TesisParteIyII Engels

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTN - TARAPOTO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

TESIS:
EVALUACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA
MICROPROPAGACION IN VITRO DE ORQUIDEAS EN EL
DEPARTAMENTO DE SAN MARTN

PRESENTADO POR EL BACH:
ENGELS DARWIN PADILLA GMEZ

PARA OPTAR EL TTULO DE:
INGENIERO AGRNOMO

TARAPOTO - PER
2008

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTN - TARAPOTO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO ACADMICO AGROSILVO PASTORIL

AREA DE MEJORAMIENTO Y PROTECCION DE CULTIVOS

TESIS:

EVALUACIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA
MICROPROPAGACION IN VITRO DE ORQUIDEAS EN EL
DEPARTAMENTO DE SAN MARTN

PRESENTADO POR: BACH.

ENGELS DARWIN PADILLA GMEZ

Miembros del Jurado

________________________________ ______________________________

Presidente Miembro

________________________________ _________________________________
Ing. Mara Emilia Ruz Snchez
Miembro Asesor
DEDICATORIA

Con todo cario, respeto y amor a mi familia.

A mi madre EDMITH ISABEL GOMEZ
SANTILLAN por el impulso que me
brinda en todo momento para salir
adelante en mi futuro profesional.

A LEYLITH, ROSLIA Y HEGEL, mis
hermanos, compaeros y grandes
amigos desde mi niez.

A mis queridos ABUELOS, TIOS y
PRIMOS, Que siempre me brindan su
apoyo moral en todo momento.

DEDICATORIA ESPECIAL

Este esfuerzo constituye para m la voluntad de
superacin, de humildad y ejemplo digno

Por eso se lo dedico a mis queridas tas MARIA
LUISA MADUELL Y MARICARMEN FIGUEROA
Y TODOS LOS MIEMBROS DE LOS
MISIONEROS DE JESUS por sus enseanzas
que me brindan en todo momento y las ganas de
superacin que me inculca siempre a seguir
para ser una persona de bien y dirigirme por el
camino de la responsabilidad y del trabajo.

DEDICATORIA ESPECIAL

Un agradecimiento al DOCTOR CARLOS
NOLTE CAMPOS Y AL INGENIERO AGUSTIN
CERNA MENDOZA por brindarme sus
enseanzas sobre la vida profesional que ahora
comienzo y las oportunidades que no debo
desaprovechar durante mi vida como profesional.

AGRADECIMIENTO

A la Ing. Mara Emilia Ruz Snchez, por su apoyo incondicional como asesora de
la presente tesis.

Mi agradecimiento especial al Bilogo Marco Len Martnez, por las enseanzas
que me brind durante la realizacin de mi tesis.

Al Ing. Henri Delgado Haya, por las enseanzas y el tiempo que ocup en
impartirme parte de su conocimiento en la realizacin de mi trabajo de tesis.

A mis compaeros tesistas del laboratorio, Juan Carlos Guerrero Abad y Henry
Manuel Vera Tudela Ramrez, por todo el apoyo brindado en todo momento durante
la tesis en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos vegetales.

Al subproyecto desarrollo de tecnologas de bajo costo para la propagacin in Vitro
y el cultivo de orqudeas en la Regin San Martn, por haber financiado todo el
trabajo de investigacin de la presente tesis.

A todos mis MAESTROS, a quienes considero como pilares para mi formacin en mi
vida profesional.

NDICE

Contenido Pg.

I. INTRODUCCIN 01

II. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General . 02
2.2 Objetivos Especficos . 02

III. REVISIN DE LITERATURA
3.1. Aspectos Histricos del Cultivo de orqudeas . 03
3.2. Propagacin in Vitro de orqudeas
3.2.1. Propagacin por semillas. . 06
3.2.2.
I. INTRODUCCIN

La gran mayora de especies de orqudeas que se comercializan en nuestro pas, son
producto de recolecciones ilegales e indiscriminadas de nuestros bosques tropicales.
Consecuentemente la tala del bosque, junto a la recoleccin no controlada con fines
comerciales, viene produciendo una rpida disminucin de las poblaciones naturales
de orqudeas, algunas de las cuales se encuentran en peligro de desaparecer. Es el
caso de Cattleya rex Obrien en el departamento de San Martn. Cientos de plantas
de esta especie recolectadas anualmente son enviadas a Lima, para ser exportadas, o
donde generalmente mueren. LEON (1995).

Nuestras especies nativas de orqudeas, amenazadas o en peligro de desaparecer,
pueden protegerse utilizando las tcnicas de propagacin masiva in vitro, siempre y
cuando se asegure su reproduccin en cantidades adecuadas (OSPINA, 1 968).

Las orqudeas producidas in vitro podran distribuirse en grandes cantidades a viveros
comerciales, disminuyendo la dependencia de orqudeas tomadas de su hbitat
original. La composicin del medio nutritivo para esta tcnica es compleja y con
costos relativamente altos, puesto que las especies a introducir tienen diferentes
requerimientos nutricionales y se necesita adecuar un medio que le brinde todos los
nutrientes necesarios para el normal desarrollo de las plntulas.

El presente trabajo de investigacin busca identificar un medio de cultivo alternativo
y adecuado; formulado con insumos disponibles y de bajo costo, para la
micropropagacin de orqudeas.
II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Determinar medios de cultivo alternativos para la germinacin y crecimiento
de orqudeas, a bajo costo y eficientes al uso de insumos locales.

2.2. Objetivos especficos

2.2.1 Determinar el efecto de los diferentes medios de cultivo puestos en
estudio, en la propagacin in vitro de Cattleya rex, Oncidium
lanceanum y Mormodes sp.

2.2.2 Determinar la relacin costo beneficio de los medios de cultivo
empleados en el trabajo de investigacin.

III. REVISIN DE LITERATURA

3.1. Aspectos histricos del cultivo de orqudeas.
Los primeros intentos de germinacin de semillas de orqudeas fueron
realizadas en Europa por Moore (1 849) al sembrarlas en compost o sustratos
que haban sido utilizados para cultivar plantas adultas, practica que fue
adoptada por los cultivadores comerciales de su poca, ARDITTI (1984).

Posteriormente Noel Bernard (***) realizo una serie de experimentos que le
permitieron explicar el rol del hongo micorrzico en la germinacin de semillas
de orqudeas (Bernard 1990), demostrando la importancia de esta asociacin
simbitica y germinando exitosamente distintas especies e hbridos de
orqudeas terrestres y epfitas. Otros investigadores continuaron su trabajo,
ARDITTI (1990).

- WENT y THIMANN (1 937), descubren la auxina (cido indol Actico).
Hormona reguladora de crecimiento que estimula el desarrollo de races,
ARDITTI (1990).

- CAPLIN Y STEWARD (1 948), determinan que la leche de coco tiene un
efecto en la formacin de clulas aisladas de races de zanahoria, ARDITTI
(1990).

- SKOOG y MILLER (1 957), combinan auxinas y citoquininas, controlando la
formacin de brotes y races, ARDITTI (1990).
- MURASHIGE y SKOOG (1 962), logran desarrollar el medio nutritivo que
actualmente es el ms utilizado para muchas de las especies de orqudeas,
ARDITTI (1990).

- La semilla de la orqudea consta de una testa gruesa, que encierra un
embrin. La cual tiene aspecto caracterstico en forma de red y diferente
para cada especie. La testa est formada por un tejido muerto, compuesto
en un 96% de aire, de tal forma que cada semilla puede ser considerada
como un autntico globo, PIERIK (1989).

- SING, demostr que el 2, 3, 5 trifenil tretazolium es til para determinar la
viabilidad de las semillas, donde los embriones viables se tien de rojo,
mientras que los no viables quedan blancos, LEON (1995).

- Los protocormos deben ser transferidos antes que induzcan hiperhidricidad
o felonizar y luego mueran, DELGADO (2001).

- A pesar del descubrimiento del medio de cultivo KNUDSON, se comprob
que no siempre es posible hacer un medio en el que una determinada
especie de orqudea pueda germinar y desarrollarse; se han descrito
muchos medios nutritivos para muchos gneros y especies diferentes,
ARDITTI (1982).

- Arditti (1984); Pierik, et al, (1 988), Las orqudeas germinan
asimbiticamente despus de la inhibicin formando un pequeo cuerpo
esfrico denominado protocormo, a partir de cuya base surgen rizoides y a
continuacin primordios de races y hojas, todo lo cual permite distinguir
etapas bien definidas que se usan en el clculo de ndices de crecimiento,
ESPINOZA (2001).

- Algunas especies de orqudeas pueden germinar de 4 a 8 semanas
despus de su siembra, y la multiplicacin se efecta dentro de las 12 a 16
semanas, empleando el medio de micropropagacin que sirve para
multiplicar todas las especies con xito, DONAYRE (2000).

- Un medio de cultivo con sales M&S, suplementadas con vitaminas, azcar,
ANA y BAP, permite una rpida germinacin de las semillas y un
crecimiento de las plntulas, dado que se desarrollan bien las hojas y
forman races, SELENA (1999).

- El medio de cultivo utilizado en la fase de multiplicacin para el cultivo de
plantas ornamentales fue el M&S (1962) aumentado la concentracin de BA
a 2 mg/l y ANA 0.3 mg/l, ACEVES (2000).

- Para la fase de enraizamiento en el cultivo de plantas ornamentales, se
utiliza las mismas sales M&S en el medio de cultivo, omitindose la
citoquinina (BA). Complementado con 1.5 g/l de carbn activado, 20 g/l de
sacarosa y agregando auxina (ANA), las condiciones de incubacin fueron
las mismas que para las etapas anteriores, ACEVES (2000).

- Mauro M. & Arditti (1994), probaron la influencia de diferentes dosis de
benzilaminopurina (BA) y cido naftaleneacetico (ANA), en el medio de
cultivo Murashige y Skoog (M&S) en Cattleya sp. ellos sugirieron que para la
multiplicacin se utilizar el medio suplementado con la combinacin de
10mg/l de BA y 0.1 mg/l de ANA, y para el desarrollo de plntulas con el
incremento de hojas y raz, se utilizara el medio suplementado con 10mg/l
de ANA. ESPINOZA (2001).

- Arditti y Ernest, 1993, varios aditivos se han usado en el cultivo in Vitro, tal
es el caso del agua de coco, la cual posee una gran cantidad de
componentes, entre ellos encontramos algunas fitohormonas con diferentes
concentraciones como: auxinas, citocininas y giberelinas y, se ha usado
rutinariamente en un sinnmero de mtodos de propagacin, ESPINOZA
(2001).

