Produccin industrial de penicilina

Metabolitos secundarios
1) No son esenciales para el crecimiento 2) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados qumicamente entre s. 3) La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea 4) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos ANTIBIOTICOS ANTITUMORALES: doxorubicina bleomicina zinostatin INHIBIDORES DE PROTEASAS:

leupeptina aprotinina INHIBIDORES DE LA SINTESIS DEL COLESTEROL: compactina lovastatina INMUNOSUPRESORES : ciclosporinaA FK506 (tracolimus)

ANTIBITICOS
INTRODUCCIN GRUPOS DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES APLICACIONES IMPORTANCIA ECONOMICA

CLASIFICACIN DE LOS ANTIBITICOS POR SU MECANISMO DE ACCIN: ANTIBITICOS QUE ACTAN SOBRE LA PARED CELULAR. ANTIBITICOS LACTMICOS MODO DE ACCIN ESTRUCTURA QUMICA BIOSNTESIS Y REGULACIN TECNICAS DE ESTUDIO DESARROLLO DE CEPAS MTODOS DE PRODUCCIN

INTRODUCCION
Los antibiticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioteraputicos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de produccin para la penicilina y al inicio de la era de investigacin sobre los antibiticos. En la actualidad continua siendo una de las reas ms importante de investigacin dentro de la Microbiologa Industrial.
1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos qumicos de sntesis como balas mgicas selectivas hacia microorganismos, pero inofensivas para las personas o animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsn es efectivo contra la sfilis. Acua el trmino quimioterapia. Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la accin del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el neumococo y otros estreptococos in vivo Woods descubre el mecanismo de accin de las sulfamidas. Estamos en plena Edad de oro de la Quimioterapia de sntesis. Fleming descubre la penicilina, el primer antibitico natural, pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria farmacutica se muestra "indiferente. Chain y Florey purifican la penicilina. Se usa en la 2 Guerra Mundial. Comienza la era de los antibiticos naturales Waksman, un microbilogo de suelos, ha iniciado una bsqueda de microorganismos productores de antibiticos. Descubre la estreptomicina. Comienza la poca dorada de los antibiticos (quimioterpicos naturales), y la bsqueda racional rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de Actinomicetos, otras bacterias y hongos.

1932-35 1940 1929 1940 1944

GRUPOS DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBIOTICOS Hongos filamentosos: Penicillium (penicilina) Aspegillus Acremonium (cefalosporina) Actinomicetos, familia Streptomycetaceae. Streptomyces (tetraciclina, eritromicina, estreptomicin Nocardia Micromonospora Familia Bacillaceae. Ej. Bacillus (bacitracina, gramicidina y polimixina)

INTRODUCCION
Los antibiticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos, solamente 10 de los antibiticos conocidos se producen comercialmente y solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y cido fusdico tienen importancia clnica. En las bacterias existen muchos grupos taxonmicos que producen antibiticos. La mayor variedad en estructura y nmero de antibiticos se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el gnero Streptomyces. La produccin mundial de antibiticos en 1979 estaba por encima de las 100.000 toneladas por ao. Las ventas brutas anuales, slo en USA, eran de 1000 millones de dlares, con la cefalosporina en la posicin de cabeza, seguida de la ampicilina y las tetraciclinas.

Porcentajes de produccin de diversas familias de quimioterpicos

CLASIFICACIN DE LOS ANTIBIOTICOS POR SU MECANISMO DE ACCIN

1.- Antibiticos que afectan a la pared celular: Bloquean la sntesis del peptidoglicano fosfomicina, cicloserina, bacitracina, vancomicina, beta-lactmicos 2.- Antibiticos que actan sobre la membrana plasmtica: Polipeptidicos: polimixina B Polienos: nistatina y la anfotericina B Agentes imidazlicos 3.- Antibiticos que acta sobre la sntesis de protena Actan sobre la transcripcin: Actinomicina y Rifamicina Actan sobre la traduccin: Aminoglicsidos (estreptomicina, kanamicina..etc), tetraciclinas, cloranfenicol y eritromicina. 4:- Antibiticos que actan sobre el DNA. Mitomicina, novobiocina, cido nalidixico.

