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Examens cyto-bactriologiques des scrtions broncho-pulmonaires

2 Objectifs

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Plan du chapitre Contextes identifis Objectifs Difficults de recueil : contamination salivaire Pneumopathies communautaires Pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle Pneumopathies germes opportunistes chez limmunodprim 7 Pneumopathies atypiques 8 Recherche de Bordetella 9 Recherche de Nocardia 10 Mucoviscidose

* Identifier la bactrie ou les bactries en cause * Diffrencier les bactries commensales des pathognes * tudier la sensibilit aux agents antimicrobiens. * Rechercher une colonisation (surveillance pidmiologique) * Identifier certains critres pronostiques (paucicellularit, bactrie muqueuse) * Participer au suivi thrapeutique

1 Contextes
Pneumopathies communautaires Pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle Pneumopathie atypiques Pneumopathies chez limmunodprim Mucoviscidose Surinfections bronchiques (BPCO)

3 Difficults de recueil : contamination salivaire

De nombreuses espces bactriennes responsables dinfections pleuropulmonaires peuvent tre prsentes ltat de commensales dans loropharynx et la salive. Ce sont notamment : Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, des bactries anarobies strictes.

Micro-organismes responsables dinfections broncho-pulmonaires Pneumopathies communautaires nosocomiales S. pneumoniae H. influenzae S. aureus M. catarrhalis K. pneumoniae Autres BGN P. aeruginosa Burkholderia cepacia Mycobactries Nocardia Chlamydia pneumoniae Mycoplasma Legionella Coxiella Anarobies Candida Aspergillus Surinfections bronchiques Mucoviscidose

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rechercher dans tous les cas rechercher de faon exceptionnelle

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l rechercher dans des circonstances particulires

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Une attention extrme doit tre porte aux conditions de recueil de ces prlvements. Il faut viter la prsence de salive qui risque de diluer la flore pathogne et de la contaminer par des bactries commensales. Sont considres comme bactries salivaires : staphylocoques coagulase ngative, streptocoques autres que S. pneumoniae, corynformes, Neisseria commensales. Pour remdier cet cueil important, plusieurs mesures sont prconises : liminer les prlvements dont lexamen microscopique montre une contamination salivaire vidente ; procder une analyse quantitative de la flore bactrienne ; recueillir les scrtions pulmonaires des malades ayant une pneumopathie grave au moyen de mthodes invasives mais plus fiables : brossage bronchique protg et lavage broncho-alvolaire. Pour viter la pullulation des bactries commensales aux dpens de bactries fragiles comme S. pneumoniae, le prlvement doit tre achemin rapidement au laboratoire. Dans les pneumopathies graves, lexamen bactriologique des scrtions pulmonaires est complt utilement par la pratique dhmocultures et ventuellement par lexamen du liquide pleural. Les antibiotiques modifiant les flores, il est fondamental de recueillir les scrtions bronchopulmonaires avant le dbut du traitement antibiotique si cela est possible.

Ses indications sont alors limites aux suppurations bronchiques rfractaires. Les pneumopathies qui saggravent sous traitement justifient une hospitalisation et la mise en uvre de mthodes invasives visant notamment mettre en vidence une Legionella (voir ci-dessous). Pour dautres auteurs les indications sont moins restrictives. Cet examen a une valeur informative condition que : 1) le recueil de lexpectoration soit de bonne qualit ; 2) la qualit du prlvement soit confirme par lexamen microscopique ; 3) une signification clinique soit accorde uniquement lespce prdominante si elle atteint ou dpasse le seuil de 107 bactries/ml. Si ces trois conditions sont remplies il est intressant de procder ltude de la sensibilit aux antibiotiques de la souche bactrienne isole, particulirement sil sagit de S. pneumoniae. Le recueil de lexpectoration doit respecter un protocole rigoureux : il doit se faire le matin, au rveil, aprs rinage bucco-dentaire leau distille strile et lors dun effort de toux aid, si besoin dune kinsithrapie. Lexamen bactriologique doit tre effectu sans dlai. Lexamen microscopique La technique suivie, dcrite par Bartlett et adapte par Murray et Washington, permet dapprcier le degr de contamination par la salive. Elle consiste examiner soit ltat frais, soit un frottis color par la mthode de Gram au microscope grossissement x 100 et dnombrer en faisant une moyenne sur 10 champs les cellules pithliales et les leucocytes par champ (aprs vrification de la morphologie un grossissement plus fort). Les rsultats de lexamen microscopique permettent de distinguer 5 classes de crachats :
Classe 1 2 3 4 5 Cellules par champ Epithliales Leucocytes > 25 > 25 > 25 10 - 25 < 10 < 10 10 - 25 > 25 > 25 > 25

