Manual Practico de Parasitologia - LUIS ADAN 2013

Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua-Len BAC 2013 Manual prctico de parasitologa
1. Uso, cuidado y manejo del microscopio, Medicin de parsitos

Introduccin Una de las herramientas de un laboratorio de parasitologa es un microscopio de luz. Este tipo de microscopio recibe este nombre ya que permite el paso de luz no alterada a travs de un sistema de lentes de manera que produzca un campo brillante donde se puedan observar pequeos objetos. Es un instrumento delicado y costoso, por lo tanto, su manejo requiere pericia y conocimiento de la teora. Esto ltimo es especialmente para obtener resultados ptimos de las observaciones microscpicas. Partes de un microscopio El microscopio de luz es un aparato ptico usado para amplificar y resolver detalles finos de un objeto microscpico. Est compuesto de diferentes partes (figura 1): 1. Mecnica, 2. ptica 3. Iluminacin 1. Parte mecnica Tubo: sostiene al ocular y al objetivo y los mantiene separados por la distancia de trabajo correcta. Brazo: continuacin de la base o pie que permite movilizar al microscopio con la mano. Platina: sostiene las preparaciones con la muestra colocadas sobre una perforacin central que deja pasar la luz que viene del condensador o del espejo. Pinzas: sostienen a la lmina portaobjeto con firmeza sobre la platina Revolver: pieza que sostiene los objetivos y que permite colocarlos alternativamente en posicin de trabajo. Tornillo macromtrico: mueve la platina hacia arriba o hacia abajo, con rapidez para acercar la preparacin a la distancia de trabajo aproximada del objetivo. Se usa para hacer el enfoque aproximado del objetivo.
Luis Adn Mairena Alvarado
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Figura 1: Microscopio de luz y sus partes
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Tornillo micromtrico: mueve muy lentamente la platina, hacia arriba o abajo, permitiendo ajustar el enfoque con exactitud y seguridad. Est diseado de modo que una revolucin de la perilla sube o baja la platina del microscopio en 0.2 mm. De este modo, se pueden hacer mediciones de espesor con escala en la perilla graduada en micrmetros.
2. Parte ptica Oculares: compuesto por lentes que multiplican el aumento del objetivo. Estn ubicados en la parte superior del tubo. Un buen ocular (10X) puede permitir un aumento total de 1000x.
Objetivos: se encuentran ubicados en la parte inferior del tubo, en el revlver. Normalmente un microscopio dispone de cuatro objetivos: 4X, 10X, 40X y 100X, independientes e intercambiables. Sus distancias de trabajo son: 15mm, 4mm, 0.5 mm y 0.1 mm respectivamente (figura 2).
Figura 2: Objetivo y sus partes
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1. Parte lumnica
Lmpara: se emplea una buja que emite una luz con una longitud de onda determinada provista por el fabricante del equipo, que funcionara adecuadamente en dependencia del voltaje que usted utiliza en su laboratorio (110 w o 120 w).
Diafragma: este sirve para controlar el dimetro del haz de luz que indique en el plano del objeto. Por medio de este puede ajustarse el campo luminoso en el objeto, de manera que concuerde con el campo visual del microscopio. Al cerrar este diafragma hasta que quede apenas ms grande que en el campo de observacin se disminuye la luz dispersa, con lo que mejora la resolucin y el contraste. En pocas palabras sirve para ajustar el paso de luz de la lmpara al condensador en dependencia del objetivo que estemos utilizando.
Condensador: es un sistema de lentes que sirve para enfocar en el objetivo el haz de luz proveniente de la lmpara, formando para tal efecto un cono luminoso cuyo vrtice se sita en el plano del objeto. Los condensadores ms comunes son los de tipo ABBE, que no estn corregidos de aberracin cromtica ni de esfericidad, pero son tiles para los trabajos corrientes. Los condensadores de aplanaticos estn corregidos de aberracin esfrica y cromtica pero son muy costosos. Los condensadores ordinarios de tipo ABBE usualmente tienen una abertura numrica de 1.25 y pueden tener una lente superior abatible que se aparta a un lado cuando se utilizan objetivos de poco aumento (2X, 4X). otros condensadores tienen aberturas numricas (AN) de hasta 1.40 y funcionan con inmersin en agua o aceite.
La razn de que se use un condensador de 1.25 AN es que el objetivo de inmersin (100X) tiene una AN de 1.25. Si se empleara un condensador de una AN menor no se podra aprovechar toda la capacidad de resolucin de este objetivo (figura 3).
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Figura 3: caractersticas de objetivos comunes para microscopia en campo claro. Conservacin y cuidados del microscopio El cuidado del microscopio consiste esencialmente en la limpieza. Los microscopios no se desgastan y no sufren de desalineamientos ni desajustes mecnicos. Tampoco requieren de engrase de sus cremalleras y cojinetes ya que vienen lubricados de por vida. El nico procedimiento es el cambio de la lmpara. Un microscopio mantenido limpio durara eternamente. 1. El polvo y la humedad son los principales enemigos de su microscopio. Despus de usarlo cbralo con una funda para protegerlo del polvo y gurdelo en un lugar fresco y seco. 2. De vez en cuando puede limpiar el estativo con un pao de hilo o de gamuza. No emplee como limpiadores solventes orgnicos como alcohol, ter, o thinner ya que podra deteriorar la pintura de las pizas de plstico. Utilice mejor un pao humedecido con detergente neutro. 3. Los componentes pticos deben conservarse impecablemente limpios. El polvo depositado en la superficie de los oculares debe quitarse con un pao muy suave o papel lente humedecido con alcohol etlico.
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4. Asegrese de limpiar el aceite de los objetivos de inmersin inmediatamente despus de su uso. Utilice para esto papel lente para no rayar el lente. Si es necesaria una mayor limpieza puede humedecer ligeramente el papel con bencina o xilol. Evite el exceso de disolvente ya que este puede penetrar en el interior del lente y puede arruinarlo. Por ningn motivo desarme los objetivos o los oculares para limpiarlos, ya que el conjunto de lentes de un objetivo ha sido alineado y ajustado en fabrica con extrema precisin.