INTRODUCCION
Los antibiticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones. Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioteraputicos para tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de produccin para la penicilina y al inicio de la era de investigacin sobre los antibiticos. En la actualidad continua siendo una de las reas ms importante de investigacin dentro de la Microbiologa Industrial. El nmero de antibiticos descritos contina aumentando debido a los programas intensivos de bsqueda en todos los pases industriales. En 1961 eran conocidos 513 antibiticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990 alrededor de 8000. Cada ao se detectan aproximadamente 300 nuevas sustancias con actividad antibitica, de las que el 30-35% son componentes secundarios de las fermentaciones de antibiticos conocidos. Del gran nmero de antibiticos conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producan por fermentacin en 1984. Adems, ms de 50 antibiticos se producan como compuestos semisintticos y 3 antibiticos (cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina) se producen en forma completamente sinttica.

PRODUCCION DE PENICILINAS

Los antibiticos -lactmicos son metabolitos secundarios Los antibiticos -lactmicos se caracterizan por poseer en su estructura el anillo -lactmico que est compuesto por 3 tomos de carbono y 1 tomo de nitrgeno. Los antibiticos lactmicos se pueden dividir en cinco clases diferentes: Penicilinas Clavamas Cefalosporinas Monobactamas Carbapenemas Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los ms efectivos de todos los agentes teraputicos usados en el control de las enfermedades infecciosas.

PRODUCCION DE PENICILINAS
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigacin en Oxford, bajo la direccin de Florey y Chain, la aisl a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicacin clnica de la penicilina se realiz en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Penicillium notatum
Placa de Petri sembrada con Staphylococcus aureus y contaminada con P. notatum

PRODUCCION DE PENICILINAS
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigacin en Oxford, bajo la direccin de Florey y Chain, la aisl a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicacin clnica de la penicilina se realiz en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Fleming

Chain

Florey

PRODUCCION DE PENICILINAS

Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +. Son lbiles en medio cido y pueden ser inactivadas por hidrlisis del anillo -lactmico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas grandes dosis de penicilina, solamente un pequeo porcentaje de pacientes desarrollan alergia (0,5-2%). Los antibiticos -lactmicos son inhibidores especficos de la sntesis de peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son anlogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos frmacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintticas y cefalosporinas tienen efecto tambin frente a Bacterias G -.

PRODUCCION DE PENICILINAS
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigacin en Oxford, bajo la direccin de Florey y Chain, la aisl a partir de cultivos de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicacin clnica de la penicilina se realiz en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos, particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.

Penicillium notatum
Sir Alexander Fleming, 1952
Photograph courtesy of Associated Press

1.- Estructura qumica

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6.

1.- Estructura qumica

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6.

SITIO DE ACCIN DE LAS PENICILINAS

2.- Biosntesis y regulacin

El anillo -lactmico-tiazolidnico de la penicilina se produce a partir de L-cistena y Lvalina. La biosntesis se produce por medio de un dipptido compuesto de cido L-a-aminoadpico (L-a-AAA) y L-cistena. Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reaccin de epimerizacin, dando lugar a la formacin del tripptido d-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclacin del tripptido que puede ser aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioqumicas que conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio de L-a-AAA (L-a-aminoadpico) con cido fenilactico activado. El 6APA, que no es un producto intermediario de biosntesis, se excreta en ausencia de un precursor de la cadena lateral.

Metabolito secundario

2.- Biosntesis y regulacin

Ruta de produccin de penicilina en Penicillium chrysogenum

2.- Biosntesis y regulacin

SNTESIS DE PENICILINA G Ruta de produccin de penicilina en Penicillium chrysogenum

2.- Biosntesis y regulacin

Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosntesis de la penicilina. El aminocido lisina es sintetizado a partir de la va que origina el cido L-a-aminoadpico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta biosinttica ramificada comn. La lisina inhibe la sntesis de penicilina debido a que inhibe por retroalimentacin a la homocitrato sintasa, un enzima implicado en la sntesis de L-a-AAA. Si el L-a-AAA es deficiente, no puede sintetizarse penicilina. Sin embargo, la retrorregulacin por lisina no parece ser una etapa limitante en la biosntesis de penicilina. La biosntesis de penicilina se ve afectada por la concentracin de fosfato y tambin muestra una clara represin catablica, particularmente por glucosa.

