Facultad de Ingenieras y Arquitectura Ingeniera Ambiental

ADAPTACION Y SELECCIN MICROBIANA AUTOCTONA EN MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS CON BENZO(A)PIRENO

Miguel ngel Palomino Gonzales

Docente: Blgo. Fernando Merino Rafael

RESUMEN Un nmero creciente de sustancias xenobioticas y compuestos orgnicos naturales son introducidos en el ambiente, que pueden ser toxicas para los seres vivos. Los suelos receptores de desechos txicos derivados del petrleo acumulan hidrocarburos policiclicos aromaticos como el benzo(a)pireno. Al establecerse estas molculas en el suelo, inicialmente las poblaciones microbianas disminuyen, y algunas especies se adaptan sobre todo en las rizosferas de los pastos nativos. El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta de bacterias y hongos aislados en suelos contaminados con petrleo a venzo(a)pireno en medio de cultivo y seleccionar y estabilizar los microorganismos tolerantes. Para ello se realiz el aislamiento, evaluacin, adaptacin y seleccin de bacterias y hongos nativos de las rizosferas de los pastos alemn (Echinochloa polystachya) y cabezon (Paspalum virgatum), en Gleysoles (Endoaquents e Hydraquents) influenciados por derrames y fugas de petrleo del campo petrolero localizados en la regin occidental del estado de Tabasco. El mtodo utilizado fue el conteo de viables de clulas vivas sembradas en cajas Petri. Cindo cepas de bacterias (CT11, CT16, CT26, CT36 Y AT4) y tres hongos nativos (Trichoderma spp. Paecilomuces sp. Y Aspergillus sp.) de la rizosfera del pasto cabezon tuvieron altas tasas de crecimiento y de biomasa, lo que indican tolerancia y uso del carbono del benzo(a)pireno en la multiplicacin celular. Las bacterias y hongos poseen potencial para la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos poliaromaticos.

INTRODUCCION El benzo(a)pireno (Bap) es un hidrocarburo aromatico policiclico (HAP) componente del petrleo, con cinco anillos bencnicos y un peso molecular de 252. de 252. El BaP es considerado por la Agencia de Proteccin Ambiental como uno de los 16 hidrocarburos aromticos policclicos ms txicos, cancergenos y mutagnicos, que adems puede ser transformado a metabolitos como el benzo(a)pireno 7,8 dihidrodiol 9-10, en clulas de mamferos y en bacterias, y es ms cancergeno que el BaP El petrleo crudo contiene 20 mg kg-1 de Bap. Los suelos cercanos a refineras pueden acumular concentraciones cercanas a 8 mg kg-1 de BaP por la contaminacin con. En estudios realizados por PEMEX (1997) en Histosoles y Gleysoles de Tabasco, se encontraron concentraciones hasta de 4.22 mg kg-1 de BaP.

El BaP origina diversas interacciones con los microorganismos en el suelo. Las bacterias y hongos poseen mecanismos de adaptacin fisiolgica, probablemente de origen gentico, que les permiten usar carbono del BaP en su multiplicacin celular. Kstner y Mahro (1996) encontraron que especies de Mycobacterium, Rhodococcus, Gordona y Sphingomonas paucimobilis utilizan molculas de HaP con cuatro y ms anillos bencnicos. Los microorganismos degradadores del BaP incorporados en sustratos minerales han sido utilizados en estudios de laboratorio. Field et al. (1992) encontraron que el hongo Phanerochaete chrysosporium tuvo un aumento poblacional significativo a partir de la degradacin de 10 mg L-1 de BaP. La bacteria S. paucimobilis puede adaptarse a la presencia de BaP y al utilizarlo para multiplicar se lo redujo en 33 %. Kotterman et al. (1998) reportaron el crecimiento del hongo Bjerkandera sp. Cepa BOS55 y la degradacin de 20 mg L-1 de BaP en 15 das. Tambin los hongos han crecido en medios de cultivo con 60 mg kg-1 de BaP. El objetivo del presente estudio fue evaluar en laboratorio la respuesta de bacterias y hongos aislados de pastos en suelos contaminados con petrleo al benzo(a)pireno (BaP) en medio de cultivo, y seleccionar y estabilizar las bacterias y hongos tolerantes al BaP.

