OTIMIZAO DAS CONDIES PARA OBTENO DE PADRO DE BIXINA E DAS ETAPAS DE EXTRAO E SAPONIFICAO PARA QUANTIFICAO DE BIXINA EM SNACKS

EXTRUSADOS POR CLAE*

Alessandro de Oliveira RIOS** Adriana Zerlotti MERCADANTE** RESUMO: A escolha do mtodo de anlise do corante de urucum est profundamente relacionada com o tipo de matriz alimentcia que influencia as etapas iniciais de um procedimento analtico, tais como extrao e saponificao. Para a quantificao por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) necessrio o uso de padres que s vezes no esto disponveis comercialmente. Os objetivos deste trabalho foram isolar padres de bixina e de norbixina e verificar o efeito de diferentes condies na extrao de bixina em snacks extrusados e sua converso em norbixina durante a saponificao, utilizando CLAE em fase reversa. Atravs de cristalizaes foram obtidos cristais de bixina com 98% de pureza e norbixina, purificada por coluna de slica-gel, com pureza de 93%. As condies de extrao e saponificao foram estudadas atravs de planejamento experimental fatorial e as respostas obtidas por CLAE. Os cromatogramas evidenciaram que o melhor solvente para extrao foi acetato de etila, sendo necessrio realizar 8 extraes sucessivas para completa remoo dos pigmentos. Para obter 100% de converso de bixina em norbixina, a saponificao deve ser efetuada com 35 mL de KOH 35% metanlico com agitao a 50oC por 20 minutos. PALAVRAS-CHAVE: Corante; urucum; snacks extrusados; bixina; norbixina; CLAE. Tropical, e o Brasil um dos maiores produtores e exportadores de suas sementes.6 Para uso industrial, o corante comercializado na forma de p ou como preparaes lipossolveis e hidrossolveis. A semente de urucum apresenta um pericarpo rico em bixina (metil hidrognio 9-cis-6,6-diapocaroteno6,6-dioato), que um diapocarotenide (C25H30O4) com configurao cis,1,8 solvel em solventes orgnicos e sendo o pigmento predominante nas sementes,12 nas preparaes comerciais lipossolveis de urucum10 e em colorfico18 (Figura 1).
HOOC

Bixina

COOCH3

HOOC

Norbixina

COOH

FIGURA 1 - Estrutura da bixina e da norbixina A norbixina (9-cis-6,6-diapocaroteno-6,6-dioato) encontrada em pequena quantidade nas sementes, o pigmento principal das preparaes hidrossolveis10 e pode ser obtida pela saponificao da bixina em meio alcalino. Este pigmento tambm um diapocarotenide com configurao cis (C24H28O4)8, porm solvel em solventes polares10 (Figura 1). Os carotenides totais de urucum podem ser determinados atravs de leitura em espectrofotmetro no comprimento de onda mximo de absorbncia ( max)3. Porm, como os ismeros apresentam max prximos aos do carotenide original, torna-se praticamente impossvel verificar a presena de ismeros atravs da simples leitura do extrato total em espectrofotmetro. Atualmente a tcnica

Introduo Nos ltimos anos, o corante natural de urucum tem sido extensivamente utilizado pelas indstrias de alimentos para colorir diversos produtos como massas alimentcias, produtos extrusados, cereais matinais, produtos de panificao, gelados comestveis, sobremesas, molhos e condimentos.2 O corante de urucum extrado das sementes do urucueiro (Bixa orellana L.), uma planta nativa da Amrica

Parte da Dissertao de Doutorado do primeiro autor, em 2004, no Curso de Doutorado em Cincia de Alimentos - Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP - Campinas -SP - Brasil. Trabalho elaborado com auxlio financeiro da CAPES e FAPESP. ** Departamento de Cincia de Alimentos - Faculdade de Engenharia de Alimentos - UNICAMP - 13083-862 Campinas - SP - Brasil.

