CROMATOGRAFA DE GASES Y DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN

TEMA XXIV
CURSO DE POSTGRADO

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TEMA XXIV Aplicaciones II. Separacin de mezclas complejas: Programacin de temperatura y trabajo en gradiente. Tcnica de reciclaje. Enriquecimiento de trazas. Confeccin de metdicas de trabajo y su optimizacin. Seleccin del tipo de cromatografa a emplear. Ejemplos de aplicacin.

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SEPARACIN DE MUESTRAS COMPLEJAS

En cromatografa, los problemas analticos ms difciles de resolver son las matrices de muestra que se pueden tipificar as: a) pocos analitos y muy similares en propiedades como ismeros cis-trans, o-m-p, homlogos de grupos funcionales iguales, enantimeros o diasteremeros. b) muchos analitos y muy dispares en propiedades como aguas de desecho, petrleos, un hidrolizado de pptidos, complejos vitamnicos...

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MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD Caso prctico a. Separacin de enantimeros. En las separaciones difciles que consisten en pocos analitos pero muy semejantes y, por tanto, de difcil separacin, se debe manejar preferentemente la naturaleza de la fase estacionaria aunque tambin el ajuste fino de las condiciones: pH, composicin de la fase mvil, fuerza inica, temperatura, etc, tiene lgicamente su influencia ya que el reconocimiento quiral para conseguir suficiente resolucin requiere interacciones altamente especficas.

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Importancia de la separacin quiral : 60% de los frmacos son quirales. 40% de los frmacos quirales se venden como racmico. Normalmente slo uno de los enantimeros es biolgicamente activo. La interaccin con receptores o enzimas tambin quirales hacen que haya diferencias en la absorcin, distribucin y metabolismo. En algunos casos, incluso, uno de los enantimeros es txico.

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Dificultad de la separacin : Propiedades iguales dificultan la separacin.

Mtodos indirectos como la reaccin con un reactivo quiral (resolucin del racmico) son laboriosos y a veces pueden ser reversibles. Por HPLC especial se puede conseguir la separacin en muchas ocasiones, tanto analtica como preparativa. No todos los racmicos pueden separarse en una columna quiral dada. Elegir la columna adecuada a un caso no es un problema sencillo. No existe una fase estacionaria universal por lo que deben hacerse aproximaciones manejando como criterios: la interaccin electrosttica y el factor estrico.

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COMPLEJOS DE AFINIDAD PARA AMINOCIDOS

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ENANTIMEROS FRENTE A FASES ESTACIONARIAS QUIRALES

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slica

Mecanismo de interaccin atribuido al proceso de reconocimiento quiral en las columnas tipo Pirkle

Geometra Mapa de potenciales

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COMPLEJO DE AFINIDAD DE UNA FASE ESTACIONARIA QUIRAL CON UNO DE LOS ENANTIMEROS ANALITO

O H N S* H O

SLICA

H3C H

O H O

R* H N H
O H

N H

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Diversos tipos de fragmentos quirales activos enlazados a slica y/o presentando adems grupos polares, aromticos e hidrgenos activos para adaptarse a la geometra y potenciales de un enantimero mediante las interacciones: Dipolo-dipolo / Puentes de hidrgeno Impedimento estrico

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Triptofano *

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CICLODEXTRINAS Las ciclodextrinas son producidas por la accin de la enzima ciclodextrin-glicosiltransferasa sobre el almidn. Son oligmeros cclicos de unidades de glucosa -(1,4)enlazadas con una geometra y polaridad definidas. Contienen de 6 a 12 unidades y las de 6(), 7() y 8() son las ms comunes. La cavidad interior resulta ser ms hidrofbica por lo que tiene a retener en ella compuestos no polares mientras que la exterior es compatible con medios acuosos.

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COMPLEJOS DE INCLUSIN EN UNA CAVIDAD (CICLODEXTRINAS)

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MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD

Caso prctico b. Muchos analitos de propiedades muy dispares. Muestras complejas con componentes que difieren en polaridad, constantes fsicas, tamao molecular, geometras, grupos funcionales y distinta afinidad por la fase estacionaria.