Calibracin y medicin de quiste, huevos y trofozitos de parsitos
Para medir los elementos presentes en el campo microscpico es necesario disponer de una escala apropiada en el ocular del microscopio. Ahora bien antes de utilizar esa escala habr que calibrarla. Los micrmetros oculares son discos planos de vidrio que llevan grabada una escala lineal dividida en 50 o 100 pequeas divisiones. Estas divisiones tienen diferentes valores de medicin con arreglo al poder de resolucin del objetivo utilizado. El valor de medicin se calcula utilizando un micrmetro de platina provisto de una escala calibrada en divisiones y subdivisiones de 0.01 mm. Para calibrar el micrmetro ocular se procede del modo siguiente: Figura 4: calibracin de los oculares de un microscopio de luz
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1. Retirar el ocular (de 10X o de otra graduacin) del microscopio y desenroscar la lente superior o inferior. Colocar la escala sobre el diafragma situado en el interior del ocular, con el lado grabado contra la superficie inferior del lente. Volver a enroscar y reinsertar el ocular en el microscopio.
2. Colocar el micrmetro de platina sobre la platina del microscopio y enfocar con el objetivo de menor aumento en algn segmento de la escala con el ocular de 10X.
3. Ajustar el micrmetro de platina desplazando esta de manera que la lnea 0 del micrmetro ocular quede exactamente sobre la lnea 0 del micrmetro de platina.
4. Sin mover el micrmetro de platina, encontrar otro punto en el extremo derecho en el que coincidan con exactitud otra dos lneas. Este segundo par de lneas superpuestas debe estar lo ms alejado posible de la lnea 0. La distancia depender del objetivo utilizado.
5. Contar en el micrmetro ocular el nmero de divisiones entre la lnea 0 y el punto donde se superpone el segundo par de lneas. En la figura 4 adjunta, por ejemplo: este nmero indicado por la lnea de puntos, equivale a 33 unidades del ocular.
6. Contar luego el nmero de lneas divisorias de 0.1 mm entre la lnea 0 y el segundo par de lneas superpuestas en el micrmetro de platina; en la figura, este nmero, indicado por la flecha, equivale a 0.22 mm.
7. Calcular la longitud representada por una unidad del ocular 33 unidades del ocular = 0.22 mm 1 unidad del ocular = mm = 0.066 mm = 6.6 um
As pues, 1 unidad del ocular = 6.6 um para este objetivo (10X). Cada objetivo del microscopio debe de calibrarse por separado.
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Otra forma y un poco ms sencilla de hacer los clculos es mediante el siguiente ejemplo: Factor = B: nmero de lneas contadas en el micrmetro del objetivo A: nmero de lneas en el micrmetro ocular 10: factor de conversin de mm a um Mediciones Objetivo 4X 10X 40X 100X A 27 68 100 98 B 100 100 37 14 formula 100 x 10 / 27 100 x 10 / 68 37 x 10 / 100 14 X 10 / 98 factor 37.03 14.70 3.7 1.4
Calibracin Con un frotis teido con Whirtg o Giemsa, observar los eritrocitos con el micrmetro ocular medir cuantas lneas mide un eritrocito, anotar la medicin y multiplicar por el factor de multiplicacin del objetivo: Eritrocito: 4 unidades Objetivo: 100X Factor: 1.4 Medicin = unidades x factor Medicin = 4 x 1.4 = 5.6 = 6 um Buena calibracin
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2. Preparacin y fijacin de muestras fecales y Examen General de Heces

Introduccin Las muestras fecales deben llevarse al laboratorio lo ms pronto posible despus de obtenidas, pues los trofozitos pierden motilidad y las caractersticas morfolgicas en pocas horas. La putrefaccin por multiplicacin bacteriana, puede hacer que la muestra sea inadecuada despus de tiempo prolongado. Las muestras con ms de un da de obtenidas, favorecen la incubacin de algunos huevos de helmintos, lo cual dificulta su reconocimiento. Si es indispensable conservar la muestra para envi o examen posterior, se recomiendan los siguientes mtodos. Refrigeracin: es el mtodo ms sencillo y prctico, cuando la conservacin debe hacerse por algunas horas o por un da. El frasco con la muestra debe colocarse en el refrigerador a una temperatura de 4 oC, pero no en el congelador.
Preparaciones selladas en porta objetos: pueden hacerse con vaselina o barniz de uas, aplicados en los bordes del cubre objeto. Se obtienen preparaciones semi permanentes con el mtodo de la doble laminilla, que consiste en cubrir la muestra con una laminilla pequea sobre la cual se aplica blsamo y una laminilla de mayor tamao.
Formol o formalina: se mezcla una cantidad aproximada de 3 gr de heces fecales por cada 10 ml de formol o formalina diluidos al 5% o 10%. Este mantiene la muestra sin descomposicin, disminuye el mal olor y fija los parsitos para estudios posteriores. Con este mtodo se conservan bien los huevos de helmintos y los quistes de protozoos, no as las larvas y trofozitos.
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Reactivo de MIF (methiolate, iodo, formol): tiene doble utilidad, pues adems de fijar los parsitos, los colorea. Se prepara de la siguiente forma: Solucin madre Agua destilada Methiolate 1:100 250 ml 200 ml Lugol (se prepara cada 3 semanas) Cristales de iodo Ioduro de potasio Agua destilada 1.5 gr 4.0 gr 100 ml
Formol concentrado 25 ml Glicerina 5 ml
Se aconseja disolver primero el ioduro de potasio en agua destilada y luego agregar los cristales de iodo, agitando lentamente hasta que se disuelva; finalmente se filtra. El MIF se prepara mezclando 2.35 ml de la solucin madre con 0.15 ml de3 lugol fresco. Con la mezcla se pueden hacer dos tipos de preparaciones: Conservacin en frasco o portaobjeto. Se toma 1 gr de heces frescas, se coloca en un frasco de vidrio de boca ancha con tapn de rosca y se le agregan 10 ml de MIF; se mezclan con un aplicador o palillo se las heces son formadas y se agitan si son liquidas. Este material puede preservarse por un ao o ms. En porta objeto se utiliza colocando una pequea porcin de materia fecal; esta preparacin se cubre con lmina para verla al microscopio o se sella para estudio posterior.