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que utiliza cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) em coluna de C18 a mais indicada para separao desses compostos. Lancaster & Lawrence9 analisaram os pigmentos de urucum presentes em produtos como margarina, manteiga e queijos. A extrao exaustiva dos pigmentos foi realizada com etanol/gua/hidrxido de amnio concentrado (29,7% NH3) e ter de petrleo. Devido extrao em meio alcalino a bixina foi convertida parcialmente em norbixina. Scotter et al. 16 desenvolveram mtodo para determinao de corante de urucum em diversos alimentos. Para snacks extrusados, aps prvia eliminao de lipdeos com hexano, a extrao exaustiva foi realizada com etanol/ gua/hidrxido de amnio (100:35:15 v/v/v) com converso parcial de bixina em norbixina. Tocchini & Mercadante18 quantificaram os teores de bixina e norbixina em vrias marcas e lotes de colorfico. Os carotenides foram extrados com acetona e metanol com uso de ultra-som. Deste modo, verifica-se que o tipo de extrao na anlise de carotenides de urucum dependeu da composio e complexidade da matriz alimentcia, tornando importante o estudo da influncia de diferentes condies na extrao do corante de urucum. Levando em considerao que a ingesto diria aceitvel (IDA) para o extrato de urucum de 0,065 mg/kg de peso corpreo, 5 e os snacks so consumidos principalmente pelo pblico infantil que atinge mais rapidamente o limite de IDA, h necessidade de se estudar uma metodologia para a determinao do corante neste tipo de produto. Os objetivos do presente estudo foram (1) a obteno de padro de bixina e de norbixina com alto teor de pureza e (2) estudar as etapas de extrao e saponificao de bixina em snacks extrusados base de farinha de milho por CLAE com detector de arranjo de diodos (DAD).

possvel, onde foram realizadas lavagens prvias das sementes de urucum com hexano e metanol para eliminao de lipdeos e compostos polares, respectivamente. Para tal, utilizou-se 25 g de sementes de urucum, 50 mL de cada solvente separadamente sob agitao por 15 minutos (2x), sendo os solventes descartados. Os pigmentos foram extrados sob agitao com 50 mL de acetato de etila por 15 minutos (2x) e o extrato obtido foi seco em evaporador rotatrio (T<30oC). 2.1.2. Cristalizao Aps avaliar a combinao de vrios solventes (acetona, acetato de etila, clorofrmio, diclorometano, etanol e metanol) para cristalizao de bixina, a seguinte metodologia foi desenvolvida. O extrato seco contendo os pigmentos foi diludo em diclorometano e adicionou-se lentamente etanol absoluto na proporo em volume de 1:4. Em seguida, a mistura foi levada para banho de gelo por 5 minutos e posteriormente colocada no congelador por uma noite. Assim, verificou-se a formao de cristais de bixina, que foram filtrados e lavados com etanol absoluto, e secos em estufa a vcuo temperatura ambiente por 24 horas. A pureza dos cristais foi verificada por CLAE e atravs do espectro no UV-visvel da bixina obtido pelo DAD. O procedimento de cristalizao foi novamente realizado para obteno de cristais com maior teor de pureza. Utilizou-se microscopia eletrnica de varredura para verificar a forma dos cristais. As amostras foram aspergidas sobre fita metlica adesiva de dupla face, colocadas sobre suportes metlicos e recobertas com ouro (240s/40mA) em metalizador a vcuo (Balzers). As micrografias foram obtidas por Itaciara Larroza Nunes no microscpio Jeol modelo T-300 sob acelerao de 15KV atravs de captura de imagem.17 2.2. Norbixina

Material e mtodos 1. Material Sementes de urucum usadas para obteno dos padres de bixina e norbixina e uma amostra comercial de snack extrusado sabor queijo que possua em sua formulao corante natural de urucum foram adquiridas no comrcio de Campinas, So Paulo. Cristais de bixina foram gentilmente cedidos pelo Dr. Werner Simon da DSM Nutritional Products (Basilia, Sua). 2. Isolamento dos padres 2.1. Bixina 2.1.1. Extrao A seguinte metodologia foi desenvolvida para a obteno de um extrato com menor teor de impurezas

O padro de norbixina foi obtido de acordo com o procedimento descrito por Tocchini & Mercadante. 18 Brevemente, os carotenides foram extrados com uma mistura de metanol/diclorometano (1:1) a partir de sementes de urucum previamente lavadas com ter de petrleo para eliminao de lipdeos. Aps evaporao do diclorometano, adicionou-se ao extrato uma soluo metanlica de KOH 10% para ocorrer saponificao da bixina, originando sais de norbixina. A esta mistura foi ento acrescentado cido actico para neutralizao e precipitao da norbixina que foi recolhida por filtrao. A norbixina foi purificada por coluna de slica-gel (2,5 x 10 cm) previamente condicionada com acetato de etila. O mesmo solvente foi utilizado para dissolver a amostra, acrescentando apenas algumas gotas de metanol (para facilitar a solubilizao completa do pigmento) e ter de petrleo para equilibrar a polaridade. Aps eluio de uma banda amarela com aproximadamente 100 mL de acetato de etila, aumentou-se a polaridade do solvente