4 Pneumopathies communautaires
Pour certains auteurs lexamen bactriologique du crachat en routine doit tre proscrit. Il ne doit pas retarder la mise en route du traitement probabiliste. Plus de 90 % de ces infections sont dues un nombre limit despces bactriennes savoir : - Streptococcus pneumoniae, - Haemophilus influenzae, - Mycoplasma pneumoniae, - Legionella pneumophila, - Chlamydia pneumoniae. Ses rsultats sont alatoires en raison de la contamination salivaire. Le traitement antibiotique de premire intention est prescrit de faon probabiliste en fonction de critres pidmiologiques.

La prsence de macrophages alvolaires est le tmoin de lorigine basse des scrtions.

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Les crachats de classe 1 et 2 sont fortement contamins par la salive. Ils ne sont pas utilisables pour la culture. Un autre prlvement est demander. Les crachats de classe 3, 4 ont un nombre de leucocytes qui tmoigne dune raction inflammatoire mais sont contamins par la salive. Les crachats de classe 5 sont les plus appropris pour l'examen bactriologique. Ceux de classe 4 sont acceptables. Cultures et dnombrement Aprs fluidification du prlvement on ensemence une dilution approprie permettant un dnombrement des bactries au del de 105 UFC/ml sur : glose chocolat enrichie (5 10 % de CO2) avec ou sans bacitracine glose au sang glose slective pour les bacilles Gram Habituellement on se limite l'identification et l'antibiogramme d'une ou deux espces bactriennes en quantit 107 bactries par ml.

probablement sous-estime et dont lincidence est importante lors des pneumopathies de dglutition ; Legionella pneumophila .

2- Mthodes prconises

5 Pneumopathies nosocomiales sous ventilation artificielle

Elles sont frquentes : 10 30 % des malades sous respirateur. Elles sont graves : mortalit 20 50 %. Lisolement des micro-organismes en cause est la cl du traitement.

Le diagnostic microbiologique le plus fiable dune pneumopathie nosocomiale est assur par lassociation : - dune culture quantitative partir dun prlvement endobronchique protg distal et dirig vers la lsion ; - de lexamen cytobactriologique des scrtions issues de poumon profond. Trois techniques de recueil des scrtions sont utilises couramment : - le brossage bronchique protg (BBP), - le lavage broncho-alvolaire (LBA), - laspiration endotrachale (AET). La BBP est la mthode de rfrence pour tablir le diagnostic de pneumonie. Lorsque BBP et LBAsont associs, la sensibilit et la spcificit de ces examens dpassent 90 %. Ces examens invasifs permettent dorienter le traitement antibiotique. LAET est pratique si les deux mthodes invasives ne sont pas ralisables notamment chez le nourrisson. Chez ladulte, elle a essentiellement une valeur prdictive ngative.
3- Brossage bronchique protg

1- Principales espces responsables

Ce sont les bacilles Gram ngatif (BGN) pour 60 % des cas et les staphylocoques pour 40 % des cas. Dans un tiers des cas, il sagit dune infection polymicrobienne. Les BGN sont par ordre de frquence : - Pseudomonas aeruginosa - Acinetobacter baumannii - Klebsiella - Enterobacter - Serratia Les staphylocoques sont Staphylococcus aureus (30 %) et aussi S. epidermidis (10 %). Les Candida spp. sont trouvs avec une frquence croissante, jusqu 10 % des cas. Parmi les autres espces, citons : - S. pneumoniae et H. influenzae , au cours de pneumopathies nosocomiales prcoces (moins de 5 jours dhospitalisation) ; - les bactries anarobies dont la frquence est