2.- Penicilinas naturales, semisintticas y biosintticas

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA), que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El 6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6. Si la fermentacin de penicilina se lleva a cabo sin adicin de precursores de la cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla solamente es til teraputicamente la bencilpenicilina; los otros compuestos deben ser eliminados durante la etapa de recuperacin del producto. La fermentacin puede ser controlada mejor aadiendo un precursor de la cadena lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Ms de 100 penicilinas biosintticas han sido producidas de esta forma. En los procesos comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas la penicilina G y la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O. Utilizando el cido fenoxiactico, como precursor de la cadena lateral, se consigui la obtencin de penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es particularmente estable en medio cido y que puede, por tanto, suministrarse por va oral al contrario de lo que ocurre con la penicilina G ya que debido a su sensibilidad a los cidos no se puede administrar oralmente puesto que es hidrolizada en el estmago.

PRODUCCION DE PENICILINAS

2.- Penicilinas naturales, semisintticas y biosintticas

A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintticas incluyen diversas penicilinas obtenidas al aadir qumicamente una gran variedad de cadenas laterales al cido 6-APA. Penicillium chrysogenum puede sintetizar este cido si el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la produccin de 6-APA en estas condiciones es tan pequea que hace inviable este procedimiento. La deacilacin qumica tampoco es rentable pues este proceso comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura y en condiciones anhidras estrictas, requirindose adems varios solventes qumicos. Por estas razones, la produccin industrial del 6-APA necesario para la fabricacin de penicilinas semisintticas se realiza por deacilacin enzimtica de la penicilina G. Este proceso biolgico se basa en la produccin por ciertas bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilacin se realiza en H2O a 37C, lo que reduce considerablemente los costes. Despus de la deacilacin se obtiene una solucin de sales sdicas del cido fenilactico y 6-APA. El fenilactico recuperado se puede utilizar posteriormente para la produccin de penicilina G. Debido a sus mejores caractersticas (estabilidad a la acidez, resistencia a -lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las penicilinas semisintticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia. Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43% como material de partida para la produccin de penicilinas semisintticas.

2.- Penicilinas naturales, semisintticas y biosintticas

Modificaciones de las Penicilinas

NATURAL PENICILLINS

2.- Penicilinas semisintticas

3.- Desarrollo de cepas y de tcnicas de cultivo

La produccin de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un ttulo de penicilina de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde 0,0012 g/l hasta 50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de seleccin de cepas. Los primeros procesos para la produccin de penicilina implicaban el crecimiento de Penicillium notatum sobre la superficie de un medio lquido (Czapek-Dox-glucosa). El perodo de incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la penicilina se extraa con solventes previa separacin del micelio

3.- Desarrollo de cepas y de tcnicas de cultivo

La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era ms adecuado para la produccin en cultivo sumergido que la cepa original, Penicillium notatum.

P. Chrysogenum permiti trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente de carbono y energa, y agua de macerado de maz (corn-steep liquor) como fuente de nitrgeno.
Mediante posterior mutagnesis fue aislada la cepa WisQ176, la cepa original de la lnea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fue adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fue utilizada como cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas, acerca de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los aumentos de rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las cepas, tambin han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre la fermentacin y la eficiencia de recuperacin del producto.

