Esputo Inducido El esputo inducido se obtiene a travs de la inhalacin de soluciones hipertnicas de cloruro sdico (3%) con un nebulizador ultrasnico.

Con ello se produce la acumulacin de lquido en las vas respiratorias bajas y un efecto irritante que estimula la tos y la consiguiente expectoracin de contenidos broncoalveolares. En pacientes con infeccin por el VIH la sensibilidad de esta tcnica llega hasta el 70% de las ocasiones. Los principales inconvenientes son que no todos los pacientes colaboran adecuadamente en su obtencin y que hay pocos hospitales que cuenten con un nebulizador ultrasnico para su induccin. Un riesgo aadido, especialmente en las unidades que atienden a pacientes con infeccin por el VIH, es que en realidad el cuadro clnico del enfermo sea una tuberculosis en lugar de una PCP. En el caso de la primera, al inducir el esputo se corre el riesgo de producir partculas de aerosol contaminadas con Mycobacterium tuberculosis, con el consiguiente compromiso para los dems pacientes o el personal sanitario que los atiende. Antes de la obtencin del esputo inducido es muy importante que el paciente se haya cepillado los dientes y la lengua vigorosamente con un cepillo dental, seguido de un intenso enjuague durante 5-10 minutos antes de la induccin. El esputo obtenido suele ser mucoide, translucido y no purulento. La muestra se debe fluidificarse con agentes mucoliticos , como el ditioeritritol o la N-acetil-L-cistena, acompaada de agitacin continua a una temperatura de 35C y con aplicacin intermitente de agitacin, hasta que este completamente licuado. Posteriormente centrifugar a 3000 g durante 5 minutos. Sin este proceso de licuefaccin, la sensibilidad del esputo inducido es menor. Por otra parte, la licuefaccin disgrega los grupos de P.jiroveci de la muestra, hacindolos ms difciles de diferenciar de levaduras de tipo Candida, y se afecta la adhesividad de la muestra al portaobjetos, por lo que la fijacin a 60C de las preparaciones, previa a la tincin, debe ser prolongada hasta 30 minutos. Lavado broncoalveolar La prueba que puede considerarse el mtodo de referencia en el diagnstico de la PCP es el LBA obtenido mediante broncoscopia. Es la tcnica que tiene mayor sensibilidad, pero su principal inconveniente es la dificultad de su realizacin. Ademas de requerir la colaboracin de los servicios de neumologa, no todos los pacientes pueden ser sometidos a esta tcnica, especialmente aquellos con hipoxemia intensa. A pesar de ello, permite establecer el diagnostico microbiolgico hasta en un tercio de los pacientes con sospecha de PCP y en los que el esputo inducido no dio ningn resultado. Desde el punto de vista microbiolgico, el LBA no requiere fluidificacin. La muestra se concentra mediante centrifugacin a 3000 g durante 15 minutos y el sedimento se reconstituye con 0.5-1 mL de suero salino aunque tambin puede concentrarse con la utilizacin de una citocentrifuga. Aspirados/lavados nasofarngeos (LNF)

El lavado nasofarngeo (LNF) constituye una muestra que durante los ltimos aos ha ido ganando aceptacin en la deteccin de P.jirovecii. Aunque estas muestras tienen un escaso rendimiento en la realizacin de tinciones microbiolgicas clsicas, han demostrado gran utilidad en la deteccin de DNA de P.jirovecii mediante tcnicas de PCR. El LNF se obtiene de la misma forma que para los estudios virolgicos directos, utilizando suero salino o PBS y un catter de succin. Identificacin microscpica Tcnica de impregnacin argntica: que usan metenamina argntica. Permiten la observacin de otros hongos lo que puede ser una ventaja, pero dificultan la diferenciacin de P.jirovecii de otras levaduras tipo Candida. Solo tie la pared de las formas qusticas y no su contenido o las formas troficas. Es un mtodo muy sensible. La tincin de Gomori-Grocott requiere un tiempo prolongado, pero se han descrito varias modificaciones que, aumentando la temperatura de la fase de impregnacin, permiten la tincin en un tiempo de una hora aproximadamente. El mayor problema de esta tincin es la inestabilidad de las soluciones utilizadas. De forma caracterstica, P.jirovecii presenta pliegues y no tiene las gemaciones tpicas de las levaduras tipo Candida, lo que permite su diferenciacin. Azul de Toluidina O: Tie la pared de los quistes y no su contenido ni las formas troficas. Es ms rpida que la anterior, pero requiere que las muestras sea muy limpia. Las levaduras se tien de forma similar a las formas qusticas de P.jirovecii, y es necesario el diagnostico diferencial. Calcoflr blanco: Es una tincin muy sencilla y rpida(menos de 5 minutos), pero requiere microscopia de fluorescencia para su visualizacin y un observador experto para diferenciar P.jirovecii de otras levaduras, ya que la morfologa no es tan ntida y reconocible como en las tinciones argnticas o en las basadas en el azul de toluidina. Tecnicas basadas en la inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales: Solventada el problema de especificidad del calcoflr. La tincin es rpida (30 minutos), pero los reactivos son caros. El aspecto de la tincin depende de los anticuerpos monoclonales utilizados. En general, los anticuerpos que reconocen estructuras de las formas troficas tienen mayor sensibilidad, pues estas formas son ms numerosas que los sacos de esporas (quistes) en las muestras clnicas. Reviste gran importancia el proceso de fijacin de la muestra y se deben seguir las instrucciones del fabricante del anticuerpo monoclonal. Tincin de Giemsa y modificaciones rpidas: Tie el contenido de las formas qusticas y las formas troficas, pero no las paredes de las formas qusticas. Requieren mucha experiencia por parte del microscopista o se pierde sensibilidad. Tincion de Gram-Weigert y sus modificaciones: Es una tincin rpida. Fundamentalmente tie el contenido de las formas qusticas. Tambien requiere mucha experiencia por parte del observador