3.2. Propagacin In Vitro de orqudeas.
ARDITTI (1990) las tcnicas de propagacin de orqudeas pueden ser de dos
tipos:

3.2.1. Propagacin por semillas
a. Por semillas provenientes de cpsula dehiscente
Se utiliza semillas de cpsulas dehiscentes, las semillas son
esterilizadas con una solucin de hipoclorito de sodio en
concentraciones de 0,5 a 1,0% por 10 30 minutos, dependiendo del
tipo de semilla, para favorecer su esterilizacin es conveniente usar
un agente que rompa la tensin superficial de la solucin esterilizante
(Tween 20) ,es un agente que permite el mejor contacto del
esterilizante con la semilla, se utiliza a razn de 2 gotas/100 ml o
reemplazado por detergente casero, como Hipoclorito de calcio y
sodio.

b. Por semillas provenientes de cpsula no dehiscente(cpsula
verde)
La cpsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes
que no sern necesarias o que pueden ser una fuente de
contaminacin (restos de ptalos y de columna), se enjuaga con
agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol etlico
al 75%, luego se esteriliza sumergindola en una solucin de
Hipoclorito de calcio al 2 - 4% por 20 minutos.

La siembra se hace directamente sin necesidad de enjuague, para
abrir la cpsula se hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la
sutura de dehiscencia y dos cortes transversales se retiran el pedazo
de cpsula seleccionado y se procede a la siembra.

3.3. Medios de cultivo.
Los medios de cultivos empleados tienen diversas composiciones y se emplean
como lquido o geles (ROCA y MROGINSKI, 1991). Los constituyentes bsicos
incluyen todos los elementos minerales esenciales para el desarrollo de la
planta, macro y micro nutrientes; un azcar (usualmente sacarosa, sucrosa o
glucosa); vitaminas como la tiamina, glicina entre otros; sustancias reguladoras
del crecimiento; y otros compuestos. Entre estas juegan un papel esencial las
auxinas y las citoquininas cuyas proporciones relativas favorecen el desarrollo
del tallo y el de la raz, citado en RUZ (2003).

Usando las sustancias qumicas necesarias y las combinaciones apropiadas de
nutrientes, as como su forma qumica adecuada, ha sido posible establecer
cultivos para casi todas las partes de la planta en diversas especies vegetales,
citado en RUZ (2003).

3.4. Sustancias orgnicas complejas usadas en la germinacin asimbitica de
semillas de orqudeas.
Un gran numero de aditivos se usan para favorecer la germinacin asimbitica
de semillas de orqudeas y el subsecuente desarrollo y diferenciacin de los
protocormos (ARDITTI, 1967).

Los ms frecuentemente usados son el endosperma lquido de coco, el jugo de
tomate y el fruto del pltano. STEWARD AND SIMMONDS (1954) reportaron
que las capas formativas del fruto del pltano poseen sustancias que estimulan
la divisin en clulas de zanahoria; con solo esta evidencia disponible,
KHALIFAH (1966 b) lleg a la conclusin de que estas sustancias
responsables de la divisin celular eran las citokininas.

Encontraron que el fruto del pltano contiene pequeas cantidades de
compuestos inductores de la divisin celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-(
2
-
isopentilamino) purina] pero que comparados con el endosperma lquido del
coco su actividad era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una
respuesta similar a 500 g de pltano. Sin embargo, existen evidencias de que el
efecto del pltano sobre el desarrollo de las orqudeas puede deberse a la
presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues se ha reportado
la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo
(KHALIFAH, 1966a, 1966b).

VALMAYOR (1972), report que el endosperma lquido del coco solamente
permite una pobre diferenciacin en protocormos de Dendrobium, Vanda y
Cattleya, mientras que su combinacin con extractos de pltano resulta en un
buen desarrollo de races y tallos.

3.5. Carbn activado.
El carbn activado utilizado en cultivo de tejidos es el carbn resultante de la
combustin de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina,
etc). Actualmente es incluido con frecuencia en la formulacin de medios de
cultivo In Vitro de orqudeas, tanto para la siembra de plntulas como de
protocormos obtenidos a partir de semillas o de meristemas (YAM ET. AL.,
1990).

Algunos solutos de una solucin son adsorbidos por el carbn activado cuando
entran en contacto con este; el grado de adsorcin depende de la temperatura,
el pH, y la composicin qumica de la sustancia adsorbida, siendo mayormente
adsorbidos los compuestos moderadamente polares y poco solubles, como
fenoles, fito hormonas y vitaminas, en comparacin con los muy polares o los
apolares: azucares, sorbitol, manitol, inositol, etc. que no son adsorbidos
(WEATHERHEAD ET. AL., 1979).

Las sales inorgnicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbn
activado, pero si lo son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli
valentes. Es por ello en estos casos importante el uso de agentes quelantes
(EDTA) que incrementan la solubilidad de los mismos (YAM ET. AL., 1990).

Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benfico del
carbn activado en el cultivo de orqudeas (WEATHERHEAD ET. AL., 1978).
En primer lugar la contribucin de minerales en forma de impurezas estara
enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la capacidad para adsorber
metabolitos fitotxicos que estaran siendo liberados al medio de cultivo por los
tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, cido para hidro benzoico).
Tercero la adsorcin de sustancias producidas durante la esterilizacin en el
medio de cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratacin de
las hexosas que afectan el crecimiento y desarrollo de las plntulas. Cuarto, la
adsorcin de etileno que inhibe el crecimiento y la diferenciacin de las
plntulas y protocormos.

Para el cultivo de orqudeas se utiliza carbn activado en medios de
germinacin de semillas y en medios de desarrollo como para etapas
posteriores (replante) a una concentracin de 2 g/l.

3.6. Experiencias en cultivo In Vitro de orqudeas con medios de cultivo
casero.
3.6.1 Medios de cultivo para simbra de semillas y meristemas.
Para un laboratorio casero, podemos preparar medios de cultivo con
componentes de facil adquisicion o de precios bien baratos. Y el mejor,
tan eficientes y en algunos casos hasta mejores de los mas tradicionales
medios usados en sofisticados laboratorios de biotecnologia. En
cualquier feria libre o mercado de productos de culinaria casera
podemos adquirir los componentes para los medios de cultivos. Y quien
sabe hacer una vitamina para consumo, sabr tambien con seguridad
hacer un exelente medio para reproducir orquideas (MACHADO, 2003).

3.6.2 Reseta de un
Figura N 01: Materiales e insumos para un medio de cultivo casero
medio de cultivo para cultivar semillas.
MACHADO, 2003. menciona que: todos los componentes deben ser de
cultivo organico sin agroquimicos:

1. Pltano seda semi madura con cascara (mitad) aproximadamente 50
g.
2. Papaya (una cuchara de sopa bien llena) aproximadamente 50 g.
3. Tomate cereza (cinco pequeos tomates) aproximadamente 50 g.
4. Agua de coco verde (1 vaso) aproximadamente 120 ml.
5. Azucar (una cuchara de sopa) aproximadamente 20 g.
6. Agar agar (una cuchara de sopa) aproximadamente 10 g.
7. Polvo de carbon (una cuchara de te) aproximadamente 01 g.
8. Agua destilada completar para un litro.
IV. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Ubicacin del experimento
El presente trabajo se desarrollo en el Laboratorio de Cultivos de Tejidos
Vegetales (LCTV) de la Universidad Nacional de San Martn Tarapoto,
situado en la Ciudad Universitaria, cuya ubicacin poltica y geogrfica se
menciona a continuacin:

4.1.1 Ubicacin Poltica
Lugar : LCTV UNSM - T
Distrito : Morales
Provincia : San Martn
Departamento : San Martn

4.1.2 Ubicacin Geogrfica
Longitud Oeste : 76 22 48.4
Latitud Sur : 06 29 13.2
Altitud : 278 m.s.n.m.
Clima : Bosque seco - Tropical (bs T). Holdridge 1 978

4.2. Materiales
De laboratorio:
- Botellas de wisky
- Erlermeyer de diferentes graduaciones
- Placas petri
- Pinzas de acero quirrgico
- Mangos de bistur
- Hojas de bistur No. 10 y 11
- Papel aluminio
- Alcohol
- Complejo B
- Agua de coco
- Agar - agar
- Azcar
- Pltano seda
- Carbn vegetal
- Mecheros
- Algodn
- Hipoclorito de sodio
- Potencimetro
- Destilador de agua
- Agua destilada
- Balanza analtica
- Refrigerador
- Autoclave
- Cmara de flujo laminar
- Agua destilada 1000 ml

Material fotogrfico:
- Cmara digital profesional

Materiales de oficina:
- Papel bond A-4
- Lapiceros
- Computadora
- Memoria USB

4.3. Metodologa
4.3.1. Proceso de la propagacin in Vitro de orqudeas.
a. Preparacin y desinfeccin de cpsula indehiscente (cerrada)
a.1. Preparacin de los materiales
Para la desinfeccin de capsulas cerradas se preparo una
solucin desinfectante al 1.0% de NaOCl. Se sumergi las
capsulas a la solucin desinfectante por un intermedio de 20
minutos.

Para el proceso de siembra, con la ayuda de un bistur se
aperturo la capsula cerrada, realizando tres cortes
longitudinales, se extrajo la semilla y se coloco en un
erlenmeyer de 125 ml con 75 ml de agua destilada estril y
con una esptula estril se procedi a homogenizar, con el
fin de tener una suspensin. Para la desinfeccin se sigui el
mismo proceso propuesto por LEON (1995).

Antes de la siembra, se obtuvo una muestra de semilla para
observar al microscopio (mayor aumento 100X), siguiendo el
proceso propuesto por DONAYRE (1996), pero existe otro
mtodo mas confiable para determinar la viabilidad (mtodo
del 2, 3, 5 trifenil tetrazolium), como lo menciona LEN
(1995).

a.2. Trabajo en cmara de flujo laminar.
En la cmara de flujo laminar se procedi a abrir la capsula
haciendo tres cortes a la capsula con la ayuda de una hoja de
bistur nmero 10 y de esta manera se obtuvo las semillas y se
coloc en un principio en una placa petri estril para luego
introducirlos en un erlemeyer de 125 ml contenida con 75 ml de
agua destilada estril para as obtener la suspensin de las
semillas, tal como muestra la figura N 01.

a.3. Proceso de siembra.
Despus de haber obtenido la suspensin, se realiz la siembra,
utilizando una esptula tipo cuchara estril y desinfectada para
evitar contaminaciones, con el cual se tom una pequea
cantidad de la suspensin (una cucharada) y se coloc en las
botellas de wisky que contenan los diferentes medios de cultivo
(tratamientos puestos en estudio), posteriormente se coloc la
tapa de algodn y luego se sello con papel aluminio y plstico,
tal como muestran en las figuras N 02, 03, 04, 05, 06, y 07,
anotndose despus los datos de siembra Y para su posterior
ubicacin en la cmara (cuarto) de incubacin a una temperatura
de 21 25C, con una humedad relativa de 60%.