204

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acrescentando uma mistura de metanol/acetato de etila (1:1) para eliminao de uma banda amarela mais forte que a primeira. Partiu-se ento para 100% de metanol e uma faixa laranja escura, correspondente norbixina, rapidamente moveu-se do topo, sendo recolhida a parte intermediria da mesma. Aps concentrao em evaporador rotatrio verificouse a pureza da frao obtida, por CLAE, que era de 93%. 3. Metodologia para anlise de corante de urucum em snacks extrusados Foi utilizado o mtodo desenvolvido por Rios & Mercadante13 que consiste das seguintes etapas: digesto, extrao, saponificao, separao e quantificao por CLAE. Uma hidrlise enzimtica foi utilizada para degradar o amido e facilitar a posterior extrao do corante. Com o intuito de avaliar o comportamento de algumas variveis na extrao do corante de urucum, foram estudados tipo e volume de solvente, nmero de extraes e tempo de cada extrao atravs de um planejamento experimental fatorial 24-1. A saponificao foi estudada temperatura ambiente (25 3 oC) onde foram avaliados tempo de reao, uso ou no de agitao, presena ou ausncia de nitrognio e quantidade final de KOH na soluo composta por 10 mL de KOH metanlico e 10 mL de extrato de carotenides em acetato de etila atravs de um planejamento fatorial fracionrio 24-1. Tambm foi estudada, por um planejamento 25-1, a saponificao sob aquecimento, avaliando os mesmos fatores e nveis, porm reduzindo o tempo de saponificao. Resumidamente, para cada 5 g de amostra triturada, foi realizada uma digesto com 200 L de -amilase bacteriana por 2 horas em temperatura ambiente. Os pigmentos foram extrados com 30 mL de acetato de etila a 150 rpm em temperatura ambiente por 10 minutos, sendo necessrio 8 extraes sucessivas. A saponificao foi realizada sob agitao com 35 mL de KOH 35% em metanol a 50oC por 20 minutos. Aps lavagem para retirada do lcali, o extrato foi seco e os carotenides separados e quantificados por CLAE.13 4. Cromatografia lquida de alta eficincia Foi utilizado um cromatgrafo lquido com sistema quaternrio de bombeamento de solventes (Waters), injetor Rheodyne de 20 L, forno externo com controle de temperatura, desgaseificador on line, DAD (Waters) e sistema de aquisio e processamento de dados Millenium (Waters). Os carotenides foram separados em coluna de C18 Spherisorb ODS-2 (150 x 4,6 mm), com 3 m de dimetro de partcula, mantida em forno a 29oC. Foi utilizada como fase mvel, ao fluxo de 1 mL/min, acetonitrila/cido actico 2% (65:35).15,18 Os espectros foram adquiridos entre 250 e 600 nm e os cromatogramas processados no comprimento de onda de 450 nm. Os extratos secos de carotenides foram diludos em metanol/acetonitrila (1:1) e filtrados em membrana de polietileno com 0,22 m de poro imediatamente antes da

