publicado en 1973 por Fliedner et al y
fue un modelo teraputico del uso de clulas madre sanguneas en el tratamiento del fallo
medular inducido por radiacin (Gee, 1997); sin embargo, como ya se mencion, la
existencia de esas clulas ya haba sido propuesto en 1909 por Maximov.
La recoleccin de clulas madre por centrifugacin de flujo continuo fue realizada
por primera vez en voluntarios humanos a finales de los setenta por Korbling et al, y ya
para 1986 aparecieron en la literatura seis estudios independientes en los cuales se
utilizaron clulas madre sanguneas para transplante. (Gee, 1997)
Las primeras recolecciones de clulas pluripotentes sanguneas fueron realizadas
durante el estado estacionario de hematopoyesis, con el resultado de que eran necesarias
muchas afresis para llegar al nmero de clulas ,requeridas. Esto hizo el procedimiento
costoso y cansado tanto para el paciente como para el personal, se requiri congelacin y
almacenamiento en cada recoleccin y por lo tanto un gran volumen de injerto. Esta
situacin cambi con el uso de quimioterapia y10 factores de crecimiento para movilizar las
clulas madre de la mdula sea a la circulacin, reduciendo el nmero de recolecciones y
el volumen del injerto final. Esto trajo como consecuencia un gran incremento en el uso de
este tipo de transplante, el cual empez solamente como autlogo pero se ha extendido su
uso hacia el transplante alognico. (Gee, 1997)
En humanos, el proceso de movilizacin se not inicialmente durante la
recuperacin despus de terapia mielosupresiva. La capacidad de los factores de
crecimiento para movilizar clulas madre, ya sea solos o en combinacin con
quimioterapia, increment la utilizacin de estas clulas para transplante. Sin embargo, se
conoce poco acerca del mecanismo de movilizacin de clulas malignas o no malignas y el
diseo de protocolos de movilizacin permanece emprico. (To, 1 997)
El fenmeno de movilizacin
La creencia general es que las clulas madre movilizadas se originan de la mdula
sea. Este postulado predice una secuencia de eventos durante la movilizacin: primero, la
modulacin de la interaccin entre la clula madre y el estroma medular, luego la
migracin a travs de los sinusoides medulares y el egreso a travs de la membrana basal y
la capa endotelial. (To, 1997)
La localizacin de la hematopoyesis en la mdula sea implica interacciones
adhesivas entre las clulas hematopoyticas primitivas y el estroma medular
(microambiente hematopoytico). Este hecho dio pie a muchos investigadores para
proponer que la movilizacin involucra una perturbacin de las interacciones adhesivas con
los elementos estromales, los cuales bajo condiciones estacionarias son responsables de la
retencin fisiolgica de las clulas hematopoyticas primitivas en la mdula sea. Las
clulas primitivas exhiben un amplio rango de molculas de adhesin celular, incluyendo
miembros de las superfamilias de las integrinas, selectinas, inmunoglobulinas y de la
familia de molculas de adhesin CD44. Los ligandos de muchas de esas molculas de
adhesin son expresados por las clulas estromales de la mdula sea. (To, 1997)
Estudios recientes han sugerido una contribucin importante al alojamiento y
retencin de las clulas madre en la mdula sea por la 0 1 integrina VLA-4, con sus
ligandos fbronectina y VCAM-1. Notablemente, la perturbacin de la funcin de VLA-4
despus de la administracin de un anticuerpo anti-VLA-4 en primates, resulta en la
induccin de la movilizacin de clulas madre hacia el torrente sanguneo. En otros
estudios se demostr que clulas CD34+ movilizadas mediante varias combinaciones de
citoquinas tienen una expresin reducida de ciertas molculas de adhesin, en particular
VLA-4, LFA-1 y LFA-3. Las clulas CD34+ durante estado estacionario de la mdula
sea expresan las integrinas VLA-4 y VLA-5 en un estado inactivo o de muy baja afinidad.