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Reactivo de PVA (Alcohol Polivinilico): es una resina que se presenta como un polvo blanco, con los nombres comrciales de Elvanol o Gelvatol. Debidamente mezclado con un fijador es buen preservante para trofozoitos y quistes, los cuales conservan su morfologa por mucho tiempo. Con este mtodo es necesario hacer coloraciones para la identificacio9n de los parsitos, como hematoxilina frrica o coloracin tricromica. La preparacin del reactivo s hacer de la siguiente manera: Solucin saturada de cloruro de mercurio (Se obtiene mezclando 140 gr de la sustancia en cristales, con 1,000 ml de agua destilada. Se calienta y se mezcla; despus de fra se decanta y filtra) Alcohol etlico al 95 % Glicerina cido actico glacial 31.0 ml 1.5 ml 5.0 ml 62.5 ml
Mezclar y luego agregar 5 gr de alcohol polivinilico calentando 75 oC, hasta que la suspensin se aclare. Con ella se pueden hacer dos tipos de preparados: Preparacin en placa: se mezclan 3 gotas del fijador con un poco de materia fecal y se deja secar. Esta preparacin se puede guardar durante 2 meses para coloracin posterior. Conservacin en frasco: mezclar una parte de heces con 3 partes del fijador y se conserva tapado. De ah se hacen las preparaciones microscpicas para colorear despus de secas. Si se gelifica el contenido del frasco puede licuarse por calentamiento a bao mara.
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Examen General de Heces (EGH) Este examen nos gua o ms bien orienta cuando existe sospecha clnica de alguna enfermedad o infeccin de orinen parasitario, en el cual se evalan muchos aspectos, pero que principalmente consta de tres partes (macroscpico, qumico y microscpico), aunque en la mayora de laboratorios solamente se realiza el macroscpico y el microscpico. Examen macroscpico Este examen puede conducir al diagnstico de muchas alteraciones patolgicas del tracto gastrointestinal, de origen funcional o infeccioso, tales como ictericia obstructiva, mala absorcin, obstruccin rectosigmoidal, neoplasma, colitis ulcerativa, sangrado del tracto gastrointestinal, etc. Adems este examen puede revelar la presencia de parsitos macroscpicos. Por consiguiente, es esencial que al efectuar el EGH, se determinen plenamente las caractersticas del aspecto macroscpico de estas de modo que sea posible interpretar su significado clnico. En el examen macroscpico de las heces se determinan las siguientes caractersticas: consistencia, color, presencia de pus, mucus y sangre, as como tambin, la existencia de algunos helmintos. Consistencia: se evala en cuatro grados mediante los trminos: duras, pastosas, blandas y acuosas o diarreicas. Las heces de consistencia dura son producidas generalmente por estreimiento o constipacin. Las evacuaciones copiosas, serosas, sin material fecal observable sugieren una infeccin por clera u otra gastroenteritis bacteriana. Las distribucin de las formas evolutivas de los protozoarios intestinales tiene relacin con la consistencia de las heces; de tal modo que las heces ms liquidas contienen mayor cantidad de trofozoitos, mientras que la solidas contienen mayor cantidad de quistes. La distribucin y de los huevos y larvas de los helmintos tiene menos relacin con la consistencia de las heces.
Color: el color normal de las heces se debe a la estercobilina, que es un producto de la reduccin de la bilirrubina. Este es modificado por la ingestin de ciertos alimentos, frmacos o por alteraciones patolgicas del tracto gastrointestinal. El color amarillo de las
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heces de los nios alimentados con leche se debe a la excrecin normal de bilirrubina. El color verde que se observa algunas veces en las heces de los nios resulta de la bilirrubina excretada o por la presencia de bacterias cromognicas, en otros casos el color verde se origina por ingestin de vegetales ricos en clorofila, o puede deberse a la presencia de bilirrubina que ocurre en los pacientes que toman antibiticos. La heces de color arcilla y de aspecto voluminoso y espumoso son caractersticas de la esteatorrea, la ingestin de compuestos de bario para radiografas tambin producen heces de color arcilla. El sangrado abundante (ms de 50 ml) en las porciones superiores del tracto digestivo da a las heces un color negro (melena) y una consistencia de brea. Este color tambin puede ser causado por la ingestin de compuestos de bismuto, hierro o de carbn. El sangrado en las porciones inferiores del tracto digestivo (colon descendente, recto y ano) confiere a las heces un color rojo o produce estras sanguinolentas. La ingestin de remolachas o de bromosulfaleina tambin da a las heces un color rojo.
Olor: el olor caracterstico de las heces se debe principalmente a la presencia de indol y escatol. Tambin puede estar presente acido butrico, sulfuro de hidrogeno y metano. La intensidad del olor fecal depende de la actividad putrefactiva de las bacterias y la cantidad de protenas de carne. Un olor acido o rancio indica fermentacin de carbohidratos que no fueran digeridos o absorbidos, o cidos grasos no adsorbidos. La diarrea severa de nios y adultos producen un olor ftido o ptrido debido a la putrefaccin de alimentos no ingeridos. La degradacin bacteriana de la protena de la carne no absorbida llega al colon produce un fuerte olor ptrido las ulceraciones extensas y las lesiones malignas del colon descendente tambin producen un olor muy ftido.
