UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

TALLER MULTIDISCIPLINARIO DE PROCESOS TECNOLGICOS DE FRUTOS Y HORTALIZAS

PRACTICA 3. DETERMINACIN DE ENZIMAS RELACIONADAS CON LA MADURACIN DE PRODUCTOS VEGETALES

Dra. Ma. Andrea Trejo Mrquez I.A. Selene Pascual Bustamante

En esta prctica se desarrollan los mtodos para la determinacin de enzimas causantes del pardeamiento como son PDO y PPO. El alumno desarrollar el conocimiento sobre estas enzimas, as como en el uso de equipos y material de laboratorio.

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OBJETIVO Determinar la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa en diversos productos hortofrutcolas en diferentes estadios de maduracin para asociarla la actividad de estas enzimas al tipo de manejo postcosecha del producto.

ANTECEDENTES

1. Polifenoloxidasa (PPO) 1.1. Funcin de PPO en frutas y hortalizas. La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno oxireductasa (E.C. 1.14.18.1), cataliza la oxidacin difenoles en presencia de oxigeno molcular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en plantas. La localizacin de la enzima en las clulas de las plantas depende de la especie y estado de madurez. La distribucin de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales puede ser diferente ya que la proporcin de enzimas solubles vara con la madurez. Dentro de su papel en la naturaleza, la PPO es participe en la cadena de respiracin de plantas como una de las oxidasas terminales, sin embargo esto ha sido cuestionado. Mucho ms importante es el papel que juega en la resistencia a infecciones microbiolgicas o virales en las plantas en un clima adverso. Participa indirectamente en la biosntesis de auxinas. Por lo que jugar un papel importante en la regulacin del crecimiento de las plantas junto con la enzima degradante de la auxina (POD). Tambin participan en el fenmeno denominado pardeamiento enzimtico, el cual es consecuencia indirecta del la accin de la PPO en alimentos procesados. 1.2 Bioqumica y mecanismos de reaccin Es una enzima que contiene cobre y que cataliza dos diferentes reacciones: (a) la hidroxidacin de monofenoles a o- difenoles y (b) la oxidacin de o- dihidroxifenoles a oquinonas, para llevar a cabo estas reacciones se requiere oxgeno molecular. Los extractos enzimticos de diferentes fuentes poseen estas dos actividades en diferentes proporciones, se ha reportado que en preparaciones de papas, manzanas, championes posee ambas actividades y las de tabaco, mango, pltano y pera, se presenta solamente una actividad. El mecanismo que describe la reaccin catalizada por PPO es el siguiente:

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1.3. Sustratos Las frutas y hortalizas poseen una amplia variedad de compuestos fenlicos, de los cuales slo una pequea parte de estos son sustrato para la PPO. Los ms importantes son catequinas ( 3-hidroxiflavanes), steres de cido cinmico cido clorgenico ( 3- O-cafeoyl-D-cido quinico) el cual, es el sustrato ms encontrado en la naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el producto de la hidroxilacin de tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al mismo tiempo un aminocido constituyente de protenas, se encuentra en cada tejido de las plantas. 0 1.4 pH y temperatura ptima de actividad El valor de pH ptimo de actividad de PPO vara dependiendo la fuente de la enzima, as como tambin el sustrato en un intervalo relativamente amplio, en la mayora de los casos va desde pH 4.0 a 7.0. Muchas preparaciones muestran un slo pH ptimo de actividad y en algunos casos se presenta un segundo pH ptimo que puede ser atribuido a una insuficiente purificacin. En cuanto la temperatura ptima de actividad que ha sido mucho menos investigada que el pH ptimo, los datos disponibles indican que la temperatura ptima depende de los mismos factores que depende el pH ptimo. La actividad en melocotones se incrementa de 3C- 37C y decrece arriba de 45C. 1.5 Inhibidores Debido a que la PPO es una metaloprotena con cobre puede ser inhibida por agentes metalo quelantes tales como cianuro, monxido de carbn, dietil- ditiocarbamato de sodio( DIECA), mercaptobenztiazol , dimercaptopropanol, azide o xanato metilpotasio. Algunos de estos reaccionan tambin con las quinonas formadas. 1.6 Extraccin y purificacin Existen tres problemas para extraccin de PPO (1) latencia, (2) solubilizacin de la actividad lmite de la clula, y (3) prevencin de la oxidacin inducida de la enzima y la subsecuente polimerizacin y precipitacin en la protena enzimtica, o fenoles

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endgenos. Para prevenir la oxidacin de fenoles durante la extraccin enzimtica se remueven los sustratos por medio de ligamiento de estos a un polmero insoluble, de los cuales el ms utilizado es el Polyvinylpyrrolidone (PVP), es un fuerte receptor de protones y es neutral a pH cidos en los cuales los fenoles no se encuentran ionizados. Para la purificacin de los extractos crudos se utiliza la precipitacin con sulfato de amonio a diferentes saturaciones, o por cromatografa en gel en Sephandex G 100 o G 200 y cromatografa de intercambio inico o dilisis.