Figura N 02: Obtencin de semillas de capsula verde

b. Establecimiento de las semillas
Al cabo de un tiempo de ser sembradas las semillas en las botellas
de wisky que contenan 100 ml de medio de cultivo/botella. Se
observ el desarrollo de las semillas, acondicionado a una
temperatura de 21 24C con una humedad relativa de 40 60%.

Se sabe que la semilla de las orqudeas son muy pequeas entre 0.4
1.25 mm y de un embrin diferenciado y suspendida dentro de una
estructura reticulada (testa) y rodeada de un gran volumen de aire
Figura N 03: Esterilizacin Figura N 04: Siembra
Figura N 08: Sellado Figura N 07: Esterilizacin
Figura N 05: Dispersin Figura N 06: Tapado
(en algunas especies), lo que permite flotar por periodos largos.

El embrin de la orqudea esta formado por clulas relativamente
indiferenciadas con abundantes cuerpos de lpidos y protenas que
constituyen su nica fuente de reserva, pero utilizando el cultivo in
vitro, las semillas comenzaran a germinar y desarrollarse ya que
cuenta con nutrientes que aceleran su desarrollo en condiciones de
laboratorio.

Aproximadamente a 3 semanas y media (21 30 das) despus de la
siembra en el medio de cultivo (germinacin), se observ el proceso
de rompimiento de testa que cubre el embrin de la semilla de
Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, tal como muestra las figuras N
08, 09, 10, 11, 12 y 13; esto se da por germinacin del embrin y
tambin por las condiciones favorables para su desarrollo
(temperatura, foto periodo y humedad).

D
F
Figura N 09: A 10 X (T0) Figura N 10: A 10 X (T1)

Figura N 11: A 10 X (T2)

c. Multiplicacin de protocormos
En su segunda etapa de propagacin in vitro (multiplicacin) se
continu con los mismos tratamientos sin adicionar ningn otro
componente a los mismos, para as poder determinar la eficiencia de
los medios de cultivo propuestos.

En esta fase los protocormos comenzaron a diferenciarse algunos en
plntulas y desarrollaron hojas (figura N 14), esto gracias a las
condiciones ambientales controladas en el laboratorio, el medio de
cultivo y tambin los repiques realizados cada 30 das, evitando as
el retrazo en su desarrollo, esto se hace porque el medio de cultivo
se agota y es necesario el reemplazo por un nuevo medio.

Se podr observar que los protocormos se estn formando algunas
en plntulas ya diferenciadas, esto debido a que el medio utilizado
esta favoreciendo su desarrollo y siempre controlando las
condiciones ambientales en el laboratorio para su desarrollo y estar
nuevamente en las condiciones de un nuevo medio de enraizamiento
y desarrollo, tal como se puede observar en la figura N 15.
Figura N 12: A
10 X (T3)

Figura N 13: A 10 X (T4)

Figura N 14: T4 a simple vista

d. Enraizamiento y desarrollo de las plntulas
Al cabo de un periodo donde los protocormos estaban formando
algunas plntulas, se procedi al cambio de un medio mas
nutritivo, el mismo que se consigui agregando a todos los
tratamientos 100 ml de endospermo liquido de coco (agua de
coco verde), llegando a la fase de enraizamiento y desarrollo de
las plntulas, en esta etapa se estableci un nmero
determinado de plntulas por botella (48 plntulas/botella),
siempre con las mismas condiciones ambientales para su
enraizamiento y desarrollo, en esta fase las plntulas tendrn
mayor tamao y formaran races (Firuras N 16, 17, 18, 19, 20 y
21).

Figura N 15: Protocormos a (10X)
Figura N 16: Diferenciacin

4.4. Diseo Experimental
Se utilizo un Diseo Completamente al Azar (DCA) con cinco (5) tratamientos y
diez (10) repeticiones, donde se estableci cinco (5) tipos de medios para la
fase de germinacin y desarrollo.
4.4.1 Medios de Cultivo
Cuadro N01: Componentes y dosis del medio de cult ivo T
0
para
germinacin.
Reactivos e insumos
g/200 ml
stock
Concentracin
final
Figura N 17: Cattleya maxima T3
Figura N 18: Oncidium lanceanum T4
Nitrato de amonio 20,625 1,031
Nitrato de potasio 23,750 1,188
EDTA 0,466
0,032
Sulfato ferroso heptahidratado 0,348
Cloruro de calcio dihidratado 17,600 0,880
Fosfato de potasio
monobsico (g/l)
6,800 0,085
Molibdato de sodio dihidratado 0,010
0,004 g/l
Cloruro de cobalto dihidratado 0,001
cido brico 0,248
Yoduro de potasio 0,033
Sulfato de manganeso
monobsico
0,676
0,198 g/l
heptahidratado
14,800
Sulfato de zinc heptahidratado 0,345
Sulfato de cobre
pentahidratado
0,001
Tiamina 0,100 0,400
cido nicotnico 0,100 0,500
Sucrosa (g) .. 20,000
C. Activado (g) ..... 2,000
Agar agar (g) .. 8,000
Agua destilada (ml) .. 1000,000
pH .. 5.1 5.4

Medio N01: Establecido por Len M. en el Laboratorio de Cultivo de
Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T
Cuadro N02: Componentes y dosis del medio de cul tivo T
0
para
la fase de enraizamiento y desarrollo.

Reactivos e insumos
g/200 ml
stock
Concentracin
final
Nitrato de amonio 20,625 1,031
Nitrato de potasio 23,750 1,188
EDTA 0,466 0,032
Sulfato ferroso heptahidratado 0,348
Cloruro de calcio dihidratado 17,600 0,880
Fosfato de potasio
monobsico (g/l)
6,800 0,085
Molibdato de sodio dihidratado 0,010
0,004 g/l
Cloruro de cobalto dihidratado 0,001
cido brico 0,248
Yoduro de potasio 0,033
monobsico
0,676
0,198 g/l
heptahidratado
14,800
Sulfato de zinc heptahidratado 0,345
Sulfato de cobre
pentahidratado
0,001
Tiamina 0,100 0,400
cido nicotnico 0,100 0,500
Sucrosa (g) .. 20,000
C. Activado (g) ..... 2,000
Agar agar (g) .. 8,000
Agua de coco (ml) .. 100,000
Agua destilada (ml) .. 1000,000
pH .. 5.1 5.4

Medio N02: Establecido por Len M. en el Laborato rio de Cultivo de
Tejidos vegetales (LCTV), UNSM T
1
para
germinacin.

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Fertilizante Bayfolan (11 9 8) (ml) . 7,100
Complejo B (ml) . 3,000
Azcar blanca (g) . 20,000
Agar agar (g) . 10,000
Carbn vegetal molido (g) . 2,000
Agua destilada (ml) . 1000,000
pH . 5.1 5.4

Medio N03: Establecido por Len M. y Padilla, E. en el laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales (LCTV), UNSM T

1
para la
fase de enraizamiento y desarrollo.

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Agua de coco (ml) . 100,000
pH . 5.1 5.4

2
para
germinacin.

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Agua de coco desproteinizado (ml) . 200,0000
pH . 5.1 5.4


2
para la

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Agua de coco desproteinizado (ml) . 200,000
pH . 5.1 5.4


3
para
germinacin.

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
pH . 5.1 5.4


3
para la

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
pH . 5.1 5.4

4
para
germinacin.

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Pltano seda (g) . 40,000
pH . 5.1 5.4


4
para la

Insumos
g/200 ml
stock
Cantidades
finales de pxto.
Pltano seda (g) . 40,000
pH . 5.1 5.4

4.4.2 Procedimiento para la preparacin del medio de cultivo.
En un vaso precipitado se colocaron 500 ml de agua destilada.
Se pesaron los componentes slidos (azcar, agar-agar, carbn
activado, etc).
Para el tratamiento T0 (Testigo) se agrego las cantidades de las
sales minerales especificados por Murashige & Skoog (1962)
contenidos en stocks A, B, G, C, D, E y F.
Para los tratamientos (T
1
, T
2
, T
3
y T
4
) no se utilizo las soluciones
stock; para cada uno los tratamientos mencionados anteriormente se
agregaron los siguientes componentes.
- Para T
1
: Bayfolan y complejo B.
- Para T
2
: Coco desproteinizado y complejo B. Cabe indicar que
para la desproteinizacin del endospermo lquido de coco (agua
de coco), se sigui el siguiente procedimiento; colocamos 300 ml
de agua de coco en un vaso de precipitado de 500 ml y lo
calentamos hasta hervir en una cocina, el agua de coco debe
hervir por 5 minutos y luego se filtr, con algodn y un embudo
(Figura N 22).
- Para T
3
: Bayfolan, complejo B y agua de coco.
- Para T
4
: Bayfolan y complejo B, pero antes se debe preparar una
suspensin (jugo) con 300 ml de agua destilada y pltano seda
(figura N 23), licuado hasta homogenizar y luego se agreg esta
mezcla a la solucin anterior.
Para cada etapa de propagacin, preparamos diferentes tipos de
medio de cultivo, con diferentes concentraciones de componentes;
germinacin: cinco (05) medios (Tratamientos); para enraizamiento y
desarrollo tambin cinco (5) medios de cultivo (Tratamientos).
Luego adicionamos los componentes slidos a cada solucin
establecida por separados segn su formulacin y tipo de medio
requerido para cada caso.
Luego de aplicar los componentes enrazamos a 1000 ml.
A cada medio de cultivo establecido se ajust su pH de 5.1 5.4,
como se muestra en la figura N 24.
El medio de cultivo se distribuy en botellas de wisky, colocando 100
ml de medio de cultivo por botella, con la ayuda de una medida de
dispersin de (100 ml), obteniendo 10 botellas de medio del T
0

para la fase de germinacin, y al mismo tiempo 10 botellas para la
Todas las botellas con medio de cultivo, se pas a la esterilizacin en
una olla autoclave de capacidad de 40 litros a temperatura de 121 C,
con una presin de 15 lb, por un periodo de 15 minutos (figura N 25).
Despus de enfriado, se agito el medio para tener homogeneidad y
luego se almacen en la sala de incubacin a la temperatura de 20 a
24C hasta el momento de su uso, donde se las ubico
horizontalmente para una mejor solidificacin (figura N 26).