Despus del tratamiento con varias citoquinas, incluyendo IL-3, GM-CSF y SCF, las
clulas CD34+ exhiben un incremento transitorio en las propiedades de unin de VLA-4 y
VLA-5. Todos estos datos sugieren que el desplazamiento de clulas progenitoras
hematopoyticas es el resultado de cambios inducidos por citoquinas en la funcin de
integrinas de la clula CD34+ que facilita su egreso de la mdula sea. Los factores que
modulan la migracin directamente no han sido definidos. (To, 1997)
La mayora de los estudios que investigan estos mecanismos han sido enfocados en
los cambios de las clulas madre, pero pocos han investigado la contribucin del estroma
medular a este fenmeno. Daos al estroma causados por exposicin previa a
quimioterapia podran explicar los pobres resultados en la movilizacin en algunos
pacientes y en modelos murinos. (To, 1997)
El entendimiento de este proceso puede contribuir al desarrollo de protocolos de
movilizacin ms eficaces y predecibles con implicaciones clnicas relevantes. En
particular, la elucidacin de los eventos moleculares y bioqumicos relacionados con el
desprendimiento y migracin pueden permitirnos el movilizar clulas ms directamente.
Cambios en la funcin de integrinas y selectinas tambin han sido descritos en el trfico de
clulas tumorales, as, podra ser posible desarrollar protocolos que favorezcan la migracin
de clulas normales y reduzcan el riesgo de contaminacin por clulas malignas. (To,
1997)
Protocolos de movilizacin
Actualmente, existen tres formas de movilizar las clulas madre hacia la circulacin:
utilizacin de quimioterapia mielosupresiva, factores de crecimiento, o una combinacin de
factores de crecimiento y quimioterapia.
Quimioterapia mielosupresiva
La quimioterapia mielosupresiva fue el primer protocolo clnicamente til. Durante
la fase de recuperacin despus de quimioterapia mielosupresiva, ocurre un incremento de
50 veces en las CFU-GM circulantes. La droga de utilizacin ms comn es la
ciclofosfamida en altas dosis, porque es activa contra muchos tipos de tumores. (To, 1997)
Las limitaciones principales de la quimioterapia son la sepsis neutropnica, diatesis
y la imposibilidad de predecir el tiempo ptimo para hacer la afresis. Con el advenimiento
de los factores de crecimiento hematopoyticos, ya no es necesaria la utilizacin de
quimioterapia solamente para incrementar la circulacin de clulas madre. (To, 1997)
Ouimioterapia mielosupresiva + Factores de Crecimiento Hematopoyticos
La adicin de factores de crecimiento hematopoyticos como G-CSF o GM-CSF a
la quimioterapia mielosupresiva, incrementa la movilizacin mientras que reduce la
mielotoxicidad. En la literatura se reporta el uso de diversos ensayos biolgicos:
G-CSF: En numerosos estudios clnicos de fase 11 se ha reportado la eficacia de la
utilizacin de esta citoquina en combinacin con la quimioterapia, lo que da como
resultado reduccin de la hospitalizacin en pacientes con diferentes tumores malignos. La
dosis utilizada con quimioterapia es de 3 a 6 pg/kg/da y usualmente se inicia el da despus
de que comienza la quimioterapia y contina hasta que se completa la leucoafresis. (To,
1997)
GM-CSF con IL-3: GM-CSF fue la primera citoquina utilizada para incrementar la
movilizacin dada por la quimioterapia. Aunque su eficacia es comparable con G-CSF, es
menos utilizada probablemente por sus efectos colaterales como fiebre e hipoxemia. La
dosis usual es de 5 pg/kg/da, dosis mayores estn asociadas con efectos secundarios
mayores. El inicio de GM-CSF cinco das despus de la quimioterapia es igual de efectivo
que un da despus, pero el inicio en el stimo da despus de la quimioterapia es menos
efectivo. Un protocolo con IL-3 en secuencia con GM-CSF da mejores resultados que el
uso de GM-CSF solamente despus de la quimioterapia o la quimioterapia sola. (To, 1997)
Factores de crecimiento
Otra forma de movilizar clulas madre es utilizando factores de crecimiento como el
G-CSF, GM-CSF y SCF.
G-CSF: estimula la granulopoyesis de neutrfilos en una forma dependiente de la dosis e
incrementa el nivel de clulas progenitoras sanguneas en pacientes con cncer. El nivel de
clulas madre se incrementa de 40 a 80 veces despus de cuatro a cinco das de tratamiento.
