0 UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA REABILITAO

Vanessa Christina Santos Pavesi

EFEITO DA CRIOLESO NO REMODELAMENTO DA MATRIZ EXTRACELULAR EM MSCULO ESQUELTICO DE RATO

So Paulo, SP 2008

1 UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA REABILITAO

Vanessa Christina Santos Pavesi

EFEITO DA CRIOLESO NO REMODELAMENTO DA MATRIZ EXTRACELULAR EM MSCULO ESQUELTICO DE RATO

Dissertao apresentada

de

Mestrado Universidade

Nove de Julho, para obteno do ttulo de Mestre em Cincias da Reabilitao.

Orientadora: Profa. Dra. Manoela Domingues Martins Co-orientadora: Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita Ferrari

So Paulo, SP 2008

Pavesi, Vanessa Christina Santos. Efeito da criolesao no remodelamento na matriz extracelular em msculo esqueltico de rato. / Vanessa Christina Santos Pavesi. So Paulo : 2008. 78f. Dissertao (Mestrado) Universidade Nove de Julho, 2008. Orientador: Profa. Manoela Domingues Martins. 1. Remodelamento muscular. 2. Matriz extracelular. 3. Colgeno IV. I. Martins, Manoela Domingues. CDU 612

Dedicatria
Aos meus filhos Jos Fernando e Maria Jlia, sem sua colaborao e compreenso a mame no teria conseguido.

Agradecimentos
A Deus que se fez sentir presente em todos os momentos.

Aos meus pais Jos e Ftima, por todo apoio, carinho, amor e compreenso. Muito obrigada por tudo.

s minhas irms, Andressa e Talissa, por no me deixarem nunca desistir dos meus objetivos.

minha querida orientadora e amiga Profa. Dra. Manoela Domingues Martins, pessoa admirvel, a quem devo toda a minha trajetria acadmica, aprendi a amar a pesquisa graas ao seu exemplo de competncia e ao seu estmulo.

minha co-orientadora e amiga Profa. Dra. Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari, profissional e pessoa incrvel, agradeo por toda dedicao e pacincia.

s minhas queridas, Profa. Dra. Kristianne Porta Santos Fernandes e Profa. Dra. Sandra Kalil Bussadori, que sempre acreditaram no meu potencial, torcendo e comemorando junto comigo cada acerto. Obrigada por todo carinho.

Ao tcnico do laboratrio de pesquisa, Bruno Duzzi, por toda sua fundamental colaborao.

Aos tcnicos dos laboratrios multidisciplinares da UNINOVE, pela ajuda e palavras de incentivo.

Ao Prof. Dr. Dcio dos Santos Pinto Jnior, Prof. Dr. Fabio Daumas Nunes e Profa. Dra. Mrcia Martins Marques, da Faculdade de Odontologia da USP que foram essnciais nessa caminhada, colaborando no aperfeioamento das tcnicas utilizadas neste estudo.

5 Ao Prof.Dr.Carlos Alberto Silva pelas conversas e trocas de informaes que foram fundamentais para a concluso desse projeto. A sua querida coorientada Joyce por toda ateno e carinho.

A todos os colegas do Mestrado, em especial Marcos Paulo, Luciane e Lara, pelo convvio e troca de experincias que contriburam para meu crescimento pessoal e profissional

Aos alunos de iniciao cientfica Dayane Aparecida Mesquita, Juliana Baptista, Srgio Bezerra e Aline Cervera, pelo agradvel convvio e empenho na execuo deste e de outros trabalhos.

tcnica Elisa Santos, do laboratrio de Patologia Bucal da FOUSP, por sempre se mostrar disposta a ajudar.

Ao Prof. Dr. Marcelo Betti Mascaro e as tcnicas do laboratrio de Neurocincia do ICB-USP Sra. Joelcimar Martins da Silva e Sra. Amanda Ribeiro de Oliveira pela disposio e ateno durante a utilizao do criostato.

Aos amigos que mesmo distantes, sempre estiveram muito presentes, Marcelo Cancherini, Mirela Cunha, Adriana Tavares e Dr. Mrio Velloni.

Aos professores do Programa de Mestrado em Cincias da Reabilitao por todos os ensinamentos e agradvel convvio.

Ao Prof. Dr. Joo Carlos Ferrari Correa, coordenador do Programa de Mestrado em Cincias da Reabilitao da UNINOVE, pela oportunidade.

secretria do Programa de Mestrado em Cincias da Reabilitao da UNINOVE, Srta. Juliana Ribeiro por toda ajuda e ateno.

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pela bolsa concedida.

Resumo
O objetivo deste estudo foi investigar os componentes da matriz extracelular (MEC) durante a regenerao muscular esqueltica. Foram utilizados 60 ratos Wistar sendo que destes, foram organizados 4 grupos avaliados 1, 7, 14 e 21 dias aps a leso (10 animais/grupo). Esses grupos foram submetidos crioleso no msculo tibial anterior do lado esquerdo e os msculos contralaterais foram os controles. Foi realizado um grupo sham, que recebeu apenas o procedimento cirrgico e um grupo de animais controle que no recebeu nenhuma interveno. Os msculos foram submetidos coloraes por hematoxilina & eosina e imuno-histoqumica para deteco de colgeno tipo IV, MMP-2 e MMP-9. A atividade enzimtica de MMPs foi verificada pela zimografia. Os msculos controle mostraram morfologia normal, o grupo sham exibiu leve infiltrado inflamatrio. No grupo criolesionado foi observado aps 1 dia moderado infiltrado inflamatrio e reas de necrose. Aps 7 e 14 dias pode-se observar reduo significativa do processo inflamatrio, ausncia de necrose e presena de clulas musculares imaturas. Aos 21 dias o msculo mostrou evidncia de reparo completo. O colgeno IV mostrou-se desorganizado por entre as fibras lesadas aps 1 dia da crioleso e se reorganizou gradualmente ao longo dos 21 dias. A imunoreatividade da MMP-2 e MMP-9, assim como a atividade de MMP-2 se mostraram relacionadas com a fase do reparo tecidual. Aps 1 dia da injria foi observado aumento da imunomarcao da MMP-2 e MMP-9 e da atividade da MMP-2. Conclui-se que, aumento e diminuio dos nveis de marcao e atividade de MMPs esto relacionados com a degradao e o acmulo de colgeno IV, durante o remodelamento da MEC no msculo esqueltico.

Palavras chaves: remodelamento muscular, matriz extracelular, colgeno IV, MMP-2, MMP-9.

Abstract
The aim of the present study was to investigate components of extracellular matrix (ECM) during the skeletal muscle regeneration after cryolesion in rats. Sixty adult Wistar rats were used. The animals were divided into 4 groups: 1, 7, 14 and 21 days post-injury (10animls/group). One of the tibialis anterior muscles was cryolesioned and the contralateral muscle was used as the control. One sham group, in which animals received only the surgical procedure and one group of control animals that do not receive any intervention were included. The muscles were submitted to hematoxylin-eosin and immunohistochemistry staining for collagen IV, MMP-2 and MMP-9 detection. The MMP enzymatic activity was verified by zymography. The control muscles showed normal morphology and the sham group exhibited an inflammatory infiltrated. After 1 day, the cryolesioned group exhibit moderate inflammatory infiltrated and necrosis areas. At 7 and 14 days a significant reduction of the inflammatory process, absence of necrosis and presence of immature muscular cells could be observed. The injured group revealed total remodeling after the 21 days. Collagen IV showed a disordered distribution pattern after 1 day of injury and gradually it was reorganized during the 21 days of the muscle regeneration. The MMP-2 and MMP-9 immunolabeling, as well, the MMP-2 activity were related to the phase of skeletal muscle repair. After 1 day, an increase on MMP-2 and MMP-9 labeling and MMP-2 activity were observed. In conclusion, the increase and decrease of immunolabeling and activity of MMP were related to the break down and accumulation of collagen IV during the skeletal muscle remodeling.

Keywords: muscle remodeling, extracellular matrix, collagen IV, MMP-2, MMP9

Sumrio

1. Contextualizao.............................................................................12 2. Estudos............................................................................................15 2.1. Artigo 1- Remodelamento do msculo esqueltico: papel da matriz extracelular..............................................................................................15 2.2. Artigo 2- Distribuio do colgeno IV no remodelamento de msculo esqueltico de rato aps crioleso..........................................................32 2.3. Artigo 3- Estudo da imunolocalizao e atividade da MMP-2 e MMP9 durante o remodelamento muscular aps injria...........50 3. Consideraes Finais.......................................................................70 Referncias Bibliogrficas...................................................................71 Anexos...................................................................................................74

Lista de Ilustraes
Artigo 1 Figura 1. Fotomicrografias de marcao imuno-histoqumica para colgeno I, III e IV em msculos normais........................................ .......................................26

Artigo 2 Figura 1 - Peso corporal mdio (g) inicial e final desvio padro dos animais durante todos os perodos experimentais..........................................................40

Figura 2 - Peso mdio (g) do msculo criolesionado e controle desvio padro dos animais durante todos os perodos experimentais......................................41

Figura 3. Fotomicrografias dos cortes histolgicos de msculos controle e criolesionados corados por hematoxilina & eosina............................................42

Figura 4. Fotomicrografias de marcao imuno-histoqumica para colgeno IV em msculos controle e criolesionados............ ...............................................44

Artigo 3 Figura 1. Distribuio imuno-histoqumica da MMP-2 no msculo esqueltico em ratos .........................57

Figura 2. Anlise imuno-histoqumica da MMP-9 no msculo esqueltico. A distribuio de MMP-9 foi semelhante MMP-2.......58

Figura 3. Anlise da atividade das MMP-2 (62kDa) e MMP9 (82kDa) em extratos de msculo TA por zimografia em SDS-PAGE gelatina1%. ...............59 Figura 4. Concentrao de MMP-2 no msculo TA apresentados como a mdia e DP...60

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Lista de Abreviaturas e Smbolos

%- Percentual g- Microgramas m- Micrmetros ABR- Affinity BioReagents BSA- Albumina de soro bovina CaCl2- Cloreto de clcio COBEA- Colgio Brasileiro de Experimentao animal DAB- 3-31-diaminobenzidina ECM- Extracellular matrix HCl- cido clordrico HE- Hematoxilina-eosina HGF- Fator de crescimento de hepatcitos HPR- Enzima horseradish peroxidase ICLAS- International Council of Laboratory Animal Science ICTP- Concentrao intersticial terminal de telopeptideos IGF- Fator de crescimento insulina-smile LSAB- Labeled streptavidinbiotin MEC- Matriz extracelular mg/mL- Miligrama por mililitro Min- Minutos mM- Milimolar MMP- Metaloproteinase MyoD- Fator miognico NaCl- Cloreto de sdio NaN3- Azida Sdica NIH- National Institutes of Health
o

C- Graus Celsius

PBS- Tampo salina fosfato pH- Potencial hidrogeninico RNAm- cido ribonuclico s- Segundos

11 SDS- Sodium dodecyl sulfate TA- Tibial anterior TIMP- Inibidor tecidual de MMPs (metalopeptidases); TNF- Fator de necrose tumoral TrisHCl- Tampo contendo Tris 10mM e NaCl (cloreto de sdio) 100mM ZnCl2- Cloreto de zinco

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1. Contextualizao
As leses musculares, freqentes dentro das prticas desportivas e ambiente de trabalho, levam ao comprometimento de atividades ocupacionais e de lazer1. Assim sendo, existe considervel interesse na regenerao do msculo esqueltico em funo de vrias situaes que necessitam desta como: transplantes, distrofias musculares, traumas despostivos entre outras2. Os msculos esquelticos so tecidos dinmicos compostos por fibras musculares e clulas satlites embebidas em uma matriz extracelular (MEC) que exibem capacidade de se adaptar ou se modificar frente a diversos estmulos3,4. O processo de remodelamento muscular pode ser dividido em trs fases denominadas de destruio, reparo e remodelamento tecidual. Na primeira, observa-se a formao de hematomas, necrose tecidual, degenerao e resposta inflamatria celular. Na segunda nota-se fagocitose do tecido degenerado, regenerao das fibras musculares, produo tecidual e crescimento vascular. Na ltima fase denominada de remodelamento ocorrem os processos de maturao das fibras regeneradas e reorganizao tecidual 5,6. O remodelamento fisiolgico ou patolgico do msculo esqueltico depende, dentre outros fatores, da ao coordenada da degradao e sntese de protenas intracelulares e dos componentes da matriz extracelular. Portanto, modificaes nos msculos esquelticos tais como aumento ou diminuio de atividade contrtil, leso muscular que gere inflamao ou atrofia promovem o remodelamento da MEC. Esta por sua vez, representa um conglomerado de substncias com propriedades bioqumicas e biofsicas, que mantm a integridade estrutural e individual das fibras musculares 7. As interaes entre clula-clula e clulaMEC suprem as clulas com informaes essenciais para homeostase e para o controle da morfognese, crescimento e diferenciao 8,9. As principais macromolculas que compem a MEC so representadas por protenas colagnicas (colgenos) e no-colagnicas (fibronectina, tenascina, laminina), proteoglicanas, incluindo-se o cido hialurnico, sulfato de condroitina e sulfato de heparana e fosfolipdios7.

13 Os principais colgenos identificados no msculo esqueltico so os tipos I e III no epimsio, perimsio e endomsio e os tipos IV e V na membrana basal, em volta das fibras individuais do msculo, fibras de msculo liso de vasos sangneos e clulas de Schwann7. A associao entre o aumento da sntese de colgeno e os processos regenerativos que ocorrem no tecido muscular aps dano, principalmente os causados por exerccio, tem sido demonstrada na literatura10-19. As metaloproteinases de matriz (MMPs) compreendem uma famlia de endoproteases que degradam um ou vrios componentes da MEC tais como colgeno, elastina, laminina e proteoglicanos. As MMPs, portanto, esto envolvidas no remodelamento da matriz extracelular em uma grande variedade de fenmenos fisiolgicos e patolgicos nos diferentes tecidos dentre eles, no msculo esqueltico 9,20,21. A MMP-2 e a MMP-9 parecem ter um papel mais importante na adaptao do msculo esqueltico a alteraes de demanda contrtil ou em resposta a injria e atividade fsica. A ativao de MMP-2 e MMP-9 tambm est envolvida em vrias miopatias e alteraes inflamatrias induzidas em msculos esquelticos 18,22-26. Alguns modelos de estudo de remodelamento muscular frente a diferentes exerccios fsicos e a miotoxinas j esto bem estabelecidos na literatura
26-29

e verificam as modificaes do padro dos diferentes tipos de

colgeno e expresso de MMPs . O modelo de crioleso promove necrose em uma rea delimitada do msculo, consequentemente edema e reao inflamatria. Alguns trabalhos estudaram o remodelamento do msculo frente crioleso
28,30-32

entretanto,

estes no abordaram as caractersticas da MEC no remodelamento muscular. Os estudos sobre as modificaes da MEC no msculo esqueltico, em situaes fisiolgicas e patolgicas, vem sendo desenvolvidos para melhor compreender o papel da cada protena tecidual, mas, principalmente, para desenvolver mtodos de preveno e reabilitao de leses musculares; seleo de tipo, carga e durao do exerccio em treinamento fsico e para contribuir no desenvolvimento de novas terapias para doenas musculares congnitas e inflamatrias. O melhor entendimento sobre a participao da

14 MEC na adaptao tecidual frente aos diversos tipos de demanda torna-se um ponto crucial para o estabelecimento das vias envolvidas no remodelamento do msculo esqueltico. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os componentes da MEC, colgeno IV, MMP-2 e MMP-9, durante a regenerao muscular esqueltica em rato.