4.4.3 Especies.
Cattleya sp. y Oncidium lanceanum

4.4.4. Anlisis de Varianza.
Se da a conocer que a partir de la primera fase (germinacin) y la
segunda fase (enraizamiento y desarrollo) de la propagacin in vitro,
para el caso de la primera fase se hizo un recuadro de 4 cm
2
sobre la
Figura N 23: Filtrado de agua de coco
Figura N 24: Preparacin del
homogenizado de pltano
Figura N 25: Medicin del pH
Figura N 26: Esterilizacin del medio
de cultivo
Figura N 27: Enfriado del medio de cultivo
superficie del vidrio de las botellas de wisky, con la finalidad de lograr la
facilitacin en la toma de datos, para el caso de la segunda fase, se
coloc en cada botella 48 plntulas por cada especie por tratamiento
(Cattleya sp. y Oncidium lanceanum).

Cuadro N11: Anlisis de varianza del experimento en la primera
fase (germinacin y formacin de protocormos).
Fuente de variabilidad G.L.
Tratamientos 5 1 = 4
Error 5(10 1)= 45
Total (5 x 10) 1 = 49

4.4.5. Modelo Matemtico.
Yij = + i + ij
Donde:
= Media General i = Efecto del i-simo tratamiento
ij = Efecto aleatorio del error
4.5. Evaluaciones realizadas
4.5.1. Establecimiento de las semillas

a) Viabilidad.
Se evalu la viabilidad de las semillas observando al microscopio
(aumento 100x). Donde se tom 10 muestras de semillas al azar, en
cada uno de los cuales se realizo la evaluacin y se hizo el recuento
de semillas viables y no viables, obtenindose el porcentaje de
viabilidad de la siguiente manera:

Total de semillas viables
% Viabilidad = --------------------------------------- x 100%
Total de semillas

b) Contaminacin.
Se evalu presencia de microorganismos (hongo) por observacin
directa, a los 07 das despus de la siembra, en dos momentos de
siembra: 07/08/07 y 09/08/07, para luego obtener el porcentaje de
contaminacin en cada momento de siembra, por medio de la formula
general.

c) Porcentaje de Germinacin.
Se evalu el porcentaje de germinacin, al cabo de una (1) semana
despus de la siembra, y despus se tomo observaciones cada 7
das, donde se procedi a tomar 10 botellas al azar por cada
tratamiento y se hizo el recuento total de semillas y de semillas
germinadas que se encontraban dentro del cuadro de 2 cm x 2 cm,
para luego obtenerse el porcentaje de germinacin en cada
cuadrado y elevado al nmero total de semillas por botella evaluado
por medio de la formula general.

Semillas germinadas
% germinacin = -------------------------------------- x 100%
Total de semillas

d) Rompimiento de testa.
Se evalu el rompimiento de testa de las semillas en el medio de
cultivo (germinacin). Se procedi a tomar las cinco (5) botellas
establecidas y observar la velocidad de rompimiento de testa de las
semillas por cada cuadrado (en cada botella), esto cada 7 das en 4
evaluaciones.

e) Color verde vivo y verde transparente.
Se evalu el estado de protocormos en buen estado (verdes) y
vitrificados o a punto de morir (verde transparente o tornndose como
vidrio) a 75 das despus de la siembra, donde contamos el nmero
de protocormos vivos y vitrificados de los dos cuadrados de 2 cm. x 2
cm. (Dos cuadrados en cada botella) en las cinco (5) botellas
establecidas por los cinco (5) tratamientos.

f) Color verde y marrn
Se evalu el estado de protocormos en buen estado (verdes) y
fenolizados o muertos (marrn) a 90 das despus de la siembra,
donde contamos el nmero de protocormos vivos y muertos de los
dos cuadrados de 2 cm. x 2 cm. (dos cuadrados en cada botella) en
las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.

4.5.2. Etapa de Enraizamiento y Desarrollo.
Se estableci cinco (5) medios de cultivo para el enraizamiento y
desarrollo, con 10 repeticiones (botellas) y por cada botella se coloc 48
plntulas.

a) Nmero de hojas.
Se evalu el nmero de hojas de las plntulas, donde se procedi a
contar el nmero de hojas de cada plntula (10 plntulas/botella)
obtenindose un promedio final que representara el nmero de
hojas/botella en cada tratamiento, para luego realizar el Anlisis de
Varianza y Duncan.

b) rea folear.
Se evalu el rea folear de las plntulas, procedindose a medir el
largo y el ancho de las hojas, de cada plntula (10 plntulas/botella)
utilizando un papel milimetrado, obtenindose un promedio final que
representa el rea folear en cada tratamiento, para luego realizar el
anlisis de varianza y prueba de Duncan. Cabe indicar que las
mediciones se realiz a cada hoja que apareca (es decir que la hoja
que fue medida antes, ya no se volva a medir).

c) Altura de plntulas.
Se evalu la altura de las plntulas, tomndose la longitud de las
plntulas con un papel milimetrado. De cada plntula (10
plntulas/botella) obtenindose un promedio final que representara la
altura de plntulas/botella, esto a las cinco (5) botellas evaluadas en
los cinco (5) tratamientos, para luego realizar el anlisis de varianza y
prueba de Duncan.

d) Nmero de races.
Se evalu el nmero de races, donde se procedi a contar el nmero
de races de cada plntula (10 plntulas/botella) obtenindose un
promedio final de races/botella, esto a las cinco (5) botellas
evaluadas en los cinco (5) tratamientos, para luego realizar el anlisis
de varianza y Prueba de Duncan.

e) Contaminacin.
Al igual que para la primera etapa se evalu la presencia de
microorganismos (hongo) por observacin directa, a los 07 das
despus de la siembra, en dos momentos de siembra: 04/12/07 y
06/12/07, para luego obtener el porcentaje de contaminacin en cada
momento de siembra, por medio de la formula general.

f) Color verde vivo y verde transparente.
Al igual que para la primera fase se evalu el estado de plntulas en
buen estado (verdes) y vitrificados o a punto de morir (verde
transparente o tornndose como vidrio) a 60 das despus de la
siembra, donde contamos el nmero de plntulas vivas y vitrificadas
en las cinco (5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.

g) Color verde y marrn.
Tambin se evalu el estado de plntulas en buen estado (verdes) y
fenolizados o muertos (marrn) a 60 das despus de la siembra,
donde contamos el nmero de plntulas vivas y muertas en las cinco
(5) botellas establecidas por los cinco (5) tratamientos.

4.5.3 Anlisis de costos.
Se determin el costo de los diferentes medios de cultivo propuestos, los
mismos que representan los diferentes tratamientos del presente trabajo
investigacin. Para esto se realiz la cotizacin respectiva de todas las
sales nutritivas y minerales que se utiliza en el medio de cultivo
propuesto por Murashige y Skoog en 1962, modificada para el cultivo
de orqudeas por Len en 1995, y de los insumos y fertilizante, utilizados
en los medios caseros propuestos como tratamientos, esto se puede
observar en los cuadros 12, 13, 14, 15 y 16.
Cuadro N 12. Costos de 1 litro de medio de cultivo M&S (T
0
).
componente Costo (S/.) Q. Pxto total Q. Usado (g/l) Total
nitrato de amonio (g) 89.605 1000 1.65 0.14784825
Nitrato de potasio (g) 59 500 1.9 0.2242
Cloruro de calcio (g) 65 500 0.44 0.0572
Sulfato de magnesio (g) 97 500 0.016 0.003104
Sulfato de zinc (g) 95 500 0.0086 0.001634
acido borico (g) 65 500 0.0062 0.000806
Ioduro de potasio (g) 150 250 0.00083 0.000498
acido molibdico (g) 536.95 500 0.00005 5.3695
cloruro de cobalto (g) 125 100 0.000025 0.00003125
sulfato de hierro (g) 125 500 0.0278 0.00695
agente quelante Na2 - EDTA (g) 125 500 0.0373 0.009325
Tiamina HCl (g) 135
100 0.0004 0.00054
acido nocotinico (g) 69 25 0.0005 0.00138
sucrosa (g) 62 500 20 2.48
agar - agar (g) 224 500 10 4.48
carbon activado (g) 110 1000 2 0.22
agua destilada (L) 9.7 1000 1000 9.7
agua de coco * 0.5 400 100 0.125
Equipo Costo/H Tiempo usado Total
Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625
Costo total del medio de cultivo para germinacin 17.8398202
Costo total del medio de cultivo para desarrollo 17.9648202
* Slo se utiliza para medio de desarrollo.
Cuadro N 13. Costos de1 litro de medio de cultivo T
1
.
Insumos Costo (S/.) Q. Pxto total Q. usado/L Total (S/.)
Fertilizante Bayfolan (11 9 8)
(ml)

22 1000

7.1 0.1562
Complejo B (ml) 3.3
120
3
0.0825
Azcar blanca (g) 2.3
1000
20
0.046
Agar agar (g) 224
500
10
4.48
Carbn vegetal molido (g) 1.2
1000
2
0.0024
Agua destilada (ml) 9.7
1000
890
8.63203
agua de coco* 0.5 400
100 0.125
Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625

Cuadro N 14. Costos de 1 litro de medio de cultivo T
2
.
coco desproteinizado (ml) 0.5
350
200
0.28571429
Complejo B (ml) 3.3
120
3
0.0825
1000
20
0.046
Agar agar (g) 224
500
10
4.48
1000
2
0.0024
Agua destilada (ml) 9.7 1,000
697 6.7609
agua de coco*
0.5 400
100
0.125
Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625

3
.
(ml)

22 1000

7.1 0.1562
Complejo B (ml) 3.3
120
3
0.0825
1000
20
0.046
Agar agar (g) 224
500
10
4.48
1000
2
0.0024
689.9 6.69203
Agua de coco
0.5 400
100
0.125
Agua de coco*
0,5 400
100
0.125
Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625
4
.
(ml)

22 1000

7.1 0.1562
Complejo B (ml) 3.3 120 3 0.0825
1000
20
0.046
Agar agar (g) 224
500
10
4.48
1000
2
0.0024
889.9 8.63203
pltano seda (g)
0.2 93.032 40 0.08599192
agua de coco*
0.5 400
100
0.125
Autoclave 0,675 0,75 H 0,50625
V. RESULTADOS

5.1. Evaluacin del establecimiento de las semillas

Cuadro N12: Viabilidad de las semillas de Cattleya sp, expresado en
porcentajes antes de la siembra.
Nde
muestras
Cantidad
de semillas
Viables o
buenos (%)
No Viable o
Vanos (%)
1 247 72,5 27,5
2 247 70,0 30,0
3 242 72,7 27,3
4 245 73,9 26,1
5 247 72,5 27,5
6 247 74,9 25,1
7 246 75,2 24,8
8 244 76,2 23,8
9 245 77,9 22,1
10 248 77,8 22,2
X 245.8 74,36 25,64

Grfico N01: Viabilidad de las semillas Cattleya sp.