injeo no cromatgrafo. Todos os solventes utilizados foram grau cromatogrfico e previamente filtrados em sistema Millipore de filtrao a vcuo, com membrana para solvente orgnico de 0,45 m. Bixina e norbixina foram identificadas segundo a ordem de eluio e comparao dos max, estrutura fina e intensidade do pico cis dos espectros UV-visvel, obtidos no detector de arranjo de diodos, com dados da literatura.3,4 A estrutura fina (%III/II) foi determinada traando uma linha reta no valor mnimo entre os picos de maior comprimento de onda (III) e o pico designado de max (II), e aps a medio da altura destes picos realizou-se o clculo em porcentagem de altura pico III sobre altura do pico II. A intensidade do pico cis (%AB/AII) foi determinada a partir da linha de base do espectro medindo a altura do pico de (II) e a altura da banda de absoro a 285 nm conhecida max como pico cis e calculando a porcentagem de altura do pico cis (AB) sobre pico II (AII). Resultados e discusso 1. Obteno dos padres 1.1. Cristalizao de bixina Como mostra a Figura 2 e Tabela 1, aps a primeira cristalizao, a bixina apresentou grau de pureza de 94%. No processo de re-cristalizao, a pureza da bixina (pico 9) aumentou para 98%, devido eliminao dos compostos com tempo de reteno menor que a bixina (picos de 1 a 6), e reduo da intensidade dos picos 7 e 8. A Figura 3 apresenta os espectros no UV-visvel dos picos referentes Figura 2. Os cristais obtidos neste trabalho apresentaram maior teor de pureza que o empregado por Scotter et al.16, que a partir de bixina do Laboratrio Chr. Hansen Ltd. (Reino Unido) realizaram 3 cristalizaes sucessivas com acetato de etila obtendo 97% de pureza, e por Lancaster & Lawrence9 que utilizaram para quantificao de corante de urucum em alimentos, cristais de bixina adquiridos da Warner-Jenkinson (Canad) com 90% de pureza. Como esperado, para coluna de fase reversa, a norbixina (pico 4) que contm dois grupos cidos, eluiu primeiramente que a bixina (pico 9) com um grupo cido e outro ster. Alm disso, o max destes dois diapocarotenides obtidos no presente trabalho foram iguais aos previamente relatados por Scotter et al.,15 ou seja, de 460 a 461 nm para norbixina e bixina, respectivamente. Em outros solventes, diferentes foram relatados como 470 nm em max clorofrmio15 e 456 nm em ter de petrleo para bixina3 e para norbixina 453 nm em NaOH 0,1 M.15. Uma vez que os espectros dos ismeros cis apresentam deslocamento hipsocrmico, menor grau de estrutura fina e aparecimento de uma nova banda de absoro conhecida como pico cis3, e considerando a ordem de eluio, os picos 1 e 3 foram caracterizados como

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ismeros cis da norbixina devido ao deslocamento hipsocrmico de 4 nm e 6 nm, perda e reduo da estrutura fina respectivamente, e aparecimento do pico cis no composto 3. De forma anloga, os pico 7 e 8 foram tentativamente identificados como ismeros cis da bixina devido ao deslocamento hipsocrmico de 6 nm e 7 nm, reduo da estrutura fina de 30% para 15% respectivamente, e surgimento do pico cis em ambos compostos. Por comparao das caractersticas dos espectros do dimetil hidrognio 9-cis, 9-cis-6,6-diapocaroteno-6,6dioato,11 o pico 8 foi tentativamente identificado como metil hidrognio 9-cis, 9-cis-6,6-diapocaroteno-6,6-dioato (9cis-bixina). As micrografias obtidas por microscopia eletrnica dos cristais de bixina preparados no presente trabalho e do cristal cedido pela DSM Nutritional Products esto apresentadas na Figura 4.
0,35 0,30

Ambos cristais apresentaram formas geomtricas irregulares, predominando as formas alongadas e prismticas. Os cristais da DSM Nutritional Products mostraram-se maiores do que os cristais de bixina obtidos no presente estudo. Gutmann et al.7 tambm relataram que cristais de all- trans -metil bixina apresentaram formas geomtricas semelhantes s descritas neste trabalho. O tamanho e a forma dos cristais para o mesmo carotenide pode variar dependendo do conjunto de solventes utilizados na cristalizao. Outro fator importante a temperatura, uma vez que durante o processo de cristalizao uma reduo lenta da temperatura leva formao de cristais de diferentes tamanhos, e um rpido resfriamento do extrato acelera o processo conduzindo formao de cristais menores e uniformes.4 Entretanto, esta comparao no pode ser feita, pois no havia informao disponvel sobre o processo de cristalizao da bixina cedida pela DSM Nutritional Products.
0,35

a - cristalizado 9
Resposta do Detector (UA)

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05

b - recristalizado 9

Resposta do Detector (UA)

0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 -0,05 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

11 23 4

56

78

78
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

20

22

24

Tempo (minutos)

Tempo (minutos)

FIGURA 2 - Cromatogramas, obtidos por CLAE, de cristais de bixina. a cristalizada e b re-cristalizada. Condies cromatogrficas: coluna Spherisorb ODS-2 e como fase mvel acetonitrila/cido actico 2% (65:35), com vazo de 1 mL/min e temperatura da coluna mantida a 29oC. Caractersticas dos picos: vide Tabela 1. Processado no maxplot. Tabela 1 - Caractersticas espectrais e quantidade (%), obtidas por CLAE, dos compostos presentes na bixina cristalizada e re-cristalizada.

