Controle

Controle
Microbiolgico nas
Microbiolgico nas
Usinas de acar e
Usinas de acar e
lcool
lcool
Prof. Dr
Prof. Dr
Dejanira
Dejanira
de Franceschi de Angelis
de Franceschi de Angelis
1. OBJETIVO
O controle do crescimento da populao
microbiana dentro de um complexo industrial de
acar e lcool objetiva essencialmente a
diminuio das perdas de matria-prima e,
conseqentemente, alcanar melhores
rendimentos econmicos.
2.
gua de lavagem da cana nbactrias/mL
Reduo de resazurina
Plaqueamento (contagem
geral)
Caldo primrio nbactrias/mL
Plaqueamento para
produtores de goma e cido
Caldo misto nbactrias/mL
Plaqueamento para
produtores de goma e cido
Anlises que podem ser
realizadas
Pontos de
Amostragem
Caldo antes da sulfitao
ou calagem
nbactrias/mL
Plaqueamento para produtores de
goma e cido
Caldo decantado nbactrias/mL
Plaqueamento para produtores de
goma e cido
Reduo de resazurina
Mosto e Mel
Xarope, gua de
diluio, caldo cru
nbactrias/mL
Reduo de resazurina
Plaqueamento para produtores de
goma e cido
Mosto antes e aps os
trocadores de calor
Reduo de resazurina
Plaqueamento para produtores de
goma e cido
Incio de alimentao da
dorna
Final da alimentao
nbactrias/mL
n de clulas vivas/mL
% de viabilidade
% de brotamento
% de brotos vivos
Plaqueamento
Leite de leveduras ou cubas nbactrias/mL
% de clulas vivas
% de brotamento
% de brotos vivos
plaqueamento
3. COLETA DE AMOSTRAS
As amostras devem ser coletadas com muito
cuidado, sempre da mesma forma e por pessoas
de alta responsabilidade.
Da coleta correta das amostras, acoplado com o
bom desenvolvimento laboratorial, depende o
resultado de uma empresa.
O ideal que as coletas sejam feitas em frascos
inquebrveis, autoclavveis e transparentes.
Existem frascos especiais de coleta, que podem
ser autoclavados.
Quando as anlises so para microbiologia, os
frascos so de 200, 300 a 500 mL. As amostras
preferencialmente devem ser amostras mistas ou
compostas.
Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem
ser fechados e guardados sob refrigerao de 5
2C, pelo menor tempo possvel. Dependendo da
amostra conveniente anotar no momento da
coleta a temperatura e o pH.
4. AVALIAO DO NMERO DE BACTRIAS
A avaliao pode ser feita pelos seguintes
mtodos principais:
MICROSCPICA
PLAQUEAMENTO
FISIOLGICA
A anlise por contagem microscpica importante
pois permite relacionar possveis aumentos das
bactrias no mosto proveniente das diferentes
etapas do processo.
MICROSCPICA
Para contagem pode-se empregar vrias tcnicas,
entretanto a cmara de Neubauer simples e
confivel.
PLAQUEAMENTO
O plaqueamento embora no fornea o resultado
imediato pode garantir a viabilidade dos
microrganismos presentes alm de poder avaliar a
presena de microrganismos em volumes maiores.
FISIOLGICA
O mtodo de resazurina permite avaliar de forma
relativa a presena de atividade microbiana em
funo da mudana de cor no corante.
A produo de cido pode ser avaliada e
comprovada mediante medida do pH, ou com
aplicao de corantes como indicadores.
Quanto produo de goma, que o resultado da
polimerizao de acares simples glicose e
frutose que formam respectivamente dextrana e
levana.
5. MATERIAL E MTODOS
5.1. Teste da Resazurina
Preparar uma soluo de NaCl 9 g/L, ajustar o
pH a 7,0 com soluo de NaOH.
Soluo de resazurina a 10 mg/L de soluo de
NaCl 9 g/L. A soluo no deve ser estocada por
muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz
e de altas temperaturas.
Preparar tubos com 9 mL de soluo de
resazurina, tampar com algodo, autoclavar 10
minutos a 121C.
Nos tubos com resazurina, adicionar 1 mL da
amostra. Incubar em estufa ou banho-maria a
37C.
Anotar as mudanas de cor a cada 30 minutos
(violeta-rseo-incolor), esto em relao direta
com a atividade microbiana.