Cuando el tratamiento cesa, los niveles de clulas regresan a los niveles basales en cuatro a
seis das. Transplantes singnicos en ratones han demostrado que clulas sanguneas
movilizadas con G-CSF tienen un nmero sustancial de clulas madre primitivas capaces
de reconstituir la hematopoyesis a largo plazo y de repoblar el timo. En humanos, las
clulas CD34+ movilizadas con G-CSF son capaces de generar CFU-GM en cultivo lquido
por tres o ms semanas. Los efectos colaterales de G-CSF son pocos. Los efectos ms
comunes son dolor seo y elevacin asintomtica de la fosfatasa alcalina srica y gamma
glutamil transferasa. (To, 1997)
Actualmente estn disponibles dos formas comerciales de G-CSF. El filgrastim es la forma
no glicosilada producida en Escherichia coli, mientras que la lenograstim es la forma
glicosilada producida en clulas de ovario de hrnster chino. La lenograstim ha demostrado
ser ms activa que la filgrastim en ensayos de mdula sea in vitro, aunque ambas son
equivalentes en ensayos inrnunolgicos. (To, 1 997)
G-CSFISCF: SCF tiene slo un efecto modesto en la proliferacin de clulas
hematopoyticas in vitro pero ejerce efectos potenciadores con factores de crecimiento
hematopoyticos que actan directamente. (To, 1997)
El uso clnico de SCF + G-CSF para la movilizacin ha demostrado sinergismo en
experimentos en animales como ratones, adems de que se ha observado tambin en
pacientes con quimioterapia previa. La administracin de SCF ha producido
ocasionalmente reacciones anafilcticas. (To, 1 997)
GM-CSF: en varios estudios se ha demostrado que este factor es menos efectivo que G-
CSF en cuanto a la movilizacin de clulas, por lo que su utilizacin no es muy frecuente.
IL-3: tiene un efecto proliferativo en clulas hematopoyticas, pero tiene poca actividad
en movilizacin ya que los efectos secundarios limitan su dosis a un nivel que es poco
efectivo para este propsito. (To, 1997)
Recoleccin de clulas madre
Preparacin del donador
Tradicionalmente, la afresis comienza cuando el conteo de leucocitos es
aproximadamente 10~/litro, pero se prefiere retrasarla hasta que el conteo alcance ms de 2
x 10 g/litro. Alternativamente, algunos centros monitorean la concentracin de clulas
CD34+ en la circulacin e inician la afresis cuando el conteo es mayor de 15 CD34+/pl.
(Gee, 1997)
Varias organizaciones han desarrollado lineamientos y estndares para la evaluacin
de donadores para transplante de clulas madre sanguneas (TCMS). El siguiente es un
resumen de los estndares desarrollados por la Fundacin para la Acreditacin de Terapia
de Clulas Madre:
Debe haber una evaluacin documentada de historia mdica, examen fsico y de
laboratorio, en cuanto a los riesgos de la donacin por afresis.
Antes de cada procedimiento de recoleccin debe hacerse una evaluacin de la salud
completa.
Debe hacerse un conteo de las clulas sanguneas completo 72 horas antes de la primera
recoleccin y 24 horas antes de cada afresis siguiente.
Para donaciones alognicas, debe ser obtenerse la historia mdica y deben hacerse una
evaluacin fisica completa y exmenes de laboratorio ( tipo de HLA-A, -B o -DR,
grupo ABO y factor Rh, pruebas para anti-HIV-1, anti-HIV-2, HIV-1 Ag, anti-HTLV,
HBsAg, anti-HBc, anti-HBC y anti-CMV, y una prueba serolgica para sfilis)
Se requiere un consentimiento informado antes de comenzar con la quimioterapia a
altas dosis, y el procedimiento debe ser explicado de forma que el donador pueda
entender.
La administracin de factor de crecimiento debe hacerse bajo la supervisin de un
mdico especializado en el manejo de personas que reciben estos agentes.
Catteres venosos centrales deben ser colocados por un mdico calificado para este
procedimiento, y la colocacin adecuada debe ser documentada radiogrficamente.
