IDENTIFICAO DE MICRORGANISMOS ISOLADOS EM FRUTAS, POLPAS E AMBIENTE INDUSTRIAL

RENATA TORREZAN * MIRTHA NELLY UBOLDI EIROA ** LUDWIG PFENNING ***

As frutas e seus derivados so em geral alimentos cidos, sendo contaminados principalmente, por bactrias lcticas, leveduras e fungos filamentosos. Neste trabalho foram isolados e identificados os microrganismos presentes em frutas e polpas de frutas e no ambiente industrial de seu processamento, sendo detectado predomnio de fungos nas amostras analisadas. As bactrias lcticas tiveram maior incidncia nas superfcies analisadas.

1 INTRODUO O desenvolvimento microbiano nos alimentos condicionado por diversos fatores ambientais, como temperatura e umidade relativa, denominados extrnsecos e por fatores intrnsecos, sendo os principais a atividade de gua, o pH, o potencial redox e a composio do alimento (4). CORLETT JR. & BROWN (1) afirmam que o pH dos alimentos um dos fatores que determinam o crescimento e a sobrevivncia de microrganismos durante seu processamento, estocagem e distribuio. Os microrganismos so afetados pela presena do on [H+] livre e pela concentrao de cido fraco no dissociado. Os nions de alguns cidos fracos (por exemplo cido actico ou lctico) so metabolizados dentro da clula bacteriana, havendo liberao do on [H+] e acidificao da clula em nveis inibitrios. Outros nions no so metabolizados e portanto no acidificam as clulas. Certas cepas de microrganismos podem desenvolver
* ** M.Sc. em Tecnologia de Alimentos, Embrapa Agroindstria de Alimentos, Rio de Janeiro - RJ (e-mail: torrezan@ctaa.embrapa.br). D.Sc. em Cincia e Tecnologia de Alimentos, Professora Colaboradora da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA), Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP. Ph.D em Cincias Naturais, Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, MG.

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resistncias ao abaixamento de pH e conseguir, assim, multiplicar-se em condies adversas (14). As frutas e seus produtos so em geral alimentos cidos ou que podem ser acidificados para sua melhor conservao. A maior parte da microbiota contaminante das frutas reside na parte externa das frutas, sendo o seu interior praticamente estril, a menos que haja alguma ruptura de continuidade por leses em alguma parte da casca. A microbiota que contamina os produtos de frutas proveniente das condies da matriaprima e da lavagem a qual esta submetida, alm das condies higinico-sanitrias dos manipuladores, equipamentos e ambiente industrial em geral. O pH destes produtos no favorece, em geral, a proliferao de microrganismos, principalmente os patognicos (11), podendo haver apenas desenvolvimento de microrganismos deteriorantes como bolores, leveduras, bactrias lcticas e outros microrganismos cido tolerantes como bactrias acticas, Zymomonas e algumas espcies de Bacillus. Devido a sua baixa resistncia trmica, as leveduras e os bolores raramente esto associados a processos de deteriorao de produtos cidos que sofreram tratamento trmico, como a pasteurizao (5). Deve ser lembrada porm, a existncia de espcies termo-resistentes de fungos deterioradores. O objetivo deste trabalho foi o isolamento e identificao de bactrias lcticas, leveduras e fungos filamentosos de polpas, frutas e do ambiente industrial de seu processamento para o conhecimento da microbiota potencial de contaminao destes produtos.

MATERIAL E MTODOS

2.1 MATERIAL 2.1.1 Frutas

O material em estudo foi constitudo de amostras de goiaba e morango in natura, polpa de goiaba concentrada (15 Brix) e polpas de frutas congeladas (morango, morango com sementes, morango adicionado de acar e maracuj).

2.1.2

Ambiente industrial

Todas as amostras de ar e das superfcies de equipamentos e utenslios foram obtidas em indstria processadora, localizada no estado de So Paulo.
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2.1.3

Meios de cultura e diluentes para as anlises microbiolgicas

PDA (gar de batata dextrose), ref. 10130 Merck, adicionado de 2 mL de soluo de antibiticos (500 mg de cloranfenicol e 500 mg de clorotetraciclina-HCl em 100 mL de tampo fosfato pH 7,2 estril) para cada 100 mL de meio;MRS gar (gar de Man, Rogosa e Sharpe) ref. 10660 Merck;soluo salina peptonada (1,0 litro de gua destilada, 8,5 g de NaCl, 1,0 g de Peptona-L37).