Cuadro N
13: Viabilidad de las semillas de Oncidium lanceanum,
expresado en porcentajes antes de la siembra.

Nde
muestras
Cantidad de
semillas
Viables o buenos
(%)
No Viable o Vanos
(%)
1 246 66,3 33,7
2 248
75,4
24,6
3 243
75,3
24,7
4 247 75,7 24,3
5 245 78,4 21,6
6 273
67,0
33,0
7 248
75,9
24,1
8 245 77,6 22,4
9 246 76,8 23,2
10 247
77,7
22,3
X 248,8
74,61 25,39

Grfico N02: Viabilidad de las semillas de Oncidium lanceanum

74.36
25.64
0
20
40
60
80
Viable s No
viables
74.61
25.39
0
20
40
60
80
Viables No
viables

5.1.1. Contaminacin.

Cuadros N14: Nmero de botellas con Cattleya sp. contaminadas
en medio de cultivo (Germinacin), primer momento
de siembra: 07/08/07; despus de 2 semanas.

N Cantidad de botellas Contaminados No contaminado s
1* 50 0 50
% 100 0 100

Cuadro N15: Nmero de botellas con Oncidium lanceanum
contaminadas en medio de cultivo (Germinacin),
segundo momento de siembra: 09/08/07; despus
de 2 semanas.

N Cantidad de botellas Contaminados No contaminado s
2 50 0 50
% 100 0 100

Grafico N03.a: Siembra 1 Grafico N03.b: Siemb ra 2

5.1.2. Porcentaje de Germinacin.

Cuadros N16: Anlisis de Varianza para el porcent aje de
germinacin de semillas de Cattleya sp. en un
medio de germinacin a 30 das de la siembra.

F. de V. GL SC CM FC FT
Tratamientos t-1 4 139.32 34.82983274 5.99273 (2.87-4.43)
Error (t)(r-1) 20 116.24 5.812015798
Total rt-1 24 255.56
** Altamente significativo
X = 73,94% R
2
=54,52% C.V= 3,26%

Grafico N04: Prueba de DUNCAN al 0.01% para el P orcentaje de
germinacin de semillas de Cattleya sp. en un
medio de germinacin a 30 das de la siembra.

0
50
0
10
20
30
40
50
Contaminados No contaminados
0
50
0
10
20
30
40
50
Contaminados No contaminados

Cuadro N17: Anlisis de Varianza para el porcenta je de
germinacin de semillas de Oncidium lanceanum en
un medio de germinacin a 30 das de la siembra.

Tratamientos t-1 4 118.98 29.7441129 3.68957
(2.87-4.43)
Error (t)(r-1) 20 161.23 8.061671879

Total rt-1 24 280.21

X=74,98% R
2
=42,46% C.V=3,78%

Grfico N05: Prueba de DUNCAN al 0.01% para el po rcentaje de
germinacin de semillas de Oncidium lanceanum en
un medio de germinacin a 30 das de la siembra.

a
b
ab
b
b
a
ab
b
ab
ab

5.1.3. Rompimiento de testa.

Cuadro N18: Velocidad de rompimiento de testa de semillas de
Cattleya sp., en un medio de germinacin durante 4
evaluaciones expresado en cantidad.

Tto. Velocidad de rompimiento de testa en un medio de cultivo
(germinacin) expresado en proporcin.
7 das 14 das 21 das 28 das
T
0
0,8 5.4 31.6 42.2
T
1
7,0 14,4 34,6 59,0
T
2
5,0 14,6 39 60,0
T
3
21,0 50,6 56,4 35,6
T
4
23,6 71,8 64,0 4,8
x 11,48 31,36 45,12 40,32
Total 57,4 156,8 225,6 201,6

Grfico N06: Velocidad de rompimiento de testa

Cuadro N19: Velocidad de rompimiento de testa de semillas de
Oncidium lanceanum, en un medio de germinacin
durante 4 evaluaciones expresado en cantidad.

Tto. Velocidad de rompimiento de testa en un medio de cultivo
(germinacin) expresado en proporcin.
7 das 14 das 21 das 28 das
T
0
5,0 17,0 37,8 48,8
T
1
15,2 25,4 40,8 63,0
T
2
12,0 32,4 56,0 53,2
T
3
24,2 65,8 32,4 31,4
T
4
25,2 70,6 69,0 6,2
x 16,32 42,24 47,2 40,52
Total 81,6 211,2 236 202,6

Grfico N07: Velocidad de rompimiento de testa
0
10
20
30
40
50
60
70
80
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias
v
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

r
o
m
p
i
m
i
e
n
t
o

T0
T1
T2
T3
T4

5.1.5. Color verde vivo y verde transparente.
Cuadro N20: Cuadro de observacin del nmero de p rotocormos
de color verde (Vivos) y verde transparente
(vitrificados) de Cattleya sp. a los 75 das despus
de la siembra.

T
0
T
1
T
2
T
3
T
4

Repet. Verd. Trpts. Verd. Trpts. Verd. Trpts. Vedr. Trpts. Vedr. Trpts.
1 154 14 153 21 152 27 146 40 173 18
2 159 16 161 14 151 23 158 25 141 54
3 175 9 164 16 146 30 151 38 156 24
4 179 11 169 10 150 35 154 33 155 38
5 161 18 161 11 149 31 146 36 171 26
X 165,6 13,6 161,6 14,4 149,6 29,2 151 34,4 159,2 32
Total 828 68 808 72 748 146 755 172 796 160

Leyenda: Repet.: Repeticiones Verd.: Protocormos verdes vivos
Trpts.: Protocormos verde transparentes (vitrificados)

Grafico N 08: Protocormos vivos y vitrificados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
7 dias 14 dias 21 dias 28 dias
v
e
l
o
c
i
d
a
d

d
e

r
o
m
p
i
m
i
e
n
t
o

T0
T1
T2
T3
T4
165.6
13.6
161.6
14.4
149.6
29.2
151
34.4
159.2
32
0
50
100
150
200
T0 T1 T2 T3 T4
Vivos Vitrificados

de color verde (Vivos) y verde transparente
(vitrificados) de Oncidium lanceanum a los 75 das
despus de la siembra.

T
0
T
1
T
2
T
3
T
4

Repet. Vedr. Trpts. Vedr. Trpts. Vedr. Trpts. Vedr. Trpts. Vedr. Trpts.
1 150 12 176 10 175 9 176 15 173 21
2 161 13 173 16 171 16 176 13 178 13
3 149 14 174 13 173 17 161 26 173 17
4 147 17 167 15 163 12 155 24 170 24
5 133 20 179 12 166 15 171 19 182 11
X 148 15,2 173,8 13,2 169,6 13,8 167,8 19,4 175,2 17,2
Total 740 76 869 66 848 69 839 97 876 86

Leyenda: Repet.: Repeticiones Verd.: Protocormos verdes vivos
Trpts.: Protocormos verde transparentes (vitrificados)

Grafico N 09: Protocormos vivos y vitrificados.
148
15.2
173.8
13.2
169.6
13.8
167.8
19.4
175.2
17.2
0
50
100
150
200
T0 T1 T2 T3 T4
Vivos Vitrificados

5.1.6. Color verde y marrn
de color verde (Vivos) y marrn (Muertos) de
Cattleya sp. a los 75 das despus de la siembra.

T
0
T
1
T
2
T
3
T
4

Repet. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr.
1 163 5 165 9 171 8 183 3 185 6
2 168 7 169 6 168 6 177 6 190 5
3 175 9 176 4 172 4 180 9 176 4
4 186 4 171 8 178 7 183 4 190 3
5 171 8 169 3 174 6 177 5 195 4
X 172,6 6,6 170,0 6,0 172,6 6,2 180,0 5,4 187,2 4,4
Total 863 33 850 30 863 31 900 27 936 20

Leyenda: Repet.: Repeticiones Vedr.: Protocormos verdes vivos
Mar.: Protocormos muertos (Fenolizados)

Grafico N 10: Protocormos vivos y fenolizados (marrn).
172.6
6.6
170
6
172.6
6.2
180
5.4
187.2
4.4
0
50
100
150
200
T0 T1 T2 T3 T4
Vivos Marrn

de color verde (Vivos) y marrn (Muertos) de
Oncidium lanceanum a los 75 das despus de la
siembra.
T
0
T
1
T
2
T
3
T
4

Repet. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr. Vedr. Marr.
1 159 9 172 2 176 3 184 2 190 1
2 171 4 169 6 166 8 180 3 193 2
3 169 15 176 4 174 2 186 3 180 0
4 184 6 177 2 181 4 184 3 191 2
5 161 18 165 7 177 3 178 4 196 1
x 168,8 10,4 171,8 4,2 174,8 4,0 182,4 3,0 190,0 1,2
Total 844 52 859 21 874 20 912 15 950 6
Leyenda: Repet.: Repeticiones Vedr.: Protocormos verdes vivos
Mar.: Protocormos muertos (Fenolizados)

Grafico N 11: Protocormos vivos y fenolizados (marrn).

168.8
10.4
171.8
4.2
174.8
4
182.4
3
190
1.2
0
50
100
150
200
T0 T1 T2 T3 T4
Vivos Marrn

5.2. Etapa de enraizamiento y desarrollo.

5.2.1. Nmero de hojas

Cuadro N24: Anlisis de varianza para determinar el nmero de
hojas de Cattleya maxima en fase de enraizamiento
y desarrollo a 24 semanas despus de la siembra.
F. de V. GL SC CM FC FT(0.01-0.05)
Tratamientos t-1 4 15.68 3.92 73.5 2.56-3.77
Error (t)(r-1) 45 2.4 0.053333333
Total rt-1 49 18.08
X = 3,72 R
2
=86,72% C.V= 6,20%

Grfico N12: Prueba de Duncan para determinar el nmero de
hojas de Cattleya maxima a 24 semanas despus
de la siembra.
a a a a
b

hojas de Oncidium lanceanum en fase de
enraizamiento y desarrollo a 24 semanas despus
de la siembra.
Tratamientos t-1 4 31.32 7.83 37.0894737 2.56-3.77
Error (t)(r-1) 45 9.5 0.211111111
Total rt-1 49 40.82
X = 3,94 R
2
=76,72% C.V = 11,66%

hojas de Oncidium lanceanum a 24 semanas

a a
a
b
a
5.3.2. Altura de las plntulas.