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2. Estudos
2.1. Artigo 1- Submetido para publicao no peridico Fisioterapia em Movimento (Anexo 1).

Remodelamento do msculo esqueltico: papel da matriz extracelular Skeletal muscle remodeling: role of extracellular matrix Vanessa Christina Santos Pavesi1, Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari2, Dayane Aparecida Mesquita3, Juliana Baptista4, Manoela Domingues Martins2.
1

Aluna de mestrado em Cincias da Reabilitao da Universidade Nove de

Julho e bolsista de Mestrado FAPESP;

2

Docentes do Mestrado em Cincias da Reabilitao da Universidade Nove de

Julho UNINOVE;
3

Aluna de Iniciao Cientfica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove

de Julho e bolsista de Iniciao Cientfica FAPESP;

4

Aluna de Iniciao Cientfica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove

de Julho e bolsista PIBIC/CNPq.

Endereo para contato: *Manoela Domingues Martins, Rua Demstenes, 636 apto 11, Campo Belo, CEP 04614-010, So Paulo-SP, Brasil, 11-83156030 Email: manomartins@gmail.com

TTULO CONDENSADO: Matriz extracelular no remodelamento muscular

16 Remodelamento do msculo esqueltico: papel da matriz extracelular Skeletal muscle remodeling: role of extracellular matrix

TTULO CONDENSADO: Matriz extracelular no remodelamento muscular

Resumo A plasticidade ou remodelamento do msculo esqueltico em resposta a estmulos diferentes, tanto em situaes fisiolgicas como patolgicas, tem sido demonstrada em vrios modelos experimentais e estudos clnicos. Este processo depende de uma ao coordenada entre a degradao e sntese da matriz extracelular (MEC) e, portanto, as alteraes nos componentes da matriz vm sendo alvo de inmeros trabalhos nos ltimos anos. O objetivo do presente estudo foi revisar a literatura sobre o papel dos diversos tipos de colgeno, que so os principais componentes da MEC, das metaloproteinases (MMPs) e dos inibidores de metaloproteinases (TIMPs) no processo de remodelamento muscular esqueltico. Palavra-chave: Msculo esqueltico; Matriz extracelular, Remodelamento muscular, Colgeno, Metaloproteinases.

Abstract The skeletal muscle remodeling in response to several stimuli in physiological and pathological conditions have been demonstrated by different experimental and clinical studies. This process depends on an interaction between the degradation and synthesis of extracellular matrix. Therefore, the modifications in the extracellular matrix components have been studied in last years. The aim of this study was to revise the literature about collagen types that are the main components of the MEC, metalloproteinases (MMPs) and metalloproteinases inhibitors (TIMPs) during the skeletal muscle healing process.

Keywords: Skeletal muscle, Extracellular matrix, Muscle remodeling, Collagen, Metalloproteinases.

17 Introduo Os msculos esquelticos representam cerca de 40 a 45% do peso corpreo total e so essenciais para o movimento do corpo, respirao e manuteno da postura. Esse tecido dinmico e pode alterar suas

caractersticas fenotpicas, proporcionando uma melhor adaptao funcional frente a estmulos variados. Sendo que, aps o nascimento, a massa muscular e o fentipo so determinados, em parte, por influncias e sinais ambientais (1,2). Existe considervel interesse na regenerao do msculo esqueltico em funo de vrias situaes que necessitam desta como: reparo rpido de leses em atletas, transplantes, distrofias musculares, atrofias por desuso ou permanncia no espao entre outras (2). O remodelamento tecidual fisiolgico ou patolgico do msculo esqueltico depende da ao coordenada da degradao e sntese de protenas intracelulares e dos componentes da matriz extracelular (MEC). Esta por sua vez, representa uma enorme e complexa rede de macromolculas compostas de vrias protenas versteis e polissacardeos que so secretados localmente e montados em associao com a superfcie celular que os produz. As interaes entre clula-clula e clulaMEC suprem as clulas com informaes essenciais para homeostase e para o controle da morfognese, funes tecido-especficas, migrao celular, reparo e morte celular (3,4). As variaes nas quantidades relativas dos diversos tipos de macromolculas e o modo como so organizadas na MEC geram uma grande diversidade de formas, cada uma adaptada s necessidades funcionais particulares de cada tecido. Nos tecidos musculares a MEC circunda as fibras musculares conferindo suporte e proteo e importante na manuteno da integridade funcional das fibras (5). O objetivo principal do presente estudo foi revisar a literatura sobre o papel dos diferentes componentes da MEC, das metaloproteinases (MMPs) e inibidores de metaloproteinases (TIMPs) no processo de remodelamento muscular esqueltico.

1. Regenerao e Remodelamento do Msculo Esqueltico A leso muscular um fenmeno comum que pode ocorrer em funo de

18 exerccios fsicos intensos, traumas, contuses, eletroestimulao entre outros e envolve uma resposta inflamatria seguida de processo de cicatrizao e reparo tecidual. Este processo de remodelamento do msculo esqueltico aps injria complexo e ocorre em vrias etapas interconectadas que envolvem a ativao de diferentes tipos de clulas, em especial as inflamatrias e as clulas satlites, com a funo de manter e preservar a estrutura e funo do tecido muscular (2,6). O reparo muscular ocorre em quatro fases interdependentes:

degenerao, inflamao, regenerao e fibrose. As duas primeiras fases so observadas nos primeiros dias aps a agresso enquanto que, a regenerao muscular ocorre por volta de 7 a 10 dias, com pico mximo na 2 a semana diminuindo na 3a semana. A formao de fibrose (escara) inicia-se entre a 2a semana e 3a semana aps injria aumentando de tamanho com o passar do tempo (2,6,7) . Estudos demonstram que aps a agresso muscular, ocorre dano ao sarcoplasma ou reticulo sarcoplasmtico levando a necrose das fibras musculares e os fenmenos de regenerao muscular so iniciados pela infiltrao de neutrfilos, seguidos de fagocitose dos restos necrticos pelos macrfagos que invadem a rea danificada. As clulas inflamatrias tambm auxiliam na formao de um novo tecido muscular por meio da secreo de fatores quimiotticos para outras clulas inflamatrias e produo de fatores de crescimento que agem na ativao das clulas satlites (2,7). Aps o aumento da sntese e da liberao de mediadores qumicos como o IGF (Insulin-like Growth Factor) e HGF (Hepatocyte Growth Factor) e fatores de transcrio como o MyoD, no local da agresso as clulas satlite tornam-se ativadas (7,8). Aps a ativao, as clulas satlites passam por uma srie de estgios que envolvem proliferao, diferenciao em mioblastos e fuso as miofibras para reparar o dano muscular e/ou para facilitar o aumento de tamanho do msculo (6). Esses fenmenos esto acompanhados do aumento da sntese protica e da expresso gnica no tecido muscular. Assim como pode ocorrer em outros tecidos conjuntivos vascularizados, o msculo quando agredido, pode ter ao final do processo inflamatrio a regenerao tecidual ou a fibrose (cicatrizao da ferida). Alguns fatores so determinantes para definir qual desfecho ir ocorrer tais como severidade da

19 injria, tipo de msculo lesado, interveno realizada aps a leso, entre outros fatores (2,9). Pesquisas vm sendo desenvolvidas na rea de remodelamento tecidual para desenvolvimento de novas terapias e tecnologias para manter as citocinas e fatores de crescimentos importantes para a regenerao muscular atuantes, por longo perodo de tempo, at que o reparo muscular ocorre por completo.

2. MEC no msculo esqueltico A MEC representa uma complexa rede de macromolculas composta de vrias protenas versteis e polissacardeos que so secretados localmente e montados em associao com a superfcie celular que os produz. As interaes entre clula-clula e clulaMEC suprem as clulas com informaes essenciais para homeostase, controle da morfognese, funes tecidoespecficas, migrao celular, reparo e morte celular (3,10,11). As principais macromolculas que compem a matriz extracelular so representadas por protenas colagnicas (colgenos) e no-colagnicas (fibronectina, tenascina, laminina, entre outras), proteoglicanas, incluindo-se o cido hialurnico, sulfato de condroitina e sulfato de heparana e fosfolipdios (3,10,11). No msculo esqueltico, a MEC alm de proporcionar a estruturao do tecido possui um papel bioativo na regulao do comportamento celular, influenciando assim o seu desenvolvimento e o remodelamento tecidual fisiolgico ou patolgico (3,4,12). A MEC circunda as fibras musculares conferindo suporte e proteo e importante na manuteno da integridade funcional das fibras (5). Assim, frente a qualquer estmulo mecnico existe uma adaptao da MEC que procura tornar o msculo mais resistente ao dano, para permitir uma transmisso adequada da fora durante a contrao muscular (3). Alm disto, a MEC possui importante papel no remodelamento do tecido muscular, pois este ocorre a partir da ao coordenada da degradao e sntese de protenas intracelulares e dos componentes da MEC (3,4,12). No tecido muscular adulto, um grupo distinto de molculas da MEC est envolvido na manuteno da estrutura e funo normal deste tecido. As protenas predominantes so a laminina-2 e 4 , fibronectina, tenascina,

20 colgeno I, III e IV, e as proteoglicanas como o sulfato de dermatano e de heparana. Nas situaes onde necessria a adaptao e regenerao do msculo a expresso destas molculas pode estar aumentada e alguns outros tipos podem ser sintetizados localmente tais como laminina-8,-9,-10, -11 e sindecano (13). Os principais colgenos identificados no msculo esqueltico so os tipos I e III no epimsio, perimsio e endomsio (Figura 1 a-f) , sendo que os tipos IV e V esto presentes na membrana basal, em volta das fibras individuais do msculo, fibras de msculo liso de vasos sangneos e clulas de Schwann (3). O tipo e a quantidade de colgeno variam de acordo com o msculo avaliado devido ao papel que o tecido conjuntivo apresenta em cada tipo de msculo (3,14). Assim como, nas situaes de dano muscular gerado por exerccio tem sido observado aumento da sntese de colgeno durante a regenerao (15). O colgeno I importante para a estabilizao da arquitetura tecidual e chamado de colgeno intersticial uma vez que forma estruturas fibrilares no espao intercelular (Figura 1a,b,c). O colgeno tipo I representa a maior parte do colgeno intramuscular variando entre 30% e 97% do colgeno total (2,3,15). Os colgenos II e III tambm so chamados de colgenos intersticiais, uma vez que formam estruturas fibrilares no espao intercelular. O colgeno III mais presente em tecido conjuntivo frouxo, possui uma importante funo na elasticidade do tecido (32). O colgeno IV exclusivo de membrana basal e produzido pelas clulas musculares sendo formado por molculas de colgeno que no se associam em fibrilas, mas prendem-se umas as outras pelas extremidades, formando uma rede semelhante a uma tela de arame (Figura 1g,h,i). Ele se associa as vrias molculas no fibrosas da matriz extracelular e forma uma membrana contnua que compatimentaliza certos tecidos denominada de membrana basal (3). No msculo, o colgeno tipo IV o principal componente da membrana basal sendo responsvel pela manuteno da estabilidade mecnica da fibra muscular esqueltica. Tem sido sugerido que o colgeno tipo IV tem um papel crtico no arranjo dentro do tecido, embora ele sozinho constitua uma pequena

21 parte do total da MEC. No entanto, a tolerncia da membrana basal celular ao stress pode no caso de leses extensas, ser dependente da integridade do componente colagenoso (16).

3. Remodelamento da matriz extracelular em msculo esqueltico frente a estmulos fisiolgicos e patolgicos Modificaes na composio da MEC em msculo esqueltico humano sob condies fisiolgicas e patolgicas tm sido demonstradas (3,14,17) e, em especial, so analisados os colgenos e as MMPs. No que diz respeito ao componente colagenoso da MEC, uma ntima relao tem sido estabelecida entre aumento da sntese de colgeno e o processo regenerativo que ocorre no msculo esqueltico em resposta as diferentes atividades fsicas (3). Sendo que, o aumento da sntese de colgeno aps exerccio pode representar uma adaptao fisiolgica ou parte do processo de reparo com ou sem dano tecidual evidente (18). Estudos demonstram que o colgeno IV aumenta nos msculo de ratos aps longos perodos de treinamento (19), aps contraes (20, 21), exerccios agudos (14,15,22,23) e hipertrofia compensatria experimental (40). Assim

como, foi verificado o aumento dos nveis de RNAm de colgeno I e III no msculo esqueltico de ratos aps corrida (18). Koskinen et al.(14) estudaram o efeito do exerccio intenso no remodelamento da MEC do msculo. Estes autores mostraram que o dano muscular causado pelo exerccio agudo em animais ocasiona modificaes na concentrao de colgeno IV intramuscular. Neste estudo foi observado que a MMP-2, enzima que degrada o colgeno tipo IV, esteve aumentada nas fases de dano muscular severo e o aumento de colgeno IV esteve associado regenerao da membrana basal da miofibrilas. TIMP-1, uma enzima que inibe a atividade de MMP, parece estar ativada durante as fases iniciais do dano tecidual enquanto que o inibidor TIMP-2 foi ativado nas fases tardias do dano muscular. Mackey et al. (21)avaliaram o efeito da contrao excntrica mxima no remodelamento do colgeno em humanos. Os voluntrios realizaram 100 contraes excntricas mximas voluntrias de extenso do joelho. Foram realizadas bipsias musculares antes, aps 4 e 22 dias de exerccio. Os

22 autores observaram um aumento do colgeno tipo IV no endomsio aps uma nica contrao excntrica mxima sugerindo um remodelamento da MEC. Moore et al. (24) avaliaram o perfil do colgeno e de protenas miofibrilares aps contrao muscular mxima em posio de alongamento e encurtamento muscular. Ambas as situaes de contrao mxima provocaram aumento na sntese das protenas miofibrilares, entretanto durante o alongamento este aumento foi mais rpido e maior quando comparado a outra situao podendo ocasionar hipertrofia muscular. A anlise da sntese de colgeno mostrou aumento desta protena aps contrao mxima em ambas as formas de contrao. Em contraste com o aumento muscular, durante o envelhecimento, imobilizao e denervao, ocorre um aumento na concentrao da MEC, em especial dos colgenos, no msculo (25,26,27). A imobilizao de membros de ratos leva a uma diminuio da atividade de biosntese de colgeno (3,26,29) evidenciando-se pela diminuio dos nveis de RNAm dos colgenos I, III e IV aps imobilizao (17, 28) e diminuio da taxa de degradao do colgeno (25,28) promovendo o acmulo deste componente da MEC.