Picoa

Tempo de rea (%) Reteno Cristalizado Recristalizado (min) 4,7 5,4 5,7 7,5 14,8 15,3 17,9 19,5 20,1 0,17 0,17 0,13 0,36 0,74 0,25 1,88 2,34 93,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,05 0,85 98,01

max

(nm)b

III/II (%) 0 20 11 36 40 10 15 15 39

AB/AII (%) 0 15 33 4 15 22 41 25 5

1 2 3 4 (norbixina) 5 6 7
cis 8 (9-cis-bixina)

(424), 456, 482 (420), 461, 489 (424), 454, 481 (435), 460, 489 (420), 448, 474 (412), 430, 452 (428), 455, 480 (428), 454, 481 (433), 461, 489

9 (bixina)
a

Numerado de acordo com os cromatogramas da Figura 2. b Solvente: acetonitrila/cido actico 2% (65:35).

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0,0030

0,0025

Pico 1
424

456 482
Resposta do Detector (UA)

0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000

Pico 2
424

461

489

Resposta do Detector (UA)

0,0020

0,0015

0,0010

280

350

0,0005

0,0000 250 300 350 400 450 500 550 600

250

300

350

400

450

500

550

600

Comprimento de Onda (nm)

Comprimento de Onda (nm)

0,020

Pico 3
424

454
Resposta do Detector (UA)

0,4

Resposta do Detector (UA)

481
0,015 0,010

Pico 4 (Norbixina)
435

460 489

0,3

0,2

0,005

288
250 300

352

0,1

0,000 350 400 450 500 550 600

0,0 250 300 350 400 450 500 550 600

Comprimento de Onda (nm)

0,10 0,09

Comprimento de Onda (nm)

Pico 5
474 420 271
250 300 350 400 450 500 550 600

0,014

Pico 6
412

430

Resposta do Detector (UA)

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00

Resposta do Detector (UA)

0,08

448

0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 250 300 350 400

452

318

450

500

550

600

Comprimento de Onda (nm)

0,020 0,018

Comprimento de Onda (nm)

Pico 7
428 288

0,020

Resposta do Detector (UA)

0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000

455
Resposta do Detector (UA)

0,018

480

0,016 0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000

Pico 8
428 290
250 300

454 481

350
350 400 450 500 550 600

250

300

350

400

450

500

550

600

Comprimento de Onda (nm)

Comprimento de Onda (nm)

0,08

Resposta do Detector (UA)

0,06

Resposta do Detector (UA)

461 Pico 9 (Bixina 433 Cristalizada)

489

0,08

Bixina DSM

461 433

489

0,06

0,04

0,04

0,02

0,02

0,00

0,00

250

300

350

400

450

500

550

600

250

300

350

400

450

500

550

600

Comprimento de Onda (nm)

Comprimento de Onda (nm)

FIGURA 3 - Espectros, obtidos atravs do DAD em acetonitrila/cido actico 2% (65:35), dos carotenides presentes nos cristais de bixina. Picos numerados de acordo com os cromatogramas da Figura 2. 1.2. Padro de norbixina O cromatograma, obtido por CLAE, do padro de norbixina est apresentado na Figura 5. A norbixina (pico 4) apresentou pureza de 93% e presena de outros compostos, provavelmente ismeros (picos 1, 2 e 3) (Tabela 2). O pico 3 foi tentativamente identificado como 9-cis, 9-cis-6,6-diapocaroteno-6,6-dioato (9-cis-norbixina) pois apresentou deslocamento hipsocrmico de 5-6 nm em relao norbixina, diminuio da estrutura fina e aumento da intensidade do pico cis (Tabela 2), da mesma forma que a 9-cis-bixina em relao bixina (Tabela 1).

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FIGURA 4 - Micrografias, obtidas por microscopia eletrnica com aumento de 1.600 vezes, de cristais de bixina. a - preparado no presente trabalho e b - cedido pela DSM Nutritional Products. Tabela 2 - Caractersticas espectrais, obtidas por CLAE, do padro de norbixina.