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Cromatogramas de una mezcla segn condiciones cromatogrficas:

Acetonitrilo/agua (50:50)

Acetonitrilo/agua (90:10)

Acetonitrilo/agua (65:35)

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MEZCLAS COMPLEJAS FUERZA DEL DISOLVENTE O TEMPERATURA BAJA

ALTA

INTERMEDIA

PROGRAMADA 20
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MUESTRAS DE ALTA DIFICULTAD

Actuacin:
Poder de elucin: capacidad impulsora de la fase mvil sobre los solutos de la muestra retenidos por la fase estacionaria. El poder de elucin puede aplicarse con INTENSIDAD: CONSTANTE VARIABLE.

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Tcnica: incremento gradual y progresivo del poder de elucin a lo largo del tiempo de anlisis por modulacin de la variable adecuada. Variable de regulacin del poder de elucin : TEMPERATURA en COMATOGRAFA DE GASES FUERZA DEL ELUYENTE en CROMATOGRAFA DE LQUIDOS Resultado: adecuacin del poder de elucin a las caractersticas de cada componente de la muestra.

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PERFIL TPICO DE UN TRABAJO CON TEMPERATURA PROGRAMADA EN CROMATOGRAFA DE GASES

preacondicionamiento

TEMPERATURA

isoterma inferior

inyeccin

gradiente

isoterma superior

TIEMPO

enfriamiento

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PROGRAMA:

CROMATOGRAFA DE GASES CAPILAR DE UNA GASOLINA

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CGAR DE ESTEROIDES Tprogramada

265 210

isoterma

100
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AROMTICOS Y FENOLES

CROMATOGRAFA DE GASES CAPILAR A TEMPERATURA PROGRAMADA

10C/min

10,5C/min
225

130 50

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Otras alternativas innovadoras para muestras complejas: CROMATOGRAFA DE GASES BIDIMENSIONAL

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% COMPONENTE MAYOR FUERZA DE ELUCIN

TRABAJO CON GRADIENTE EN CLAR PODER DE ELUCIN LINEAL PODER DE ELUCIN CONVEXO (mayor poder de elucin al principio) PODER DE ELUCIN CNCAVO (mayor poder de elucin al final)
TIEMPO

Seleccin rpida de un perfil de elucin

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SEPARACIN DE AMINOCIDOS CON GRADIENTE DE MeOH/H2O

%MeOH

isoterma

rampa

isoterma

rampa

isoterma 30
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CLOROFENOLES RESIDUOS DE PESTICIDAS % acetonitrilo 100

50

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SITUACIONES EXTREMAS DE BAJA RESOLUCIN 1. DISPOSICIN DE COLUMNAS EN SERIE En cromatografa de gases capilar, donde la permeabilidad es alta, pueden conectarse columnas para aumentar la resolucin. En cromatografa lquida la permeabilidad es menor por el relleno pero columnas ultrarpidas y cortas pueden conectarse en serie con gran eficacia. 2. TCNICA DEL RECICLAJE Ya en desuso por el gran ensanchamiento de pico que produce, repite el efecto separador de una columna haciendo pasar por ella repetidas veces la muestra.
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EFECTO SEPARADOR DEL RECICLADO

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BOMBA AUXILIAR BOMBA PRINCIPAL

desecho

COLUMNA DE SEPARACIN

COLUMNA DE RETENCIN

POSICIN DE CARGA
BOMBA AUXILIAR

ENRIQUECIMIENTO DE TRAZAS

COLUMNA DE SEPARACIN

BOMBA PRINCIPAL
desecho

COLUMNA DE RETENCIN

INTRODUCCIN DE MUESTRA
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PLANIFICACIN DE ESTRATEGIAS DE ACTUACIN

Estudio virtual de casos prcticos: A) Para CG se proponen las actuaciones para la resolucin de un supuesto de diseo de una rutina afn como una variante de un problema conocido. B) Para CL se estudia el tratamiento general a aplicar a un problema nuevo.