MATERIALES Y METODOS La investigacin se realiz en el Laboratorio de Microbiolga de Suelos del Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrcolas, en Montecillo, Estado de Mxico, y comprendi tres etapas: colecta de rizosferas de vegetacin de pastos del rea de estudio; evaluacin mIcrobiolgica de las rizosferas; y, seleccin y estabilizacin de microorganismos en medios de cultivo enriquecidos con benzo(a)pireno, la cual incluy tres fases sucesivas para bacterias y dos para hongos. Actividades de preparacin y materiales utilizados El material de vidrio fue esterilizado por 5 h en calor seco a 180 C, en estufa. La esterilizacin de los medios de cultivo, el agua y las puntillas para la micropipeta se realiz en calor hmedo a 121 C, en olla de presin de vapor a 1.3 kg cm-2 durante 18 min. En la segunda etapa se utiliz el medio de cultivo selectivo de carbn combinado modificado (CCM1) para bacterias fijadoras de N atmosfrico tolerantes a BaP, basado en medio inorgnico ms BaP. Este medio const de dos soluciones: la solucin 1 fuede K2HPO4, (0.8 g L-1), NaCl (0.1 g L-1), NaFeEDTA (0.007 g L-1), Na2MoO42H2O (0.25 g L-1), agar y agua destilada, con pH ajustado a 7.0; y la solucin 2 fue de MgSO47H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.06 g L-1), biotina y cido p-aminobenzoico (10 mg L-1), y se adicion 30 mg L-1 de BaP. El medio para bacterias asimiladoras de N tolerantes a BaP consisti de las dos soluciones anteriores ms NH4Cl (CCM2). El medio para hongos celulticos, modificado (HCM) para hongos tolerantes a BaP, se form con nutrimentos inorgnicos ms BaP. Este medio consisti de (NH4)2SO4 (0.5 g L-1), KH2PO4 (1.0 g L-1), KCl (0.5 g L-1), MgSO47H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.1g L-1), agar, agua destilada y estreptomicina, con adicin de 30 mg kg-1 de BaP (v/v) y pH ajustado a 6. En la segunda etapa se utilizaron medios de cultivo slidos En la segunda y tercera fases del estudio de las bacterias y segunda de los hongos de la tercera etapa se utilizaron los medios de cultivo lquido CCM1 y HCM, respectivamente.

La solucin estndar de BaP se prepar a una concentracin de 100 mg L-1 en acetona y se aplic durante las diferentes fases. Se utiliz BaP (3,4-benzopireno) con un mnimo de 97% de pureza, grado HPLC (Sigma B-1760). Esta molcula tiene una solubilidad en agua de 0.003 mg L , punto de ebullicin de 496 C y estado fsico slido cristalino de color amarillo, y es soluble en solventes orgnicos como acetona y hexano.

RESULTADOS Y DISCUSIN La tolerancia de los microorganismos rizosfricos al BaP se evidenci en el tamao de las poblaciones nativas de la rizosfera de los pastos cabezn y alemn en suelos contaminados con petrleo. Las poblaciones de bacterias fijadoras de N, de bacterias asimiladoras de N y de hongos del pasto cabezn fueron 4, 6 y 52 veces mayores en el suelo con contaminacin crnica que en el suelo no contaminado; y para el pasto alemn, 4, 19 y 3 veces mayores en el suelo con contaminacin reciente que en el suelo sin contaminacin (Cuadro 1). El aumento significativo de las poblaciones microbianas posiblemente est relacionado con el tiempo de exposicin y de adaptacin de las bacterias y hongos a los HAP presentes en el suelo recientemente contaminado (Gleysol histi-dstrico) y en el suelo afectado por derrames crnicos de petrleo (Gleysol histi-utri-sdico). Las poblaciones de bacterias fijadoras de N fueron 102 y 103 (Cuadro 1), comparado con poblaciones de 103 y 104 para Bacterium sp. En muestras de suelos aledaos a petroqumicas. El suelo Gleysol histi-eutri-sdico receptor de contaminacin crnica con petrleo desde 1963, tuvo la mayor cantidad de microorganismos tolerantes a BaP. Esto es atribuible a que el alto contenido de cal (datos no presentados) y el surcado han propiciado condiciones adecuadas para la aireacin y formacin de pH neutro (6.7 a 7.3), as como a los contenidos ricos de N (87 a 98 ppm) y de P (11 a 74 ppm), puesto que ellos favorecen el crecimiento de microorganismos en el suelo. La mayora de las cepas de bacterias tolerantes a BaP fue aislada de la rizosfera del pasto cabezn (16 colonias) y una cantidad menor (ocho colonias) del pasto alemn. Las 24 cepas aisladas son gram negativas y mviles. Los 16 hongos tolerantes a BaP son nativos de la rizosfera del pasto cabezn, y los gneros ms comunes fueron Trichoderma, Penicillium, Aspergillus y Paecilomyces, y solamente dos especies del gnero Trichoderma fueron aislados de la rizosfera del pasto alemn. La mayor diversidad de hongos encontrados en la rizosfera del pasto cabezn es atribuible al largo periodo de exposicin y adaptacin (desde 1963) al petrleo crudo.

ANEXOS