1.7 Determinacin de actividad enzimtica Esta puede ser determinada midiendo (a) la velocidad de desaparicin de sustrato o (b) la velocidad de formacin de producto. Para determinar la desaparicin de sustrato generalmente se mide la absorcin de O2 manomtricamente en Wasburg respirmetro, o polarogrficamente con un electrodo de oxgeno. La velocidad de formacin de producto puede ser determinado espectrofotomtricamente mediante la medida de la densidad ptica de compuestos coloreados formados por las quinonas. Este mtodo es muy simple y se presta para anlisis de rutina. La linealidad es mantenida por relativamente largos periodos similar al mtodo polarogrfico.

2. Peroxidasa (POD) 2.1Funcin en fruta y hortalizas La peroxidasa (EC 1.11.1.7; Donador; Perxido de hidrgeno oxirreductasa, POD) es similar a la PPO, ya que pertenecen al grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen perxido de hidrgeno en presencia de un donador de hidrgeno es una de las enzimas que controlan el crecimiento fisiolgico de las plantas, su diferenciacin y desarrollo. Es bien conocido, que esta enzima participa en la construccin y lignificacin de la pared celular, la biosntesis de etileno a partir del cido 1- aminociclopropanocarboxlico y perxido de hidrgeno (H2O2), la regulacin de niveles de auxina, la proteccin contra el deterioro de tejidos e infeccin por microorganismos patgenos, la oxidacin de cido indolactico, etc. . Por otro lado, hoy da existe un gran inters por la POD debido a sus mltiples aplicaciones prcticas (industria maderera, industria de alimentos, bioqumica clnica, etc.). Se encuentra presente en animales, plantas y microorganismos. En las plantas localizada en la clula parcialmente en forma soluble y en el citoplasma de manera insoluble. La fraccin de POD soluble, puede ser extrada de tejidos homogenizados con un buffer de

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fuerza inica baja La POD se encuentra ampliamente distribuida en las plantas, sin embargo, en la actualidad, la POD de la raz de rbano silvestre (Armoracia lapothifolia) es la nica que tiene aplicacin prctica debido a que es la fuente que posee la mayor actividad de esta enzima. 2.2 Bioqumica y mecanismo de reaccin La peroxidasa cataliza cuatro tipos de reaccin: (a) Peroxidativas (b) Oxidativas (c) Cataliticas y (d) de hidroxilacin. La ecuacin global del mecanismo de reaccin es el siguiente:
ROOH Donde: AH 2
POD

H 2O

ROH

R = H+, CH3, C2H5 AH2 = Donador de hidrgeno en forma reducida A = Donador de hidrgeno en forma oxidada Una gran variedad de compuestos pueden actuar como donadores de hidrgeno, incluyendo fenoles (p-cresol, guayacol, resorcinol) aminas aromticas (anilina, bencidina, o-fenildiamina, o-dianisedina) nicotinamida-adenina dinucleotida reducida y nicotinamidaadenina dinucleotida fosfato reducida. La reaccin oxidativa de POD puede tener lugar en ausencia de perxido de hidrgeno. Se requiere de O2 y cofactores como Mn 2+ y un fenol. 2.3 Sustratos

Perxido

POD es altamente especfica al perxido, por lo tanto su principal sustrato es H 2O2, sin embargo la enzima es inactivada por altas concentraciones de perxido.

Sustrato donador

La POD tiene una baja especificidad por los sustratos donadores de hidrgeno: esto es interpretado como resultado de las diferentes especificidades de las isoenzimas de POD presentes en las plantas. Alguno de estos sustratos son: guayacol, o-dianisedina, ofenildiamina, o-tolidina,3-amino-9-etil-carbazol, 3, 3-diaminobencidina tetraclorada(DAB) p-fenildiamina y o-toludina.

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La afinidad de la POD por el sustrato donador depende de la fuente de la enzima y del grado de pureza de sta. 2.4 pH y temperatura ptima de actividad El pH ptimo de actividad de la POD vara dependiendo de la fuente de la enzima, la composicin de isoenzimas, el sustrato donador y el buffer aplicado. La prdida de actividad observada en acidificacin es atribuida al cambio en la protena de estado nativo a un estado reversible de desnaturalizacin. Los cambios de actividad que ocurren con los cambios de pH estn relacionados a los cambios estructurales en la molcula de la enzima. 2.5 Inhibidores Similarmente a la PPO, la inactivacin de la POD pude ser por qumicos que actan con la enzima misma , o con uno de los sustratos o productos de reaccin, tales como cianuro, sulfuro, xido ntrico , hidroxilamina, DIECA, metabisulfito de sodio. Los inhibidores ms utilizados en la prctica industrial son SO2 y sulfitos, los cuales previenen la prdida de sabor, pero solo reducen parcialmente la regeneracin de la enzima.