(Gee, 1997)
Rutinariamente se utiliza anticoagulacin con ACD-A (anticoagulante-citrato-
dextrosa frmula A) durante la recoleccin, tambin se usa heparina para pacientes
alrgicos al citrato. El mayor efecto colateral asociado al uso de ACD-A es la
hipocalcemia, la cual puede ser prevenida por administracin oral de leche o citrato de
calcio. Si los sntomas aparecen durante la recoleccin debe administrarse gluconato de
calcio durante 5-10 minutos. Los signos vitales as como el conteo de plaquetas y
hematocrito, deben ser monitoreados cada 30 minutos durante la recoleccin y deben
observarse los sntomas de hipocalcemia. (Gee, 1997)
Recoleccin
La recoleccin es automtica, conectando al donador en una mquina de afresis,
con el fin de realizar un procedimiento de leucoafresis modificado. Aunque hay una gran
variedad de mquinas para esto, todas funcionan bajo el mismo principio. La sangre se
drena del donador , se anticoagula y se bombea hacia una cmara giratoria All la sangre
se separa en sus componentes con base en el tamao celular y la densidad, formando
distintas capas. La capa rica en leucocitos se deposita en un recipiente recolector y los
dems elementos regresan al paciente. Este procedimiento puede ser realizado de forma
continua o discantinua y se mantiene hasta .que el volumen requerido de sangre es
procesado. En la mayora de los casos se procesan dos o tres volmenes de sangre (10-12
litros) durante 3-4 horas. (Stroncek, 1999)
La leucoafresis se repite en los das siguientes hasta que se haya recolectado el
nmero necesario de clulas. La experiencia indica que la dosis ptima de clulas es de
1-2 x 10 ' clulas nucleadas por kilogramo de peso corporal del paciente. Si el producto se
va a manipular ex vivo, se requiere una concentracin de clulas dos o tres veces mayor
para compensar las prdidas. (Gee, 1997)
Se han utilizado tres parrnetros para medir la eficiencia de la recoleccin: total de
clulas nucleadas, ensayos de formacin de colonias y clulas CD34+ totales y
subpoblaciones. El parrnetro que ms se utiliza es el nmero total de clulas CD34+
recolectadas. Sin embargo, hay una gran variabilidad entre laboratorios en el conteo de
CD34+, principalmente dada por la eleccin del anticuerpo monoclonal anti-CD34, del
conjugado, del anlisis de citometra de flujo y del denominador usado. Tambin hay que
tomar en cuenta que la poblacin de clulas CD34+ es heterognea, y que contiene tanto
progenitores como clulas madre pluripotentes y este fenotipo puede ser afectado por el
tipo de movilizacin usado y la terapia anterior que haya tenido el paciente. (Gee, 1997)
Por estos aspectos el criterio utilizado entonces es el nmero de clulas nucleadas
(2-6 x 10 ') y el nmero de clulas CD34+ (1-3 x 10 6) . (Gee, 1997)
Complicaciones asociadas a la recoleccin
El nmero de complicaciones ha bajado conforme el procedimiento se ha hecho ms
eficiente y el nmero de afresis por paciente ha disminuido.
Como ya se mencion, la toxicidad del citrato puede ser un problema, pero
usualmente es fcilmente prevenida y controlada. Otra complicacin es la hipovolemia, la
cual se puede evitar interrumpiendo el procedimiento o disminuyendo la tasa de flujo.
Algunas veces se presenta trombocitopenia como resultado de la adherencia de la plaquetas
a la superficie del equipo. (Gee, 1997)
En una revisin de 5 54 recolecciones en 75 pacientes, entre 1990 y 1994, Golberg et
al describieron complicaciones asociadas al catter en 15,9% de los procedimientos.