Cuadro N26: Anlisis de varianza para determinar la altura de
plntulas en mm de Cattleya maxima en fase de
de la siembra.
Tratamientos t-1 4 307.1948 76.7987 287.947134
(2.57 - 3.77)
Error (t)(r-1) 45 12.002 0.266711111

Total rt-1 49 319.1968

X=9.58 mm R
2
=96,24% C.V=
5,43%
Grfico N14: Prueba de Duncan al 0.01% para deter minar la altura
de plntulas en mm de Cattleya maxima a 24
semanas despus de la siembra.

Cuadro N27: Anlisis de varianza para determinar la altura de
plntulas en mm de Oncidium lanceanum en fase de
a
b
e
d
cd
de la siembra.

Tratamientos t-1 4 2435.941 608.9852 371.811058
(2.55 - 3.77)
Error (t)(r-1) 45 73.705 1.637888889

Total rt-1 49 2509.646

X=18.67 mm R
2
=97,10% C.V= 6,9%

Grfico N15: Prueba de Duncan al 0.01% para deter minar la altura
de plntulas en mm de Oncidium lanceanum a 24
semanas despus de la siembra.

5.3.3. Nmero de races.

races del Cattleya maxima en fase de
a
b
c
d
e
de la siembra.
Tratamientos t-1 4 7.92 1.98 10.011236 2.56-3.77
Error (t)(r-1) 45 8.9 0.197777778
Total rt-1 49 16.82
X = 1,94 R
2
=47,08% C.V= 22,92%

races de Cattleya maxima a 24 semanas despus
de la siembra.

races del Oncidium lanceanum en fase de
de la siembra.
a
a
ab
bc
c
Tratamientos t-1 4 13.52 3.38 15.0594059 2.56-3.77
Error (t)(r-1) 45 10.1 0.224444444
Total rt-1 49 23.62
X = 2,26% R
2
=57,23% C.V= 20,96%

races de Oncidium lanceanum a 24 semanas

a
a
ab
b
c
VI. DISCUSIN

6.1. Viabilidad
6.1.1 Para Cattleya sp. El cuadro N12, nos muestra los resultados de la
prueba de viabilidad de las semillas de Cattleya sp. antes de la
siembra, registrando un 74,36% promedio de semillas viables, de un
total de 245,8 semillas evaluadas, en medio de germinacin, esta
prueba se realiz por medio del microscopio, para saber si las semillas
eran viables o no, tambin para determinar si las semillas estn en
buen estado y libre de agentes contaminantes, lo cual afectara al
medio de cultivo y prdida de mano de obra.

6.1.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N 13, muestra de manera clara
los resultados de la prueba de viabilidad para las semillas de Oncidium
lanceanum antes del momento de la siembra, registrando un 74,61%
en promedio para las semillas viables, de un total de 248,8 semillas
evaluadas, al igual que para Cattleya sp. en este caso se sigui los
mismos procedimientos para la evaluacin de este parmetro.

Esto conforme lo realizado por RODRGUEZ 1996, en donde menciona que
para determinar la viabilidad de las semillas de Phragmipedium kovachii, se
puede realizar por medio del microscopio electrnico, donde se observar las
semillas a simple vista, y se reconoce las viables o las no viables.

Existe otro mtodo como es el 2, 3, 5 trifenil tretazolium (TTZ) al 1%, donde
se coloca una pequea muestra de semillas ms una pequea cantidad del
TTZ, por un periodo de 24 a 72 horas, luego se extrae y se lo coloca en una
placa petri, y se puede distinguir las semillas viables y no viables, esto
conforme lo mencionado por LEN (1995).

6.2. Porcentaje de contaminacin
Los cuadros N14 y 15, de 2 semanas de sembradas l as semillas del
Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, no se encontr contaminacin por ningn
tipo de microorganismos, esto debido al buen trabajo realizado en la cmara
de flujo laminar, cabe mencionar tambin que la tcnica de desinfeccin de
las semillas utilizado para este trabajo ha sido buena y bien empleada, dado a
que las botellas de wisky contenidas con medio de cultivo y semillas de las
especies antes mencionadas se mantuvieron sin contaminarse hasta el
momento de la transferencia a un medio de cultivo de desarrollo.

Conforme lo indicado por DONAYRE 2000, indica que el material a sembrar
pueda tener presencia de algn patgeno que pueda afectar el desarrollo y
germinacin de las semillas, para el cual es necesario utilizar algn
desinfectante que pueda disminuir la contaminacin, por ejemplo el hipoclorito
de sodio o de calcio, agua oxigenada (peroxido de hidrogeno) y alcoholes, en
concentraciones mininas (0.1 0.5%).

Referente a lo que son desinfectantes utilizado por ARDITTI 1999, sugiere
que tambin podemos utilizar un agente que rompa la tensin superficial con
la semillas (Tween 20) y que acta esterilizando y desinfectndolo
completamente y as permitiremos que las semillas al sembrarlas no puedan
contaminarse.

6.3. Porcentaje de germinacin.
6.3.1 Para Cattleya sp. El cuadro N16 y el grfico N 04, representan el
anlisis de varianza y la prueba de Duncan respectivamente respecto
al porcentaje de germinacin de Cattleya sp., con valores para el C. V.
con 3,26% y un R
2
con 54,32%, para el caso del C. V. corrobora la
confiabilidad de los resultados obtenidos, en el caso del R
2
muestra
que el diseo no se ajusta para la evaluacin de este parmetro. En el
grfico N 04 se observa el resultado de la prueba de Duncan con
respecto al porcentaje de germinacin con resultados de T
0
con
72,63%, T
1
con 71,38%, T
2
con 72,5%, T
3
con 75,27% y T
4
con
77,91%, esto nos indica que el medio de cultivo con pltano tiene un
mejor resultado para germinar semillas de Cattleya sp.

6.3.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N17 representa el anlisis de
varianza respecto al porcentaje de germinacin de Oncidium
lanceanum, con valores para el C. V. con 3,78% y un R
2
con 42,46%,
para el caso del C. V. corrobora la confiabilidad de los resultados
obtenidos, en el caso del R
2
muestra que el diseo al igual que para
Cattleya sp., no se ajusta para la evaluacin de este parmetro. En el
respecto al porcentaje de germinacin con resultados de T
0
con
71,23%, T
1
con 74,60%, T
2
con 74,97%, T
3
con 76,36% y T
4
con
77,74%, esto corrobora la informacin obtenida con Cattleya sp., lo que
muestra que el medio de cultivo con pltano es adecuado para la
germinacin in Vitro de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.

La razn de este resultado fue que el embrin de la semilla comenz a
romper la testa, debido a que el medio de cultivo influyo en la germinacin
absorbiendo el embrin los nutrientes que contena (sales, vitaminas,
reguladores, sustancias orgnicas, etc). Otros factores que ayudaron a la
germinacin fueron la alta humedad en el medio de cultivo, la temperatura y
la luz (fotoperiodo 16/8) controlada por un timer.

Este resultado concuerda con lo planteado para el proceso de propagacin in
Vitro de Cattleya spp. y Psychopsis versteegianum, por LEN 1995, donde
menciona que las semillas de estas especies tienen mejor germinacin bajo
condiciones in Vitro, y que pueden germinar en un perodo de 30 das en
buena cantidad y uniforme, gracias al medio de cultivo empleado, como
tambin el manejo brindado a la semilla para que germinen como las
condiciones ambientales, una buena desinfeccin evitando as perdidas de
semillas por contaminacin.

6.4. Rompimiento de testa.
En los cuadros N 18 y 19, muestran los resultados de las evaluacin del das
al rompimiento de la testa, donde se puede apreciar que para el caso del
tratamiento T
4
a los 14 das se tuvo el mayor nmero de semillas rompiendo la
testa, seguido del tratamiento T
3
, a diferencia que en el tratamiento T
0
, se
observa el mayor nmero de semillas que rompieron la testa est a los 28
das despus de la siembra, la razn es porque la testa al ser una estructura
reticulada que cubre al embrin y compuesta por clulas indiferenciadas con
cuerpos lipidito, protenas, al entrar en contacto con el medio de cultivo,
comienzo a desarrollarse y activarse para poder realizar el rompimiento,
posteriormente formar protocormo y luego plntula. El hecho de romper la
testa en menos tiempo indica que el proceso de germinacin y aparicin del
protocormo ser en menos tiempo, lo que implica un aceleramiento del
proceso de germinacin.

Este resultado tiene relacin con lo afirmado por PIERIK 1989, cuando
menciona que el proceso de rompimiento de testa es rpido y se da por las
condiciones ambientales brindadas a la semilla (temperatura, fotoperiodo
18/6, humedad relativa, etc) y al medio de cultivo, donde las semillas al entrar
en contacto con el medio reaccionan instintivamente y comienzan a
desarrollarse.

6.5. Color verde y verde transparente.
Los cuadros N 20 y 21, muestran al cabo de 75 das despus de la siembra
de semillas de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum en el medio de cultivo para
germinacin, se obtuvo en promedio los siguientes resultados: T
0
con 13,6 y
15,2; T
1
con 14,4 y 13,2; T
2
con 29,2 y 13,8; T
3
con 34,4 y 19,4 y T
4
con 32 y
17,2; estos valores representan a los protocormos que sufrieron el problema
de vitrificacin (color verde transparente), esto es debido al tiempo
transcurrido en el medio de cultivo, se observ que el proceso de vitrificacin
es producto de la competencia y el agotamiento de los nutrientes del medio
de cultivo, lo que implica que hay que realizar el cambio del medio de cultivo
en menos tiempo (cada 30 das).