Metaloproteinases de Matriz (MMPs) As metaloproteinases de matriz (MMPs) compreendem uma famlia de pelo menos vinte enzimas (endoproteases) que degradam um ou vrios componentes da matriz extracelular, portanto, esto envolvidas no

remodelamento da matriz extracelular em situaes fisiolgicas e patolgicas (30, 31,32). Com base em sua estrutura primria, organizao, especificidade de substrato e localizao celular, as MMPs tem sido classificadas em 6 subfamilias maiores quem incluem as colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13 e MMP-18), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-10 e MMP-11), MMPs tipo membrana (MMP-14 at MMP-17), e outras MMPs como a matrilisina (MMP-7),e metaloeslastase (MMP-12) (33). O nmero de MMPs descritas tem aumentado, embora o atual conhecimento sobre seus padres de expresso em vrios tecidos permanea incompleto (34). As MMPs podem degradar os componentes da matriz extracelular sendo que as colagenases (MMP-1 e MMP-8) iniciam a degradao do colgeno tipo

23 I, colgeno tipo II e outras fibrilas colagnicas; as gelatinases (MMP-2 e MMP9) quebram o colgeno tipo IV e outros componentes da matriz extracelular enquanto que a MMP-9 tambm capaz de digerir colgeno tipo XI, and XIV (5,26). No msculo esqueltico, as MMPs desempenham um importante papel no desenvolvimento, homeostase e regenerao da matriz extracelular (MEC). Alteraes da exigncia do msculo esqueltico (sobrecarga ou reduo da atividade contrtil) promovem o remodelamento da MEC e consequentemente ativam as MMPs especficas que garantiro este processo (35). As alteraes na atividade das MMPs podem tambm estar associadas a quadros patolgicos uma vez que a excessiva ou inapropriada expresso de MMPs contribui para a patognese de muitos processos teciduais destrutivos, incluindo artrite reumatide, miosite focal, esclerose mltipla e periodontite (36) e falhas na atividade de MMPS podem ser notadas nas doenas fibrticas devido a uma maior deposio de MEC (10,11). Vrias MMPs esto presentes no msculo, mas particularmente duas possuem um importante papel na adaptao muscular frente a alterao de demandas contrteis e em resposta a leso, sendo estas a MMP-2 (tambm conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (gelatinase B). Ambas pertencem a um grupo de endoproteinases de clcio e zinco que degradam o colgeno tipo IV e tem uma importante funo na homeostase da MEC durante a morfognese, proliferao e apoptose celular em uma larga gama de tecidos (37). Nos msculos esquelticos normais os nveis de MMP-2 ativas so relativamente baixos na MEC e a atividade da MMP-9 est ausente, sendo que a expresso destas enzimas sofre regulao por citocinas e fatores de crescimento (37). No entanto, o aumento de expresso de ambas MMPs, -2 e 9, tm sido demonstrado em vrias miopatias e em condies inflamatrias no msculo esqueltico (37,38). Alm disso, o aumento da MMP-2 tambm tem sido descrito em situaes de proliferao e diferenciao de clulas musculares, cicatrizao aps injria e manuteno do tecido conjuntivo circunjacente (35). Outros estudos evidenciaram que a expresso de MMP-2 nos msculos esquelticos sofreu aumento aps aplicao de estimulao eltrica crnica

24 (39), aps corrida e aps exerccios de alta intensidade (35). J a expresso de MMP-9 aumentou aps aumento crnico do fluxo sanguneo (40), aps corrida (35) e em fases iniciais da resposta inflamatria do msculo frente miotoxina (41), Rodolico et al. (36) estudaram o padro imunoistoqumico das MMPs 2, 7 and 9 em miosite focal e compararam com polimiosite e dermatomiosite. Os autores observaram que existe um aumento de imunoreatividade para MMP-9 nas clulas musculares em todas as miopatias e sugerem que a MMP-2 e MMP-7 no esto implicadas na miosite focal, pois as amostras desta condio no mostraram imunoreatividade para estas protenas teciduais.

Reznick (42) avaliaram as MMPs aps imobilizao e verificaram por meio de zimografia que a atividade da MMP-2 sofre aumento de expresso durante as 4 semanas de imobilizao. Com relao a MMP-9 tambm foi possvel observar uma aumento de expresso aps esta imobilizao e, alm disso, deve ser ressaltado o fato de que esta protease no foi detectada nos animais controle, que no sofreram imobilizao. De acordo com os autores, o papel da MMP-2 e MMP-9 provavelmente seja diferente uma vez que a MMP-2 secretada por vrios tipos de clulas do tecido conjuntivo e pode degradar vrios colgenos intersticiais (I-V) e a MMP-9 produzida nos msculos principalmente pelas clulas inflamatrias e sua expresso est aumentada em condies inflamatrias severas. Apesar de MMP-2 e MMP-9 terem os mesmos substratos elas so expressas e moduladas por diferentes citocinas e fatores de crescimento. Por exemplo, TNF (fator de necrose tumoral) secretado pelos macrfagos regula positivamente mais a MMP-9 do que a MMP-2.

Inibidores de metaloproteinases (TIMPS) Existem vrios mecanismos regulatrios que influenciam na ao das MMPs sobre a degradao da MEC. Dentre estes, os mais estudados so a regulao da transcrio, ativao de MMPs latentes e inibio por TIMPs, uma famlia de protenas que inibem seletivamente e reversivelmente as MMPs (43). Os TIMPs so derivados das clulas musculares e secretados na MEC e se ligam as MMPs na forma de zimognio regulando a formao e a maturao da MMP-2 e MMP-9 (31). TIMP-2 conhecido por se ligar mais efetivamente a

25 MMP-2, enquanto que TIMP-1 possui maior afinidade pela MMP-9. Assim, os nveis de atividade dos TIMPs mudam em paralelo com as alteraes da atividade da MMP-2 e MMP-9 (14,44). Alteraes no balano entre MMPs e TIMPs podem causar alteraes na composio da MEC e afetar as funes celulares (45). Curiosamente, TIMPs so as vezes ativados juntos com as MMPs em resposta a atividade fsica indicando estimulao simultnea e inibio da degradao. Em vez de considerar estas, como aes competitivas, provvel que a atividade da MMP proceda a atividade dos TIMPs, e portanto, TIMPs servem como reguladores da degradao terminal para garantir um limite de degradao. Para sustentar mais que uma reao de integrao das MMPs e TIMPs existentes, TIMP-2 tem se mostrando importante para uma ativao de pro-MMP-2 in vivo. TIMP-1 tem sido encontrada correlacionada com concentrao intersticial terminal de telepeptdeos (ICTP) em pacientes com cncer indicando atividade em e controle da degradao de colgeno (3). Embora MMPs e TIMPs sejam expressados no msculo, pouco conhecido sobre seu papel no desenvolvimento, remodelamento e funo do tecido msculo esqueltico (46).

Consideraes finais Os estudos sobre as modificaes da MEC no msculo esqueltico, em situaes fisiolgicas e patolgicas, vem sendo desenvolvidos para melhor compreender o papel da cada protena tecidual, mas, principalmente, para desenvolver mtodos de preveno e reabilitao de leses musculares; seleo de tipo, carga e durao do exerccio em treinamento fsico e para contribuir no desenvolvimento de novas terapias para doenas musculares congnitas e inflamatrias. Desta forma, o melhor entendimento sobre a participao de MMPs e respectivos TIMPs na adaptao tecidual frente aos diversos tipos de demanda torna-se um ponto crucial para o estabelecimento das vias que estariam envolvidas e que permitiriam o remodelamento do msculo esqueltico.

26

Col I

Col III

Col IV

Figura 1. Fotomicrografias de marcao imuno-histoqumica para colgeno I, III e IV em msculos normais. O colgeno I (a,40x; b,100x; c,400x) e III (d,40x; e,100x; f,400x) distribui-se de forma linear em torno do endomsio e perimsio. O colgeno III mostra uma marcao mais intensa (d,e,f). O colgeno IV no endomsio (g, 40x) e perimsio (h, 100X; i,400x) mostra marcao mais delicada.

Agradecimentos Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pela bolsa de IC (processo no 07/55439-6) e de mestrado (processo no 07/52927-0). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico pela bolsa de Iniciao Cientfica.

27 Bibliografia 1. Goldspink G. Selective gene expression during adaptation of muscle in response to different physiological demands. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 1998; 120:5-15. 2. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in research. J Bone Joint Surg Am 2002; 84:822-32. 3. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal muscle to mechanical loading. Physiol Rev 2004; 84:649-98. 4. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29: 191 197. 5. Chiquet M, Matthison M, Koch M, Tannheimer M, Chiquet-Ehrismann R. Regulation of extracellular matrix synthesis by mechanical stress. Biochem Cell Biol 1996; 74:737744. 6. Shi X, Garry DJ. Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes Dev 2006; 20:1692-708. 7. Bischoff R. The satellite cell and muscle regeneration. In: Engel AG, Franzini-Armstrong C, editors. Myology. Basic and clinical. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 1994. p 97-118. 8. Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol 2001; 91:534551. 9. Prisk V, Huard J. Muscle injuries and repair: the role of prostaglandins and inflammation. Histol Histopathol 2003; 18:1243-56. 10. Tracy A-KL, Senior RM. Fragments of extracellular matrix as mediators of inflammation. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 1101-1110. 11. Velleman SG. The Role of the Extracellular Matrix in Skeletal Muscle Development. Poltry Science 1999; 78:778-784. 12. Carmeli E, Moas M, Lennon S, Powers SK. High intensity exercise

increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle fibres. Exp Physiol 2005; 90: 613-9. 13. Lewis MP, Machell JR, Hunt NP, Sinanan AC, Tippett HL. The extracellular matrix of muscle-implications for manipulation of the craniofacial musculature. Eur J Oral Sci 2001; 109: 209-21. 14. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjr M, Han XY, Komulainen J, Kovanen V, and Takala TES. Turnover of basement membrane type IV

28 collagen in exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2001; 280: R1292 1300. 15. Myllyl R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise injuries. Pflugers Arch 1986; 407:6470. 16. Ahtikoski AM, Tuominen H, Korpelainen JT, Takala TE, Oikarinen A.Collagen synthesis and degradation in polyneuropathy and

myopathies. Muscle Nerve 2004; 30: 602-8. 17. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P, Kovanen V, and Takala TES. Regulation of synthesis of fibrillar collagens in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and lengthened positions. Acta Physiol Scand 2001; 172: 131140. 18. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV, Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers Arch 1999; 437: 857864. 19. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, Risteli L. Type IV collagen and laminin in slow and fast skeletal muscle in rats--effects of age and lifetime endurance training. Coll Relat Res 1988; 8: 145-53. 20. Koskinen SO, Ahtikoski AM, Komulainen J, Hesselink MK, Drost MR, Takala TE. Short-term effects of forced eccentric contractions on collagen synthesis and degradation in rat skeletal muscle. Pflugers Arch 2002; 444: 59-72. 21. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T, Roper HP. Skeletal muscle collagen content in humans after high-force eccentric

contractions. J Appl Physiol 2004; 97: 197-203. 22. Savolainen J, Vnnen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES Effect of immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J Physiol 1987; 252: R883R888. 23. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK, Thomas DP. Age and training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb muscle. J Appl Physiol 1993; 75: 16701674. 24. Moore DR, Phillips SM, Babraj JA, Smith K, Rennie MJ. Myofibrillar and collagen protein synthesis in human skeletal muscle in young men after

29 maximal shortening and lengthening contractions. Am J Physiol Endocrinol Metab 2005; 288: E11531159. 25. Kannus P, Jozsa L, Jarvinen TL, Kvist M, Vieno T, Jarvinen TA, Natri A, Jarvinen M. Free mobilization and low- to high-intensity exercise in immobilization-induced muscle atrophy. J Appl Physiol 1998; 84: 1418 1424. 26. Savolainen J, Myllyl V, Myllyl R, Vihko V, Vnnen K, Takala TE. Effects of denervation and immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscle and tendon. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 1988; 254: R897902. 27. Virtanen P, Tolonen U, Savolainen J, Takala TE. Effect of reinnervation on collagen synthesis in rat skeletal muscle. J Appl Physiol 1992; 72: 20692074. 28. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P, Kovanen V, Risteli J, Takala TE. Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and lengthened positions. Acta Physiol Scand 2003; 177: 473481. 29. Savolainen J, Vnnen K, Puranen J, Takala TE, Komulainen J, Vihko V. Collagen synthesis and proteolytic activities in rat skeletal muscles: effect of cast-immobilization in the lengthened and shortened positions. Arch Phys Med Rehabil 1988; 69: 964969. 30. Chakraborti S, Mandal M,Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation of matrix metalloproteinases.Mol Cell Biol 2003; 253:269 285. 31. Guerin CW, Holland PC. Synthesis and secretion of matrix degrading metalloproteinases by human skeletal satellite cells. Dev Dyn 1995; 202: 9199. 32. Curran S, Murray GI. Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumor invasion and metastasis. Eur J Cancer 2000; 36: 1621-1630. 33. Nagase H, Woessner JFJr. Matrix metalloproteinases: a minireview. J Biol Chem 1999; 274: 2149121494. 34. Yohei O, Hideaki T, Seiki M. Multifuncional roles of MT1-MMP in myofiber and morphostatic of sketal muscle. J Cell Sci 2006; 22: 38223832.

30 35. Carmeli E, Haimovitch TG. The expression of MMP-2 following immobilization and high-intensity running in plantaris muscle fiber in rats. Scientific World Journal 2006; 6: 542-50. 36. Rodolico C, Mazzeo A, Toscano A, Messina S, Aguennouz M, Gaeta M, Messina C, Vita G. Specific matrix metalloproteinase expression in focal myositis: an immunopathological study. Acta Neurol Scand 2005; 112: 173-7. 37. Carmeli E, Haimovitch TG, Nemcovsky CE. Expression of matrix metalloproteinase 2 and heat shock protein-72 in immobilized muscle in rats. J Musculoskelet Neuronal Interact 2006; 6: 96-102. 38. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Srensen FB, Suuronen T, Takala TE. Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical stimulation. Muscle Nerve 2000; 23: 580-9. 39. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ, Zhou AL, Egginton S, Brown MD, Madri JA, Hudlicka O. Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced angiogenesis in rat skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000; 279: H15401547. 40. Van Gieson EJ, Skalak TC. Chronic vasodilatation induces matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation 2001; 8: 2531. 41. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the snake Bothrops asper. Mediators Inflamm 2002; 11: 121-8. 42. Reznick AZ, Menashe O, Bar-Shai M, Coleman R, Carmeli E.Expression of matrix metalloproteinases, inhibitor, and acid phosphatase in muscles of immobilized hindlimbs of rats. Muscle Nerve 2003; 27: 51-9. 43. Chang C, Werb Z. The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion, angiogenesis, and metastasis. Trends Cell Biol 2001; 11: 3743. 44. Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP. Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol 1997; 74: 111-22. 45. Singh A, Nelson-Moon ZL, Thomas GJ, Hunt NP, Lewis MP.

31 Identification of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors type 1 and 2 in human masseter muscle. Arch Oral Biol 2000; 45: 431-40. 46. Lluri G, Jaworski DM.Regulation of TIMP-2, MT1-MMP, and MMP-2 expression during C2C12 differentiation. Muscle Nerve 2005; 32: 492-9.

32

2.2. Artigo 2- Submetido para publicao no peridico Revista Brasileira de Fisioterapia/Brazilian Journal of Physical Therapy (Anexo II).

Distribuio do colgeno IV no remodelamento de msculo esqueltico de rato aps crioleso Colagen IV distribution during rat skeletal muscle remodeling after cryolesion

Dayane Aparecida Mesquita1, Vanessa Christina Santos Pavesi2, Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari3, Dcio dos Santos Pinto Jnior4, Fbio Daumas Nunes4, Manoela Domingues Martins3.
1

Aluna de Iniciao Cientfica do Curso de Fisioterapia da Universidade Nove

de Julho e bolsista de Iniciao Cientfica FAPESP;

2

Aluna de mestrado em Cincias da Reabilitao da Universidade Nove de

Julho e bolsista de Mestrado FAPESP;

3

Docentes do Mestrado em Cincias da Reabilitao da Universidade Nove de

Julho UNINOVE;
4

Professor Associado do Departamento de Estomatologia, Disciplina de

Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da USP.

