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FLUORESCENCIA APLICADA A PROTENAS por Jos Antonio Poveda

Por qu es tan importante estudiar las protenas? En el mbito de las ciencias de la vida, conforme se ha desarrollado la instrumentacin cientfica, se ha estudiado desde lo grande o macroscpico hasta lo ms pequeo o microscpico; desde los organismos o estructuras pluricelulares como los rganos o tejidos, pasando por las clulas y los orgnulos subcelulares, hasta llegar a las macromolculas que los componen, como las protenas y los cidos nucleicos (figura 1). El estudio de estas macromolculas es un gran desafo cientfico, puesto que su tamao es de pocos nanometros (nm, mil millonsima parte de un metro) y adems se encuentran en entornos muy complejos con multitud de elementos interconectados como son las clulas.

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Biochim Biophys Acta. 2013 Sep 11. Identification of voltage-gated K+ channel beta 2 (Kvbeta2) subunit as a novel interaction partner of the pain transducer Transient Receptor Potential Vanilloid 1 channel (TRPV1).

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La comprensin de la estructura y funcin de las protenas es uno de los grandes retos de la biologa despus de haber descifrado el genoma humano, puesto que estas macromolculas son las que van a ejecutar a nivel molecular la informacin codificada en el genoma. Alcanzar este hito, adems de permitirnos comprender a nivel molecular

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el genoma. Alcanzar este hito, adems de permitirnos comprender a nivel molecular cmo funcionan las clulas, es fundamental para descubrir nuevas dianas de inters farmacolgico, es decir, sitios a los que se unirn los frmacos para ejercer su funcin. La fluorescencia y las protenas. Dentro de este campo de investigacin, el uso de la fluorescencia se ha incrementado y diversificado enormemente en las ltimas dcadas. Antes de entrar de lleno en las aplicaciones, conviene entender lo que es la fluorescencia. Ciertas molculas, llamadas fluorforos (como ejemplo ver figura 3), son capaces de absorber fotones de una cierta longitud de onda, es decir, de un cierto color. Esta absorcin, provoca que un electrn de la molcula que est en su estado fundamental (S 0), pase a un estado excitado de mayor energa. Cuando dicho electrn vuelve al estado fundamental, esa prdida de energa se traduce en la emisin de un fotn de cierta longitud de onda (color), caracterstico de dicho fluorforo (figura 2).

Prxima lectura de Tesis IBMC (31-Enero2014): Interaccin de TRPV1 y GABARAP y sus efectos en la dinmica del receptor.

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resistencia al tratamiento con selumetinib (AZD6244) en lineas celulares de carcinoma colorrectal.

Si la fluorescencia es simplemente luz emitida por una molcula, por qu es tan til para el estudio de las protenas? La fluorescencia es un proceso que ocurre en pocos nanosegundos (ns, mil millonsima de segundo), rango de tiempo en el que ocurren muchos procesos a nivel molecular, y por ello es sensible a los mismos. De esta manera, la fluorescencia aporta informacin muy valiosa sobre estructura y dinmica a escala molecular del sistema que estemos estudiando. Adems de esto, el simple hecho de que una molcula emita luz de una determinada longitud de onda, slo si hacemos incidir sobre ella luz de otra determinada longitud de onda, hace que sea una tcnica que sirva para detectar, localizar e incluso seguir la trayectoria de aquellas molculas que presenten fluorescencia, con una alta resolucin espacial y temporal, incluso en entornos complejos como puede ser una clula. El aminocido triptfano En el caso de las protenas, estas macromolculas estn formadas por la unin en cadena de muchos aminocidos, que seran como los eslabones a partir de las que se construyen. Esta cadena es capaz de plegarse en una estructura tridimensional o estado nativo, fundamental para poder ejercer su funcin biolgica. Algunos de estos aminocidos son en si mismos fluorforos, como es el caso del triptfano, tirosina y fenilalanina. La fluorescencia de las protenas est generalmente dominada por la del triptfano (figura 3), que absorbe luz cerca de 280 nm y que emite luz cerca de los 340 nm, en la regin del ultravioleta. Tambin hay algunas protenas naturales que contienen otros fluorforos que no son aminocidos. La ms conocida es la green fluorescent protein o GFP procedente de la medusa Aequorea victoria y que ha sido ampliamente utilizada para unirla a otras protenas y as conferirles fluorescencia en el rango del color verde. De esta manera se ha podido estudiar su localizacin e interacciones a nivel celular. Otra alternativa es modificar qumicamente la protena de inters con un fluorforo sinttico, lo que nos permite elegir el sitio de la protena donde ubicarlo y la longitud de onda que
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Seminarios IBMC (17-01-2014): Noble metal nanoparticles (NPs) in nanomedicine: preparation, sensing, imaging, labeling and therapy. Seminarios IBMC (04-12-2013): Modeling Human Peripheral Sensory Neural Development Using Pluripotent Stem Cells.