Desarrollo de cepas
0,07g/l

Mtodos clsicos: obtencin de mutantes

0,55g/l
Penicillium notatum (Fleming)

2 u/ml 85.000 u/ml

7g/l

3.- Desarrollo de cepas

Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a travs del screening emprico de mutantes. Hasta mitad de los aos 60 los mutgenos utilizados ms frecuentemente eran los rayos X, mostaza nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Ms recientemente han sido utilizados como mutgenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y los nitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la mutacin haba alcanzado su lmite. El descubrimiento de un ciclo parasexual en Penicillium chrysogenum proporcion una forma de utilizar la recombinacin gentica para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigticos que tenan ttulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales. Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con produccin superior de penicilina se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de diferentes lneas. La tcnica de fusin de protoplastos abri un nuevo enfoque en el desarrollo de cepas de alta produccin obtenindose rendimientos del 8% superiores a los obtenidos por mutacin y seleccin. Adems, algunas de las cepas resultantes han tenido mejores caractersticas de crecimiento, como esporulacin ms estable y mejor crecimiento para la produccin del inculo. El uso de la ingeniera gentica para aumentar la sntesis de enzimas que catalizan pasos limitantes, mediante la amplificacin gnica o mejora de la transcripcin, no ha sido todava posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de datos biosintticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vector-hospedador. Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformacin

4.- Mtodos de produccin

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el suministro de oxgeno no pueden ser empleados tanques mayores. La fermentacin de penicilina es un proceso aerbico con una velocidad de absorcin volumtrica de oxgeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de aireacin requerida est entre 0,5-1,0 volmenes de aire (volumen de lquido)-1 min-1 dependiendo de la cepa, del biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura ptima es de 25-27C. En un esquema tpico de produccin de penicilina el inculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad de las cepas de alta produccin, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las cepas. La concentracin de esporas (ptima 5x103/ ml) y la formacin de agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir una velocidad ptima de formacin de penicilina, los agregados (pellets) no deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta. Despus de varias etapas de crecimiento est preparado el cultivo de produccin. En la fermentacin tpica de penicilina existe una fase de crecimiento de unas 40h con un tiempo de duplicacin de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la masa celular. El suministro de oxgeno es crtico en el cultivo en crecimiento ya que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxgeno. Despus de la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de produccin de penicilina. Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de produccin puede extenderse hasta 120-160h.

4.- Mtodos de produccin

El medio de un cultivo tpico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y generalmente consiste en: Lquido de maceracin de maiz (4-5% peso seco). Una fuente de Nitrgeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero. Una fuente de carbono, lactosa. Varios tampones El pH se mantiene constante a 6,5. El cido fenilactico o el fenoxiactico se alimentan continuamente como precursores (0,5-0,8% del total). Los procesos con alimentacin de glucosa o melazas tambin tienen xito. En estos casos las velocidades de alimentacin son de 1.0-2.5 kg*m-3*h-1, con una concentracin de glucosa de 500 kg*m-3. Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el mantenimiento energtico, el 25% para el crecimiento y slo el 10% para la produccin de penicilina.

4.- Mtodos de produccin

4.- Mtodos de produccin

La principal fuente nitrogenada empleada hasta la dcada del 70 fue "corn steep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibitico probablemente al suministrar compuestos como aminocidos, factores de crecimiento, precursores de la cadena lateral, adems de elementos trazas. Sin embargo, dada la variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suministro, y tambin debido a la introduccin de precursores especficos de la cadena lateral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la harina de semilla de algodn, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embargo en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o ms caros.

4.- Mtodos de produccin

Produccin de penicilina (x) en cultivos discontnuos. La variacin en biomasa se representa con punto negros

4.- Mtodos de produccin

En 1976 se demostr la importancia de un suministro continuo de amonio (por alimentacin con (NH4)2SO4), que permitiese mantener niveles del mismo de aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificando la relacin nitrgeno/carbono en la alimentacin, se comprob que cuando el cultivo estaba limitado en nitrgeno cesaba la produccin de penicilina, la cual se restableca al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandes cantidades de NH4+ podra reflejar su necesidad para la sntesis de glutamato, el cual es requerido para producir valina y cistena. El azufre se incorpora como (NH4)2SO4 y con la fuente de nitrgeno orgnica (extractos, peptona). El fsforo en forma inorgnica se adiciona como sales de fosfato y se aconseja mantener su concentracin entre 250 y 500 mg l-1 con alimen tacin continua. Adems se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" es una fuente importante de fsforo. Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicialmente, o bien por alimentacin en los medios, una cantidad relativamente grande de precursor. El requerimiento terico de fenilacetato sdico, es 0.47 g g-1 de penicilina G cida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V cida.