2.6 Extraccin y purificacin Como en muchas frutas y vegetales la enzima est presente en forma soluble. Esta fraccin soluble puede ser extrada con agua o con buffer de fuerza inica baja.

2.7 Determinacin de actividad enzimtica Puede ser determinada por los mtodos espectrofotomtricos basados en la formacin de compuestos coloreados que ocurre durante la reaccin con el hidrgeno y el sustrato donador. Tambin puede ser estimada por el mtodo de densitometria visual, o por la actividad residual despus de un tratamiento por calentamiento, as como por la composicin de las isoenzimas.

EQUIPO: Espectrofotmetro Centrifuga Agitador Vortex Balanza analtica

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MATERIAL:

2 Esptulas 12 Tubos de Microcentrfuga de 1.5 ml 1 Micropipeta 1000 l

1 Micropipeta de 200 l 1 Micropipeta de 100 l Puntas de micropipeta. 1 Cronmetro 4 Celdas para espectrofotmetro. Hielo 10 Tubos de ensaye 20ml Gradilla 1 Guantes Parafilm

MUESTRAS Y REACTIVOS: Una o dos especies del producto hortofrutcola en tres estadios de madurez por equipo. Buffer fosfatos 0.2 M, pH 7 Buffer fosfatos 10mM, pH 7.5 Buffer fosfatos 0.05M, pH 5 Dopamina hidroclorada 0.07M Perxido de hidrogeno (15ml/l) p-fenilendiamina (10mg/ml)

Albmina srica bovina (1mg/ml) Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1M CuSO4.5H2O al 1%

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Tartrato de Na y K al 2% Reactivo de Folin-Ciocalteu Reactivo A Reactivo B PROCEDIMIENTO: Preparacin de los extractos crudos. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Pesar 200 mg del tejido Triturar en manualmente en mortero utilizando nitrgeno lquido Colocar en tubo de micro centrifuga y agregar 1 ml de buffer fosfatos 0.2M. Agitarlo en el vortex durante 1 minuto Centrifugar en micro centrifuga a 14 000 rpm durante 15 minutos. Extraer el sobrenadante, colocndolo en otro tubo de micro centrifuga y descartar el pellet. 7. Colocarlo en hielo hasta su determinacin. Determinacin de la actividad de polifenoloxidasa.

La actividad de la polifenol oxidasa se determinara espectrofotomtricamente por lo que es importante mencionar algunas consideraciones para el uso del espectrofotmetro. Se debe encender 30 minutos antes de su uso. Ser cuidadosos de no derramar ningn reactivo dentro de este al colocar la celda ya que esto pudiera daarlo. Ajustar la longitud de onda para cada determinacin. 1. En una celda limpia agregar 1.45 ml de buffer fosfatos 10mM con 0.07M de dopamina hidroclorada. 2. Agregar 100 l del extracto crudo 3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm 4. Rpidamente colocarla en el espectro y medir el aumento en la absorbancia a 420 nm por 4 minutos. 5. Calcular la actividad de la polifenol oxidasa con base en la pendiente de la proporcin lineal de la curva 420 nm contra el tiempo. Clculo: Absorbancia / mg protena*min*ml. Determinacin de la actividad de peroxidasa.

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1. En una celda limpia agregar 1.35 ml de buffer fosfatos 0.05 M con 50 l de Perxido de hidrogeno y 100 l de p-fenilendiamina (10mg/ml) 2. Agregar 100 l del extracto crudo 3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm 4. Rpidamente colocarla en le espectro y medir el aumento en la absorbancia a 485 nm por 4 minutos. 5. Calcular la actividad de la peroxidasa con base en la pendiente de la proporcin lineal de la curva 485 nm contra el tiempo. Clculo: Absorbancia / mg protena*min*ml.