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usaremos para detectarlo. Eso es fundamental cuando se trata de microscopa de fluorescencia, sistemas no preparados para trabajar en la regin del ultravioleta, que es la regin donde se ha de trabajar con el triptfano. Como contrapartida, hemos de comprobar que dicho fluorforo, o la unin a GFP, no modifique sustancialmente la estructura y funcin de la protena de inters. En el caso de la fluorescencia del triptfano, se ha aprovechado su alta sensibilidad al ambiente qumico a su alrededor, para desarrollar multitud de metodologas con las que obtener informacin sobre la estructura y dinmica de las protenas que lo contienen. Qu informacin se puede obtener de la fluorescencia de los triptfanos de las protenas? Ciertas caractersticas fisicoqumicas del ambiente alrededor del triptfano condicionan el espectro de emisin del mismo, entendindose por espectro el rango de longitudes de onda donde la molcula emite fluorescencia. De esta forma, mediante la toma de este espectro se puede tener una idea de la localizacin del triptfano y de cualquier cambio en la estructura de la protena que afecte a la zona donde se encuentra. As, si un triptfano se encuentra en la superficie de la protena, expuesto a una disolucin acuosa, su espectro estar desplazado hacia mayores longitudes de onda. Sin embargo, en el caso de que el triptfano est en un entorno ms resguardado del agua, su espectro estar desplazado hacia menores longitudes de onda (figura 4). Esta es una propiedad que se ha utilizado frecuentemente para el estudio del plegamiento y desplegamiento de protenas, puesto que la estructura de la protena alrededor de los triptfanos cambia generalmente mucho desde el estado plegado o nativo, donde este residuo suele tener un entorno ms resguardado en el interior de la protena, al desplegado, donde suele estar totalmente expuesto al entorno acuoso.

Tambin se puede obtener informacin sobre la estructura proteica alrededor del triptfano utilizando el quenching o apagamiento de fluorescencia, fenmeno por el que un fluorforo pierde fluorescencia por su interaccin con pequeas molculas como el oxgeno o la acrilamida, o iones pesados como el ioduro (I -). Evidentemente, si un triptfano se encuentra en la superficie de una protena, su fluorescencia ser apagada ms fcilmente si le aadimos uno de estos compuestos, que si se encuentra en el interior de la protena.

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Otra propiedad que puede usarse a la hora de obtener informacin a nivel molecular de protenas, es la anisotropa de fluorescencia del triptfano. Este fenmeno depende de la capacidad de rotacin del fluorforo durante el tiempo que est en el estado excitado. Este parmetro nos da informacin, por un lado sobre el tamao global de la protena, y por otro lado sobre la dinmica (capacidad para moverse) de la regin de la protena donde se encuentra el triptfano. Estos datos son muy importantes y complementa a los obtenidos por tcnicas como la cristalografa de rayos X, que dan informacin de muy alta resolucin pero esttica sobre la estructura de las protenas. Adems, tambin se puede usar para cuantificar la interaccin de la protena de inters con otras protenas o macromolculas, siempre y cuando el tamao del complejo formado sea suficientemente ms grande que la protena de inters (figura 5).