Presencia de sangre: el sangrado gastrointestinal puede ser agudo o crnico, masivo o ligero, notorio u oculto y puede ocurrir en cualquier sitio desde las encas al ano. el sangrado gastrointestinal en individuos sanos, o su intensificacin en individuos con lesiones gastrointestinales, puede ser causado por drogas, especialmente por los salicilatos, esteroides, derivados de la rawolfia, idometacina y colchisina. Este efecto puede ocurrir aun cuando la droga se administre por va parenteral. La prdida de ms de 50 ml de sangre en las porciones superiores del tracto gastrointestinal confiere a las heces un color rojo
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oscuro o negro y una consistencia de brea o alquitrn. La persistencia de este aspecto de las heces por 2 o 3 das sugiere la perdida por lo menos de 1000 ml de sangre. El de las porciones inferiores del tracto digestivo produce un color rojo en las heces o la presencia de estras sanguinolentas. En estas heces la presencia de sangre debe confirmarse mediante pruebas qumicas apropiadas o microscopia para evitar cualquier confusin que resultara por sustancia o drogas que dan un color rojo a las heces. La prdida de pequeos volmenes de sangre no altera la apariencia general de las heces. A esta sangre se le llama sangre oculta y se detecta por mtodos qumicos. La deteccin de sangre oculta es de gran utilidad para descubrir o localizar precozmente procesos patolgicos del tracto digestivo. Esto es especialmente importante porque la mitad de los casos de cncer (excepto los de la piel) ocurren en el tracto digestivo y el diagnostico precoz y tratamiento de los pacientes con cncer de colon tiene un pronstico favorable.
Mucus: la presencia de mucus reconocible en las heces no es normal y debe reportarse en trminos positivo o negativo. Un mucus gelatinoso y traslucido adherido a la superficie de las heces sugiere una constipacin espstica o colitis mucosa. El mucus sanguinolento adherido a las heces sugiere la existencia de neoplasia o de procesos inflamatorios en el canal rectal. En los pacientes con colitis ulcerativa, disentera bacilar, carcinoma y ms raramente diverticulitis aguda o tuberculosis intestinal, las heces suelen presentar mucus asociado con pus y sangre, el los pacientes con adenoma velloso del colon, la cantidad de mucus evacuado es copiosa alcanzando hasta 3 o 4 litros en 24 horas.
Pus: en pacientes con disentir bacilar o colitis ulcerativa crnica frecuentemente se encuentra abundante pus en las heces. Esto ocurre tambin en pacientes con abscesos o fistulas que comunican con el recto sigmoideo o el ano. La pus que es observada en las heces debe de confirmarse mediante el examen microscpico. En los pacientes con gastroenteritis viral no se encuentra ningn exudado inflamatorio en las heces. Se reporta como positivo o negativo.
Bsqueda de Helmintos: mediante una inspeccin macroscpica de las heces pueden detectarse los helmintos macroscpicos tales como: scaris, uncinarias, tricocfalos,
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proglotides y esclex de Taenia, etc. Con un palillo aplicador revise minuciosamente las heces en busca de helmintos macroscpicos (larvas), si los encuentra extrigalos cuidadosamente y depostelas en un palto petri con solucin salina para su identificacin.
Cantidad y frecuencia: la cantidad de las heces y la frecuencia de evacuaciones dependen de la dieta ingerida y la motilidad intestinal. Normalmente la cantidad de heces evacuada es de 100 a 200 gr por da y la frecuencia es du una o dos evacuaciones diarias, sin embargo muchos individuo sanos pueden tener una frecuencia de una defecacin da de por medio o tres a la semana. La diarrea puede definirse como un aumento en la frecuencia y del contenido acuoso de las heces se ha establecido, como una regla clnica conveniente, que el estado de diarrea se produce cuando el contenido acuoso de las heces es mayor de 200 ml en un periodo de 24 horas. En trminos generales la diarrea es causada por cualquier condicin que aumenta el contenido acuosa de las heces. Estas condiciones pueden agruparse en dos categoras: a. Diminucin de la absorcin de agua en el intestino delgado b. Aumento se secrecin de agua en el tracto intestinal La disentera es un sndrome que se manifiesta sintomticamente por un aumento de la frecuencia de evacuaciones de pequeas cantidades de heces mucosas y sanguinolentas, caracterizadas por tenesmo, dolores abdominales y malestares generales.
Examen Qumico En esta parte del EGH se determinan aspectos como: pH, azucares reductores y sangre oculta (test de Guayaco). Con el fin de tener un diagnstico diferencial referente a las enfermedades gastrointestinales. pH: se mide con un papel indicador. Normalmente el pH es aproximadamente 7.0. en diarreas por bacterias invasivas, generalmente es acido (menor de 6.0); en diarreas de origen toxico, es neutro; en diarreas virales, siempre es acido. Tambin acido (5.0 o menor) en diarreas por intolerancia a la lactosa. La medida del pH no es vlida en pacientes que estn tomando antibiticos orales. Esta prueba junto al estudio de la
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reduccin de los azucares tienen mayor valor en la enfermedad diarreica aguda en nios menores de 5 aos.
Azucares reductores: son detectados por el reactivo de Benedict o con tabletas de Clinitest, ambos revelan la presencia de estos azucares sin diferenciarlos entre s. La glucosa fecal puede medirse con Diastix. Para las pruebas se emplea material fecal liquida o diluida, si es necesario. En caso de que la reaccin con Diastix sea negativa y la reaccin con Clinitest sea positiva hay una alta probabilidad de que la azcar presente, sea lactosa. Se ha encontrado que siempre hay presencia de glucosa y ausencia de lactosa en diarreas de origen bacteriano toxico, mientras que lo contrario se encuentra en las diarreas virales. En diarreas inespecficas las dos pruebas son negativas y en las bacterianas invasivas, los resultados son variables. La prueba de la lactosa positiva es tambin til en el diagnstico de diarrea por deficiencia de la enzima disacaridasa, que se presenta en nios alimentados al pecho, que no pueden desdoblar la lactosa, abundante en leche materna.