2.1.4

Meios de cultura utilizados para seleo, identificao e manuteno das cepas isoladas

PDA; MRS gar; gar Rogosa, ref. 5413 Merck; OSA (gar Soro de Laranja), ref. 0521, Difco Laboratories;MA (gar Malte), ref. 0024-01-1, Difco Laboratories;(MEA) gar Extrato de Malte, ref. 5398, Merck;meio de Wickerham (0,67 g de Bacto Yeast Nitrogen Base, ref. 0392-15, Difco Laboratories e 1 g de glicose PA Merck, para 100 mL de H2O destilada) e meio para Teste de Nitrato (1,17 g de Bacto Yeast Carbon Base, ref. 039115-0, Difco Laboratories, e 0,078 g de KNO3 para 100 mL H2O destilada). Os meios OA (gar de Aveia), PCA (gar de Batata e Cenoura) e CYA (gar Extrato de Levedura de Czapek) foram preparados e as suas formulaes encontram-se descritas em TORREZAN (13).

2.2 MTODO EXPERIMENTAL As amostras do ambiente industrial foram coletadas e identificadas de acordo com a sua localizao. A linha de produo conta com duas salas diferentes. Para facilitar a referncia destes ambientes designou-se, aleatoriamente, estas salas como 1 e 2. Na sala 1 so realizadas a recepo, lavagem, seleo e cozimento das matrias-primas utilizadas. Na sala 2 ocorrem as operaes de preparo, desintegrao, pasteurizao e envasamento. Aps avaliao visual da linha de produo foram escolhidos cinco pontos diferentes para coleta de amostras do ar, a saber: sala 1, prximo porta; sala 2, prximo ao preparo, ao exaustor, ao desintegrador e ao envase. Nestes locais foram colocadas placas de Petri com os seguintes meios de cultura: PDA, OSA, Rogosa e MRS gar. O primeiro meio foi utilizado visando o isolamento de fungos filamentosos e leveduras, e os demais, de bactrias lcticas. Estas placas foram deixadas por cerca de 20 minutos abertas, expondo o meio de cultura ao ambiente industrial, sendo a seguir incubadas a 25 C por 5 dias, no caso das placas de PDA e a 30 C por 72 horas no caso das placas de OSA, Rogosa e MRS. As placas contendo os meios (OSA, Rogosa e MRS) para isolamento das bactrias lcticas foram incubadas em atmosfera microaerfila. Aps incubao foram isoladas as
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colnias que apresentaram diferentes morfologias, as quais foram transferidas para tubos inclinados com o respectivo meio de cultura. A indstria foi visitada no perodo da tarde e a temperatura ambiente era de 22 C em mdia. A contaminao superficial foi avaliada pela amostragem de cinco superfcies diferentes: mesa de madeira (utilizada na limpeza e seleo das matrias-primas in natura ), mesa de inox (utilizada na mistura de frutas e acar), balde plstico (no qual estavam acondicionadas as frutas congeladas destinadas ao reprocessamento), desintegrador (entrada e sada do desintegrador). Estas superfcies foram amostradas mediante esfregao com zaragatoas estreis umedecidas com soluo salina peptonada e que foram imediatamente transferidas para tubos com 5 mL de soluo salina peptonada. Estes tubos foram agitados, retirando-se uma alquota de 0,1 mL para o plaqueamento por espalhamento em superfcie nos meios de cultura mencionados. As placas foram incubadas nas mesmas condies anteriormente citadas. Aps o perodo de incubao foram isoladas as colnias que apresentaram diferentes morfologias, as quais foram transferidas para tubos com meio inclinado. No caso especfico das frutas que estavam sendo processadas foram retiradas amostras, assepticamente, para contagem (15) e isolamento de microrganismos. Uma poro de polpa de goiaba proveniente de outra indstria processadora de doces de goiaba, localizada na regio de Campinas/SP, foi exposta ao ambiente industrial, por cerca de 10 dias at a sua deteriorao ser evidente a olho nu. Os microrganismos presentes foram igualmente isolados e transferidos para tubos inclinados, como j mencionado. Todas as culturas isoladas foram separadas por origem, devidamente codificadas e adequadamente purificadas. As culturas de leveduras foram inoculadas por estrias em superfcie de placas de Petri com meio de gar Malte e incubadas a 25 C por 5 dias. Aps este perodo, as placas foram observadas sob microscpio esteroscpico (BAUSCH & LOMB) e as colnias que se diferenciaram pela sua morfologia foram isoladas em tubos contendo o mesmo meio inclinado. Foram realizados esfregaos em lminas de cada uma das colnias isoladas para observao em microscpio (CARL ZEISS, com contraste de fase). As culturas de leveduras foram identificadas pelo sistema API 20 C AUX (Bio Mrieux S.A.) para identificao rpida de leveduras, sendo os resultados obtidos complementados com provas de assimilao de nitrato (6), crescimento a 37 C (6) e observao microscpica.
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As culturas de bactrias foram isoladas por estrias em superfcie em placas de Petri com o meio gar MRS e incubadas a 30 C por 72 horas em atmosfera microerfila. Cada colnia caracterstica isolada foi repicada para tubo com gar MRS inclinado e incubada a 30 C por 72 horas. Foram realizados esfregaos em lminas de cada uma das colnias isoladas para observao em microscpio. Aps o perodo de incubao foi realizada a colorao de Gram (10). A observao das lminas foi feita em microscpio (Spencer). Como a colorao de Gram no conclusiva foi realizado, tambm, o teste da catalase (12). Estas culturas foram devidamente identificadas com kit para identificao rpida de Lactobacillus API 50 CHL (Bio Mrieux). As culturas de fungos filamentosos foram inoculadas na superfcie de placas com gar Extrato de Malte para purificao e incubadas a 25 C por 5 dias. Todas as colnias visualmente diferentes foram selecionadas e purificadas em tubos com gar Extrato de Malte e incubadas a 25 C por 5 dias. Aps o perodo de incubao foram feitas lminas para observao microscpica e nova seleo para separar os fungos filamentosos, por gnero, para o seu cultivo nos meios apropriados para a sua identificao. Os fungos filamentosos do gnero Penicillium foram cultivados em meio MEA e CYA. As placas foram inoculadas em trs pontos equidistantes e incubadas a 28 C por 7 dias. Aps o perodo de incubao foram feitas as medies das colnias, observaes das mesmas na lupa e lminas para as medies, ao microscpio, dos condeos, filides, vesculas e mtulas, de acordo com cada caso. A identificao das espcies foi feita com o auxlio das chaves propostas por PITT (9). As espcies de fungos filamentosos dos gneros Fusarium, Cladosporium, Scopulariopsis e de Coelomycetes e Ascomycetes foram cultivados nos meios AO, MA, PCA, CYA e MEA, respectivamente. A inoculao foi feita mediante estria com agulha na parte central das placas. As placas foram deixadas no laboratrio em temperatura ambiente por cerca de 7 dias ou mais de acordo com o desenvolvimento das culturas. Em duas culturas de Ascomycetes foi possvel a visualizao dos ascos. Foram medidas a largura e o comprimento dos ascosporos com auxlio de ocular micromtrica, sendo utilizada a chave de classificao proposta por GRAHAM & LUTTRELL (3). As espcies fngicas do gnero Fusarium foram identificados com auxlio da chave proposta por NELSON et al (8) e as espcies do gnero Cladosporium pela chave proposta por DOMSCH et al (2). Dentre as colnias avaliadas havia uma de gnero Scopulariopsis, cuja identificao ocorreu com auxlio da chave proposta por MORTON & SMITH (7). 3 RESULTADOS E DISCUSSO