4.- Mtodos de produccin

Produccin de penicilina (x) en cultivos discontnuos. La variacin en biomasa se representa con punto negros

4.- Mtodos de produccin

Se ha intentado la produccin de penicilina por fermentacin continua, pero ha sido difcil debido a la inestabilidad de las cepas de produccin. Como alternativa se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar (feed batch). En este procedimiento el 20-40% del contenido de la fermentacin se saca y se reemplaza con solucin fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin reduccin del rendimiento.

4.- Mtodos de produccin

Actualmente la extraccin con solventes es la base para la separacin y purificacin de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del medio de cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objeto de disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extraccin posteriores. Las penicilinas G y V son cidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas cidas son solubles en muchos solventes orgnicos y se pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extraccin se puede realizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrfugos en etapas mltiples, a temperaturas de 0 - 3 C. Otra posibilidad es el empleo de mezcladores estticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inversin. Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan en medio cido con una cintica de primer orden a una velocidad proporcional a la temperatura y recproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en condiciones de eficiente extraccin en medio cido sea muy reducida. Sin embargo como la forma V en tales condiciones es ms estable que la G, si el objetivo es obtener 6-amino penicilnico (6-APA) la produccin de penicilina V es ms aconsejable.

4.- Mtodos de produccin

La extraccin de penicilina se puede realizar en una o ms etapas sucesivas, con una acidificacin del caldo filtrado con H2SO4 o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizndose la extraccin y concentracin en extractores centrfugos. Dependiendo de las especificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratar con carbn para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmente no se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientos obtenidos. La cristalizacin se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo los valores crticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concentracin de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalizacin a partir de un solvente se requiere tambin un exceso de Na+ o K+ , siendo los cristales recuperados en un filtro rotatorio a vaco. Estos cristales son lavados y presecados con un solvente voltil que tambin separa impurezas coloreadas. El secado definitivo se puede realizar con aire caliente, vaco o calor radiante. La penicilina cristalina G o V as obtenida puede ser empleada como tal o como intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas semisintticas, cuidando en todos los casos que los productos debern tener un grado farmacutico. El cido 6-APA puede ser obtenido por va enzimtica (penicilinacilasa) o qumica; sin embargo todas estas etapas escapan al alcance de esta monografa, por lo tanto se remite al lector interesado a la bibliografa.

4.- Mtodos de produccin

Se est llevando a cabo una intensa investigacin para producir penicilina con clulas inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostr la ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero esta tcnica no ha sido introducida todava a nivel comercial. La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio. Despus de la separacin del micelio, la recuperacin del producto se lleva a cabo por medio de dos etapas de extraccin continua en contracorriente del caldo de fermentacin con acetato de amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0. El rendimiento es de alrededor del 90%.

Proceso de produccin de penicilina

Fuente de N2: lquido de maceracin de maz Fuente de carbono: lactosa pH: 6,5-7,7 cido fenilactico

40.000-200.000 litros

Acetato de amilo 0-3C, pH 2,5

5x 103 /ml

proceso aerbico (vvm, 0,5-1) impulsores de tipo turbina para el mezclado

Medio alcalino cristaliza

APLICACIONES 1) Como agentes quimio-terapeticos. 2) Antibiticos utilizados en patologa de plantas. 3) Antibiticos usados para aumentar el crecimiento de los animales en veterinaria. 5) Antibiticos usados como herramientas en bioqumica y en biologa molecular. IMPORTANCIA ECONOMICA Aproximadamente 30000 toneladas/ao.24 billones de $ Debe continuar la bsqueda de nuevos antibiticos?