Anemia o trombocitopenia que requirieron transfusin se observ en un 30,7% y 14,7% de
los casos, respectivamente. (Gee, 1997)
Estandarizacin de la medicin de clulas progenitoras
La citometra de flujo ha sido ampliamente utilizada para enumerar las clulas
CD34+, aunque no hay un consenso acerca de que ese sea el mejor mtodo para este
propsito. Es importante considerar que una subpoblacin de clulas movilizadas, definida
inmunofenotpicamente, no necesariamente tiene las mismas propiedades funcionales que
su contraparte de mdula sea. El ensayo de CFU-GM ha sido utilizado para enumerar
clulas progenitoras y para probar la viabilidad de clulas criopreservadas, sin embargo, no
provee informacin directa sobre las clulas progenitoras primitivas. Estos ensayos son los
dos ndices de reconstitucin hematopoytica ms utilizados, pero la estandarizacin de
estos mtodos no se ha establecido. (Gee, 1997)
Hay una serie de variantes crticas para la estandarizacin del conteo de clulas
CD34+. Primero, el mtodo de procesamiento de la muestra influencia el grado de
contaminacin por detritos celulares y eritrocitos. Segundo, el anticuerpo anti-CD34 y el
fluorocromo utilizado influencia la sensibilidad y especificidad . Tercero, el denominador
utilizado para el clculo del nmero de clulas CD34+ es crtico en el establecimiento de la
incidencia de clulas CD34+ relacionada a otros leucocitos. (To, 1997)
El establecimiento de un rango de referencia basado en individuos sanos podra
proporcionar una medida para comparar los datos de diferentes laboratorios y10 diferentes
mtodos para enumerar CFU-GM o clulas CD34+ y as poder establecer la validez de un
determinado mtodo de movilizacin de clulas sanguneas. (To, 1997)
Procesamiento de las clulas
Procesamiento de rutina
Las condiciones ptimas de almacenamiento no han sido rigurosamente
establecidas, sin embargo, parece que las clulas se mantienen adecuadamente a 4 "C con
la concentracin mantenida debajo de 5 * 107/ m~ y el pH menor a 7. (Gee, 1997)
El control de calidad requiere que cada producto sea probado por esterilidad,
composicin celular cualitativa y cuantitativa y contenido de clulas progenitoras. Los
ensayos de formacin de colonias se pueden utilizar tambin para evaluar viabilidad y
actividad funcional de las clulas midiendo su habilidad para proliferar. Ensayos de
viabilidad por exclusin de tinciones proveen informacin acerca de la integridad de la
membrana, pero no del potencial proliferativo. (Gee, 1997)
Procesamiento extensivo
Las clulas madre sanguneas pueden ser manipuladas de varias maneras. Las
clulas tumorales en el producto para trasplante autlogo pueden ser disminuidas con el
fin de aminorar la probabilidad de una recada, ya que se ha demostrado en varios estudios
que el uso de productos "purgados" de clulas tumorales est asociado con una mayar
supervivencia del paciente. Estas clulas se pueden disminuir activamente (seleccin
negativa) o enriqueciendo especficamente la poblacin de clulas CD34+ (seleccin
positiva). La seleccin negativa puede disminuir las clulas tumorales muy
eficientemente, sin embargo, el procediiniento es relativamente caro, puede haber prdida
significativa de clulas nucleadas y la mayora de procedimientos son largos y deben ser
repetidos con cada producto. (Gee, 1997)
El enriquecimiento de clulas CD34+ es una alternativa atractiva, y hay varios
sistemas disponibles en el mercado que usualmente son automatizados y relativamente
rpidos. Los resultados obtenidos son variables y adems ha habido reportes de que ciertas
clulas tumorales pueden tener el antgeno CD34+ y podran copurificarse con la poblacin
de clulas madre. (Gee, 1997)
Estas clulas madre pueden ser infundidas directamente, expandidas o diferenciadas
ex vivo, o ser utilizadas como blanco para terapia gnica. (Gee, 1997)
En el caso del transplante alognico, pueden disminuirse las clulas T como
profilaxis contra la Enfermedad Injerto versus Husped (EIVH). (Gee, 1997)
Criopreservacin y almacenamiento
Requiere la adicin de un agente crioprotector para mantener la integridad celular,
adems de una transicin de temperatura controlada hacia la temperatura final de
almacenamiento.