Picoa 1 2 3 (9-cis-norbixina) cis 4 (norbixina)

rea (%) 2,98 2,42 1,15 93,45

Tempo de Reteno (min) 6,2 6,6 7,0 7,5

max

(nm)b

III/II (%) 15 11 14 36

AB/AII (%) 31 33 24 4

(428), 455, 480 (424), 454, 481 (428), 455, 482 (435), 460, 489

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 Tem po (m inutos) 9 10

1 2 3 4

FIGURA 5 - Cromatograma, obtido por CLAE, de padro de norbixina. Condies cromatogrficas: vide texto. Identidade dos picos: vide Tabela 2. 2. Avaliao da metodologia para determinao de bixina em snacks extrusados 2.1. Extrao A Tabela 3 apresenta as condies experimentais e os resultados obtidos para a etapa de extrao. Os cromatogramas apresentados nas Figuras 6a e 6b foram obtidos, respectivamente, com 6 extraes com 50 mL de diclorometano por 20 minutos cada (ensaio 8, Tabela 3) e 6 extraes com 50 mL de acetato de etila por 10 minutos cada (ensaio 7, Tabela 3). Nestas condies,

apesar do menor tempo de extrao com acetato de etila, as respostas em rea absoluta do pico de norbixina foram 1,84 e 4,40 para extrao com diclorometano e acetato de etila, respectivamente. A maior quantidade de bixina extrada por acetato de etila (rea de 5,35, ensaio 5, Tabela 3) foi tambm verificada utilizando um menor volume deste solvente, 25 mL em 6 extraes de 20 minutos (Figura 6c), em comparao com 50 mL de diclorometano (Figura 6a). Desta forma, acetato de etila foi escolhido como solvente de extrao. Utilizando acetato de etila verificou-se que a variao do volume de solvente e tempo de extrao apresentou pequeno efeito na quantidade de pigmento extrado, (ensaios 1 e 3 da Tabela 3) quando foi aumentado o volume de acetato de etila de 25 para 50 mL e tempo de extrao de 10 para 20 minutos. Para otimizar a extrao com acetato de etila, um planejamento experimental completo 23 foi conduzido diminuindo os valores de volume de solvente e tempo de cada extrao, e aumentando o nmero de extraes (Tabela 4). Foi verificado que, aumentando-se o nmero de extraes maior quantidade de pigmento foi extrado, como mostram os ensaios 10 e 15 (Tabela 4). Atravs de extrao exaustiva, foi verificada a no necessidade do aumento do nmero extraes. Os experimentos mostraram que as melhores condies para extrao foram obtidas com 8 extraes por 10 minutos cada, utilizando 30 mL de acetato de etila (ensaio 15, Tabela 4). Cabe ressaltar que os ismeros (picos menores na Figura 6) so provavelmente provenientes dos corantes comerciais utilizados pelas indstrias, aliado ao fato de que

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altas temperaturas so utilizadas durante o processo de extruso dos snacks. Scotter et al.14 tambm relataram a presena de ismeros de norbixina em amostras de corantes comerciais

de bixina e norbixina. Estes ismeros estavam em quantidades diferentes em todos os corantes e os autores correlacionaram tal diferena aos mtodos utilizados na sua obteno.

Tabela 3 - Condies experimentais e resultados do planejamento fatorial fracionrio para etapa de extrao.
Ensaios Solvente 1 2 3 4 5 6 7 8 EtOAc CH2Cl2 EtOAc CH2Cl2 EtOAc CH2Cl2 EtOAc CH2Cl2 Volume solvente (mL) 25 25 50 50 25 25 50 50 Fatores Nmero extraes 3 3 3 3 6 6 6 6 Respostas Tempo extrao (min) 10 20 20 10 20 10 10 20 R1 3,52 1,01 3,59 1,54 5,21 2,56 4,22 1,80 R2 3,38 1,00 3,39 1,57 5,48 2,37 4,58 1,88 Mdia 3,45 1,01 3,49 1,56 5,35 2,46 4,40 1,84

Resposta: rea do pico da norbixina.