Endereo para contato: *Manoela Domingues Martins, Rua Demstenes, 636 apto 11, Campo Belo, CEP 04614-010, So Paulo-SP, Brasil, 11-83156030 Email: manomartins@gmail.com TTULO CONDENSADO: Colgeno IV no remodelamento muscular

33 RESUMO O objetivo do presente estudo foi investigar a distribuio do colgeno IV durante a regenerao muscular esqueltica em modelo de crioleso em rato. Foram utilizados 25 ratos da linhagem Wistar submetidos a crioleso no msculo tibial anterior (TA) do lado esquerdo e o msculo contralateral foi o controle. Os animais foram divididos aleatoriamente em 4 grupos, os quais foram avaliados 1 dia, 7 dias, 14 dias e 21 dias aps a leso. Foi realizado um grupo sham, animais controle, que receberam apenas o procedimento cirrgico. O peso corpreo e dos msculos foram obtidos em todos os tempos experimentais. Os msculos foram analisados pela colorao de H&E e o colgeno IV pela tcnica imuno-histoqumica. Histologicamente, os msculos controle mostraram morfologia normal, o grupo sham exibiu leve infiltrado inflamatrio e clulas musculares com ncleo centralizado. No grupo criolesionado foi observado aps 1 dia moderado infiltrado inflamatrio e reas de necrose. Aps 7 dias pode-se observar reduo significativa do processo inflamatrio, ausncia de necrose e presena de clulas musculares imaturas. Aos 21 dias o msculo mostrou evidncia de reparo completo. O colgeno IV mostrou-se desorganizado por entre as fibras lesadas no primeiro dia aps a crioleso e se reorganizou gradualmente durante as fases de remodelamento muscular ao longo dos 21 dias. Conclui-se que existem modificaes na distribuio do colgeno IV ao longo do remodelamento muscular aps crioleso e que este componente da MEC leva em torno de 21 dias para se organizar de forma semelhante aos msculos normais

Palavras chave: msculo esqueltico, matriz extracelular, colgeno IV, remodelamento muscular

34 ABSTRACT The aim of the present study was to investigate the distribution of collagen IV during skeletal muscle regeneration after cryolesion in rats. Twentyfive adult Wistar rats were used. One of the tibialis anterior muscles was cryolesioned and the contralateral muscle was used as the control. The animals were divided into 4 groups: 1, 7, 14 and 21 days post-injury. One sham group, in which animals received only the surgical procedure was included and analyzed after 7 days. Animals were sacrificed and the muscles were submitted to hematoxylin-eosin and immunohistochemistry staining. Histologically, the control muscles showed normal morphology and the sham group exhibited an inflammatory infiltrated. After 1 day, the cryolesioned group exhibit moderate inflammatory infiltrated and necrosis areas. At 7 days a significant reduction of the inflammatory process, absence of necrosis and presence of immature muscular cells could be observed. The injured group revealed total remodeling after the 21 days. Collagen IV revealed a disordered pattern of distribution after 1 day post-injury and gradually it was reorganized during the 21 days of the muscle regeneration. In conclusion, this study demonstrates that collagen IV staining vary according to the phase of tissue repair after cryolesion. This component of the extracellular matrix leads around 21 days to organize itself of similar form to the normal muscles. Key Words: skeletal muscle, extracellular matrix , collagen IV, muscle remodeling

35 INTRODUO O msculo esqueltico morfologicamente consiste de fibras musculares, sendo estas, constitudas de miofibrilas e clulas satlites embebidas em uma matriz extracelular (MEC), associados a uma rede de vasos sanguneos e nervos
1,8

. Frente a estmulos fisiolgicos e patolgicos distintos, este tecido

possui capacidade de se adaptar, o que caracteriza a sua propriedade de plasticidade 5,8. O processo de remodelamento muscular complexo, ocorre em vrias etapas interconectadas (necrose/degenerao, inflamao, reparo e fibrose) que envolvem a ativao de diferentes tipos de clulas e de uma ao coordenada entre a degradao e sntese da MEC com a funo de restabelecer a estrutura e funo do tecido muscular 2,3,4,7,8,9,20,22,23. No tecido muscular adulto, um grupo distinto de molculas da MEC est envolvido na manuteno da sua estrutura e funo normal. As protenas predominantes so a laminina-2 e 4 , fibronectina, tenascina, colgeno I, III e IV, e as proteoglicanas como o sulfato de dermatano e de heparana. Modificaes na composio da MEC em msculo esqueltico sob condies fisiolgicas e patolgicas tm sido demonstradas
9,11

e, em especial , so

analisados os colgenos e as metaloproteinases de matriz (MMPs). Dentre os diversos tipos de colgenos que podem ser observdos no msculo, o tipo IV, o principal componente da membrana basal, sendo responsvel pela manuteno da estabilidade mecnica da fibra muscular esqueltica. Tem sido sugerido que o colgeno tipo IV tem um papel crtico no arranjo dentro do tecido, embora ele sozinho constitua uma pequena parte do total da MEC. No entanto, a tolerncia da membrana basal celular ao estresse, como no caso de leses, serem dependente da integridade desta protena 9. Com o intuito de estudar a regenerao muscular e os recursos teraputicos utilizados na reabilitao de leses musculares, vrios modelos experimentais em animais foram desenvolvidos10,11,16,17,19,21,25 tais como: crioleso, miotoxina, contuso, eletroestimulao, exerccio fsico,

desnervao, desvascularizao que apresentam caractersticas prprias de resposta tecidual. Entretanto, existem lacunas no conhecimento no que diz respeito a distribuio da MEC durante o remodelamento muscular. Com base no exposto, o presente estudo teve como objetivo analisar o padro de

36 distribuio do colgeno IV, a curto e longo prazo, durante o remodelamento do msculo tibial anterior de rato submetido crioleso.

MATERIAL E MTODOS A metodologia utilizada neste estudo foi elaborada atendendo s resolues 196/96 do Conselho Nacional de Sade e aprovada pelo Comit de tica (protocolo ANO13/2007-Anexo III). O protocolo experimental utilizado neste estudo segue os princpios de tica e experimentao animal, elaborados pelo COBEA (Colgio Brasileiro de Experimentao Animal), entidade filiada ao International Council of Laboratory Animal Science (ICLAS) com base nas normas internacionais, que visam o aprimoramento de condutas na experimentao animal baseando-se em trs princpios bsicos: sensibilidade, bom senso e boa cincia. Animais Foram utilizados 25 ratos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia, Mammalia da linhagem Wistar) machos, com 8 semanas de vida, com peso mdio inicial de 234g 37,99g mantidos no biotrio da UNINOVE- Unidade Vergueiro. Os animais foram mantidos em caixas plsticas apropriadas, temperatura ambiente (25C) e luminosidade controlados com ciclo de 12 horas sendo que os animais possuram comida e gua ad libitum. Em todos os animais utilizados neste estudo um msculo tibial anterior (TA) foi criolesionado (pata esquerda) e o TA contralateral (pata direita) foi usado como controle. Os animais foram divididos randomicamente em cinco grupos sendo classificados de acordo com os perodos de avaliao aps a leso em: Grupo 1dia (n=5), Grupo 7 (n=5), Grupo 14 dias (n=5) e Grupo 21 dias (n=5) e Grupo sham 7 dias (n=5) que foram animais controle, que receberam apenas o procedimento cirrgico (inciso e exposio do TA), sem crioleso. Os grupo 1 e 7 dias so considerados perodos de avaliao de remodelamento muscular de curto prazo, enquanto que aps 14 e 21 dias de agresso muscular pode-se considerar avaliao de longo prazo.

37 Modelo de Crioleso Os procedimentos cirrgicos foram realizados aps os animais terem sido anestesiados com injeo intramuscular de anestsico geral injetvel a base de Ketamina (Dopalen) e de Xilazina (Anasedan). Para aplicao da anestesia intramuscular foram utilizadas seringas da marca BD 100 Unidades com Agulha BD Ultra-Fine, modelo insulina com a agulha Ultra-Fine (regular), comprimento: 12,7 mm, calibre: 0,33 mm e bisel trifacetado. Cada animal foi anestesiado utilizando-se uma mistura de ketamina (0,1 ml/100 gramas do animal) e de xylazina (0,1 ml/100 gramas do animal). O modelo de crioleso que foi utilizado est de acordo com o descrito por Miyabara et al. 16 . A pele que recobre o msculo da pata esquerda foi tricotomizada, limpa, a seguir foi realizada uma inciso transversal e afastamento da fscia que o recobre. A crioleso foi realizada por meio de duas aplicaes (durao de 10 segundos cada), utilizando basto metlico de extremidade plana, previamente resfriado em nitrognio lquido, diretamente na musculatura. O basto metlico a ser utilizado no msculo TA foi de 0.4 x 1 cm. Aps o procedimento foi realizada a sutura das reas incisadas utilizando-se fio de poliamida (6,0) e os animais foram mantidos em gaiolas com aquecimento para prevenir a hipotermia. O modelo de leso muscular por meio de crioleso foi o escolhido para este estudo devido ao fato deste, ser um modelo no qual se consegue executar uma injria na superfcie ventral do msculo, com caractersticas semelhantes, de forma limpa, causando menor variabilidade na severidade da leso18. Os animais foram pesados antes da realizao da leso e nos dias de sacrifcio de cada grupo. Os animais foram sacrificados com overdose de anestsico.

Tcnica histolgica Aps o sacrifcio dos animais, os msculos TA (controle e tratado) foram cuidadosamente dissecados, divididos em dois fragmentos, proximal e distal, imediatamente resfriados em isopentano por 10 segundos e congelados a seguir em nitrognio lquido. Os fragmentos musculares foram posicionados de

38 modo a fornecer, durante a microtomia cortes transversais. Esses materiais foram armazenados em freezer -70 C. Cortes seriados de 10 m foram obtidos em criostato, temperatura de 20C, coletados em lminas de vidro silanizadas e submergidos em acetona e secos temperatura ambiente por 10 minutos em cada etapa. Para anlise morfolgica utilizou-se colorao com Hematoxilina e Eosina (HE) e os cortes histolgicos foram avaliados por microscopia de luz (microscpio Axioplan 2 Zeiss). Os critrios morfolgicos utilizados para avaliar as etapas do remodelamento tecidual foram a presena e o tipo de infiltrado inflamatrio, edema, necrose, fibras com ncleos centralizados e fibras com nuclolos proeminentes.

Tcnica imuno-histoqumica Com o intuito de avaliar a imunomarcao do colgeno IV, seces histolgicas foram obtidas e as lminas passaram pelo procedimento de bloqueio da peroxidase endgena que consistiu em banhos de: (1) 15min em soluo de metanol 50%; (2) lavagem em gua destilada; (3) imerso em tampo fosfato (PBS1X) por 10 min; (4) imerso em tampo PBS1X / BSA 2% por 20 e (5) imerso em tampo PBS 1X por 10 minutos. Aps as etapas descritas, as lminas foram incubadas na presena de anticorpo primrio anti-colgeno IV (Dako, anti-mouse, lote MO785) diludo 1:50 em soluo de PBS1X/ BSA por 1 hora. Ao trmino do perodo de incubao, as lminas foram lavadas com tampo PBS1X por 10 min e incubadas com anticorpo secundrio conjugado a peroxidase HRP do Kit DakoCytomation LSAB plus System HRP por 30 min. Ao final desta incubao, foi realizada a lavagem novamente com tampo PBS1X por 10 min e incubao com o anticorpo tercirio (deste mesmo kit) por 30min. Retirado o anticorpo tercirio, as lminas passaram por uma lavagem final com PBS 1X seguiu-se com o procedimento de deteco. A deteco consistiu de incubao com soluo cromgena, contendo 0,03% de 3-31-diaminobenzidina (tabletes DAB, Novocastra) em tampo Tris-Hcl 0,05M, pH 7,4 e adicionado perxido de hidrognio a 0,3%. Aps a revelao, foi realizada a contra-colorao das

39 lminas com soluo de hematoxilina de Mayer, durante 10 minutos, seguida de lavagem em gua corrente por 10 minutos e passagem em gua destilada. A seguir as lminas passaram pelo processo de desidratao em cadeia de concentrao ascendentes de etanol (etanol 50% a etanol absoluto), diafanizao em xilol e, finalmente, a montagem em meio sinttico (Erv-Mount, Erviegas). Todas as reaes foram acompanhadas de controles positivos. No controle negativo os anticorpos primrios foram substitudos por albumina srica bovina (BSA) a 1% diluda em tampo TRIS-HCL, pH 7,4.

Anlise estatstica Na anlise do peso dos msculos e dos animais os dados obtidos foram de peso inicial e peso no sacrifcio; peso de msculo normal e peso de msculo criolesionado, medidos em diversos momentos (1, 7, 14 e 21 dias). Para a anlise estatstica foi adotado um modelo inteiramente casualizado

considerando 5 momentos com 5 repeties. Os dados no apresentavam distribuio normal. Neste caso, foram usadas as transformaes recprocas quadrticas para peso inicial e no sacrifcio bem como, logartmica para os msculos criolesionados e recproca para os msculos controle. Na anlise para peso dos animais inicial e no sacrifcio os dados apresentaram distribuio normal e foi feita uma anlise da varincia Anova com aplicao do teste F e atribuda significncia de 5% (p0.05). RESULTADOS Peso dos animais e peso dos msculos Durante todo o perodo experimental, os animais apresentaram aspecto saudvel, sem manifestao de distrbios locomotores. A anlise estatstica do peso inicial dos animais revelou que o p-valor obtido pelo teste F foi maior que 5%, mostrando que o peso inicial dos animais para os diversos momentos no difere significativamente, ou seja, os pesos iniciais podem ser considerados homogneos. Entretanto, quando analisados os resultados do peso dos animais aps o sacrifcio o p-valor do teste F foi menor que 5%, indicando que existe diferena entre os momentos para o peso no sacrifcio. Para verificar em quais momentos os pesos diferiam, foi feito um teste de

40 Tukey para comparaes mltiplas. Os resultados mostraram que os animais do dia 1 no apresentaram diferena de peso no sacrifcio em relao aos animais do dia 7 e sham. Entretanto, quando comparado aos animais aps 14 e 21 dias observou-se que os animais ganharam peso com o passar do tempo de forma estatisticamente significante. A Figura 1 mostra o peso corporal mdio inicial e final dos animais nos diferentes perodos de tempo analisados.

Figura 1 - Peso corporal mdio (g) inicial e final desvio padro dos animais durante todos os perodos experimentais.

A anlise do peso dos msculos controles ao longo dos perodos experimentais mostrou que o p-valor do teste F foi maior que 5%, indicando que no existe diferena entre os momentos. Entretanto, o peso dos msculos criolesionados variou de forma a apresentar diferena estatisticamente significante (p 0.05) indicando que existe diferena entre os grupos analisados de acordo com o tempo aps leso. Para verificar em quais momentos os pesos diferiram, foi feito um teste de Tukey para comparaes mltiplas. Foi observado que os animais aps 7 dias, tanto com crioleso ou sem (sham) mostraram perda de peso muscular com diferena estatisticamente significante entre os demais perodos (Figura 2).

41

Figura 2 - Peso mdio (g) do msculo criolesionado e controle desvio padro dos animais durante todos os perodos experimentais.

Anlise morfolgica O resultado da anlise histopatolgica dos msculos controle mostrou que os mesmo exibem morfologia normal, com presena de fibras com ncleo perifrico, de formato poligonal e sem sinais de leso ou processo inflamatrio (Figura 3a). O grupo sham apresentou leve infiltrado inflamatrio predominantemente mononuclear situados em regio superficial (Figura 3b). Na anlise de curto prazo, ou seja, 1 e 7 dias aps injria exibiram processo inflamatrio e degenerao de fibras musculares de forma mais intensa do que os msculos avaliados em longo prazo, 14 e 21 dias, que mostraram reorganizao das fibras musculares e discreto processo

inflamatrio residual. No grupo criolesionado aps 1 dia foi observado intenso edema entre as fibras musculares (Figura 3c), moderado infiltrado inflamatrio com neutrfilos e macrfagos dispersos por entre as fibras de aspecto normal e reas de

necrose(seta) caracterizadas pelo rompimento e desorganizao das fibras musculares .