6.6. Color verde y marrn.
En los cuadros N22 y 23, podemos observar que al cabo de 90 das
despus de la siembra de las semillas de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum
en el medio de germinacin, se tuvo los promedios siguientes: T
0
con 6,6 y
10,4; T
1
con 6 y 4,2; T
2
con 6,2 y 4; T
3
con 5,4 y 3 y T
4
con 4,4 y 1,2; estos
valores representan a los protocormos que estaban sufrieron problema de
fenolizacin o muerte (color marrn), al igual que para vitrificacin este
problema aparece debido al tiempo transcurrido antes del repique, ya que es
necesario el reemplazo cada cierto tiempo (30 das), como tambin la
cantidad de protocormos y fueron eliminando sustancias como fenoles y
anhdrido carbnico, contaminando el medio de cultivo, creo que es necesario
la adiccin de una dosis ms de carbn vegetal o activado, como tambin
adicionar una dosis de antioxidantes como cido ctrico o cido ascrbico
para as neutralizar algunas sustancias que pudieran ser excretadas por los
protocormos, porque sufren estragos y decoloracin.

Referente a lo que es repique tanto para el tem 6.5 y 6.6; indica RODRGUEZ
1999, que es necesario realizar repique cada 30 das, para evitar
fenolizaciones, porque sabemos que algunas especies contienen sustancias
endgenas que exudan de la superficie cortados al medio de cultivo, el cual
se puede evitar utilizando antioxidante, adems si la humedad relativa es muy
baja, durante el periodo de cultivo se puede presentar deshidratacin del
medio y aumentar la salinidad.

As mismo para lo que es repique (tem 6.5 y 6.6), menciona DONAYRE
2000, que consiste en separar los protocormos que se encuentra en un medio
inicial y transferirlos en diferentes frascos a un nuevo medio de cultivo,
repitiendo la operacin cada 4 semanas como mximo. Tambin se indica
que los protocormos deben ser transferidos cada 30 das como mximo de un
medio a otro, antes de sufrir hiperhidricidad o fenolizacin, esto conforme lo
mencionado por DELGADO 2001

6.7. Nmero de hojas en fase de desarrollo y enraizamiento.
6.7.1 Para Cattleya sp. El cuadro N24, representa el anlisis de varianza
respecto al nmero de hojas en la fase de desarrollo y enraizamiento
de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 6,2% y un R
2
con
86,72%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los resultados
obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin entre la
variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico N 12 se
observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto al nmero
de hojas en la etapa de desarrollo, en el factor medio de cultivo se
observa que no existe diferencia estadstica entre los tratamientos T
0

con 4, T
1
con 4, T
3
con 4 y T
4
con 4; la diferencia estadstica radica
entre los tratamientos mencionados y el tratamiento T
2
con 2,6, los
mismos que lo superan, quienes provocaron la mayor formacin de
hojas promedios en las plntulas por tratamientos esto nos indica que
el medio de cultivo con pltano tiene un mejor resultado para germinar
semillas de Cattleya sp.

varianza respecto al nmero de hojas en la etapa de desarrollo y
enraizamiento de Oncidium lanceanum, con valores para el C. V. con
11,66% y un R
2
con 76,72%, los mismos que corroboran la
confiabilidad de los resultados obtenidos durante la investigacin y la
alta determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en
estudio. En el grfico N 13 se observa el resultado de la prueba de
Duncan con respecto al nmero de hojas en la etapa de desarrollo, en
el factor medio de cultivo se observa diferencia estadstica en T
0
y T
4
,
ambos con 4,5; superan a T
3
con 4,3; que supera a T
1
con 4; que
supera a T
2
con 2,4, esto corrobora la informacin obtenida con
Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano es
adecuado para el desarrollo de plntulas de orqudeas Cattleya sp. y
Oncidium lanceanum.

De la interaccin de los medios de cultivos con respecto al nmero de hojas
en fase de desarrollo, respondieron mejor las botellas con medio de cultivo
M&S (T
0
) y el medio de cultivo con pltano (T
4
), a ambos agregados agua de
coco, las botellas que con medio de cultivo con coco desproteinizado y agua
de coco (T
2
) fue el que form menor nmero de hojas y las plntulas se
tornaron color amarillo y truncaron sus desarrollo, esto debido a la falta de
nutrientes en el medio y debido a las fitohormonas que se encuentran en el
agua de coco, durante esta fase. ESPINOZA 2001, menciona que el agua de
coco contiene fitohormonas (auxinas, citoquininas y giberelinas) que ayudan a
un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las concentraciones
deben estar estandarizadas, para evitar problemas durante su desarrollo.

6.8. Altura de plntula en fase de desarrollo.
respecto al nmero a la altura de plntulas en la fase de desarrollo y
enraizamiento de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 5,43% y
un R
2
con 96,24%, los mismos que corroboran la confiabilidad de los
resultados obtenidos durante la investigacin y la alta determinacin
entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio. En el grfico
N 14 se observa el resultado de la prueba de Duncan con respecto a
la altura de plntulas en la etapa de desarrollo, en el factor medio de
cultivo se observa que existe diferencia estadstica entre los
tratamientos T
4
con 12 mm, supera a los tratamientos T
3
con 11 mm,
que supera a T
1
con 10,2 mm; que supera a T
0
con 9,6 mm; el mismo
que supera a T
2
con 4,8 mm, estos valores indican que las plntulas de
Cattleya sp. se desarrollan mejor en un medio de cultivo con la adicin
de agua de coco y pltano.
6.8.2 Para Oncidium lanceanum. El cuadro N27 muestra el anlisis de
varianza respecto a la altura de plntulas en la etapa de desarrollo y
6,9% y un R
2
con 97,10%, los mismos que corroboran la confiabilidad
de los resultados obtenidos durante la investigacin y la alta
determinacin entre la variable evaluada y los tratamientos en estudio.
En el grfico N 15 se observa el resultado de la prueba de Duncan con
respecto a la altura de plntulas expresados en mm en la etapa de
desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa diferencia
estadstica en T
4
con 28,3 mm, supera a los tratamientos T
3
con 23,9
mm, que supera a T
1
con 17,8 mm; que supera a T
0
con 15,2 mm; el
mismo que supera a T
2
con 8,2 mm, esto corrobora la informacin
obtenida con Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con
pltano y agua de coco es adecuado para el desarrollo de plntulas de
orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.

ESPINOZA 2001, menciona que el agua de coco contiene fitohormonas que
ayudan a un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las
concentraciones son variadas y que ayuden al desarrollo de las mismas.

6.9. Nmero de races.
respecto al nmero de races en la fase de desarrollo y enraizamiento
de Cattleya sp., con valores para el C. V. con 22,92% y un R
2
con
47,08%, estos dados nos indican que el diseo no se ajusta para
evaluar estos parmetros. El grfico N 16 muestra el resultado de la
prueba de Duncan con respecto al nmero de races en la etapa de
desarrollo, en el factor medio de cultivo se observa que existe mnima
diferencia entre los tratamientos T
4
con 2,5; supera a los tratamientos
T
3
1
con 2; que supera a T
0
con 1,6; el mismo
que supera a T
2
con 1,4; donde T
4
obtuvo el mayor nmero de races;
esto nos indica que el medio de cultivo con pltano y agua de coco
tiene un mejor resultado para el desarrollo y enraizamiento de plntulas
de Cattleya sp.

varianza respecto al nmero de races en la etapa de desarrollo y
20,96% y un R
2
con 57,25%, estos datos muestran que el diseo no se
ajusta para la evaluacin de ste parmetro de la investigacin. En el
respecto al nmero de races en la etapa de desarrollo y
enraizamiento, en el factor medio de cultivo se observa una mnima
diferencia entre los tratamientos T
4
con 2,9; supera a los tratamientos
T
3
1
0
con 2; el mismo
que supera a T
2
con 1,4; esto corrobora la informacin obtenida con
Cattleya sp., lo que muestra que el medio de cultivo con pltano y agua
de coco es adecuado para el desarrollo y enraizamiento de plntulas
de orqudeas Cattleya sp. y Oncidium lanceanum.

El medio que obtuvo buen desarrollo fue el T
4
tanto para Cattleya sp. y
Oncidium lanceanum ya que contena en su composicin pltano y agua de
coco (que contiene fitohormonas). Segn en lo referente a auxinas, ARDITTI
1990, menciona que las plntulas responde a los cambios de medio y la
composicin que contengan, como el caso de auxinas que acta directamente
en la formacin de races , as como las condiciones ambientales controladas
(temperatura, luz y humedad relativa, fotoperiodo 16/8). Se menciona tambin
que para la fase de enraizamiento, se utiliza las mismas sales M&S,
omitindose las citoquininas (BA). Complementado con 1.5 gr/l de carbn
activado, 20 gr/l de sacarosa y agregando auxinas (ANA) mencionado por
AVECES (2000).

ESPINOZA 2001, menciona que el agua de coco contiene fitohormonas que
ayudan a un mejor desarrollo de las plntulas, siempre y cuando las
concentraciones son variadas y que ayuden al desarrollo y a la formacin de
races de las mismas.

6.10. Costos
6.10.1 Costos de los medios de cultivos para germinacin. Los cuadros
N 12, 13, 14, 15 y 16 muestran los costos de los diferentes medios de
cultivo, los mismos que representan los tratamientos del trabajo de
investigacin, en donde podemos comparar los costos que van con los
siguientes precios: T
0
con S/. 17,84 el litro de medio de cultivo, T
1
con
S/. 14,89 el litro, T
2
con S/. 13,1 el litro, T
3
con S/. 14,03 el litro y T
4
con
S/. 14,96 el litro, como se puede observar en los cuadros de varianza y
en los grficos de las pruebas de Duncan los mejores resultados
obtenidos en la investigacin corresponden a los tratamientos T
0
, T
3
y
T
4
si realizamos una observacin minuciosa el T
0
(Testigo), nos resulta
ms costoso que el tratamiento T
3
y T
4
, en este caso el tratamiento que
mayor resultado dio fue el T
4
que mantiene una diferencia de dos y
88/100 nuevos soles (S/. 2,88), lo que implica un ahorro de este monto
para el productor, esto solo para un litro de medio de cultivo, si lo
vemos desde el punto de vida de produccin entonces estamos
hablando de 50 litros de medio de cultivo a ms, por lo que se tendra
un ahorro de S/. 144,00 a ms.

6.10.2 Costos de los medios de cultivos para desarrollo y enraizamiento.
En los cuadros N 12, 13, 14, 15 y 16 se muestran los costos de los
diferentes medios de cultivo (Tratamientos), como se puede observar
los costos van desde T
0
con S/. 17,96 el litro de medio de cultivo, T
1

2
3
con S/. 12,22 el litro y
T
4
con S/. 14,12 el litro, los cuadros de varianza y los grficos de las
pruebas de Duncan muestran que los mejores resultados obtenidos en
la investigacin corresponden a los tratamientos T
0
, T
3
y T
4
esto indica
que el T
0
(Testigo), nos resulta ms costoso que el tratamiento T
3
y T
4
,
en este caso el tratamiento que mayor resultado dio fue el T
4
que
mantiene una diferencia de tres y 84/100 nuevos soles (S/. 3,84), lo
que implica un ahorro de este monto para el productor, esto solo para
un litro de medio de cultivo, si lo vemos desde el punto de vida de
produccin entonces estamos hablando de 50 litros de medio de cultivo
a ms, por lo que se tendra un ahorro de S/. 192,00 a ms.