Sangre oculta: cuando la cantidad de sangre en materias fecales es muy pequea y no se observa macroscpicamente, puede detectarse mediante el uso de sustancias que reaccionen con los derivados de la hemoglobina, la cual es de tipo peroxidasa, adems bencidina, guayaco, ortotoluidina, etc. Que con perxido de hidrogeno producen una reaccin de color. Para mayor exactitud de las pruebas, se debe tener la precaucin de no ingerir carne roja durante los tres das previos al examen. La reaccin de la bencidina se hace aplicando un poco de materia fecal en un papel de filtro, agrando una cantidad muy pequea de polvo de bencidina, a lo cual se vierten unas gotas de cido actico glacial y de perxido de hidrogeno al 3% la reaccin positiva se evidencia por la aparicin inmediata de un color verde o azul. Para la prueba con guayaco, se prepara una solucin alcohlica de esta resina, la cual se utiliza en forma similar a la bencidina. La reaccin con tetra bencidina, utiliza reactivos comerciales en tabletas, como Hematest Bayer que es ms fcil de realizar. Las principales causas de error son: ingestin de carne cruda o mal cocida y otros alimentos como hgado, chorizos, etc. presencia de peroxidasa por ingestin de rbanos, coliflor y pepinos o por metablicos de origen bacteriano, terpia
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con hierro y vitamina C en cantidad mayor a 500 ml/da. Algunas partes de la materia fecal pueden no contener sangre y dar prueba falsa negativa. La prueba no es especfica para hemoglobina humana, pues es positiva con hemoglobina de animales y con sustancias que actan como peroxidasa, en caso de hemorragia detectan 6 mg de Hb por gramo de materia fecal, lo que equivale aproximadamente a 4 ml de sangre por 100 gr de heces fecales. Examen microscpico Este se realiza con el objetivo de buscar las formas parasitarias en la muestra tantos quistes y trofozoitos de protozoarios (flagelados y no flagelados) nematodos y cestodos. A. Con solucin fisiolgica o salina al 0.85%: esta constituye el medio ms adecuado para todos los estadios de los parsitos intestinales. En este tipo de preparacin los quistes y trofozoitos de los protozoarios y los huevos y las larvas de helmintos, pueden ser detectados con relativa facilidad, dependiendo de su cantidad en las heces. as como; huevos y larvas de
B. Con solucin de Lugol: aunque las diferentes formas parasitarias pueden ser identificados con mucha facilidad con la tcnica anterior, el uso de colorantes temporales ayuda mucho en la identificacin de los quistes de protozoarios, y huevos de nematodos y cestodos. Siendo de ms relevancia en la identificacin de los primeros. La solucin de lugol se usa en principio para teir estructuras de los mismos, por ejemplo; para teir y determinar el nmero de ncleos de los quistes, la solucin tambin teir las masas de glucgeno de los mismos. La concentracin de la solucin debe de ser adecuada, porque si se usa la solucin de lugol original, produce aglutinacin de las partculas fecales pequeas, lo que dificulta el estudio microscpico y si la solucin es dbil, probablemente no haya una buena tincin. Los ncleos de las formas tanto vegetativas como qusticas, son invisibles en las preparaciones con solucin salina. No obstante, esta solucin no es satisfactoria para colorear trofozoitos, porque distorsiona la morfologa total del organismo.
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Materiales: Muestra de heces Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1) Laminas cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm) Aplicadores de madera o palillos de dientes Solucin salina al 0.85% Solucin de lugol o solucin de Dobell y OConnor (diluida)
Tcnica: coloque un gota de solucin salina y otra de lugol sobre la lmina portaobjeto, con el aplicador, tome una pequea cantidad de heces (del tamao de un grano de arroz) y con movimientos circulares, suspenda una cantidad de heces y mezcle primero con la solucin salina y luego con el lugol, de forma que el preparado no quede muy espeso (deben verse caracteres impresos a travs de la preparacin). Cubrir el porta objetos con el cubreobjetos y mirar al microscopio.
Observacin: con el objetivo de 10X examine el preparado, recorriendo toda el rea de la lmina, luego use el objetivo seco de mayor aumento (40X), para observacin de detalles de los elementos parasitarios y sobre todo para identificacin de quistes y trofozoitos. Debe tenerse cuidado especial para no confundir los huevos de los nematodos y cestodos, con detritos animales y vegetales, clulas epiteliales, exudados celulares, glbulos rojos, hongos y algas microscpicas.
Ventajas: Simplicidad de ejecucin Permite el diagnstico preciso sin la necesidad de realizar otros mtodos Buena utilidad en el diagnstico de protozoarios intestinales.
Desventajas: Poca sensibilidad y especificidad debido a la carga parasitaria Inestabilidad de los rayos solares de la solucin de iodo
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Figura 5: Procedimiento en el montaje del examen microscpico en el EGH
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3. Generalidades sobre los principales parsitos intestinales

Los parsitos son organismos vivos; unos se ven a simple vista y otros necesitan de microscopio para su observacin. stos causan diferentes enfermedades, atacando diversos rganos y tejidos del cuerpo, dependiendo el tipo de parsito. La mayora de estos parsitos viven en los intestinos y varan de tamao; pero tambin pueden invadir otros rganos como hgado, corazn, cerebro. Existen diversidades de parsitos, entre los ms comunes tenemos:
Amebiasis (Entamoeba histolytica): los sntomas ms frecuentes son: disentera, fiebre, escalofros y diarrea sanguinolenta o mucosidades; a veces slo ocurre
malestar abdominal, leve diarrea con sangre y moco, alternndose con perodos de estreimiento. La transmisin es generalmente por agua contaminada con quistes provenientes de material fecal.
Giardiasis (Giardia lambia): este parasito ataca ms el intestino delgado superior. Los sntomas ms comunes son: clicos, diarreas, timpanismo (soplado), prdida de peso, fatiga, cada del cabello, etc. Se adquieren generalmente por agua contaminada y algunas veces por alimentos contaminados.
Ascariasis (Ascaris lumbricoides): se conoce como lombriz intestinal. Produce infeccin en el intestino delgado. Los sntomas son variados y a veces ausentes. Uno de los signos es la expulsin de lombrices por el ano, la boca y a veces por la nariz, cansancio, dolores abdominales, alteracin del sueo, trastornos digestivos y nutricionales. La transmisin es por la ingestin de huevos a travs de agua y alimentos contaminados con heces humanas, manos y uas sucias.