INHIBIDORES DE LA SINTESIS DEL COLESTEROL

Compactina (Penicillium) Lovastatina (Aspergillus)
HMG CoA HMG CoA Reductasa Mevalonato Geranil PP Farnesil PP Escualeno CH3 Colesterol Estatinas

INMUNOSUPRESORES
CiclosporinaA FK506 (tracolimus)

Actan sobre el DNA (Actinomicina)

Transcripcin Antibiticos que inhiben la sntesis de protenas Traduccin

Iniciacin, elongacin y terminacin

Actan sobre RNA polimerasa (Rifamicina)

Actan sobre la subunidad 30S (Aminoglicsidos y Tetraciclinas) Actan sobre la subunidad 50S (Cloranfenicol y Eritrocicina)

PARED CELULAR GramGram+

Antibiticos que afectan a la pared celular

Los aminoazcares son de dos tipos N-acetylglucosamina (NAG) y su pariente cido N-acetylmuramic acid (NAM).

INTERIOR

EXTERIOR

autolysins

Antibiticos que afectan a la membrana plasmtica

Polimixina B

(6, metil octanoico)

Efecto detergente

Antibiticos que afectan a la membrana plasmatica

Anfotericina B

La anfotericina B forma complejos con los esteroles de la membrana y crea poros causando alteraciones en la permeabilidad

Ketoconazol, fluconazol Afectan a la ruta de biosntesis del ergosterol, inhiben a la esterol-14-alfa-desmetilasa

Antibiticos que inhiben la sntesis de proteinas: Transcripcin

Actinomicina D

Rifamicina, R= H Rifampicina, R=

Antibiticos que inhiben la sntesis de proteinas: Traduccin

Inhibidores de la sntesis de protenas a nivel de la subunidad 30S

AMINOGLICSIDOS
5 4 3 2 6 1

Estreptomicina Tobramicina Amicacina Gentamicina

Streptomyces Micromonospora

TETRACICLINAS

Tetraciclina Aureomicina Doxiciclina

Antibiticos que inhiben la sntesis de proteinas: Traduccin

Inhibidores de la sntesis de protenas a nivel de la subunidad 50 S

Cloranfenicol

Antibiticos que inhiben la sntesis de DNA

Mitomicina

Se une a la subunidad Beta de la DNA girasa

Novobiocina

Antibiticos -lactmicos: Estructura qumica

anillo lactmico ncleo 6-APA 6-aminopenicilnico

anillo tiazolidinico

ncleo 7-ACA 7-aminocefalospornico anillo lactmico anillo dihidrotiazinico

Antibiticos -lactmicos:
Penicillium chrysogenum

Especies productoras de los principales grupos de antibiticos -lactmicos

Ncleo -lactmico Penam Estructura Hongos Aspergillus Penicillium Epidermophytum Trichophyton Acremonium Anixiopsis Arachnomyces Spiroidium Scopulariopsis Streptomyces Nocardia Flavobacterium Xantomonas Lysobacter Bacterias Gram (+) Gram (-)

s
O N

Cefem

s
O N

o
Clavam Streptomyces

O
Carbapenem

N
Streptomyces Serratia Erwinia

O
Monobactam

N
Nocardia

NH

Pseudomonas Gluconobacter Chromobacter Agrobacter Acetobacter

Transpeptidacin

+ penicilina

Resistencia a vancomicina en enterococos, genes vanHAX

Penicillin G o V Penicillin acylase (E. coli)

H2N

+ R-COOH

6-aminopenicillanic acid

Desarrollo de cepas
Clsico. Mutagnesis utilizando rayos X, mostazas nitrogenadas, rayos u.v, EMS. Tras la mutagnesis: 1- Se evala la actividad antibacteriana de los mutantes (BSQUEDA) 2- Se efecta el proceso de preseleccin de mutantes como paso previo a la evaluacin de la produccin (SELECCIN). 2-1. En la resistencia al propio antibitico producido. 2.2. En la bsqueda de superproductores de precursores. 2-3. Seleccin de mutantes resistentes a iones metlicos pesados 2-4. Destoxificacin selectiva

Recombinacin gentica: se utiliza para traspasar funciones de una cepa a otra Recombinacin parasexual. Fusin de protoplastos.