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CG: VARIANTE DE UN PROBLEMA CONOCIDO Equipo preestablecido de CGAR: columna detector inyector gas portador presin/velocidad de flujo temperaturas: horno columna (programada?) detector inyector

Variables a ensayar ajuste:

tamao de muestra inyeccin (con/sin divisin, focalizacin)

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1. Programar la secuencia de cambios a realizar. 2. Marcar los intervalos lgicos en los que deben ensayarse variables y elegir el valor ptimo dentro del intervalo. 3. No debe cambiarse ms de una variable a la vez. Seguir un orden secuencial preestablecido. 4. Las variaciones ensayadas no deben nunca ser muy grandes pues se puede perder el mximo del efecto producido:

AEPT

efecto

* * _ u

* *

variable

5. Anotar todas las modificaciones y el efecto causado para 37 extraer conclusiones.

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CL: TRATAMIENTO GENERAL PARA UN NUEVO ANLISIS En el estudio previo de la muestra deben tenerse en cuenta las siguientes consideraciones para el diseo del sistema: 1. Estudio de la solubilidad. solubilidad Ensayo de la serie eluotrpica como aproximacin a la polaridad de la muestra: Hexano/tolueno/cloroformo/THF/acetonitrilo/MeOH/agua 2. Intervalo de pesos moleculares (PSG til como analtica o como preparacin de muestra?). 3. Conocimiento de grupos funcionales (acidez, basicidad, ionizable, neutro?). 4. Naturaleza de la matriz en la que est la muestra (cantidad, impurezas, concentracin). 5. Diferencias componentes. o similitudes estructurales entre los
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6. ELECCIN DEL TIPO DE CROMATOGRAFA

MUESTRA

CII = intercambio inico CET = exclusin por tamao CIP = par inico CFE = fase enlazada CSL = slido-lquido (adsorcin)
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7. Eleccin del sistema de deteccin adecuado a la muestra: grupos cromforos, fluorescentes, inicos, tomos electronegativos, molculas voluminosas, enlaces C-H,etc... 8. Sondeo bibliogrfico orientativo. 9. Optimizacin de la metdica en cuanto a: Tiempos de retencin (ajuste 2 < k < 8) Selectividad (separacin) Eficacia (forma picos) Resolucin

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ESTRATEGIA EXPERIMENTAL DE APROXIMACIN ENSAYO

2 3
VALORACIN

1
PLANIFICACIN TERICA

4
ERROR

XITO
CORRECCIN DE ERROR

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ACCIONES A CONSIDERAR PARA INCREMENTAR LA RESOLUCIN 1. Aumentar la longitud de la columna. 2. Disminuir el dimetro interior de la columna. 3. Comprobar si la velocidad de flujo es correcta. 4. Revisar el estado del empacamiento de la columna. 5. Elegir un empacado uniforme y esfrico (tamao!). 6. Disminuir el tamao de muestra introducido. 7. Seleccionar la fase estacionaria adecuada. 8. Seleccionar la fase mvil apropiada: (naturaleza, proporcin y pH). 9. Asegurarse de que la presin es la adecuada. 10. Usar un gradiente de elucin.
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Las caractersticas de las partculas empleadas y su empaquetamiento, la calidad de la columna, son factores crticos para la resolucin:

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EFECTO DE LA VARIACIN DE LA FASE MVIL

INYECCIN

INYECCIN

INYECCIN

THF/H2O (28:72)

MeOH/H2O (58:42)

CH3CN/H2O (38:62)
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EFECTO DE LA VARIACIN DE LA FASE ESTACIONARIA

C18

fenilo

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EFECTO DE LA VARIACIN DE LA FASE ESTACIONARIA

ciano

fenilo

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TRABAJO BIBLIOGRFICO (1 crdito) Innovacin de equipos Condiciones de trabajo Confeccin metdica

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