Uncinariasis (Ancylostoma duodenalis y Necator americanus): es una enfermedad crnica con sntomas vagos y variados, segn el grado de anemia causado por la succin de la sangre por estos gusanos.
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Oxiuriasis (Entorobius vermicularis): es una infeccin benigna con sntomas leves o no especficos. Puede causar prurito (picazn) anal, sueo, irritabilidad. la
transmisin es por los huevos infectantes que pueden ser de las manos a la boca del mismo paciente o a huevos huspedes o indirectamente a travs de prendas de vestir, ropa de cama, alimentos, etc.
Tricocfalosis (Trichuris trichuria): es una enfermedad infecciosa del intestino grueso. A menudo, la enfermedad no presenta sntomas; pero cuando la infeccin es grave, produce heces sanguinolentas y diarrea, y en ocasiones puede dar prolapso rectal. La transmisin es indirecta, no se transmite de una persona a otra sino a travs de la contaminacin del suelo, agua y alimentos contaminados, los cuales, al ser ingeridos por las personas, adquieren los huevos, los que se desarrollan en gusanos, fijndose en las mucosas del ciego del coln ascendente. Por la noche producen prurito perianal.
Teniasis (Taenia solium y Taenia saginata): estas producen la teniasis, que es una infeccin intestinal causada por la forma adulta; tambin producen la cisticercosis, ya sea la forma adulta o larvaria. Existen varias clases de Taenias, siendo las ms comunes: la Taenia solium, se adquiere al comer carne de cerdo mal cocida; los sntomas son: nerviosismo, insomnio, anorexia, prdida de peso y dolores abdominales. Los huevos pueden adherirse al intestino delgado y posteriormente las larvas pueden emigran a los tejidos donde se formaran los cisticercos. Las
consecuencias son graves cuando se alojan en ojos, corazn y cerebro. La Taenia saginata, es producida por la carne de res, al ingerirla cruda o mal cocida. Los sntomas son similares a los de la Taenia solium.
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Lamina 1: huevos de nematodos o helmintos (Ascaris)
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Lamina 2: huevos de nematodos (Ascaris, Trichuris, Uncinarias y larva de Strongyloides)
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Lamina 3: huevos de otros helmintos (Schistosoma spp)
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Lamina 4: huevos de otros helmintos y de cestodos (Taenia spp y Hymenolepis spp)
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Lamina 5: Protozoos intestinales, amebas (Entamoeba spp)
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Lamina 6: Amebas comensales
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Lamina 7: Protozoarios intestinales flagelados (Giardia lamblia)
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Lamina 8: Protozoos pocos frecuentes (Balantidiun coli) y artefactos
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Lamina 9: Coccidios y microsporidios intestinales
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Lamina 10: medidas de los huevos de cestodos y helmintos
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Lamina 11: trofozoitos amebianos y sus principales caractersticas morfolgicas
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Lamina 12: trofozoitos flagelados y sus principales caractersticas morfolgicas
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Lamina 13: quistes amebianos y sus principales caractersticas morfolgicas
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Lamina 14: principales caractersticas generales de coccidios y microsporidios intestinales
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Lamina 15: principales helmintos intestinales
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Lamina 16: principales artefactos y detritos en un examen general de heces
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4. Mtodos de flotacin y concentracin para el diagnstico parasitolgico

Mtodo de LARSH (mtodo de concentracin con sulfato de Zinc modificado, flotacin) Es una tcnica simplificada de flotacin en sulfato de zinc, que no requiere centrifugacin. De este modo el procedimiento requiere menos equipo de laboratorio y se efecta con mayor rapidez que le mtodo de Faust modificado y se obtienen resultados satisfactorio. Mediante el mtodo de Larsh al igual que con el de Faust, se logran concentrar huevos y larvas de helmintos y quistes de protozoarios. Sin embargo, no se obtienen huevos operculados ni huevos de Schistosoma. Materiales: Tapones o roscas de botellas plsticas de sodas limpias o estriles preferiblemente Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1) Laminas cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm) Palillos de madera Pipetas Pasteur con bulbo Solucin de sulfato de Zinc de una densidad de 1.18 (331 gr de ZnSO4 en 1000 ml de agua destilada) Solucin de lugol o solucin de Dobell y OConnor (diluida)
Procedimiento: 1. Con la solucin de sulfato de Zinc llene hasta la cuarta parte de su capacidad de la cajita circular 2. Con un aplicador tome de la muestra de heces una porcin del tamao de un guisante y homogencelo bien en la cajita con sulfato de zinc, hasta obtener una suspensin fina. Evite que se formen burbujas de aire. En caso de muestras diarreicas tomar un poco como la pipeta Pasteur 3. Llene la cajita hasta cerca del borde con la solucin de sulfato de Zinc. 4. Cubra cuidadosamente la boca de la cajita con el portaobjeto, el contacto de la superficie de la suspensin y del portaobjeto debe de ser completo. No deben de haber burbujas de aire ni debe de derramarse la suspensin. 5. Deje la preparacin en reposos por 15 minutos.
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6. Levante el portaobjetos rpidamente, en sentido vertical, sostenindolo siempre en posicin horizontal. De este modo se adhiere a la suspensin inferior una gota que contiene los parsitos. A continuacin invierta el portaobjeto rpidamente de manera que no resbale la gota. 7. Agregar una gota de lugol a la preparacin y cubrir con un cubreobjeto, luego examine la preparacin en el microscopio. Ventajas: Son mtodos utilizados cuando el EGH sale negativo, ya que aumenta la probabilidad de un diagnostico positivo Este mtodo recobra la muestra libre de detritos, lo cual facilita en tiempo de examinar la lmina.
Desventajas: No se recomienda para recobrar huevos pesados como los de trematodos y cestodos. La densidad de la solucin encoje y deforma las larvas en poco tiempo. Los trofozoitos se deforman o destruyen con la concentracin Este mtodo es mejor para quistes de protozoarios, que para huevos y larvas de helmintos.