42 Aps 7 dias pode-se observar reduo do processo inflamatrio (Figura 3d), ausncia de necrose e presena de clulas com ncleo centralizado e fibras cortadas (separadas) indicando renovao tecidual. Formao de vasos novos (angiognese) entre as novas fibras pode ser evidenciada de forma exuberante nesta fase. Aps 14 dias, apenas algumas clulas musculares com ncleo centralizado e fibras separadas foram notadas. No foram evidenciadas clulas inflamatrias aps este perodo (Figura 3e). Aos 21 dias o msculo mostrou evidncia de reparo (regenerao) completa morfologicamente (Figura 3f).

Figura 3. Fotomigrafias dos cortes histolgicos de msculos controle e criolesionados corados por hematoxilina & eosina. Msculo controle exibindo morfologia normal (A, 400x). Grupo sham exibindo processo inflamatrio na regio superficial do (B, 100x). A rea criolesionada aps 1 dia

43 mostrando edema intercelular, necrose das clulas musculares (seta) e infiltrao de neutrfilos (*) (C, 400x). Aps 7 dias nota-se manuteno do edema, diminuio do infiltrado inflamatrio e fibras regeneradas imaturas(setas) (D, 100x). Em longo prazo nota-se restabelecimento da arquitetura muscular aos 14 dias, diminuio do edema e clulas musculares regeneradas pequenas (E, 400x). Aos 21 dias observou-se ausncia de edema e de infiltrado inflamatrio, clulas musculares maiores, de aspecto poligonal e com maior grau de maturao. Apenas algumas clulas exibiam ncleo ainda no totalmente disposto na periferia (F, 400x). Anlise imuno-histoqumica Na anlise imuno-histoqumica dos msculos normais (controle), em todos os perodos experimentais, foi observado que o colgeno IV esteve presente como uma linha tnue envolvendo as fibras musculares (endomsio) e com marcao mais abundante no perimsio (Figura 4 a,b,c) porm houve alterao na intensidade desta marcao, tanto no endomsio quanto no perimsio, dependendo do estgio (perodo) de regenerao muscular. Aps 1 dia de injria pode-se observar uma modificao no padro de marcao e distribuio do colgeno IV tanto no perimso como no endomsio (Figura 4 d). A imunomarcao mostra um colgeno IV mais difuso por entre as clulas musculares lesadas e em algumas clulas com ntido rompimento de sarcolema evidencia-se marcao intra-citoplasmtica desta protena (Figura 4 e,f) Aos 7 e 14 dias o colgeno IV mostrou uma marcao delimitando as fibras musculares jovens, com ncleo centralizado entretanto, em reas focais onde ainda no houve a fuso completa dos mioblastos, o colgeno IV encontra-se difuso, disperso na MEC em reorganizao (Figura 4 g, h, i). Foi evidenciada marcao mais intensa para o colgeno IV nos msculos criolesionados aps 14 dias em comparao ao controle e demais perodos analisados (Figura 4 j, k, l). Aos 21 dias ps-agresso verificou-se que o padro de marcao do colgeno IV foi semelhante ao do msculo controle, mesmo havendo algumas

44 clulas apresentando aspecto morfolgico imaturo, com ncleo centralizado (setas) (Figura 4 m, n, o).

Figura 4.Distribuio do colgeno IV no remodelamento do msculo tibial anterior de rato. No msculo controle nota-se linha tnue de marcao do colgeno IV no endomsio (*) (a, 40x; b, 100X; c,400x) e perimsio (seta) (a,40x). Aps 1 dia de crioleso nota-se o colgeno IV ainda delimitando algumas clulas lesadas (seta), espalhado no endomsio (d, 40x; e, 100x) e disposto intracelularmente quando h rompimento evidente do sarcolema (*) (f, 400x). Aps 7 (g, 40x; h, 100x; i,400x) e 14 dias (j, 40x; k, 100x; l,400x)o colgeno IV em reas est difuso de permeio as clulas musculares imaturas e em reas delimita o sarcolema de clulas musculares regeneradas pequenas, mas com ncleos perifricos (setas). Aos 21 dias nota-se padro de

45 normalidade na distribuio do colgeno IV no perimsio e endomsio (m, 40x; n, 100x; o, 400x).

DISCUSSO Os resultados deste estudo mostram que o trauma agudo, por meio de crioleso em animais, tem impacto importante na distribuio do colgeno IV nas diferentes etapas do remodelamento muscular. Evidenciou-se que mesmo havendo colgeno IV presente no tecido, este necessita cerca de 21 dias para se organizar de forma semelhante ao msculo no agredido, tanto no endomsio quanto no perimsio. No que diz respeito anlise morfolgica dos msculos aps a crioleso nosso resultados esto de acordo com os descritos por Miyabara et al., que identificaram regenerao completa aps 3 semanas de injria. Entretanto, nenhum estudo do arranjo da MEC durante o remodelamento aps crioleso foi encontrado na literatura. Os trabalhos que analisam colgeno IV utilizam metodologias de treinamento prolongado13, contraes12,14, exerccios agudos
6,10,11,17,21,25

, hipertrofia compensatria experimental24 onde os resultados

demonstram um aumento na quantidade desta protena tecidual. Essas pesquisas avaliam a relao entre a agresso muscular e a quantidade de colgeno total ou de algum subtipo de colgeno. Esta forma de anlise importante, porm o conhecimento da localizao e da distribuio do colgeno fundamental, pois a presena de colgeno IV disperso pela MEC sem a organizao no garante o suporte mecnico adequado s fibras musculares. Os achados da anlise de curto prazo, aps 1 dia de injria, mostram que neste modelo de injria h leso muscular acompanhada de rompimento da membrana plasmtica da clula muscular, mionecrose, edema intercelular, inflamao acompanhado da desorganizao da estrutura da matriz de colgeno. Neste momento o colgeno IV observado delimitando algumas clulas musculares, entretanto, devido ao rompimento da membrana plasmtica essa protena passa a ocupar o espao intra-citoplasmtico. Aps 14 dias, um dos perodos de avaliao de longo prazo, a rea criolesionada mostrou restabelecimento das caractersticas morfolgicas normais sendo que,

46 algumas clulas musculares ainda se encontram imaturas. Ao

correlacionarmos com os achados da distribuio do colgeno IV fica evidenciado que a MEC ainda no estava madura uma vez que o colgeno IV apresentou-se disperso por entre as fibras musculares de maneira difusa e apenas aps a organizao mais poligonal das clulas musculares o colgeno IV se posicionou delimitando a clula como componente da membrana basal reorganizada. Apenas aos 21 dias pode-se verificar a maturao morfolgica e a distribuio do colgeno IV de forma semelhante ao tecido muscular normal, tanto no endomsio quanto no perimsio. Nossos achados diferem dos observados por Koskinen et al.12 no qual contraes excntricas no levaram a alterao da imunomarcao do colgeno tipo I, III e IV no msculo TA de ratos. Esses autores verificaram que ambos os tipos de colgeno estavam localizados tanto nas fibras aumentadas, necrticas e regeneradas, observados aps 6h, 2 dias e 7 dias, de forma similar ao msculo no lesionado. Essa diferena de distribuio do colgeno pode estar relacionada ao fato do dano celular no modelo de crioleso ser maior do que o observado no modelo de injria muscular por contrao e corrobora com a afirmao de Koskinen et al.11de que alteraes na concentrao de colgeno IV dependem da severidade do dano muscular. A MEC do msculo possui um papel importante na transmisso lateral da fora produzida nas fibras musculares. Esta transmisso diminui a agresso causada pela contrao conseqentemente, mudana na composio da MEC pode conduzir s mudanas na habilidade do msculo de transmitir a fora e o limite entre contrao/dano muscular. Dentre as protenas da MEC, o colgeno IV, apesar de estar em pequena quantidade, tem sido considerado o componente da MEC responsvel pela estabilizao mecnica das fibras musculares e organizao das clulas musculares no tecido. Assim sendo, a morfologia tecidual e a resistncia tecidual parecem dependentes da integridade da membrana basal e do seu componente colagenoso 9. Os presentes achados permitiram verificar que a integridade da MEC,

especialmente com relao a distribuio adequada do colgeno IV, foi alcanada apenas fases mais tardias do processo de regenerao aps crioleso e, desta forma, antes deste perodo o msculo no possui a

47 capacidade total de transmisso de foras geradas por contraes musculares tornando-se mais vulnervel a uma nova leso. Os resultados do presente estudo mostram que uma leso local pode ter influncia no peso muscular, neste caso observado por meio da diminuio da massa muscular quando comparado os animais submetidos crioleso com os controles. Esses achados podem ser decorrentes da diminuio do nmero de clulas musculares devido necrose tecidual que foram substitudas por edema inflamatrio. No que diz respeito ao peso corpreo dos animais no houve alterao do ganho de peso ao longo dos 21 dias mostrando que este modelo de agresso muscular no afeta os hbitos alimentares e de locomoo dos animais. Ambos os resultados corroboram os observados por Miyabara et al.16 . Conclui-se que existem modificaes na distribuio do colgeno IV ao longo do remodelamento muscular aps crioleso e que este componente da MEC leva em torno de 21 dias para se organizar de forma semelhante aos msculos normais. Estes dados so importantes para que condutas reabilitadoras sejam aplicadas de forma a no gerar maior dano tecidual e possam propiciar um remodelamento adequado da MEC, restabelecendo a integridade morfolgica e funcional do msculo afetado.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Best TM, McElhaney J, Garrett WE Jr, Myers BS. Characterization of the

passive responses of live skeletal muscle using the quasi-linear theory of viscoelasticity. J Biomech. 1994; 27(4):413-419. 2. Bischoff R. Myogenesis. McGraw-Hill, New York, 1994. Brinckerhoff,

Matrisian, 2002. 3. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29(2): 191197. 4. Chakraborti S , Mandal M, Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation

of matrix metalloproteinases: An overview. 2003; 258(1-2): 269-285. 5. Goldspink G. Selective gene expression during adaptation of muscle in

response to different physiological demands. Comparative Biochemistry and Physiology Part B 1999; 120 (1): 5-15.

48 6. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV,

Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers Arch. 1999;437(6):857-64 7. Hawke TJ, Garry DJ. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol 2001; 91:534551. 8. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in

research.J Bone Joint Surg Am. 2002; 84-A(5):822-32. 9. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal

muscle to mechanical loading. Physiol Rev. 2004; 84(2):649-98. 10. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Srensen FB, Suuronen T, Takala TE.

Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical stimulation. Muscle Nerve. 2000; 23(4):580-9. 11. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjr M, Han XY, Komulainen J,

Kovanen V, Takala TES. Turnover of basement membrane type IV collagen in exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001; 280(5): R1292 R1300. 12. Koskinen SOA, Athikoski AM, Komoulainen J, Hesselink MKC, Drost

MR, Takala TES. Short-term effects of forced eccentric contractions on collagen synthesis and degradation in rat skeletal muscle. Pflugers Arch. 2002; 444(1-2): 5972. 13. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, Risteli L. Type IV collagen and laminin in slow and fast skeletal muscle in ratseffects of age and life-time endurance training. Coll Relat Res.1988; 8(2): 145153. 14. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T, Roper HP. Skeletal

muscle collagen content in humans after high-force eccentric contractions. J Appl Physiol. 2004; 97(1):197-203. 15. Miyabara EH, Aoki MS, Moriscot AS. Cyclosporin A preferentially

attenuates skeletal slow-twitch muscle regeneration. Braz J Med Biol Res. 2005; 38(4):559-563. 16. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG, Moriscot AS. Expression of tropism-

related genes in regenerating skeletal muscle of rats treated with cyclosporin-A. Cell Tissue Res. 2005; 319(3):479-489.

49 17. Myllyl R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen

metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise injuries. Pflugers Arch. 1986; 407(1):64-70. 18. Oliveira NML, Gava AD, Salvini TF. Crioterapia na leso muscular: uma

anlise morfomtrica. Rev bras fisioter. 2007; 11(5): 403-409. 19. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez

JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the snake Bothrops asper. Mediators Inflamm. 2002;11(2):121-128. 20. Sakuma K, Nishikawa J, Nakao R, Watanabe K, Totsuka T, Nakano H,

Sano M, Yasuhara M. Calcineurin is a potent regulator for skeletal muscle regeneration by association with NFATc1 and GATA-2. Acta Neuropathol. 2003 Mar;105(3):271-280. 21. Savolainen J, Vnnen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES. Effect of

immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J Physiol. 1987; 252(5 Pt 2):R883-888. 22. Shi X, Garry DJ. Muscle stem cells in development, regeneration, and

disease. Genes Dev. 2006; 20(13):1692-1708. 23. Tidball, JG, Wehling-Henricks, M. Damage and inflammation in muscular

dystrophy: potential implications and relationships to autoimmune myositis Current Opinion in Rheumatology Curr Opin Rheumatol. 2005; 17(6):707-13. 24. Wiliams PE and Goldspink G. Connective tissue changes in surgically

overloaded muscle. Cell Tissue Res. 1981; 221(2):465-470. 25. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK & Thomas DP. Age and

training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb muscle. J Appl Physiol. 1993; 75(4):1670-1674.

50

2.3. Artigo 3- Submetido para publicao no peridico European Journal Journal of Applied Physiology (Anexo IV).

Estudo da imunolocalizao e atividade da MMP-2 e MMP-9 durante o remodelamento do msculo esqueltico aps injria

V. C. S. Pavesi R.A.Mesquita-Ferrari S.K.Bussadori F.D.Nunes K.P.S.Fernandes D.A.Biasotto-Gonzalez M.D.Martins.

V. C. S. Pavesi R.A.Mesquita-Ferrari S.K.Bussadori K.P.S.Fernandes D.A.Biasotto-Gonzalez M.D.Martins, Mestrado em Cincias da Reabilitao, Universidade Nove de Julho- UNINOVE, So Paulo, Brazil. F.D.Nunes, Departamento de Estomatologia, Disciplina de Patologia Bucal, Faculdade de Odontologia, Universidade de So Paulo, So Paulo, Brazil.

Autor Correspondente: Manoela Domingues Martins Rua: Demstenes, 636 apto.11 CEP 04614-013 Campo Belo Brazil Phone/FAX: 11-55425422 manomartins@gmail.com So Paulo SP

51 RESUMO

O objetivo do presente estudo foi investigar a imunomarcao e atividade MMP-2 e MMP-9 durante o reparo muscular aps crioleso. Sessenta ratos Wistar adultos foram usados. O msculo tibial anterior esquerdo foi criolesionado e o msculo contralateral foi usado como controle. Os animais foram divididos em 6 grupos: 1, 7, 14 e 21 dias ps-leso, grupos sham e controle. Os animais foram sacrificados, foram realizados cortes do tecido que foram coradas por hematoxilina-eosina e submetidos a imunomarcao, outras amostras foram submetidas anlise zimografica. O grupo injuriado revelou total remodelamento tecidual aps 21 dias. A distribuio e imunomarcao das MMP-2 e MMP-9 apresentaram perfil semelhante ao longo de todo o perodo estudado. A anlise imuno-histoqumica revelou um aumento na marcao das MMPs aps 1 dia, seguido por uma reduo de 7 e 14 dias e aumento 21 dias aps a crioleso. A zimografia mostrou uma maior atividade da MMP-2, depois de 1 dia da crioleso e uma diminuio aps 7 dias. Aps 14 e 21 dias, a MMP-2 nveis foram semelhantes ao grupo controle. A atividade da MMP-9 foi detectada, mas foi em pequena quantidade em todos os grupos. Em concluso, o presente estudo demonstra que a MMP-2 e MMP-9 a marcao e a atividade da MMP-2 varia de acordo com a fase de reparo tecidual, indicando um papel diferente das MMPs musculares em todo o processo de reparao.