0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

a1

0,60 b 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

1

0,60 c 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

4 5 6 7 8 Tempo (minutos)

9 10

3 4 5 6 7 8 Tempo (minutos)

9 10

3 4 5 6 7 8 Tempo (minutos)

9 10

FIGURA 6 - Cromatogramas, obtidos por CLAE, de extrato de carotenides em snacks extrusados extrados com: a 50 mL de diclorometano, 6 extraes de 20 min cada, b 50 mL de acetato de etila, 6 extraes de 10 min cada, c 25 mL de acetato de etila, 6 extraes de 20 min cada, Condies cromatogrficas: vide texto. Solvente de injeo: 1 mL de metanol/acetonitrila (1:1). Pico 1: norbixina. Tabela 4 - Condies experimentais e resultados do planejamento fatorial completo para a etapa de extrao.
Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Volume solvente (mL) 21 39 21 39 21 39 21 39 30 30 30 15 45 30 30 30 30 Fatores Nmero extraes 5 5 7 7 5 5 7 7 6 6 6 6 6 4 8 6 6 Tempo de extrao (min) 7 7 7 7 13 13 13 13 10 10 10 10 10 10 10 5 15 R1 3,04 3,52 3,98 4,08 2,00 2,82 2,86 4,80 3,40 3,16 4,28 2,34 2,86 3,16 5,20 3,08 2,52 Respostas R2 Mdia 3,20 3,12 3,56 3,54 4,20 4,08 4,12 4,10 2,00 2,00 2,74 2,78 2,66 2,76 4,94 4,86 3,58 3,48 3,12 3,14 4,24 4,26 2,22 2,28 3,08 2,98 3,20 3,18 5,36 5,28 3,16 3,12 2,54 2,54

Resposta: rea do pico da norbixina.

Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 3, p. 203-213, 2004

209

2.2. Saponificao do extrato Os resultados dos planejamentos fracionrios para o estudo da saponificao mostraram que a converso de bixina para norbixina foi de aproximadamente 8%, tanto temperatura ambiente por 24 horas (ensaio 3, Tabela 5) como 50 oC por 20 minutos (ensaio 1, Tabela 6) com 10% de KOH na soluo final (Figuras 7a e 7b). Elevando a concentrao final de KOH para 20% e mantendo as demais condies inalteradas, a converso aumentou para 20% de norbixina (Figuras 7c e 7d). Independente da concentrao de KOH notou-se maior presena de ismeros quando a saponificao foi realizada por um longo perodo temperatura ambiente (Figuras 7a e 7c), do que em um tempo curto com aquecimento (Figuras 7b e 7d). Desta forma, foi escolhido uso de temperatura para otimizao desta etapa. O binmio concentrao de KOH metanlico e temperatura foi estudado atravs de um planejamento experimental completo 2 2 , cujos resultados esto apresentados na Tabela 7.

Aumentando a concentrao de KOH metanlico para 30% (10 mL de KOH metanlico e 10 mL de extrato de carotenides em acetato de etila), a converso de bixina em norbixina foi de 51,4% a 50oC e de 43,6% a 70oC, valores estes que no diferiram significativamente entre si (Figuras 8a e 8b). Estes resultados mostraram que aumento de temperatura de 50oC para 70oC no aumentou a taxa de converso de bixina para norbixina e que a faixa de concentrao de KOH avaliada no foi suficiente para a converso total de bixina. Um novo experimento foi realizado mantendo a temperatura de 50oC com tempo de 20 minutos e variando a concentrao final de KOH metanlico de 45 a 70%. O uso de 55% de KOH foi suficiente para 100% de converso de bixina sem haver formao de ismeros adicionais (Figura 8c). Considerando que o teor de lipdeos pode variar consideravelmente entre as amostras comerciais, o uso de 35 mL de KOH 35% em metanol foi escolhido, correspondendo concentrao final de 62,5% como margem de segurana.

Tabela 5 - Condies experimentais e resultados do planejamento fatorial fracionrio para a etapa de saponificao temperatura ambiente.

Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 KOH (%) 10 20 10 20 10 20 10 20

a

Fatores Tempo (h) 20 20 24 24 20 20 24 24 Agitao sem sem sem sem com com com com N2 sem com com sem com sem sem com R1 8,55 22,32 9,04 19,78 8,96 20,90 14,09 19,30

Respostas R2 8,36 20,83 9,87 21,12 9,07 19,51 13,98 19,71 Mdia 8,46 21,58 9,46 20,45 9,01 20,21 14,04 19,51

Resposta: porcentagem de rea de norbixina em relao a rea total de bixina. aPorcentagem final de KOH na soluo contendo 10 mL de KOH metanlico e 10 mL de extrato de carotenides em acetato de etila.