No caso especfico da amostragem da sada do desintegrador nenhum microrganismo foi isolado, pois esta regio aquecida e as bactrias
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lcticas e fungos, salvo raras excees, apresentam baixa resistncia trmica. De modo geral, obteve-se microbiota variada dos trs grupos de microrganismos em todas as amostragens. Em alguns casos foi necessrio descartar as placas, pois o crescimento intenso e diversificado de vrias espcies de microrganismos impossibilitou o seu isolamento. Com base nos dados apresentados nas Tabelas 1, 2 e 3 e nos diferentes nichos de amostragem observou-se que, as leveduras esto amplamente distribudas em todas as amostras examinadas. Foram isoladas ao todo, cerca de 135 cepas de leveduras num total de 240 cepas isoladas das diferentes espcies de microrganismos. Foram isoladas, inicialmente, 55 cepas de fungos filamentosos e 42 de bactrias lcticas. Houve predomnio de fungos filamentosos e leveduras no ambiente industrial e no isolamento a partir das frutas e seus produtos. As bactrias lcticas foram isoladas com maior freqncia nas amostragens das superfcies dos equipamentos, mesas de madeira (utilizadas na manipulao da matria-prima in natura ) e mesa de inox (utilizada para misturas de frutas higienizadas e acar). Nas amostras de polpa de goiaba deteriorada por exposio ao ambiente industrial todos os microrganismos foram isolados em meio de cultura PDA, sendo 07 de fungos filamentosos, 01 de bactria lctica e 01 de levedura. Em relao aos meios de cultura utilizados observou-se que o meio de cultura PDA foi bastante eficiente para o isolamento dos fungos filamentosos e leveduras. Considerando-se que os meios utilizados para o crescimento de bactrias lcticas so muito ricos e no seletivos pode-se notar que os fungos apresentaram crescimento tambm neste meio (principalmente as leveduras). O gar Rogosa foi o que menos possibilitou o isolamento dos microrganismos alvos. Os meios gar MRS e OSA apresentaram comportamento semelhante em relao ao nmero de cepas isoladas.