La rfrence demeure le dispositif de Wimberley constitu dune brosse en nylon fixe lextrmit dun guide mtallique. Brosse et guide coulissent lintrieur dun premier cathter, luimme plac lintrieur dun second cathter, obtur par un bouchon de polythylne glycol. Cette brosse tlescopique est glisse au travers dun fibroscope et dirige sous contrle de la vue dans une petite bronche de 4e ordre drainant le territoire pulmonaire radiologiquement suspect. Le cathter interne est alors pouss, expulsant le bouchon et permettant davancer la brosse de quelques centimtres, pour raliser le prlvement bactriologique. Aprs cela les manuvres inverses sont effectues : on dsinfecte alors la partie externe du cathter interne par de lalcool 90C, puis on fait sortir la brosse interne et on la coupe avec des ciseaux striles pour quelle tombe dans 1 ml de liquide (eau physiologique tamponne strile ou liquide de Ringer) que lon agite sur place au lit du malade (agitation mcanique de type vor-

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tex) pendant 2 min. Le prlvement est apport sans dlai au laboratoire. Aprs avoir prlev la quantit ncessaire la culture on ralise une coloration de Gram sur le culot de centrifugation. La culture quantitative seffectue dans les conditions dcrites plus haut. Un seuil de 103 UFC/ml est considr comme significatif. La sensibilit et la spcificit sont de lordre de 70 % cest dire qu'il est observ environ 30 % de faux ngatifs. Le seuil de significativit peut tre abaiss 5.102 UFC/ml notamment chez les malades recevant des antibiotiques. Chez ces malades un dnombrement bactrien < 103 UFC/ml ne peut liminer le diagnostic dinfection pulmonaire.
4- Lavage broncho-alvolaire

nant des bactries intracellulaires permettrait de prdire ds lexamen direct lexistence dune pneumopathie bactrienne chez les malades ventils. Les cultures et le dnombrement sont raliss dans les conditions indiques plus haut. Un dnombrement des germes banals suprieur 104 UFC/ml est gnralement considr comme significatif dune pneumonie.
5- Aspiration endotrachale (AET)

Laspiration des scrtions par la sonde dintubation est une mthode alternative lorsque les mthodes invasives sont contre-indiques. Le risque de contamination par la flore buccosalivaire est important. Diffrents critres dacceptabilit du prlvement sont proposs. Chez ladulte, aprs coloration de Gram ne sont mis en culture que les prlvements contenant des bactries visibles au microscope (grossissement x 1000) ou contenant moins de 10 cellules pithliales par champ microscopique (grossissement x 100). Chez lenfant, le seul critre permettant de rejeter un prlvement est labsence de bactries visibles aprs coloration de Gram (grossissement x 1000).

La technique consiste instiller aprs blocage du bronchofibroscope dans une bronche segmentaire ou sous-segmentaire des chantillons de 50 ml de srum physiologique ( 37C) 4 6 fois et on ramne entre 20 et 60 % de la quantit injecte. Le LBAa plusieurs avantages : possibilit dexamen microscopique du culot de centrifugation du liquide, exploration dun territoire pulmonaire plus important que le BBP, recueil dune plus grande quantit de scrtions. Chez les malades intubs et ventils, suspects de pneumonie nosocomiale, la concordance entre BBP et LBAest de 90 % environ. Cette mthode de prlvement est particulirement utile pour le diagnostic des pneumopathies observes chez les immunodprims et permet de rechercher : des bactries (Nocardia, Legionella, mycobactries, Mycoplasma pneu moniae, Actinomyces) mais galement des virus (Cytomegalovirus, Herpes), des parasites (Pneumocystis carinii), des champignons et levures (Aspergillus, Cryptococcus, Candida). Le traitement des chantillons consistera : - centrifuger 30 40 ml de liquide dans un tube conique strile 5000 tours pendant 10 minutes ; - partir du culot, faire des frottis et procder aux colorations suivantes : Gram, ZiehlNeelsen (Gram-Weigert ou Gomori-Grocott pour la recherche de Pneumocystis), immunofluorescence directe pour la recherche de Legionella. La prise en compte et la numration des cellules (> 7 %) du lavage broncho-alvolaire conte-

6 Pneumopathies germes opportunistes chez l'immunodprim

La mthode de prlvement de choix est le lavage broncho-alvolaire. Ici ne se pose pas le problme de la contamination par la flore oropharynge. Les micro-organismes rechercher sont : - Pneumocystis carinii - Toxoplasma gondii - CMV - M. tuberculosis - Aspergillus spp - Candida spp - Cryptococcus neoformans

7 Pneumopathies atypiques
Recherche de Chlamydia psittaci et C . pneumo niae : prfrentiellement partir de lcouvillonnage de loropharynx postrieur. Pneumopathie nonatale : recherche de Chlamydia trachomatis dans les aspirations nasopharynges ou la gorge.