Mtodo de WILLIS (mtodo de flotacin en salmuera, flotacin) El mtodo de flotacin en salmuera, es una tcnica muy simple y eficaz para concentrar huevos de helmintos, a excepcin de los huevos pesados como los operculados y de Schistosoma. Esta tcnica resulta especialmente til para concentrar huevos de Uncinarias. El mtodo de Willis no es adecuado para concentrar quistes de protozoarios puesto que estos se deforman considerablemente. Materiales: Tapones o roscas de botellas plsticas de sodas limpias o estriles preferiblemente Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1) Laminas cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)
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Palillos de madera Pipetas Pasteur con bulbo Solucin de lugol o solucin de Dobell y OConnor (diluida) Solucin saturada de cloruro de sodio
Procedimiento: 1. Con la solucin saturada de cloruro de sodio, llene la cuarta parte del tapn o rosca 2. Con el aplicador tome de la muestra fecal una porcin del tamao de un guisante y homogencelo bien en la solucin, hasta obtener una suspensin muy fina. Evite que se formen burbujas. 3. Llene la cajita hasta cerca del borde con la solucin saturada de cloruro de sodio. 4. Cubra cuidadosamente la boca de la cajita con el portaobjeto, el contacto de la superficie de la suspensin y del portaobjeto debe de ser completo. No deben de haber burbujas de aire ni debe de derramarse la suspensin. 5. Deje la preparacin en reposos por 15 minutos. 6. Levante el portaobjetos rpidamente, en sentido vertical, sostenindolo siempre en posicin horizontal. De este modo se adhiere a la suspensin inferior una gota que contiene los huevos de los helmintos (si los hay). A continuacin invierta el portaobjeto rpidamente de manera que no resbale la gota. 7. Agregar una gota de lugol a la preparacin y cubrir con un cubreobjeto, luego examine la preparacin en el microscopio.
Ventajas: Son mtodos utilizados cuando el EGH sale negativo, ya que aumenta la probabilidad de un diagnostico positivo Este mtodo recobra la muestra libre de detritos, lo cual facilita en tiempo de examinar la lmina.
Desventajas: No se recomienda para recobrar huevos pesados como los de trematodos y cestodos. La densidad de la solucin encoje y deforma las larvas en poco tiempo.
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Los trofozoitos se deforman o destruyen con la concentracin
Mtodo de Kato-Katz Es un mtodo de concentracin cuantitativo que se utiliza para el anlisis parasitolgico de las heces. Este mtodo, ha demostrado ser eficiente en la deteccin de huevos de helmintos tales como: Ascaris, Schistosoma, Uncinarias, Trichuris, Oxiuros, Strongyloides y Taenia.
Este tipo de mtodo tiene como ventajas que puede prepararse sobre terreno, conservarse en sajas para portaobjetos hasta ser examinadas, incluso, das o meses despus, cuando son conservadas a temperatura ambiente, en condiciones de laboratorio. Sin embargo este mtodo tiene una importante limitacin cuando se trata de diagnosticar infeccin Uncinarias, ya que los huevos de estos tienen una capa delicada y fina, por lo que pueden hacerse invisibles poco tiempo despus en ciertas condiciones de temperatura y humedad a causa del glicerol utilizado; por ello, se recomienda que las lminas sean examinadas hasta un mximo de 4 horas despus de la preparacin del frotis. El molde original de las lminas de Kato-Katz, est diseado para contener unos 42 gramos de heces, de forma que multiplicando el nmero de huevos contados por 24, se obtiene el nmero total de huevos por gramo de heces (hpg).
Materiales: Palillos de madera Esptulas de madera Telas de nylon (filtro) Placas perforadas Papel celofn con solucin Kato-Katz (solucin de glicerol y verde de malaquita) Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1) Papel toalla
Procedimiento: 1. Con ayuda del palillo tome una porcin de la muestra (cantidad aproximada a un grano de frijol) y colquela sobre papel toalla.
2. Deposite sobre las heces la tela de nylon y comprmala con ayuda de la esptula, lo que har que parte de las heces pasen atraves de la red. 3. Use otro lado de la esptula para recoger las heces que pasaron por la red y depostelo en el orificio de la placa perforada, que deber estar sobre una lmina portaobjetos, y comprima el orificio de las heces hasta llenarlo. 4. Pasar el borde de la esptula sobre la placa perorada para retirar el exceso de heces. Desechar la esptula y el filtro. 5. Levante la placa perforada inclinando inicialmente uno de los extremos de tal forma que quede sobre el portaobjetos un cilindro de materia fecal. Desechar la lmina perforada. 6. Como una pinza tome un trozo de papel celofn impregnado en la solucin de Kato-Katz y coloque la sobre un pedacito de papel toalla para secar el exceso. 7. Ponga el pedacito de papel celofn sobre el cilindro de heces e invierta la preparacin sobr una superficie lisa (lo ms adecuado es que sea de vidrio o azulejo) y haga presin con un tapn de hule, de manera que el material se distribuya unifrmente entre la lmina y el papel celofn. 8. Deslice suavemente el portaobjetos hacia un lado sujetando el papel celofn, de lo contrario este puede desprenderse. 9. Coloque la preparacin (con el celofn hacia arriba) sobre la mesa y deje reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos. 10. Pasado el tiempo de reposo, observe con lente de bajo poder y proceda al recuento, multiplicando por 23 el nmero de huevos contados, que corresponder al nmero de huevos por gramo de heces
En el recuento pueden influir diversos factores, entre ellos: Numero de parsitos: cuando mayor es el nmero de parsitos, menor ser el de huevos que producen las hembras. Edad del parasito: las hembras jvenes y las muy viejas producen menos huevos Variaciones estacionales Variaciones entre distintos das del peso de las heces producidas Calidad de la muestra fecal, por ejemplo: si se trata de heces duras o muy liquidas