TABELA 1 - NMERO DE CEPAS DE BACTRIAS LCTICAS, FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADAS NO AMBIENTE INDUSTRIAL EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

Meio PDA OSA MRS ROGOSA TOTAL

Bactrias Lcticas 5 1 2 1 9

Leveduras 17 4 6 1 28

Fungos Filamentosos 34 1 35

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TABELA 2 - NMERO DE CEPAS DE BACTRIAS LCTICAS, FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADAS EM SUPERFCIES DE EQUIPAMENTOS E UTENSLIOS INDUSTRIAIS COM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

Meio PDA OSA MRS ROGOSA TOTAL

Bactrias Lcticas 1 3 6 12 22

Leveduras 11 12 5 2 30

Fungos Filamentosos -

TABELA 3 -

NMERO DE CEPAS DE BACTRIAS LCTICAS, FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS ISOLADAS NAS AMOSTRAS DE FRUTAS EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA Bactrias Lcticas 7 3 1 11 Leveduras 31 22 21 2 76 Fungos Filamentosos 9 3 1 13

Meio PDA OSA MRS ROGOSA TOTAL

A Tabela 4 apresenta os dados das contagens de microrganismos em frutas e seus produtos. Na amostra de goiaba in natura verificou-se contagem menor do que a habitual para produtos in natura . Tal fato pode ser decorrente da utilizao da variedade de mesa, plantada, colhida e transportada com maior zelo do que as normalmente destinadas ao processamento industrial. As polpas de frutas apresentaram contagens entre 102 e 103 UFC/g, com exceo da polpa de maracuj (104 UFC/g). As Tabelas 5, 6 e 7 apresentam uma lista dos gneros e espcies identificados das cepas de bactrias, leveduras e fungos filamentosos. No foram mencionadas as cepas iguais em gnero e espcie para o mesmo local de amostragem.

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TABELA 4 - CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS, LEVEDURAS E BACTRIAS LCTICAS EM FRUTAS E SEUS PRODUTOS

Amostra Polpa de morango e sementes congeladas Polpa de morango congelada Polpa de morango congelada adicionada de acar Polpa de maracuj Morango in natura Goiaba in natura

Fungos filamentosos e Leveduras (UFC/g)* Bactrias Lcticas (UFC/g)* OSA 4,2.10

3

MRS
3

3,9.10

3,7.103 1,7.103

4,0.102 3,3.104 1,0.106 2,3.103

8,0.102 2,9.104 1,1.106 3,3.103 6,0.104 1,4.106

* UFC/g = unidades formadoras de colnias por grama.

TABELA 5 - ESPCIES DE BACTRIAS LCTICAS ISOLADAS DO AMBIENTE INDUSTRIAL, DE FRUTAS E SEUS PRODUTOS

LOCAL DE AMOSTRAGEM Balde plstico Balde plstico Mesa de inox Mesa de inox Mesa de madeira Desintegrador Sala 1 (prximo porta) Polpa morango e sementes congeladas Polpa morango congelado Polpa de maracuj Maracuj in natura
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IDENTIFICAO Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides/ dextranicum Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides/ dextranicum Leuconostoc mesenteroides ssp mesenteroides/ dextranicum Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris Lactobacillus brevis Leuconostoc citreum

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A Tabela 5 demonstra a ocorrncia prxima entre as bactrias lcticas dos gneros Leuconostoc e Lactobacillus, com respectivamente 6 e 5 cepas. J para as leveduras a maior ocorrncia, conforme apresentado na Tabela 6, foi do gnero Candida com 8 cepas. De acordo com a Tabela 7, entre os fungos filamentosos a maior ocorrncia foi do gnero Penicillium (9 cepas), seguido pelo Ascomycetes (6 cepas). No caso especfico dos Ascomycetes, estas cepas seriam supostamente Ascomycetes, pois no foi possvel visualizar os ascos na observao ao microscpio. Para a identificao das culturas de Ascomycetes existe a possibilidade do seu cultivo em meio de cultura OA com pedaos de folha de bananeira, por cerca de 6 meses o que fugiria aos objetivos deste trabalho, entretanto, em duas destas culturas foi possvel a visualizao dos ascos, o que permitiu a sua identificao.