Palavras-chave: Matrix metaloproteinases (MMPs), msculo esqueltico, MMP-2, MMP-9; remodelamento; crioleso.

INTRODUO

Msculo esqueltico um tecido dinmico que tem um elevado grau de plasticidade funcional e estrutural em resposta atividade contrtil, a danos diretos (por exemplo, laceraes, contuses, estiramentos) ou a danos indiretos (por exemplo, isquemia, disfuno neurolgica) (Huard et al. 2002; Cossu e Biressi 2005; Shi e Garry 2006). Muitos modelos tm sido propostos

52 para a investigar os mecanismos de regenerao do msculo esqueltico, incluindo esmagamento, congelamento, injrias qumicas ou por veneno (d'Albis et al. 1988; Garry et al. 1997; Cornelison et al. 2004, Durigan et al. 2008 ). O modelo de crioleso tem sido eficaz na induo da leso e posterior regenerao em uma rea bem delimitada do ventre muscular e oferece uma ferida limpa e fcil reprodutibilidade (Irintchev et al. 2002; Miyabara et al. 2005). Em todos os modelos, o processo de neoformao muscular exige cluas quiescentes mononucleadas precursoras de fibras musculares (mioblastos) ao tornar-se ativado, proliferam, diferenciam e se fundem para formar clulas musculares multinucleadas jovens, conhecida como miotubos. Estes miotubos, em seguida, so submetidos a uma maior diferenciao e maturao de forma a se tornarem fibras musculares totalmente funcionais (Grounds et al 2002; Huard et al. 2002; Cossu e Biressi 2005; Shi e Garry 2006). Alm disso, novas exigncias no msculo esqueltico promovem o remodelamento da matriz extracelular (MEC), que prev o apoio estrutural e de proteo, e importante na manuteno da integridade funcional das fibras (Birkedal-Hansen et al.1993; Kjaer 2004; Carmeli et al. 2004). O remodelamento da MEC do msculo em condies fisiolgicas e

patolgicas principalmente realizada pelas metaloproteinases de matriz (MMPs), que so uma famlia de enzimas zinco-dependentes que tm a capacidade de regular a composio clula-matriz (Matrisian 1992; Kjaer 2004; Carmeli et al. 2004). MMPs so classificados em seis grandes subfamlias com base em suas estruturas primrias, organizao do domnio, especificidade do substrato e localizao na clula. Estas subfamlias so colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13, e MMP-18), gelatinases (MMP-2 e MMP-9), estromelisinas (MMP-3, MMP-10, e MMP-11), MMPs do tipo membrana (MMP-14 e MMP-17), e outros, tais como matrilisinas MMPs (MMP-7) e metaloelastase (MMP-12) (Nagase e Woessner 1999; Carmeli et al. 2004). No msculo esqueltico, MMP-2 (tambm conhecida como gelatinase A) e MMP-9 (tambm conhecida como gelatinase B) mostraram-se envolvidos em processo de resposta leso, bem como em mioptica e alteraes induzidas por inflamao (Choi & Dalakas, 2000 ; Koskinen et al. 2000; Kieseier et al. 2001, Durigan et al. 2008). Estas gelatinases principalmente quebram

53 colgeno tipo IV e outros compostos MEC. Embora haja certa preferncia para as diferentes MMPs no que diz respeito aos tipos de colgeno, a especificidade de certos tipos de MMPs em relao um determinado colgeno pode ser menor do que se pensava anteriormente (Kjaer 2004). A expresso de MMP-2 e MMP-9 no msculo esqueltico, foi encontrada aumentada em diferentes situaes patolgicas (Kieseier et al. 1999; Haas et al. 2000, Van Gieson & Skalak 2001, Bani et al. 2008; Brown e Hudlicka 2003, Durigan et al. 2008). No entanto, a sua participao no remodelamento do msculo esqueltico, especialmente em resposta a crioleso, tem sido pouco investigada . Alm disso, a maioria dos estudos simplesmente observaram a atividade destas protenas e no mostraram sua localizao especfica. Imunolocalizao importante para determinar a relao entre celulares e componentes da MEC durante o processo de remodelamento. Sabendo que a compreenso das mudanas patolgicas no msculo esqueltico so essenciais para a concepo de medidas teraputicas eficazes, o objetivo do presente estudo foi avaliar a imunolocalizao e da atividade de MMP-2 e MMP-9 na MEC durante remodelamento do msculo esqueltico aps leso .

MATERIAIS E MTODOS Sessenta ratos machos (Rattus novegicus albinus, Rodentia mammalia linhagem Wistar) pesando 250 entre 300 g foram utilizados neste estudo. Os animais foram mantidos sob condies constante de temperatura ambiente (22 C), umidade (40%), com ciclo 12/12 h dia-noite e alimentados antes e durante o perodo experimental com rao slida e gua ad libitum. Os protocolos experimentais utilizados neste estudo esto, em conformidade com os princpios de experimentao animal formulados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) e foram aprovados pelo Comit de tica da Universidade Nove de Julho. Em todos os animais, o msculo do tibial anterior (TA) foi criolesionado (perna esquerda) e o contralateral TA (perna direita) foi utilizado como controle. Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos (10 animais / grupo). Quatro grupos foram divididos de acordo com o perodo analisado: 1, 7, 14 e 21 dias aps a leso. Outros grupos denominados grupos sham e controle

54 foram includos. O grupo Sham foi composto por animais que foram submetidos ao procedimento cirrgico, porm no sofreram crioleso e foram analisados aps 7 dias. O grupo controle foi representado por animais sem qualquer tipo de manipulao dos tecidos. Os procedimentos cirrgicos foram realizados sob a administrao da ketamina 1mL/kg de 1% HCL (Dopalen, Vetbrands, So Paulo) e xilazina 2% (Anasedan, Vetbrands, So Paulo, Brasil). Exposio cirrgica do msculo TA e crioleso foram realizadas conforme descrito por Miyabara et al. (2005) e constou de dois ciclos de crioleso do msculo in situ. Congelamento foi realizado mediante a aplicao de uma pea de ao (0,4 x 1 cm) previamente resfriado em nitrognio lquido na superfcie do msculo e foi mantido nesta posio por 10 s. O mesmo procedimento foi repetido duas vezes consecutivas com um intervalo de tempo de 30 s. Aps a crioleso , o ferimento foi fechado com suturas poliamida (6-0) e os animais foram mantidos por vrias horas em caixas aquecidas (37 C) para evitar hipotermia. Os animais foram sacrificados por uma overdose anestsica e os TA msculos esquerda e direita foram retirados e imediatamente congelados em isopentano resfriado e armazenado em nitrognio lquido. Os msculos congelado foram cortados em seces transversais de 10-m de espessura em criostato (Leica CM3050, Nussloch, Alemanha). Os espcimes foram corados com hematoxilina-eosina para exame histolgico e imunoistoqumico (Zeiss Axioplan 2). Os demais msculos foram congelados em nitrognio lquido e armazenadas a -80 C. Anlise imuno-histoqumica

Os cortes foram fixados em acetona 20% por 10 minutos, em seguida, incubadas durante 15 minutos em soluo de metanol 50% por duas vezes e lavados em gua destilada, incubados por 10 min em soluo fosfato-salina tamponada (PBS) 1X e 20 min, em PBS1X / 2% de albumina soro bovino (BSA) para bloquear as ligaes inespecficas. Os cortes foram incubadas por 1 h 4 com anticorpos primrios anti-MMP-2 (ABR, rato monoclonal, MMP2/8B4, MA1-16641 catlogo) e anti-MMP-9 (ABR, rato monoclonal, clone 2C3, MA112894 catlogo) com diluio 1:50 em 0,1% BSA / PBS, respectivamente.

55 Aps a incubao com o anticorpo primrio, os cortes foram exaustivamente lavados com PBS1X por 10 min e exposta ao anticorpos secundrios (1:100) (LSAB plus System HRP, Dako) por 30 min e, aps uma nova lavagem, incubadas com estreptavidina-biotina complexo durante 30 min. Os cortes foram ento incubados com diaminobenzidina tetra-hidrocloreto (DAB, Novocastra) e contracorados com hematoxilina de Mayer. Controles negativos foram obtidos atravs da substituio dos anticorpos primrios com soro noimune. A anlise das lminas foi feita de forma qualitativa objetivando descrever os achados microscpicos e o padro de imunomarcao. Todas as lminas foram avaliadas por dois examinadores previamente calibrados

Zimografia

A atividade de proteinase foi detectada em gis SDS-gelatina (Cleutjens et al., 1995). Resumidamente, tecidos congelados (40 mg) foram lavados com soluo salina fria e homogeneizados em 1 mL extrao tampo (10 mM cacodylic cido, pH 5,0, 150 mM NaCl, 1 M ZnCl2, 20 mM de CaCl2, 1,5 mM NaN3, e 0,01% Triton X -100). O pH foi aumentado para 7,5, em seguida, com 1 M Tris, pH 8.0. Teor de protena total foi estimada utilizando o corante BioRad (BioRad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.), de acordo com o mtodo de Bradford. Para o ensaio enzimtico, gis SDS (10%) foram preparados com 1 mg / mL de gelatina e foram aplicados 30 mg de protenas por faixa, sem reduo. Aps a eletroforese, gis foram lavados duas vezes durante 15 minutos cada um com 2,5% Triton X-100 a fim de eliminar SDS. Os gis foram ento incubadas overnight a 37 C em tampo substrato (50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 5 mM de CaCl2, e 0,02% NaN3). Ambos os gis foram corados por 30 min com Coomassie blue 0,05% R-250 em cido actico: metanol: gua (1:4:5) e descorados com a mesma soluo. Todos os gis foram preparados e executados ao mesmo tempo. As bandas foram quantificadas por densitometria utilizando o software Image J (NIH). A significncia estatstica foi avaliada por ANOVA seguida pelo teste Dunnett. Os ensaios enzimticos tambm foram feitos na presena de 15 mM de EDTA no substrato tampo. Foram realizados trs gis independentes (triplicata).

56 RESULTADOS

Anlise imuno-histoqumica de MMP-2 e MMP-9 revelou um padro semelhante de distribuio dessas protenas no tecido muscular. Os msculos do grupo controle apresentaram morfologia normal, a presena de fibras poligonais com ncleos perifricos e sem sinais de leso. Neste grupo, as MMPs apareceram como uma tnue linha que envolvem fibras musculares (endomisio), com imunocolorao mais abundantes no perimsio (Fig.1 a, b e 2 a, b). Os msculos obtidos de animais controle (sem manipulao) apresentaram resultados semelhantes aos obtidos a partir de msculos TA contralaterais (perna direita), que foi utilizado como msculos controle . Um dia aps leso, o msculo esqueltico exibiu infiltrao neutroflica, com edema e fibras necrticas. As MMP-2 e MMP-9 sofreram uma importante mudana na distribuio, especificamente na rea criolesionada. Comparado com o grupo controle, essas MMPs exibiram mais intensa e difusa imunomarcao entre as clulas da regio lesionada do msculo esqueltico. Na regio da crioleso revelaram-se clulas necrticas, com ruptura do sarcolema e a invaso da MMP-2 e MMP-9, no espao celular (Fig. 1 c, d e 2 c, d). Aos 7 dias, o tecido exibiu uma reduo do infiltrado inflamatrio e o aparecimento de clulas imaturas do msculo esqueltico. A rea criolesionada ainda exibiu mais intensa marcao das MMP-2 e MMP-9 em comparao com o grupo controle, mas houve menor marcao em comparao com o 1 dia grupo. A distribuio de MMP-2 e MMP-9 revelou ligeira imunomarcao no endomsio e marcao mais abundante no perimsio (Fig. 1 E, F e 2 e, f). Aos 14 dias, a imunomarcao das MMP-2 e MMP-9 em reas com regenerao de fibras do msculo esqueltico foi semelhante obtida em 7 dias. MMP-2 e MMP-9 mantiveram uma aparncia linear em torno das clulas. No entanto, em regies onde a fuso completa dos mioblastos ainda no tinha ocorrido, nota-se o aumento MMPs, com o aparecimento do MEC desorganizada e difusa (Figura 1 G, H e 2 g, h). Com 21 dias, MMP-2 e MMP-9 apresentaram aumento na

imunomarcao em endomsio quando comparado com o musculo controle e outros dias de anlise. A maioria das clulas j apresentou uma aparncia

57 madura, mas outras ainda apresentaram uma morfologia imatura com presena de um ncleo central.

Fig.1. Distribuio imuno-histoqumica da MMP-2 no msculo esqueltico em ratos. No grupo controle (A, 400x; b, 1000x) a MMP-2 aparece no endomsio seta) e perimsio (*). Depois de 1 dia ps-crioleso, um aumento de imunomarcao da protena pde ser observada (C, 400x; d, 1000x). Nota-se desorganizao da MEC (seta) e clulas necrticas (*). Em 7 dias (e, 400x, f, 1000x) e 14 dias (g, 400x; h, 1000x) uma diminuio da marcao da MMP-2

58 notada no endomsio (seta).O perimsio exibe forte marcao (*). Em 21 dias o remodelamento muscular observado com aumento na marcao da MMP-2.

Fig. 2. Anlise imuno-histoqumica da MMP-9 no msculo esqueltico. A distribuio de MMP-9 foi semelhante MMP-2. No grupo controle (A, 400x; b, 1000x) tnue linha no endomsio (seta), com abundantes imunomarcao no perimsio (asterisco). Depois de 1 dia, MMP-9 exibe mais intensiva imunomarcao (C, 400x; d, 1000x), desorganizao da MEC (seta ) e clulas necrticas (*). Aps 7 dias (e, 400x, f, 1000x) e 14 dias (g, 400x; h, 1000x) tecido exibiu uma reduo da marcao da MMP-9, em espcial no endomsio (seta) O perimsio exibe marcao forte para MMP-9 (*). Aps 21 dias, a MMP9 apresentou um aumento da imunomarcao nesse tecido.

59 A Figura 3 mostra a atividade proteoltica dos extratos do TA sobre a gelatina. Cada faixa representa um pool das amostras dos animais de cada grupo (n = 5 amostras formando um pool de 30). Os extratos musculares dos animais controle (cont) apresentaram algum grau de atividade gelatinase (Fig. 3B), que foi claramente aumentado no grupo 1 dia aps crioleso (Fig.3E). As massas moleculares das bandas ltica esto aproximadamente em 62 kDa, sugerindo a forma ativa da MMP-2. No grupo 7 dias aps crioleso (Fig3. D) foi verificada uma diminuio na atividade MMP-2, quando comparado com os outros grupos, mas nos grupos aps 14 (Fig.3F) e 21 (Fig.3G) dias um aumento de MMP-2 atividade pode ser notado mostrando que a atividade e foi semelhante ao sham (Fig.3A), os animais do grupo controle (Fig.3B) e ao controle 1 dia (fig.3C). Assim, concluiu-se que este modelo de leso, por si s aumentou actividade da MMP. As amostras que foram testadas com etilenodiamina tetraacetic (cido EDTA; no mostrados) no exibiram atividade.