Modificao da cor
(horas)
Avaliao
da infeco
Tratamento
violeta rseo incolor
- 0,5 3,0 alta imediato
0,5 2,0 4,0 alta imediato
1,0 4,0 6,0 mdia imediato
3,0 5,0 7,0 fraca normal
3,0 5,0 - desprezvel preventivo
5.2. Plaqueamento
Para este teste deve-se dispor dos seguintes
materiais:
autoclave;
estufa de incubao;
placas de petri;
tubos para diluio;
pipetas;
bico de bunsen;
algodo
reagentes: meios de
cultura que podem ser
adquiridos prontos ou
preparados partir de
seus componentes
Preparo do Material:
Placas de petri e pipetas devem ser esterilizadas
embrulhadas em papel ou em recipientes prprios.
A soluo salina (NaCl a 0,85%) colocada no
volume de 9 mL em tubos. A seguir tampa-se com
algodo e esteriliza-se em autoclave.
Os meios de cultura quando preparados devem
ser autoclavados para esterilizao durante 15
minutos a 121C.
A amostra a ser analisada deve ser representativa
do ponto selecionado.
Das amostras so feitas diluies decimais
utilizando-se solues contidas nos tubos. Deve-se
diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300
UFC (Unidades Formadoras de Colnias) por placa.
Feitas as diluies, seleciona-se as que sero
processadas. A seguir, retira-se 0,1 mL do tubo da
diluio selecionada e transfere-se para a placa
que conter ou no o meio de cultura, depende da
tcnica a ser aplicada.
Caso a placa no contenha o meio, este dever ser
colocado posteriormente, j liquefeito e a uma
temperatura ( 50C), vertendo-o sobre a
amostra, fazendo-se movimentos em forma de
oito para homogeneiz-la no meio antes da
solidificao.
Caso o meio j tenha sido colocado na placa, este
deve estar frio e solidificado ao se colocar a
amostra na superfcie. Neste caso a amostra
espalhada com auxlio de uma esptula de
Drigalsky.
Marcar na placa a amostra, a diluio, o volume de
amostra e a data do experimento.
Aps estarem solidificadas, as placas so
incubadas a 36C (bactrias) ou 28C (leveduras).
Pode-se aplicar tambm uma temperatura de
30C para bactrias e leveduras.
A incubao deve ser de 24 a 48 horas e a seguir
as colnias so contadas. O experimento deve
sempre ser feito em placas com duplicatas.
Ex. de contagem na diluio a 10
-3
, plaqueando-se
0,1 mL
Placa 1: 110 colnias
Placa 2: 130 colnias
Mdia: 120 colnias
120 x 10
3
x 0,1 = 1,2 x 10
4
/0,1 mL
120 x 10
3
x (0,1 x 10) = 1,2 x 10
5
UFC/mL
5.3. Produo de cido
Amostras de caldo so coletadas nos diferentes
pontos do processo em frascos, tubos ou
recipientes esterilizados. A seguir so colocadas
em uma soluo contendo indicador com faixa de
variao curta (ex. prpura de bromocresol ou
verde de bromocresol).
Os tubos so incubados a 30C e observados de
hora em hora. Descartar aps 12 ou 24 horas.
Quando ocorrer predominncia de bactrias
cidas as alteraes ocorrem aproximadamente
aps 3 horas.
Ajustar o pH das amostras a pH 6,8 para prpura
de bromocresol e pH 5,0 para verde de
bromocresol.
O nmero das bactrias formadoras de goma
pode ser determinado pelo meio de Mayeux &
Colmer ou ainda pelo meio CSN. As UFC aparecem
convexas ou espalhadas, podem ser leitosas ou
lmpidas.
5.4. Produo de goma
Amostras devem ser coletadas como no caso
anterior e colocadas diretamente na estufa, caso
a presena de goma seja numerosa o meio mostra-
se em 12 horas turvo e viscoso. Para acelerar a
reao conveniente acrescentar para cada 10
mL de amostra 2 mL de soluo esterilizada de
extrato de levedura a 20%.
5.5. Tcnica de contagem de clulas ou partculas
Rotineiramente emprega-se em Microbiologia a
Cmara de Neubauer, considerada como precisa e
de leitura rpida para quantificar clulas de
leveduras, esporos, bactrias e outras partculas.
A cmara de Neubauer conhecida por lmina
hematimtrica. Presta-se contagem de clulas
ou partculas visveis ao microscpio tico.
As cmaras podem ser simples ou duplas,
atualmente apresentam-se espelhadas para
realar a matria a ser contada.