Tabela 6 - Condies experimentais e resultados do planejamento fatorial fracionrio para a etapa de saponificao com aquecimento. Fatores Respostas Ensaios KOH (%)a Tempo (min) Agitao Temp. (oC) N2 R1 R2 Mdia

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20

20 20 40 40 20 20 40 40 20 20 40 40 20 20 40 40

sem sem sem sem com com com com sem sem sem sem com com com com

50 50 50 50 50 50 50 50 70 70 70 70 70 70 70 70

com sem sem com sem com com sem sem com com sem com sem sem com

8,00 18,42 8,21 18,96 8,59 20,36 8,42 22,01 8,94 17,63 8,88 19,68 8,38 17,06 9,56 17,25

8,34 18,93 8,93 17,68 8,92 21,37 8,29 18,56 8,80 18,62 19,64 7,62 7,76 16,91 9,34 17,10

8,17 18,68 8,57 18,32 8,76 20,87 8,36 20,29 8,87 18,13 14,26 13,65 8,07 16,99 9,45 17,18

Resposta: porcentagem de rea de norbixina em relao a rea total de bixina. aPorcentagem final de KOH na soluo contendo 10 mL de KOH metanlico e 10 mL de extrato de carotenides em acetato de etila.

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0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00

a2

0,20 0,16 0,12 0,08

b2

0,04 0,00 26 30 0,20 0,16

2

2 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00 2 c-

10 14 18 22 Tempo (minutos)

2 d-

10 14 18 22 Tempo (minutos)

26

30

0,12
1

2 1

0,08 0,04 0,00

10 14 18 22 Tempo (minutos)

26 30

10 14 18 22 Tempo (minutos)

26

30

FIGURA 7 - Cromatogramas, obtidos por CLAE, de extrato de carotenides em snacks extrusados saponificados com: a 10% de KOH metanlico, por 24 horas temperatura ambiente, b 10% de KOH metanlico, por 20 min a 50oC, c 20% de KOH metanlico, por 24 horas temperatura ambiente, d 20% de KOH metanlico, por 20 min a 50oC. Condies cromatogrficas: vide texto. Pico 1: norbixina, pico 2: bixina. Tabela 7 - Condies experimentais e resultados do planejamento fatorial completo para a etapa de saponificao com aquecimento.

Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

KOH (%) 20 30 20 30 25 25 25 18 25 32 25

Fatores Temperatura (oC) 50 50 70 70 60 60 60 60 74 60 46

R1 17,82 53,42 19,43 40,25 29,68 29,08 29,54 14,67 31,22 44,64 28,28

Respostas R2 17,52 49,37 21,00 46,92 29,12 30,10 29,45 16,60 32,48 44,88 27,65

Mdia 17,67 51,40 20,22 43,59 29,40 29,59 29,50 15,64 31,85 44,76 27,97

Resposta: porcentagem de rea de norbixina em relao a rea total de bixina. aPorcentagem final de KOH na soluo contendo 10 mL de KOH metanlico e 10 mL de extrato de carotenides em acetato de etila.

0,28 a 0,24 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00 2

0,28 b 0,24
1 2

0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00

1

0,24 0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00

26 30

c-

FIGURA 8 - Cromatogramas, obtidos por CLAE, de extrato de carotenides em snacks extrusados saponificados com: a 30% de KOH metanlico, por 20 min a 50oC, b 30% de KOH metanlico, por 20 min a 70oC, c 55% de KOH metanlico, por 20 min a 50oC. Condies cromatogrficas: vide texto. Pico 1: norbixina, pico 2: bixina. Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 3, p. 203-213, 2004 211

10 14 18 22 Tempo (minutos) c-

26 30

10 14 18 22 Tempo (minutos)

10 14 18 22 26 30 Tempo (minutos)

Concluso No presente estudo, foi obtido padro de bixina com alto teor de pureza atravs de cristalizao e os cristais formados apresentaram formas geomtricas irregulares, alongadas e prismticas. O mtodo utilizado mostrou ser simples e de baixo custo. O uso de CLAE possibilitou acompanhar a influncia de importantes fatores durante a extrao dos pigmentos de snacks extrusados, demonstrando a eficincia do solvente acetato de etila e determinando o volume de solvente (30 mL), tempo (10 minutos) e nmero de extraes (8) necessrio para otimizao da metodologia desenvolvida. A converso de bixina em norbixina, durante a saponificao, foi de 100% nas seguintes condies: 35 mL de KOH 35% em metanol a 50oC por 20 minutos). Atravs dos cromatogramas obtidos por CLAE verificou-se que em todas as etapas de anlise no houve a formao de produtos de degradao com max entre 250 e 600 nm.

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Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 3, p. 203-213, 2004

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