Fig.3. Anlise da atividade das MMP-2 (62kDa) e MMP9 (82kDa) em extratos de msculo TA por zimografia em SDS-PAGE gelatina1%. Cada faixa representa um conjunto de amostras (n = 5; 30 de cada grupo) a partir de diferentes grupos animais - A: Sham; B: Controle; C: Controle 24h; D: Crioleso 1 dia; E: Crioleso 7 dias; F : Crioleso 14 dias; G: Crioleso 21 dias. Antes da colorao com Coomassie o gel foi incubado por 20 h em tampo substrato a 37 C.

60 Gis foram analisados por densitometria utilizando o software Image-J (NIH) e a atividade foi expressa em unidades arbitrrias, considerando-se um valor para o grupo controle. Os valores so apresentados por mdia e desvio padro (DP), P <0,05. * Diferena estatisticamente significativa entre os grupos foi analisada atravs de anlise de varincia (ANOVA) e o teste de Dunnet. Concentrao de MMP-2 no msculo TA apresentada como a mdia e o

desvio padro esto representados na Figura 4. A concentrao da MMP-2 foi determinada pela soma da densidade ptica integrada (IOD) obtida (expressos em unidades arbitrrias) para as trs faixas (pr-MMP, intermediria e forma ativa). Nenhuma diferena estatstica foi encontrada entre o controle, o controle 1 dia, sham, criolesionado 14 e 21 dias grupos. Todavia, pode-se notar um aumento significativo da concentrao da MMP-2 no grupo criolesionado 1 dia e uma diminuio significativa da concentrao presente no grupo

criolesionado 7 dias (* P <0,05, ** P <0,01; ANOVA - Dunnet's teste).

Fig.4. Concentrao de MMP-2 no msculo TA apresentados como a mdia e DP. A concentrao de MMP-2 foi determinada pela soma da densidade ptica integrada (IOD) obtida (expressos em unidades arbitrrias) para as trs faixas (pr-MMP-2, intermedirio e forma ativa). Nenhuma diferena estatstica foi encontrada entre o controle, o controle 1 dia, sham, grupos crioelsionados 14 e 21 dias grupos. Todavia, pode-se notar um aumento significativo na concentrao MMP2 no grupo criolesionado 1 dia e uma diminuio significativa da concentrao presente no grupo criolesionado 7 dias (* P <0,05, ** P <0,01; ANOVA - teste de Dunnet) .

61 A MMP-9 atividade foi detectada, mas a sua actividade foi em pequena quantidade e similares em todos os grupos analisados.

DISCUSSO

Este estudo demonstra o comportamento da imunomarcao das MMP2 e MMP-9 durante o processo de remodelamento do msculo esqueltico aps crioleso. Alm disso, anlise zimografica distingue a forma ativa da MMP-2 em todos os grupos durante cada fase de remodelamento do msculo esqueltico, no entanto, diferenas no seu nvel foi observada somente no grupo criolesionado. Estes resultados indicam um papel diferente para MMPs durante todo o processo de reparao muscular. As MMPs formam um grupo de mais de 20 enzimas com a capacidade de degradar componentes da matriz extracelular, especialmente protenas colagnicas e so essenciais ao desenvolvimento embrionrio, reproduo, remodelamento tecidual e inflamao (Carmeli et al. 2004), bem como de alterar o funes biolgicas das macromolculas da MEC (Marqueti et al. 2006). Tem sido relatado que as MMP-2 e MMP-9 em condies normais do msculo esqueltico tm expresso relativamente baixa e que essas protenas aumentam poucos dias aps leso (Carmeli et al. 2005) ou na distrofia muscular (Bani et al. 2008; Kherif et al . 1999). MMP-2 e MMP-9 nativas degradam colgenos tipos IV e V, bem como colgenos intersticial desnaturado (Aimes e Quiley 1995). Sabe-se que a MMP-2 tambm secretados no msculo esqueltico por fibroblastos e clulas satlites, j a MMP-9 um importante produto de leuccitos (Carmeli et al. 2004; Kherif et al. 1999; Trocm et al. 1998). No presente estudo, os msculos esquelticos controle apresentaram uma tnue linha de MMP-2 e MMP-9 no endomsio e maior depsito no perimsio. O grupo msculo criolesionado exibiu nas diferentes fases de rmodelamento , como a degenerao, inflamao e regenerao, um perfil diferente na distribuio de MMP-2 e MMP-9. Para explicar essas variaes de MMP-2 e MMP-9 a imunoistoquimica foi importante para demostrar que o remodelamento fisiolgicos e patolgicos do msculo esqueltico depende da

62 coordenao entre degradao e sntese de protenas intracelulares e matriz extracelular componentes (Kjaer, 2004). Assim, necessrio estabelecer um paralelo entre as MMPs, inflamao e colgeno. Degenerao muscular e inflamao ocorrerem nos primeiros dias psleso, enquanto a regenerao muscular ocorre normalmente sete a dez dias aps o estmulo. O pico do processo de regenerao geralmente se d em duas semanas e, em seguida, diminui em trs a quatro semanas ps-leso. A formao de tecido cicatricial (fibrose) comea entre a segunda e a terceira semana ps-leso e tecido cicatricial aumenta de tamanho ao longo do tempo (Huard et al. 2002). Em um dia (degenerao e inflamao fases), na sequncia , necrose da regio da crioleso e um processo inflamatrio agudo foram observados. A imunomarcao das MMP-2 e MMP-9 e a atividade aumentada da MMP2 na rea lesada, quando comparado com o controle msculos. Estes resultados corroboram uma srie de estudos que demonstram uma participao destas MMPs no transporte de clulas linfides da circulao para os tecidos, macrfagos,clulas T-adeso e clulas endoteliais para a matriz, e a propagao da resposta inflamatria (Phillips et al. 1990, Watt et al. 1994). Alm disso, possvel que MMPs eliminem fibras necrticas (Guerin e Holland 1995) para facilitar a migrao das clulas satlites atravs da membrana basal, a fim de criar uma passagem n MEC (NISHIMURA et al 2008) durante a regenerao muscular ( Phillips et al. 1990, Watt et al. 1994). O aumento inicial da imunomarcao da MMP2 e de sua atividade pode ser explicada pelo fato de que ela desempenha um papel fundamental na proliferao e diferenciao dos mioblastos ,a recuperao aps leso e a homeostase local dos tecidos. Imediatamente aps uma leso, as clulas satlite so ativadas e tornam-se precursoras clulas musculares, chamadas mioblastos, que expressam um elevado nvel de MMP. Este aumento no nvel MMPs resulta na migrao celular reas lesionadas, com a posterior diferenciao e fuso de mioblastos em miofibras (Marqueti et al, 2008). Alm disso, produo de MMP-2 parece estar correlacionada com a gravidade da leso muscular e provavelmente reflete a regenerao das membranas basais das miofibras (Koskinen et al. 2001).

63 Aos 7 e 14 dias (fase regenerativa), a marcao das MMP-2 e MMP-9 foi menor do que em um dia ps-leso, mas maior que no grupo controle, especialmente no perimsio. Alm disso, a atividade da MMP2 aps 7 dias foi menor que todos os grupos e aps 14 dias foi semelhante ao grupo controle. Estes resultados podem ser explicados pelo fato de que a rea danificada foi substituda por clulas imaturas do msculo esqueltico e da necessidade de biossntese de matriz extracelular para restabelecer as propriedades

morfolgicas e funcionais do msculo. Assim, um baixo nvel de MMPs necessrio. Alguns autores (Mackey et al. 2004; Koskinen et al. 2002) relataram que, aps a leso, o msculo apresenta um aumento de colgeno e uma diminuio na MMPs necessria a fim de aumentar a biossntese de colgeno no tecido muscular esqueltico de ratos. Com 21 dias, a rea lesada exibiu a restaurao da arquitetura celular e houve um aumento de marcao das MMP-2 e MMP-9, no entanto, a atividade da MMP-2 foi semelhante ao grupo controle. Este perodo caracterizado pela maturao das clulas musculares e sua membrana basal, bem como a formao de tecido cicatricial (fibrose) (Goetsch et al. 2003). Assim, a fim de prevenir ou manter a fibrose em nveis aceitveis, as MMP-2 e MMP-9 deve estar presente no endomsio e perimsio. No presente estudo, no foi observada fibrose, em qualquer momento e, portanto, a combinao entre sntese e degradao mecanismos bioqumicos foi bem coordenada. A marcao imuno-histoqumica e atividade das MMPs analisadas no presente estudo poderiam ser comparadas com as mudanas na marcao do colgeno IV. Em um nosso estudo anterior (dados no publicados), a

imunomarcao de colgeno IV no mesmo modelo leso revelou que, no dia 1, colgeno exibiu marcao elevada e com um padro difuso de distribuio, que semelhante distribuio das MMPs. Aos 7 e 14 dias, colgeno IV apresentou um aumento gradual na marcao, decorrentes da organizao da nova MEC no endomsio e perimsio. O remodelamento do Colgeno IV foi semelhante ao que no grupo controle apenas em 21 dias ps-leso. Comparando os resultados do entre os dois estudos, os altos e baixos nveis de MMPs esto relacionados com a degradao do colgeno IV e ou seu acumulo durante o remodelamento do msculo esqueltico.

64 Parece que o equilbrio entre sntese e ativao de MMP-2 e MMP-9 uma processo fundamental na degenerao e regenerao da fibra muscular esqueltica, com diferentes padres de expresso em todo o percurso da regenerao muscular. No presente estudo, a imunomarcao de MMP-2 e MMP-9 foi semelhante e as duas enzimas mostraram-se aumentadas no grupo criolesionado. Depois de 1 dia de leso a marcao das MMPs foi aumentada e diminuiu aps 7 e 14 dias. No entanto, somente a atividade MMP-2 foi detetada em todos os perodos analisados. Outros estudos confirmam que a MMP-2 amplamente expressa no dia seguinte a crioleso, atingindo um pico entre 3 e 7 dias ps-leso, enquanto que 10 dias ps-leso, ele retorna a nveis basais na regenerao do msculo esqueltico (Kherif et al. 1999; Ferre et al. 2007, Durigan et al. 2008). Nossos resultados mostraram que a atividade de MMP-2 no dia 7 divergem com a obtida por Duringan et al., 2008. Estes autores detectaram a mxima ativao da MMP-2 em 7 dias que 10 dias ps-leso a MMP retornou ao nvel basal. No nosso estudo a MMP-2 retornou ao menor nvel em 7 dias. Atividade de MMP-9 no foi quantificada nos gis de zimografia. Na maioria dos estudos no se detectou a atividade de MMP-9 em diferentes modelos de remodelao muscular (Ahtikoski et al., 2004; Hass et al. 2000). Curiosamente, Durigan et al., 2008 observaram um aumento na atividade MMP-9 apenas aps 3 dias de crioleso. Na maioria dos estudos, a MMP-2 est relacionada com a regenerao de novas miofibras, possivelmente devido degradao do colgeno tipo IV na membrana basal (Kherif et al. 1999; Ohtake et al. 2006; Fukushima et al. 2007). Por outro lado, a MMP-9 est relacionada ativao inflamatria inicial e a ativao de clulas satlites (Kherif et al. 1999; Fukushima et al. 2007). Contudo, Fukushima et al. (2007) sugerem que ambas as MMPs (2 e 9) esto relacionadas com a degenerao e regenerao das fibras do msculo esqueltico. A maior imunomarcao de MMP-2 e MMP-9 em 1 e 21 dias ps-leso pode refletir o impacto das MMPs na degradao do MEC durante a fase inflamatria, a fim de permitir a proliferao de clulas satlites musculares e manter nveis adequados de protenas colgenas durante a remodelao, a fim de evitar fibrose tecidual. MMPs so geralmente encontradas na forna inativa (pr-MMPs) nos tecidos e sua expresso altamente regulada por fatores de

65 crescimento e citocinas durante a remodelao tecidual (Marqueti et al. 2008). Com base nesta propriedade, no se pode diferenciar molculas ativas das inativas das MMPs atravs anlise imuno-histoqumica, porque os anticorpos utilizados identificam os dois tipos. No entanto, imunomarcao permite a identificao, distribuio e localizao dessas protenas em comparao com a morfologia tecidual. Outras tcnicas so mais indicadas para avaliar os aspectos quantitativos (RNAm expresso, Western blot) e atividade (zimografia e especficos ensaio enzimtico) das MMPs. Utilizamos a zimografia para verificar a atividade de MMP-2 e MMP-9 no entanto apenas a MMP-2 foi detectada. O msculo TA apresenta MMP-2 e MMP-9 durante o remodelamento aps crioleso, mas este perfil varia nos diferentes tipos de msculos so estudados. Fibras-lentas do msculos de ratos contm mais colgeno na MEC que fibras-rpidas (Zimmerman et al. 1993; Ahtikoski et al. 2003). Assim, concebvel que a respostas de adaptao dos msculos com predominncia de fibras-lentas seja diferente dos de fibras-rpidas e isso pode traduzir-se em mudanas na expresso das MMPs. O papel das MMPs no processo inflamatrio e reparativo aps a crioleso necessita de mais investigao, especialmente no que respeito sua atividade e outros marcadores imunolgicos (por exemplo, quimiocinas, interleucinas, etc) Este modelo pode ser usado para estudar diferentes tcnicas teraputicas para melhorar a reparao muscular e compreender melhor os efeitos desses procedimentos sobre componentes desse tecido.

Agradecimentos Os autores so gratos Sras. Elisa Santos, Joelcimar Martins da Silva e Amanda Ribeiro de Oliveira pelos seus excelentes conhecimentos tcnicos e assistncia, e ao apoio financeiro da Fundao de Amparo Pesquisa de So Paulo (FAPESP, nmero: 07/52927- 0).