TABELA 6 - GNERO E ESPCIES DE LEVEDURAS ISOLADAS NO AMBIENTE INDUSTRIAL, EM FRUTAS E SEUS PRODUTOS

LOCAL DE AMOSTRAGEM Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao preparo) Sala 2 (prximo ao desintegrador) Sala 2 (prximo ao desintegrador) Desintegrador Desintegrador Desintegrador Desintegrador Mesa de inox Polpa de morango congelada adicionada de acar Polpa de maracuj Polpa de maracuj Polpa de maracuj Maracuj in natura Maracuj in natura Morango in natura Morango in natura

IDENTIFICAO Rhodotorula sp Candida magnoliae Rhodotorula sp Rhodotorula glutinis Rhodotorula sp Kloeckera apiculata Torulopsis candida Candida magnoliae Hansenula sp Candida pelicullosa Candida inconspicua Kloeckera apiculata Trichosporon pullulans Torulopsis magnoliae Yeast like fungi(levedura com miclio verdadeiro) Candida magnoliae Kloeckera apiculata

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TABELA 7 - GNEROS E ESPCIES DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS NO AMBIENTE INDUSTRIAL, EM FRUTAS E SEUS PRODUTOS LOCAL DE AMOSTRAGEM Sala 2 (prximo ao exaustor) Sala 2 (prximo ao exaustor) Sala 2 (prximo ao desintegrador) Sala 2 (prximo ao desintegrador) Sala 2 (prximo ao desintegrador) Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao enchimento) Sala 2 (prximo ao preparo) Sala 2 (prximo ao preparo) Sala 2 (prximo ao preparo) Polpa deteriorada de goiaba Polpa deteriorada de goiaba Polpa deteriorada de goiaba Polpa deteriorada de goiaba Polpa deteriorada de goiaba Polpa de morango com acar congelada Maracuj in natura Maracuj in natura Maracuj in natura Goiaba in natura Goiaba in natura IDENTIFICAO Penicillium glabrum Ascomycetes Penicillium variabile Penicillium crustosum Coelomycetes Ascomycetes Leptosphaerulina australis Penicillium viridicatum Coelomycetes Penicillium glabrum Penicillium glabrum Leptosphaerulina australis Ascomycetes Penicillium crustosum Scopulariopsis sphaerospora Penicillium solitum Cladosporium sp Coelomycetes Ascomycetes Fusarium verticillioides ou F. moniliforme Fusarium subglutinans Cladosporium sp Cladosporium sphaerospermum Penicillium solitum

CONCLUSO

O meio de cultura PDA mostrou-se eficiente para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras. Os meios de cultura gar MRS e OSA apresentaram comportamento semelhante no isolamento de bactrias lcticas, possibilitando tambm, o isolamento de fungos filamentosos e leveduras.

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As frutas analisadas apresentaram contagem da carga microbiana entre 103 a 106. As polpas de frutas apresentaram contagens entre 102 a 104, indicando que o processamento das frutas pode contribuir para a reduo da carga microbiana. Pelo nmero de cepas isoladas observou-se que houve predomnio de leveduras e fungos filamentosos nas amostras do ambiente industrial e de frutas e seus produtos examinados. As bactrias lcticas tiveram maior incidncia nas superfcies dos equipamentos, mesas de madeira e de inox. Entre as cepas identificadas a maior ocorrncia de leveduras foi do gnero Candida e nos fungos filamentosos de Penicillium. No caso das bactrias lcticas os gneros Leuconostoc e Lactobacillus ocorreram praticamente em populaes equivalentes.

Abstract
Fruits and fruit products are in general acid foods, being mainly contaminated by lactic acid bacterias, yeasts and filamentous fungi. In the present work, microorganisms present in fruits, fruit pulp and industrial environment were isolated and identified, being detected a prevalence of fungi in the samples assayed. The acid lactic bacterias were more incident at the surfaces analyzed.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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