Procesos parasexuales:
Procesos no meiticos en clulas vegetativas que conducen a recombinacin FUSION PARASEXUAL: recombinacin mittica
Penicillium

(10-3)

(10-6- 10-7)

FUSION DE PROTOPLASTOS: permite mezclar el material gentico de cepas que no poseen sistemas naturales de recombinacin

Mejora de la produccin de antibiticos lactmicos mediante ingeniera gentica

*Mutagnesis dirigida *Aumento de la dosis gnica de enzimas biosintticas de pasos limitantes *Produccin biosinttica de nuevos antibiticos *Expresin heterloga de genes en hongos filamentosos

La Cefalosporina C fue descubierta en el hongo Acremonium chrisogenum. Tiene actividad contra bacterias Gram (-) y es ms estable que la Penicilina G frente a las penicilinasas

Acremonium

Biosntesis de penicilinas y cefalosporinas

penicilinas

cefalosporinas

ACV

*Produccin ACV anlogo biosinttica de nuevos antibiticos

Conversin de la Cefalosporina C a 7-ACA

(D- amino acid oxidase)

Cefalosporinas
Primera generacin Segunda Generacin (cefamicina)
Oral Cefuroxime (Ceftin) Cefacor (Ceclor) Cefprozil (Cefzil) Ceftibutin (Cedax) Cefpodoxime (Vantin) IV Cefamandole Cefonocid Cefuroxime Cefoxitin Cefotetan Cefmetazole

Tercera generacin

Cuarta generacin
Oral Cefpirome IV Cefepime (Maxipime)

Oral Cephalexin (Keflex) Cephradine (Velosef) Cefadrosil (Duricef) IV Cefazolin Cephalothin Cephapirin Cephradine

Oral Cefixime (Suprax) Cedinir (Omnicef) IV Ceftazidime Cefoperazone Ceftriaxone Cefotaxime Ceftizoxime

Cefepime

Cefoxitina (cefamicina)

Biosntesis de penicilinas y cefalosporinas

(L)

penicilinas
(D)

En Acremonium

En Streptomyces

Agrupamiento de genes implicados en la biosntesis de antibiticos -lactmicos en varios organismos fngicos y procariotas

Aspectos evolutivos relacionados con la biosntesis de Penicilinas y Cefalosporinas

El % de identidad entre la ACV Sintetasa, IPN Ciclasa, Cef E y Cef F, de bacterias con las protenas homologas en eucariotas es del 57-60%. Este porcentaje es mayor que el encontrado entre otras protenas muy conservadas, como enzimas del metabolismo primario. Se ha sugerido una posible transferencia horizontal de la ruta biosinttica de antibiticos lactmicos desde organismos procariticos hasta los eucariotas. Se estima que la transferencia debi ocurrir hace 370 millones de aos Esta teora esta apoyada por la ausencia de intrones en el gen pcbAB (11KB), pcbC y cef EF, mientras que genes especficos ausentes en los clusters bacterianos pero presentes en hongos productores de penicilinas y cefalosporinas como penDE, cefG, cef D1 y cef D2 , contienen intrones. Otro dato a favor de esta teora es la funcionalidad de las secuencias promotoras de los genes pcbAB de A. chrysogenum en un organismo procaritico como E. coli. CONSECUENCIAS. A partir de entonces los hongos podran competir con las bacterias de su entorno usando un arma a la que ellos mismos no son sensibles

Anlisis de cepas industriales

En muchas de las cepas industriales que se utilizan actualmente han ocurrido fenmenos de amplificacin gnica.

5-6 copias 14 copias

Secuencia especfica de recombinacin TTTACA

Bsqueda de nuevas molculas

*Uso de cepas de bacterias hipersensibles a lactmicos pero no a otros antibiticos * Para buscar molculas de la familia de la Vancomicina se inmoviliza el dipptido D-ala-Dala en una columna de afinidad por la que se pasa un extracto *La adicin de D-ala-D-ala a las placas de prueba revertir la accin de antibiticos de la familia de las Vancomicinas *Mutasntesis, es el empleo de mutantes bloqueados en un paso a los que se aaden distintos compuestos utilizables por la siguiente enzima de la ruta

Mutasntesis

Precursor natural

Bloqueo

Precursor anlogo

Antibitico Anlogo Antibitico natural