66 Referncias 1. Ahtikoski AM, Koskinen SOA, Virtanen P et al (2003)Type IV collagen in rat skeletal muscle during immobilization in shortened and lengthened positions. Acta Physiol Scand 177: 473481 2. Aimes RT, Quiley JP (1995) Matrix metalloproteinase-2 is an interstitial collagenase. Inhibitor-free enzyme catalyzes the cleavage of collagen fibrils and soluble type I collagen generating the specific 3/4- and 1/4length fragments. J Biol Chem 270:58725876 3. Bani C, Lagrota-Candido J, Pinheiro DF et al (2008) Pattern of metalloprotease activity and myofiber regeneration in skeletal muscles of mdx mice. Muscle Nerve 37:583-592 4. Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, et al (1993) Matrix metalloproteinases: a review, Critical Reviews in Oral Biology and Medicine 4:197250 5. Brown MD, Hudlicka O. (2003). Modulation of physiological angiogenesis in skeletal muscle by mechanical forces: involvement of VEGF and metalloproteinases. Angiogenesis 6: 1 -14 6. Carmeli E, Moas M, Lennon S et al (2005) High intensity exercise increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle fibres. Exp Physiol 90: 613-9 7. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ et al (2004) Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 29: 191 197 8. Choi YC & Dalakas MC (2000). Expression of matrix metalloproteinases in the muscle of patients with inflammatory myopathies. Neurology 54, 6571 9. Cornelison DD, Wilcox-Adelman SA, Goetinck PF, et al (2004). Essential and separable roles for Syndecan-3 and Syndecan-4 in skeletal muscle development and regeneration. Genes Dev 18:22312236 10. Cossu G, Biressi S (2005).Satellite cells, myoblasts and other occasional myogenic progenitors: Possible origin, phenotypic features and role in muscle regeneration. Semin. Cell Dev Biol 16: 623631 11. d'Albis A, Couteaux R, Janmotet al (1988) Regeneration after cardiotoxin injury of innervated and denervated slow and fast muscles of mammals. Myosin isoform analysis. Euro J Biochem 174:103110

67 12. Durigan JL, Peviani SM, Russo TL et al (2008) Effects of alternagin-C from Bothrops alternatus on gene expression and activity of

metalloproteinases in regenerating skeletal muscle. Toxicon 52:687-94 13. Ferre PJ, Liaubet L, Concordet D,et al (2007) Longitudinal analysis of gene expression in porcine skeletal muscle after post-injection local injury. Pharm Res 24:1480-1489 14. Fukushima K, Nakamura A, Ueda H, et al (2007) Activation and localization of matrix metalloproteinase-2 and -9 in the skeletal muscle of the muscular dystrophy dog (CXMDJ).BMC Musculoskelet Disord 8:54. 15. Garry DJ, Yang Q, Bassel-Duby R et al(1997) Persistent expression of MNF identifies myogenic stem cells in postnatal muscles. Dev Biol 188: 280294 16. Goetsch SC, Hawke TJ, Gallardo TD et al (2003) Transcriptional profiling and regulation of the extracellular matrix during muscle regeneration. Physiol Genomics 14: 261271 17. Grounds MD, White JD, Rosenthal N et al (2002) The role of stem cells in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 50:589 610 18. Guerin CW, Holland PC (1995) Synthesis and secretion of

matrixdegrading metalloproteases by human skeletal muscle satellite cells. Dev Dyn 202: 91-99 19. Hawke TJ, Garry DJ (2001) Myogenic satellite cells: Physiology to molecular biology. J Appl Physiol 91: 534 551. 20. Huard J, Li Y, Fu FH (2002) Muscle injuries and repair: current trends in research. J Bone Joint Surg Am 84:822-32 21. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ et al (2000) Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced angiogenesis in rat skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279, 15401547 22. Irintchev A, Zweyer M, Cooper RN et al (2002) Contractile properties, structure and fiber phenotype of intact and regenerating slow-twitch muscles of mice treated with cyclosporin A. Cell & Tissue Res. 308: 143156.

68 23. Kherif S, Lafuma C, Dehaupas M et al (1999) Expression of matrixmetalloproteinases 2 and 9 in regenerating skeletal muscle: a study in experimentally injured and mdx muscles. Dev Biol 205: 158-170 24. Kieseier BC, Seifert T, Giovannoni G & Hartung HP (1999). Matrix metalloproteinases in inflammatory demyelination: targets for treatment. Neurology 53: 2025. 25. Kjaer M. (2004) Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal muscle to mechanical loading. Physiol Rev 84:649-698. 26. Koskinen SAO, Kjaer M, Mohr T, et al(2000) Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical stimulation. Muscle Nerve 23, 580589 27. Mackey AL, Donnelly AE, Turpeenniemi-Hujanen T et al (2004) Skeletal muscle collagen content in humans after high-force eccentric

contractions. J Appl Physiol (1):197-203. 28. Marqueti RC, Prestes J, Paschoal M et al (2008) Matrix metallopeptidase 2 activity in tendon regions: effects of mechanical loading exercise associated to anabolic-androgenic steroids. Eur J Appl Physiol 104: 1087-93 29. Matrisian, L.M. (1992) The matrix-degrading metalloproteinases.

Bioessays 14: 455-463 30. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG et al (2005) Thyroid hormone receptor-beta-selective agonist GC-24 spares skeletal muscle type I to II fiber shift. Cell and Tissue Research 321: 233241 31. Nagase H, Woessner JF (1999) Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 274: 2149121494 32. Nishimura T, Nakamura K, Kishioka Y et al (2008) Inhibition of matrix metalloproteinases suppresses the migration of skeletal muscle cells. J Muscle Res Cell Motil 29:37-44 33. Ohtake Y, Tojo H , Seiki M (2006) Multifunctional roles of MT1-MMP in myofiber formation and morphostatic maintenance of skeletal muscle. J Cell Sci 119: 3822-32 34. Phillips GD, Hoffman JR, Knighton DR (1990) Migration of myogenic cells in the rat extensor digitorum longus muscle studied with a split autograft model. Cell Tissue Res 262:81-86

69 35. Shi X , Garry DJ(2006) Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes Dev 20:1692-708. 36. Trocm C, Gaudin P, Berthier S et al (1998) Human B lymphocytes synthesize the 92-kDa gelatinase, matrix metalloproteinase-9. J Biol Chem 273:20677 20684 37. Van Gieson EJ & Skalak TC (2001) Chronic vasodilation induces matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation 8: 2531 38. Watt DJ, Karasinski J, Moss J et al (1994) Migration of muscle cells. Nature 368:406 -407 39. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK et al (1993) Age and training alter collagen characteristics in fast- and slow-twitch rat limb muscle. J Appl Physio l75:1670-1676

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3. Consideraes Finais
Os nossos trabalhos mostraram a distribuio e a interao entre alguns componentes da MEC, como colgeno IV, MMP-2 e MMP-9, durante o remodelamento do msculo esqueltico em rato aps crioleso. Estas protenas teciduais sofrem modificaes durante a organizao da MEC nas diferentes etapas do remodelamento do msculo TA. A anlise da MEC foi realizada nestes estudos pela tcnica imunoistoqumca que permite a observao da distribuio das protenas teciduais juntamente com a anlise da morfologia. Assim pode-se estabelecer uma correlao entre a imunomarcao do colgeno IV, da MMP-2 e MMP-9 e as diferentes fases do reparo muscular. Esta metodologia tem sido pouco utilizada em msculos esquelticos, principalmente para avaliar a composio e distribuio da MEC. A anlise morfolgica dos msculos depois da crioleso mostrou remodelamento completo aps 3 semanas e a imunomarcao mostrou uma correlao inversa entre o colgeno IV e as MMP-2/ MMP-9. Na fase de remodelamento muscular aps 7 dias houve aumento da presena de colgeno IV e foi verificada a diminuio da marcao da MMP2/MMP-9, concomitantemente com a diminuio da atividade enzimtica da MMP-2.Neste momento, morfologicamente h maior formao de novas fibras ainda imaturas e sntese de colgeno tecidual.Assim sendo, justifica-se o aumento da imunomarcao de colgeno IV e diminuio das MMPs tanto do ponto de vista imunoistoqumico como de atividade enzimtica. Nas fases mais tardias (14 e 21 dias) o colgeno IV mostrou diminuio gradual da imunomarcao enquanto que, as MMPs aumentaram. Na zimografia a MMP-2 exibiu, nestes dois perodos, atividade semelhante aos msculos controles. No perodo de 14 dias, morfologicamente o msculo apresentava-se remodelado, porm algumas clulas exibiam ainda ncleo centralizado, indicativo de imaturidade celular e a MEC no se mostrou remodelada de forma semelhante ao msculo controle. O colgeno IV delineou de forma tnue apenas as fibras maduras e esteve de forma difusa nas reas de fibras

71 imaturas. Paralelamente as MMPs mostraram pequena imunomarcao e baixa atividade enzimtica. Se correlacionarmos estes achados entre si pode-se inferir que a diminuio da atividade de MMP-2 neste perodo ocorre para que o colgeno IV possa se manter em nveis teciduais necessrios, maior do que o normal (controle), para auxiliar na orientao e maturao das fibras que s ocorrem aps 21 dias. Aos 21 dias pode-se verificar tanto morfologiamente, como do ponto de vista imunoistoqumico e enzimtico, que h um restabelecimento morfolgico do tecido muscular e um padro de MEC semelhante ao controle. Neste contexto, estes dados so importantes para que condutas reabilitadoras sejam aplicadas de forma a no gerar maior dano tecidual e possam propiciar um remodelamento adequado da MEC, restabelecendo a integridade morfolgica e funcional do msculo afetado. O modelo de crioleso se mostrou importante para o estudo da MEC e poder ser utilizado para estudar diferentes tcnicas teraputicas que visem melhorar a reparao muscular e para entender de forma mais detalhada os efeitos desses processos nos componentes teciduais.

Referncias Bibliogrficas
1. Kirkendall DT, Garrett WE Jr. Clinical perspectives regarding eccentric muscle injury. Clin Orthop Relat Res. 2002;(403 Suppl):S81-9. 2. Huard J, Li Y, Fu FH. Muscle injuries and repair: current trends in research. J Bone Joint Surg Am 2002; 84:822-32. 3. Seale P, Rudnicki MA. A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells. Dev Biol. 2000; 218:115-24. 4. Grounds MD, White JD, Rosenthal N, Bogoyevitch MA. The role of stem cells in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 2002; 50:589-610.

72 5. Chan YS, Li Y, Foster W, Horaguchi T, Somogyi G, Fu FH, Huard J. Antifibrotic effects of suramin in injured skeletal muscle after laceration. J Appl Physiol. 2003; 95:771-80. 6. Gomez, M. The physiology and biochemistry of soft tissue healing. Rehabilitation of Injured Knee, 2nd Ed. 34-44, 1995. 7. Kjaer M. Role of extracellular matrix in adaptation of tendon and skeletal muscle to mechanical loading. Physiol Rev 2004; 84:649-98. 8. Chakraborti S, Mandal M,Das S, Mandal A, Chakraborti T. Regulation of matrix metalloproteinases.Mol Cell Biol 2003; 253:269 285. 9. Carmeli E, Moas M, Reznick AZ , Coleman R. Matrix metalloproteinases and skeletal muscle: a brief review. Muscle Nerve 2004; 29: 191197. 10. Foidart M, Foidart JM, Engel WK. Collagen localization in normal and fibrotic human skeletal muscle. Arch Neurol. 1981; 38:152-7. 11. Myllyl R, Myllyl VV, Tolonen U, Kivirikko KI. Changes in collagen metabolism in diseased muscle. I. Biochemical studies. Arch Neurol. 1982;39:752-5. 12. Salonen V, Lehto M, Kalimo M, Penttinen R, Aro H. Changes in intramuscular collagen and fibronectin in denervation atrophy. Muscle Nerve. 1985; 8:125-31. 13. Han XY, Wang W, Komulainen J, Koskinen SO, Kovanen V, VihkoV, Trackman PC, Takala TE. Increased mRNAs for procollagens and key regulating enzymes in rat muscle following downhill running. Pflugers Arch 1999; 437: 857864. 14. Kovanen V, Suominen H, Risteli J, and Risteli L. Type IV collagen and laminin in slow and fast skeletal muscle in ratseffects of age and lifetime endurance training. Coll Relat Res. 1988; 8: 145153. 15. Myllyl R, Salminen A, Peltonen L, Takala TE, Vihko V. Collagen metabolism of mouse skeletal muscle during the repair of exercise injuries. Pflugers Arch. 1986; 407:64-70. 16. Savolainen J, Vnnen K, Vihko V, Puranen J, Takala TES. Effect of immobilization on collagen synthesis in rat skeletal muscles. Am J Physiol. 1987; 252:R883R888. 17. Zimmerman SD, McCormick RJ, Vadlamudi RK, Thomas DP. Age and training alter collagen characteristics in fast-and slow-twitch rat limb

73 muscle. J Appl Physiol. 1993; 75: 16701674. 18. Koskinen SO, Kjaer M, Mohr T, Srensen FB, Suuronen T, Takala TE. Type IV collagen and its degradation in paralyzed human muscle: effect of functional electrical stimulation. Muscle Nerve. 2000; 23: 580-9. 19. Koskinen SO, Wang W, Ahtikoski AM, Kjr M, Han XY, Komulainen J, Kovanen V, and Takala TES. Turnover of basement membrane type IV collagen in exercise-induced skeletal muscle injury. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280: R1292 R1300, 2001. 20. Stetler-Stevenson WG. Dynamics of matrix turnover during pathologic remodeling of the extracellular matrix. Am J Pathol. 1996; 148:1345-50. 21. Massova I, Kotra LP, Fridman R, Mobashery S. Matrix

metalloproteinases: structures, evolution, and diversification. FASEB J. 1998 Sep;12(12):1075-95. 22. Verzola RM, Mesquita RA, Peviani S, Ramos OH, Moriscot AS, Perez SE, Selistre-de-Arajo HS. Early remodeling of rat cardiac muscle induced by swimming training. Braz J Med Biol Res. 2006; 39(5):621-7. 23. Haas TL, Milkiewicz M, Davis SJ, Zhou AL, Egginton S, Brown MD, Madri JA, Hudlicka O. Matrix metalloproteinase activity is required for activity-induced angiogenesis in rat skeletal muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000; 279: H15401547. 24. Carmeli E, Moas M, Lennon S, Powers SK. High intensity exercise

increases expression of matrix metalloproteinases in fast skeletal muscle fibres. Exp Physiol. 2005; 90: 613-9. 25. Van Gieson EJ, Skalak TC. Chronic vasodilatation induces matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) expression during microvascular remodeling in rat skeletal muscle. Microcirculation. 2001; 8: 2531. 26. Rucavado A, Escalante T, Teixeira CF, Fernandes CM, Diaz C, Gutierrez JM. Increments in cytokines and matrix metalloproteinases in skeletal muscle after injection of tissue-damaging toxins from the venom of the snake Bothrops asper. Mediators Inflamm. 2002; 11:121-8. 27. Aoki MS, Miyabara EH, Soares AG, Salvini TF, Moriscot AS. Cyclosporin-A does not affect skeletal muscle mass during disuse and recovery. Braz J Med Biol Res. 2006; 39:243-51.

74 28. Miyabara EH, Martin JL, Griffin TM, Moriscot AS, Mestril R. Overexpression of inducible 70-kDa heat shock protein in mouse attenuates skeletal muscle damage induced by cryolesioning. Am J Physiol Cell Physiol. 2006; 290:C1128-38. 29. Salvini TF, Morini CC, Selistre-de-Araujo HS, Ownby CL. Long-term regeneration of fast and slow murine skeletal muscles after induced injury by ACL myotoxin isolated from Agkistrodon contortrix laticinctus (Broad-banded copperhead) venom. Anatom Rec. 1999; 254:521-333. 30. Irintchev A, Zweyer M, Cooper RN, Butler-Browne GS, Wernig A. Contractile properties, structure and fiber phenotype of intact and regenerating slow-twitch muscles of mice treated with cyclosporin A. Cell Tissue Res. 2002; 308:143-56. 31. Miyabara EH, Aoki MS, Soares AG, Moriscot AS. Expression of tropismrelated genes in regenerating skeletal muscle of rats treated with cyclosporin-A. Cell Tissue Res. 2005; 319:479-89. 32. Miyabara EH, Tostes RC, Selistre de Arajo HS, Aoki MS, Salvini TF, Moriscot AS. Cyclosporin A attenuates skeletal muscle damage induced by crotoxin in rats. Toxicon. 2004; 43:35-42.

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ANEXO I Prezado (a) Colaborador (a)

Vimos pela presente, acusar o recebimento de seu artigo Remodelamento do msculo esqueltico: papel da matriz extracelular manuscrito 626 ao Conselho Editorial desta revista. Solicitamos que grave o nmero do mesmo, pois todo contato posterior a esse ser feito atravs desse nmero. No momento estamos apreciando o contedo de seu artigo, assim que tivermos um parecer entraremos em contato. Sem mais para o momento, agradecemos com os votos de estima e considerao.

Conselho Editorial

Prof a Dra Auristela Duarte Lima Moser Editora da Revista

Fisioterapia em Movimento

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ANEXO II

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ANEXO III

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ANEXO IV