FRET, o fluorescence resonance energy transfer (transferencia de energa por resonancia de fluorescencia), es otra propiedad de los fluorforos que nos permite medir distancias en el rango de los 150-600 nm, tamao en el orden de magnitud del dimetro de muchas protenas. Por ello, se dice que el FRET es como una regla de medir a nivel molecular. Para hacer uso de esta tcnica, hace falta tener dos sondas fluorescentes, una que hace de donador de fluorescencia y otra de aceptor. Bsicamente, lo que ocurre es que el donador de fluorescencia absorbe luz de una determinada longitud de onda y, dependiendo de la distancia que tenga con el aceptor, en vez de emitir luz, le transfiere esa energa al aceptor, que es el que en realidad emite luz a una longitud de onda diferente al donador (figura 6). Si medimos esta luz emitida por el aceptor, tras una serie de clculos, podemos obtener la distancia entre ambos fluorforos. Normalmente para aplicar esta tcnica se suele modificar las protenas de inters con fluorforos sintticos en aquellas posiciones de la protena de las que queramos obtener la distancia que las separa. Esto se puede hacer en distintas partes de una misma protena, o bien, en protenas diferentes. Con esta tcnica se han obtenido datos estructurales de protenas y tambin se ha podido cuantificar la asociacin o co-localizacin de ciertas protenas en distintos compartimentos celulares.

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Por tanto, mediante el uso aislado de alguna de estas tcnicas fluorescentes, o varias de ellas, se pueden obtener datos muy valiosos sobre el tamao de las protenas, su estructura terciaria y cuaternaria, cambios en la estructura de la protena frente a diferentes compuestos: agonistas, antagonistas, inhibidores, activadores, etc. Tambin se pueden obtener datos sobre la unin entre protenas, unin de protenas a membrana o a ligandos, inhibidores, etc. Todos estos datos son muy valiosos a nivel de investigacin bsica a la hora de comprender cul es la estructura y dinmica de las protenas, cmo interaccionan entre ellas o con otros componentes celulares, y cmo es el proceso de plegamiento de las mismas. La comprensin a nivel molecular de todos estos fenmenos es esencial para el diseo racional de nuevas protenas de inters mdico o biotecnolgico, como por ejemplo protenas con una estabilidad incrementada a fin de ser usadas en bioreactores industriales a altas temperaturas. Esta informacin tambin es imprescindible para encontrar nuevas dianas farmacolgicas, a partir de las que disear de manera racional nuevas drogas con las que combatir numerosas enfermedades todava hoy no tratables o para sustituir frmacos con efectos secundarios indeseados.

JOSE ANTONIO POVEDA LARROSA. Licenciado en Qumica por la Universidad de Alicante, Espaa, en 1995. Doctorado en Ciencias, Instituto de Neurociencias, Universidad Miguel Hernndez, Espaa, 2002. Desde 2008, Profesor Contratado Doctor en el rea de Qumica-Fsica del Departamento de Agroqumica y Medio Ambiente de la Universidad Miguel Hernndez. Investigador del Instituto de Biologa Molecular y Celular desde 2001. Actividad cientfica principal: estudio de la relacin estructura-funcin en canales inicos; efecto de los lpidos y otros moduladores. Tcnicas o especialidades: espectroscopa de fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo, incluyendo FRET, "quenching", anisotropa, etc.; microscopa confocal de fluorescencia; purificacin y reconstitucin de protenas de membrana; produccin de sistemas artificiales de membrana: bicapas planas en distintos soportes y liposomas de todo tipo: GUVs, SUVs, LUVs, MLVs; electrofisiologa: "patch-clamp".

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