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Recherche de Mycoplasma pneumoniae : les expectorations tant trop contamines par la flore commensale le recueil des scrtions doit tre ralis par brossage endo-bronchique ou lavage broncho-alvolaire. Recherche de Legionella dans les scrtions recueillies par brossage endo-bronchique ou lavage broncho-alvolaire par IFD sur le culot et par culture sur BCYE additionn d'antibiotiques. L'incubation se poursuit durant 10 jours avec une observation journalire la loupe binoculaire. La recherche de Legionella par amplification est ralise dans certains laboratoires principalement sur les LBA, de mme que la recherche prcoce dantignes urinaires.

ralise sur glose au sang incube pendant 20 jours. L'identification complte est confie un laboratoire spcialis.

10 Mucoviscidose
Des recommandations pour lanalyse bactriologique des prlvements dexpectoriation chez les patients atteints de mucoviscidose ont t publies par un groupe de travail spcifique. Ces recommandations sont reproduites ci-dessous. Recommandations pour lanalyse bactriologique des prlvements dexpectoration chez les patients atteints de mucoviscidose Groupe de travail : P.Y . Allouch, O. Bajolet, E. Bingen, G. Chabanon, J.P. Flandrois, N. Marty, M. de Montclos, H. Monteil, B. Pangon, P. Plsiat, V. Vernet, M. Weber Coordonnateur : B. Pangon La mucoviscidose est une maladie chronique dont l'une des principales manifestations est la survenue d'infections respiratoires. Au cours des pisodes infectieux, le clinicien ne dcide pas de la thrapeutique ou de ses modifications sur des critres uniquement cliniques. Il a besoin pour l'aider dans sa dcision d'un prlvement microbiologique accompli selon des rgles rigoureuses et interprtes de faon homogne. Pour la recherche d'une meilleure qualit des soins, il est apparu ncessaire d'tablir des recommandations portant sur l'analyse bactriologique de l'expectoration. Ces recommandations concernent la qualification des prlvements, le seuil de dnombrement des diffrentes espces, les milieux de culture et l'antibiogramme.
1- Critres de qualit des prlvements

8 Recherche de Bordetella
La majeure partie des cas de coqueluche observs en France le sont chez des enfants de moins de 2 ans ou chez des adultes anciennement vaccins qui peuvent faire des formes atypiques de la maladie. Le prlvement doit tre le plus prcoce possible, ce qui est difficile en dehors dun contexte pidmique. Recueilli par aspiration nasopharynge postrieure, il est achemin au laboratoire dans les 2 heures temprature ambiante. Limmunofluorescence directe manque de sensibilit et de spcificit. Elle nest pas recommande. La culture est une mthode dlicate, spcifique mais peu sensible. Elle seffectue sur milieu de Bordet et Gengou ou sur milieu de Reagan et Lowe au charbon additionn de 15 20 % de sang de cheval ou de mouton, additionn ou non de cphalexine. B. pertussis se dveloppe aprs incubation 37C pendant 4 6 jours. La raction de polymrisation en chane (PCR) est spcifique et sensible, mais elle nest pas disponible en routine. La recherche de ladnylate cyclase scrtes par B. pertussis est une mthode qui a une bonne sensibilit, mais une spcificit moyenne. Intressante par sa rapidit, elle vient en complment de la culture.

9 Recherche de Nocardia
Elle s'effectue principalement sur les LBA. L'examen direct aprs coloration de Gram peut montrer des bacilles Gram positif ramifis. Une coloration de Ziehl froid est conseille. La culture est

La qualit du prlvement est value par la coloration de Gram selon les critres microscopiques habituels : rapport entre le nombre de polynuclaires neutrophiles et le nombre de cellules pithliales pharynges. La flore bactrienne prsente est dcrite. Les chantillons ne rpondant pas aux critres de qualit (absence de polynuclaires neutrophiles) ne sont pas considrs comme impropre l'analyse. Mais la mauvaise qualit du prlvement doit tre signale afin qu'un autre chantillon soit ventuellement adress au laboratoire.