Determinacin de Protena. La cantidad de protena de los extractos se determinar utilizando el mtodo de Lowry. Preparacin del reactivo A y reactivo B. Para el reactivo A: se prepara mezclando 100 partes de Na2CO3 (2%) en NaOH 0.1M, una parte de CuSO4.5H2O (1%) y una parte de Tartrato de Na y K (2%). Para el reactivo B: Esta solucin se prepara al momento de utilizarla. Reactivo de Folin-Ciocalteu al 40% (v/v), se mantiene en agitacin hasta el momento de su uso. 1. Construir la curva patrn utilizando como estndar albmina srica bovina (ASB). Para lo cual en tubos de ensaye se van colocar las cantidades de la solucin de ASB y agua destilada que se muestran en la tabla 1. 2. Agregar 1 ml del reactivo A, agitar en el vortex y dejar a temperatura ambiente durante 10 min. 3. Posteriormente agregar 10 l del reactivo B, agitar en vortex y dejar a temperatura ambiente 1 hora. 4. Realizar la lectura en espectro a 750 nm. 5. Registrar los resultados para clculos posteriores. Tabla 1. Preparacin de tubos para la construccin de la curva patrn de protena Muestra Solucin de ASB ( l) Agua destilada ( l) Blanco 0 100 1 10 90 2 20 80 5 50 50 7 70 30 10 100 0 Muestra PROBLEMA 80 Alcuota 20 l

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Calculo de protena. Los valores de concentracin de protena se determinarn por interpolacin grfica en la curva patrn obtenida. Partiendo de la ecuacin de la recta Protena (mg/ml) = (Absorbancia b) / pendiente * el factor de dilucin. Factor de dilucin= V final / V inicial Diagrama: Muestras problema

Muestras almacenadas Hacer observaciones, Apariencia (peso, color).

Muestras congeladas

Tomar muestras

Pesar muestras

Preparacin de los extractos crudos

Determinar protena

Determinacin actividad de Polifenoloxidasa

Determinacin actividad de Peroxidasa

Realizar clculos

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Hoja de resultados.
Tabla de resultados de muestras almacenadas (Apariencia). Condicin de almacenamiento Peso (g) Color Defectos Observaciones

1 2 3
Tabla de peso de muestras para enzimas y protena.

Num. De Muestra 1 2 3 4 5 6
Grfico de Curva patrn. Tabla de resultados de actividad de Polifenol oxidasa y Peroxidasa.

Peso (g)

Num. Muestra 1 2 3 4 5 6

Actividad Polifenol oxidasa

Actividad de Peroxidasa

Protena

Grfico de actividad de polifenol oxidasa.

0.004
420/mg.prot.*min. 420/mg.prot.*min.

0.004 0.0035 0.003 0.0025 0.002 0.0015 0.001 0.0005 0 preclimaterio inicio climaterio Estadios mximo climaterio S/envase Bolsa Caja PET Condiciones de Alm acenam iento

0.0035 0.003 0.0025 0.002 0.0015 0.001 0.0005 0

Abs

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Abs

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Grfico de actividad de peroxidasa.

CUESTIONARIO: 1) Cmo actan las polifenoloxidasa en los frutos y vegetales? 2) Qu funcin fisiolgica tienen estas enzimas en los productos vegetales? 3) En qu productos vegetales se encuentran presentes estas enzimas ms frecuentemente? 4) La actividad de estas enzimas cambia con la maduracin? Por qu? 5) Qu sustratos para estas enzimas se encuentran presentes en su producto? 6) La actividad de estas enzimas cambia con las condiciones de almacenamiento? Por qu razn? Explique. 7) Qu importancia tiene el conocer la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa bajo diferentes condiciones de almacenamiento? 8) Sera benfico o contraproducente la inhibicin de estas enzimas durante el proceso de los productos vegetales? 9) En qu casos es deseable la accin de estas enzimas y en que casos no lo es? 10) Qu mtodos crees que inhiben la accin de estas enzimas? Proponga una metodologa para inhibirlo para el caso de su producto. 11) Por qu es importante la inhibicin de estas enzimas en los procesos industriales? 12) Qu otras enzimas sera importante determinar en productos vegetales? por qu razn? 13) Qu mtodos para la determinacin de actividad enzimtica existen? Descrbalos. 14) Qu otros mtodos para la determinacin de protena en productos vegetales conoce? Qu ventajas y desventajas tiene el mtodo de Lowry contra otros mtodos utilizados para determinar protena? 15) Explique el principio del funcionamiento del espectrofotmetro? 16) A qu se debe el aumento en la absorbancia durante la determinacin de la actividad de estas enzimas? 17) Investigue que tipo de compuestos se determinan en el intervalo del espectro de 420, 485 y 750 nm y si corresponde al intervalo utilizado para la determinacin en la prctica. REPORTE POR EQUIPO: Antecedentes: Breve Informacin relativa al producto con el cual se trabajo, fundamentos de las tcnicas utilizadas. Resultados: Tablas que contengan los resultados obtenidos en cada determinacin, CLCULOS, anlisis de estos y discusin con respecto a lo que se encuentra reportado en la bibliografa. Cuestionario. Bibliografa consultada.

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Material elaborado como parte del proyecto PAPIME: Elaboracin de materiales educativos para fortalecer la enseanza en el taller multidisciplinario de ingeniera en alimentos-procesos tecnolgicos de frutas y hortaliza de la carrera de ingeniera en alimentos (PE 202610).

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