Ventajas:
Fcil ejecucin Elevada sensibilidad til en el recuento de huevos de Shistoma. mansoni y en infecciones moderadas de algunos helmintos. Desventajas: No es apropiado para examinar muestras diarreicas Est contraindicado en la bsqueda de protozoarios intestinales y larvas se Strongyloides. stercolaris, puesto que estos se hacen difciles s de ver por la clarificacin. Figura 6: procedimientos del mtodo de Kato-Katz Mtodo de Graham o prueba de la cinta adhesiva Cuando existe sospecha clnica de una enterobiasis, la demostracin de los huevecillos o
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hembras adultas de Entorobius vermicularis, se realiza ms frecuente mediante el mtodo de Graham, prueba en la que los gusanos se identifican por su pequeo tamao (0.5 a 1 cm), su color blanquecino y su aspecto filiforme, que lo diferencia de otros nematodos, proglotides de cestodos, los cuales pueden encontrarse en la regin perianal o en las deposiciones. Los huevos atrapados en la cinta se caracterizan por ser translucidos con una cara plana y otra convexa, de 50 a 60 um en su dimetro mayor y contienen una larva en su interior. El EGH es de poco rendimiento en la enterobiasis, dadas las caractersticas biolgicas del parasito, por ello, se calcula que solamente 1 de cada 5 o 10 infectados por este parasito presenta huevecillos en sus heces. Materiales: Cinta adhesiva o tape Baja-legua Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1)
Procedimiento: 1. Coloque un trozo de cinta adhesiva de 1 a 2 cm de ancho, con la superficie adherente hacia arriba, en el extremo de un baja-lengua. 2. Efecte repetidos contactos de la cinta, alrededor de la regin perianal. Es conveniente haces este
procedimiento al despertar al paciente y antes del bao. 3. Adhiera la desengrasado 4. Observe al microscopio con lente de bajo poder. Figura 7: Mtodo de Graham cinta a un portaobjeto limpio y
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Mtodo de Ritchie (modificado) Si la muestra de heces contiene pocos parsitos, es posible que no se detecten en un EHG, as pues, siempre que sea posible, debe concentrarse la muestra. Los huevos y larvas de helmintos y los quistes de protozoarios pueden recuperase por concentracin. Pero los trofozoitos de protozoos no se vern, ya que este procedimiento suele destruirlos. Por este motivo es imprescindible el EGH como fase del estudio del estudio parasitolgico. El procedimiento de concentracin. El procedimiento de concentracin est indicado cuando el examen preliminar el EGH resulta negativo a pesar de los sntomas clnicos que indiquen la infeccin por parsitos del paciente, y para la deteccin de Schistosoma y Taenia. Materiales: Centrifuga Tubos de centrifuga Embudos Pipeta pasteur Aplicadores Formalina al 10% Acetato de etilo (ether etlico) Solucin salina
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Solucin de lugol o solucin de Dobell y OConnor (diluida) Laminas portaobjeto de vidrio limpias (3 x 1) Laminas cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)
Procedimiento 1. En un tubo de centrifuga colocar 8 ml de formalina al 10% y agregar aproximadamente 1gr de heces frescas o 3 ml de heces preservadas. 2. Agitar vigorosamente y dejar en reposo por 30 minutos 3. Resuspender el sedimento y filtre a travs de la gasa, recogiendo 7 ml del filtrado en un tubo de centrifuga, si el volumen es menor completar con formalina al 10% (8 ml) 4. Aadir al lquido filtrado 3 ml de acetato de etilo (en su defecto ether etlico) 5. Agitar 30 segundos y centrifugar a 3,000 rpm durante 15 min 6. Separar con cuidado de las paredes del tubo la interface que aparezca 7. Desechar todo el sobrenadante y mantener inclinado el tubo con la ayuda de dos hisopos, limpiar las paredes. Agregar al sedimento unas gotas de solucin salina. 8. Con una pipeta pasteur. Tomar unas gotas del sedimento y observar en lente de bajo poder. En caso de quistes adicionar una gota de lugol.
Tinciones especiales en parasitologa
Tincin de Wright: el colorante se prepara triturando en un mortero 1 gr del polvo, al cual se le agrega metanol, poco a poco, hasta llegar un volumen de 600 ml. Se filtra con papel filtro y se deja 3 das en una incubadora a 37 oC u 8 das a temperatura ambiente. El mtodo de coloracin consiste en cubrir el extendido con el colorante durante 3 min y luego agregarle agua destilada a pH de 6.7 o 7 o agua amortiguadora durante 5 minutos. Lavar con agua y dejarla secar. Luego observar en lente de 100X con aceite de inmersin y contar por campos el nmero de clulas mononuleadas (azules) y polimorfonucleares (rojas o violetas). Reportar nmero de clulas por campos observados.
Otras tinciones pero poco utilizadas en el diagnostico Hematoxilina frrica

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Cloracin tricromica Coloracin de Ziehl- Neelsen Isospora(mtodo de Kinyoun) modificada para Cryptosporidium, Cyclospora e
Referencias Bibliogrficas David B., Marcos R., Parasitosis humanas. 4ta ed. Pag 2-526, 2004
Universidad
Nacional
Autnoma
de
Nicaragua-len,
Departamento
de
microbiologa y parasitologa. Gua de laboratorios de parasitologa intestinal para la carrera de bioanalisis clnico 4to curso. Nlida GS., Manual prctico de parasitologa mdica. 1raed. Buenos Aires Argentina: Laboratorios Andromaco, 2002, 112 p; 23 x 17 cm. Organizacin mundial de la salud (WHO). Mtodos bsicos de laboratorio en parasitologa mdica. Pg. 1-76, 1992. Disponible en:
whqlibdoc.who.int/publications/9243544101_(part1).pdf MINSA, WHO, Rotafolio de prevencin de parsitos intestinales. Disponible en: www.paho.org/nic/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=661&ite mid=
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WHO, IRIS.Medios auxiliares para el diagnstico de las parasitosis intestinales, versin pdf. Disponible en: apps.who.int/iris/handle/10665/37331
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