De uma maneira geral tem:
1mm x 1mm x 0,1mm
E esta rea est dividida em 16 ou 25 quadrados.
Quando estiver dividido em 25, cada quadrado
ter 0,2mm.
Quando estiver dividido em 16, cada quadrado
ter 0,25mm.
Assim o volume til de cada quadrado mdio :
0,2mm x 0,2mm x 0,1mm = 0,004mm
3
25 quadrados: 25 x 0,004 = 0,1 mm
3
0,25mm x 0,25mm x 0,1mm = 0,00625mm
3
16 quadrados: 16 x 0,00625 = 0,1mm
3
RECORDANDO
Considerando a profundidade da Cmara (1/10mm)
e que as contagens so anotadas em cm
3
(1 cm
3
=
1 mL) o volume de um quadrado grande :
1mm x 1mm x 0,1mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm =
= 1/10 000 cm
3
ou 0,0001 cm
3
REGRAS DE CONTAGEM
1) Conte as clulas usando o quadrado grande do
centro.
2) Conte as clulas dos quadrados mdios e as
clulas que estiverem tocando as linhas superior
e as linhas direita.
3) Conte cerca de 200 a 250 clulas antes de
determinar o nmero por cm
3
.
Nos 25 ou 16 quadrados podem surgir 4 situaes:
A. Coincidir de haver 200 a 250 clulas, neste
caso conte as mesmas e multiplique por 10
4
para obter o n de clulas por cm
3
Ex: 200 clulas 2 x 10
2
x 10
4
= 2 x 10
6
B. Pode haver menos de 200 clulas por quadrado
grande, neste caso ser necessrio a contagem
de clulas de alguns quadrados grandes
laterais para atingir cerca de 200.
Divida o n de clulas pelo n de quadrados
grandes e multiplique por 10
4
para achar o n
de clulas por mL ou cm
3
.
C. Pode haver mais de 200 clulas por quadrado
grande, neste caso conte as clulas dos
quadrados mdios at haver contado cerca de
200. Determine o n de clulas de um dos
quadrados mdios. Multiplique a mdia por 25
para obter as clulas por quadrado grande.
Este n x 10
4
fornece o nmero de clulas por
cm
3
.
Ex: 210 clulas em 3 quadrados mdios (cada um
medindo 0,2 x 0,2mm). Quantas clulas h por
cm
3
?
210/3 = 70 clulas por quadrado mdio
70 x 25 = 1750 em 0,1mm
3
(1750 clulas
por quadrado grande)
1750 x 10
4
= 17.500.000 ou 1,75 x 10
7
cels/cm
3
D. O nmero de clulas muito grande para ser
contado. Neste caso a suspenso precisa ser
diluda.
1 mL diludo em 9 mL de gua ou soluo salina
uma diluio de 1:10 ou 1/10, neste caso o n de
clulas contadas deve ser multiplicado por 10.
Clculos de Porcentagem de clulas de Leveduras
% Viabilidade = vivas x 100
vivas + mortas
% Brotamento = brotos x 100
vivas + mortas
% Viabilidade dos Brotos = brotos x 100
Br. Vivos + Br. Mortos
Flocos por campo (mL) = Flocos
n de quadrados
Solues usadas na Contagem de Leveduras
Sol. A Soluo de Sulfato Azul de Nilo
20 g de sulfato azul de Nilo em 100 mL de gua
destilada.
Sol. B Soluo de Azul de Metileno
0,2 g de azul de metileno em 100 mL de gua
destilada.
USO: soluo A + soluo B em partes iguais
Eritrosina
1 g de eritrosina em 100 mL de gua destilada.
Diluir 1 mL desta soluo em 50 mL de soluo
tampo (partes iguais de 0,2 M de Na
2
HPO
4
e
0,2 M de NH
2
PO
4
); ficando soluo de corante
1:5000.
Guardar em refrigerador.
1 mL (suspenso de clulas) + 1 mL soluo corante
BIBLIOGRAFIA
LIMA, A. O.; SOARES, J.B.; GRECO, J.B.;
GRAUZZI, J.E.; CANADO,J.R. Mtodos de
laboratrio aplicados a Clnica 5 edio pg
403 411
SHARF, J.M. Mtodos recomendados para o
exame microbiolgico de alimentos Ed. Polgono
1972 pg 239
SUSSMAN, A.S. Microrganismos, Crescimento;
Nutrio e Interao Edart SP, 1975 pg 56
58