Mtodo de DMSO y congelacin programada
En este mtodo, se utiliza dimetil sulfxido (DMSO) solo como crioprotector y las
clulas se congelan utilizando un congelador de tasa de enfriamiento programable. Las
clulas se suspenden en plasma autlogo o en soluciones salinas fisiolgicas que contengan
protenas plasmticas a una concentracin final desde 3 x 10~1rnl hasta 8 x 108/ml. Se
depositan alcuotas en bolsas de congelacin a un volumen que no exceda la mitad de la
capacidad recomendada de la bolsa. A esta suspensin se la aade lentamente, mezclando,
solucin salina fisiolgica con 20% vlv de DMSO. Las bolsas se sellan con calor y se
colocan rpidamente en latas para protegerlas durante la congelacin y almacenamiento.
Las latas son congeladas a -1 OC/minuto hasta -50 "C y luego a -5 OC/minuto hasta -90C,
punto en el cual son transferidos a nitrgeno lquido para almacenamiento a largo plazo.
(Stroncek, 1999)
Mtodo de DMSO, hidroxietil y congelacin no controlada
En esta segunda tcnica, la concentracin final de DMSO es de 5 %v/v y se aade
6% V/V de hiroxietil. La suspensin se divide en bolsas de congelacin, las cuales se
colocan horizontalmente en un congelador a -80C para la congelacin y almacenamiento.
(Stroncek, 1999)
Descongelacin y reinfusin
El descongelamiento usualmente es llevado a cabo rpidamente por inmersin del
producto congelado en un bao a 37 'C. En este paso hay que tener cuidado de que el bao
est siempre escrupulosamente limpio y el agua que se utilice sea estril para prevenir la
contaminacin. (Gee, 1997)
Una vez que el productos ha sido descongelado, se infunde rpidamente mediante
un equipo de administracin de sangre. Se debe utilizar un filtro de sangre para remover
microagregados. Deben tomarse muestras para control de calidad directamente de las
bolsas descongeladas. (Gee, 1997)
Antes de la infusin del producto descongelado, el paciente debe hiratarse y
medicarse con antihistaminicos para reducir el riesgo de colapso vascular e hipotensin
producto de la liberacin de histarnina inducida por el DMSO. Aunque las reacciones aI
DMSO son infiecuentes, han sido reportadas, en un rango de efectos desde
cardiovasculares (bradicardia e hipertensin) y encefalopata hasta muerte sbita. Otros
efectos son comunes como el dolor de cabeza, nuseas, vmito y hematuria. (Gee, 1997)
En el caso de infusin de volmenes grandes, es necesario hacer la infusin en
varios das o lavar las clulas antes de infundirlas para remover el crioprotector y detritos
celulares, lo cual puede llevar a prdidas importantes de clulas. (Gee, 1997)
Utilizacin del transplante de clulas madre sanguneas
El transplante autlogo de clulas madre ha sido aplicado con varios grados de xito
en leucemia granuloctica crnica, leucemia aguda, sndromes mielodisplsicos, mieloma
mltiple y linfoma no Hodgkin. (Cutler, 2001)
En el caso de la leucemia aguda, el transplante se recomienda en pacientes con
caractersticas citogenticas de alto riesgo en primera remisin, pacientes con enfermedad
resistente o refractaria y pacientes en segunda remisin. En leucemia granuloctica crnica
en fase estable, el transplante alognico actualmente es la terapia de eleccin, ya que es la
nica terapia con potencial curativo. (Cutler, 2001).