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2- Seuil de dnombrement des diffrentes espces

Les chantillons sont homogniss dans une solution de fluidificateur pour expectorations et un dnombrement est ralis selon les critres suivants : Pour les patients dont le diagnostic de mucoviscidose est rcent et pour lesquels la colonisation P. aeruginosa n'est pas connue : - Le seuil infrieur de dnombrement doit tre de 10 2 UFC/ml pour P. aeruginosa et B. cepacia. - Le seuil infrieur de dnombrement doit tre de 105 UFC/ml pour les espces n'appartenant pas la flore commensale : bacilles Gram ngatif type Entrobactries ou non fermentants et pour les 3 espces pathognes suivantes appartenant aussi la flore saprophyte : S. aureus, H. influenzae, S. pneumoniae . Pour les patients dont le diagnostic de mucoviscidose est plus ancien : c'est--dire dont la colonisation P. aeruginosa est connue : - Le seuil infrieur de dnombrement doit tre de 102 UFC/ml pour B. cepacia . - Le seuil infrieur de dnombrement doit tre de 105 UF.C/ml pour les espces n'appartenant pas la flore commensale : bacilles Gram ngatif type Entrobactries ou non fermentants y compris P. aeruginosa et pour les 3 espces pathognes suivantes appartenant aussi la flore commensale : S. aureus, H. influenzae, S. pneumoniae. La srotypie de P. aeruginosa est de peu d'apport (beaucoup de souches ne sont pas typables). En revanche, la description du caractre muqueux ou non des souches est d'un rel apport pour le clinicien.
3- Milieux de culture

Dans l'tat actuel de nos connaissances, la recherche de mycobactries ne semble pas devoir tre systmatise en dehors d'un contexte clinique particulier.
4- Recommandations pour l'antibiogramme

Un antibiogramme restreint est ralis avec recherche de btalactamase pour : - Haemophilus influenzae. - Moraxella catarrhalis. Un antibiogramme pour les cocci Gram positif : S. aureus, S. pneumoniae . Un antibiogramme pour les bacilles Gram ngatif : Pour chaque morphotype dominant de P. aeruginosa. Pour B. cepacia . Pour les autres bacilles Gram ngatif non fermentants (S. maltophilia , A. xylosoxi dans). - Certaines molcules ne doivent pas tre oublies : ticarcilline, ceftazidime, aztronam, imipnme, tobramycine, amikacine, ciprofloxacine, colimycine. - D'autres molcules peuvent tre testes : ticarcilline + ac. clavulanique, pipracilline + tazobactam, cfpime, moxalactam, cotrimoxazole, ispamicine.

Bibliographie FOUCAUD, P., PANGON, B., PETITPREZ, P., ALLOUCH, P., Infections bronchopulmonaires chez les enfants atteints de mucoviscidose. Infect. Immunol., 1996, 3 : 272-276. LEROY, O., GEORGES, H., BEUSCART, C., SANTRE, C., MOUTON, Y., Analyse critique des critres de diagnostic des pneumonies nosocomiales. Lettre Infect., 1994, 9 : 339-343. MEDURI, G.U., CHASTRE, J., The standardization of bronchoscopic techniques for ventilator-associated pneumonia. Chest, 1992, 102 suppl. : 555 S-563 S. MORRIS, A.J., TANNER, D.C., RELLER, L.B., Rejection criteria for endotracheal aspirates from adults. J. Clin. Microbiol., 1993, 31 : 1027-1029. MURRAY, P., WASHINGTON, J.A., Microscopic and bacteriologic analysis of expectorated sputum. Mayo. Clin. Proc., 1975, 50 : 339-344. ZAIDI, A., RELLER, B., Rejection criteria for endotracheal aspirates from pediatric patients. J. Clin. Microbiol., 1996, 34 : 352-354. GUISO N., Diagnostic biologique de linfection Bordetella pertussis. Lettre Infect., 1995, 10 : 315-320.

Les prlvements doivent tre ensemencs au minimum sur les milieux suivants : Glose nutritive permettant la croissance de S. pneumoniae, S. aureus et S. pyogenes . Glose nutritive permettant la croissance de Haemophilus. Glose slective permettant la croissance de bacilles Gram ngatif et plus particulirement P. aeruginosa et B. cepacia. Glose permettant la croissance de champignons (Candida, Aspergillus). Tous les milieux sont incubs 48 72 heures 37C aprs une premire observation 24 heures.