El transplante de mdula sea autlogo para mieloma mltiple ha demostrado ser
superior comparado con la quimioterapia tradicional ofreciendo ventajas en cuanto a
remisin y tiempo de supervivencia. Sin embargo, estos transplantes frecuentemente se
contaminan con clulas tumorales residuales. Este riesgo de contaminacin ha impulsado
el estudio de la utilizacin de clulas madre sanguneas como una alternativa; as, se han
realizado diversos ensayos clnicos con humanos en los cuales se han obtenido buenos
resultados en cuanto a remisin. (Cutler, 2001)
Actualmente, el transplante alognico es la nica terapia con potencial curativo para
sndromes mielodisplsicos. Los pacientes con anormalidades genticas menores, menor
periodo de latencia desde el diagnstico y pacientes con anemia refractaria o anemia
refractaria con sideroblastos en anillo tienen mejores resultados despus del transplante. El
momento ptimo para realizar el transplante de clulas madre todava no se conoce para
estas enfermedades. La experiencia en el transplante para estas enfermedades es ms
limitada que en el caso de leucemia aguda y crnica. Los pacientes con sndromes
mielodisplsicos comprenden una porcin mnima en estudios donde se comparan los
transplantes , por lo que no se puede concluir nada sobre las ventajas o desventajas de la
utilizacin de esta terapia. (Cutler, 2001)
En el linfoma no Hodgkin, el transplante autlogo tiene ventajas en cuanto a
supervivencia con respecto a la quimioterapia. Este transplante ha sido utilizado en
pacientes con fiacaso de transplantes de mdula sea o enfermedad refiactaria con alto
xito en cuanta a remisin completa de la enfermedad. (Cutler, 200 1)
El transplante de clulas madre sanguneas ofiece una serie de ventajas sobre el de
mdula sea:
Se pueden tratar pacientes de mayor edad y ms enfermedades con este tipo de
transplante (To, 1997)
La recuperacin hematolgica e inmune ocurre en menor tiempo, lo que puede
disminuir el periodo de vulnerabilidad a infecciones y otras complicaciones y la
duracin de la hospitalizacin en los receptores, con lo que se disminuyen los costos.
(Korbling, 1996)
El procedimiento de recoleccin conlleva menos riesgos ya que no requiere anestesia
general, hay menor riesgo de sangrado, infeccin o daos a nervios, adems tiene
menos inconvenientes para el donador, ya que la aspiracin de mdula es ms dolorosa
y la recuperacin tarda de 2 a 4 semanas. (Korbling, 1996)
El transplante tiene un mayor nmero de clulas CD34+ y linfoides. (Korbling, 1996)
El donador est disponibles para recolecciones adicionales, adems de que hay mayor
nmero de posibles donadores que en de mdula sea. (Korbling, 1996)
Hay menor mortalidad relacionada al transplante. (Korbling, 1996)
Sin embargo, esta fuente de clulas madre para transplante tambin tiene
desventajas al compararla con la mdula sea:
La recoleccin requiere acceso vascular.
Los efectos adversos del tratamiento con citoquinas.
Pueden ser necesarias mltiples recolecciones de clulas, a diferencia de la mdula sea
donde se realiza una nica recoleccin.
El producto de afresis tiene un volumen mayor, lo cual puede dificultar el
procesamiento para disminuir las clulas tumorales o los linfocitos T. (Korbling, 1996)
Mayor incidencia de enfermedad de injerto versus husped crnica, probablemente
debido al mayor nmero de linfocitos T que se transplantan. (Korbling, 1996)
Experiencia en Costa Rica
En nuestro pas, el transplante de clulas madre sanguneas se utiliza en el Hospital
San Juan de Dios (HSJD) y en el Hospital Mxico (HM).
En el HSJD el primer transplante se realiz en el ao 2000 y ya se han realizado
seis autotransplantes. El diagnstico de todos los pacientes tratados fue linfoma no
Hodgkin. De stos, dos han fallecido, uno por causas relacionadas al transplante en s. En
cuanto a los pacientes que viven, dos de ellos han tenido una evolucin poco satisfactoria,
con varias recadas y un pobre estado de salud. Los otros dos pacientes han evolucionado
satisfactoriamente; uno tuvo una recada, se recuper y actualmente est en remisin y el
otro, que fue sometido al transplante recientemente, hasta el momento se considera que ha
sido un xito. (Agero, comunicacin personal)
En el HM, el Programa de Transplantes de Clulas Madre Hematopoyticas inici
en el ao 1998; se han realizado 26 transplantes a 19 pacientes con diagnsticos como
leucemia aguda y crnica, mieloma mltiple, linfoma no Hodgkin, anemia aplsica y
tumores germinales. (Bujn, comunicacin personal)
De estos 19 pacientes transplantados, once han fallecido, cuatro de ellos por
recadas de la enfermedad inicial; los ocho pacientes que todava viven tienen un estado de
salud favorable y por el momento se considera que el transplante ha tenido muy buen
resultado. (Bujn, comunicacin personal)
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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