6.10.3 Costos de produccin de una planta in Vitro. En los tems
anteriores se muestran solo los costos de los medios de cultivo, si a
stos los agregamos el costo de la energa consumida por la cmara
de flujo laminar y la energa consumida por los fluorescentes usados
para la incubacin de las semillas hasta sus completo desarrollo
(plantas listas para la aclimatacin), que corresponde un promedio de 9
meses entonces, y al mismos tiempo le adicionamos la cantidad de
medios litros de medios de cultivo utilizado hasta esta etapa entonces
tenemos los costos de produccin de una planta in Vitro, en el cuadro
N 31 del anexo se muestran los costos que comprende para las
plantas producidas con el T
0
= S/. 0,50; T
1
= S/. 0,44; T
2
= S/. 0,39; T
3

= S/. 0,43 y T
4
= S/. 0,40; como se puede observar los tratamiento T
2
y
T
4
muestran el menor costo de produccin, pero si revisamos los
cuadros de anlisis de varianza y los grficos de las pruebas de
Duncan nos damos cuenta que el tratamiento T
2
no muestra diferencia
significativa, pero el tratamiento T
4
si lo que indica que producir plantas
in Vitro utilizando este medio de cultivo resulta ms rentable para el
productor, esto si lo observamos desde el punto de vista de produccin
(A gran escala).

VII. CONCLUSIONES

7.1. El protocolo establecido durante el proceso de propagacin in Vitro de las
especies Cattleya spp. y Oncidium lanceanum, permiti la germinacin de las
semillas, formacin de protocormos, desarrollo y enraizamiento de las
plntulas.

7.2. Se encontraron diferencias significativas entre los medios de cultivo T
4
(con la
adicin de pltano seda), T
3
(con la adicin de endospermo lquido de coco),
T
2
(solo con coco desproteinizado), T
1
(solo con fertilizante) y el medio de
cultivo M & S (T
0
) modificado para la germinacin de semillas de las especies
Cattleya spp. y Oncidium lanceanum. Siendo el ms adecuado el medio T
4
.

7.3. La utilizacin de sustancias orgnicas complejas como el pltano seda
homogeneizado (40 g/l) y endosperma lquido de coco (100 ml/l), en la
composicin de los medios, promueven una rpida diferenciacin de los
protocormos y el desarrollo vegetativo y radicular de las plntulas.

7.4. En la etapa de desarrollo y enraizamiento, en lo referente a nmero de hojas
y altura de plntula de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, el tratamiento que
nos dio buenos resultados fue el T
4
con resultado de 4 y 12 mm
respectivamente para Cattleya spp., para Oncidium lanceanum 4,5 y 28,3 mm
respectivamente; esto a 24 semanas despus de la siembra.

7.5. En la etapa de desarrollo y enraizamiento, en lo referente a nmero de races
de Cattleya sp. y Oncidium lanceanum, el tratamiento que nos dio buenos
resultados fue el T
4
con 2,5 races en promedio para Cattleya maxima y 2,9
para Oncidium lanceanum, esto a 24 semanas despus de la siembra.

VIII. RECOMENDACIONES

8.1. Emplear herramientas apropiadas para la siembra el cultivo in Vitro de
orqudeas (Cattleya sp. y Oncidium lanceanum) en botellas de wisky, para
evitar contaminacin.

8.2. Utilizar para la produccin masiva de orqudeas de las especies Cattleya sp. y
Oncidium lanceanum el medio de cultivo con la adicin de sustancias
orgnicas complejas como el pltano seda homogenizado y el endospermo
lquido de coco (Tratamiento T
4
).

8.3. Realizar ensayos de propagacin in Vitro de otras especies de orqudeas
utilizando el medio de cultivo casero con la adicin de sustancias orgnicas
complejas como el pltano seda homogenizado y el endospermo lquido de
coco (Tratamiento T
4
).

8.4. Evaluar posteriormente otros agentes gelidificantes que remplacen al agar
agar utilizado para el presente trabajo de investigacin, de esta manera se
estar abaratando ms los costos de la produccin de plantas utilizando el
cultivo in Vitro.

8.5. Continuar con diferentes trabajos de investigacin en especies de orqudeas
en peligro de extincin utilizando el medio de cultivo con pltano seda
homogenizado y endospermo lquido de coco (Tratamiento T
4
).

8.6. El LCTV de la Universidad Nacional de San Martn Tarapoto, debe empezar
a producir orqudeas con miras a la produccin utilizando el medio de cultivo
con pltano seda homogenizado y endospermo lquido de coco (Tratamiento
T
4
).
IX. RESUMEN

El presente trabajo de investigacin se realiz en el Laboratorio de Cultivo de
Tejidos Vegetales de la Universidad Nacional de San Martn - Tarapoto, con el
objetivo de evaluar la eficiencia de cinco medios de cultivo in Vitro para germinacin,
desarrollo y enraizamiento en Cattleya sp. y Oncidium lanceanum a partir de
semillas, para plntulas libres de patgenos y se adecu un diseo completamente
al azar, 5 x 10 (medios de cultivo) y 10 repeticiones.

Las semillas en un promedio de 30 das despus de la siembra en un medio de
germinacin, comenzaron a germinar y empezar su desarrollo y formacin de
protocormos, observando un nivel muy bajo de contaminacin luego de 2 semanas,
esto debido a la asepsia que se manej al momento de la introduccin de semillas a
condiciones in Vitro y en todo momento durante el repique y transferencia de las
plntulas de una medio de germinacin a uno de desarrollo y enraizamiento.

A 24 semanas despus de la siembra en medio de desarrollo y enraizamiento
(Fase II), las plntulas mostraron un resultado promedio de 4 hojas para Cattleya sp.
y 4,5 hojas para Oncidium lanceanum, con una altura en mm de 12,0 para Cattleya
sp. y 28,3 para Oncidium lanceanum; 2,5 races para Cattleya sp. y 2,9 races para
Oncidium lanceanum, estos datos solo para el tratamiento T
4
, que demostr mayor
eficiencia en todo el proceso de propagacin in Vitro de las especies mencionadas.

Se muestra el costo de cada medio de cultivo empleado para el trabajo de
investigacin, los mismos que representan los cinco tratamientos, al mismos tiempo
se determin el costo de produccin de una planta producida en condiciones in Vitro,
con estos datos se muestran que los costos de produccin del cultivo in Vitro de
especies de orqudeas no es tan costoso puesto que con el presente trabajo de
investigacin se demostr que los costos de produccin se puede minimizar
utilizando el medio de cultivo con pltano seda homogenizado y endospermo lquido
de coco (Tratamiento T
4
).

SUMMARY

Present fact-finding work came true in Cultivations Laboratory of Woven Vegetables
of National University San Martin - Tarapoto, for the sake of evaluating the five
means efficiency of cultivation in Vitro in order to germination, I develop and
enraizamiento in Cattleya sp. and Oncidium lanceanum starting from nuts, in order to
free seedlings of pathogenic and a design was made suitable completely at random,
5 x 10 (cultivation means) and 10 repetitions.

The nuts in a 30- days average after the planting in a germination midway, they
began to germinate and beginning his development and protocorms formation,
observing a very low contamination level right after 2 weeks, this due to the asepsis
that in Vitro was driven in a minute of the nuts introduction to conditions and all the
times during the ringing and one seedlings transference halfway of germination of
one accord of development and enraizamiento.

They pointed out a worked out 4 leaves average in order to Cattleya sp. and 4,5 to
24 weeks after the planting in between development and enraizamiento (Phase II),
the seedlings leaves in order to Oncidium lanceanum, with a height in mm of 12,0 in
order to Cattleya sp. and 28,3 in order to Oncidium lanceanum; 2,5 roots in order to
Cattleya sp. and 2,9 roots in order to Oncidium lanceanum, these data alone prop the
treatment T
4
, that principal demonstrated efficiency in all the propagation process
sorts mentioned in Vitro.

He shows the cost out of every midway of cultivation once was used in order to the
fact finding work, the same ones that they represent five treatments, at the same time
the production cost of a manufactured plant in conditions determined in Vitro, with
these data itself species in Vitro of orchids show up than the production costs of the
cultivation he is not so difficult once was put than it was demonstrated that it
happens to me that the production costs can be minimized with the present fact
finding work utilizing the cultivation midway with banana silk homogenizado and
liquid coconut endosperm (Treatment T
4
).

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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5 (4), 256-265.

XI. ANEXOS

Cuadro N30: Anlisis de costos totales de los med ios de cultivos.
costo de medios de cultivo y E Cantidad
precio
unitario
Sub total
Medio germinacin T0 2 17.8398202 35.6796404
Medio desarrollo T0 2 17.9648202 35.9296404
subtotal 207.721119
E consumida por la cmara de flujo Cantidad
precio
unitario
Sub total
subtotal 51.408
E consumida en incubacin meses precio/mes Sub total
E consumida por 2 fluorescentes al mes 9 17.28 155.52
Total de costo de produccin/tratamiento Total
Tratamiento T0 241.241281

Cuadro N 31: Costos de produccin de una planta producida in Vitro.
tratamiento N botellas N plantas costo/planta
T0 10 48 0.502586
T1 10 48 0.43760029
T2 10 48 0.3915892
T3 10 48 0.42879821
T4 10 48 0.39927863

Figura N28: Fertilizante utilizado para la prepar acin de los medios de cultivo.

Figura N 29: Complejo B+Zn, usado como fuente vitamnica de los medios de
cultivo

Figura N 30: Licuadora utilizado para el
homogenizado de pltano seda.

Figura N 31: Botellas de wisky usadas para el trabajo de investigacin.
Figura N 32:

Figura N 32: Diferencia entre los
tratamiento en la primera fase.

Figuras N 33: Desarrollo de plntulas en los tratamientos T
1
y T
2
.

T
4
T
0
T
1
T
2
T
3
Figura 33 a: Desarrollo de plntulas de
Cattleya maxima en el tratamiento T
2
Figura 33 b: Desarrollo de plntulas de
Cattleya maxima en el tratamiento T
1
Figuras N 34: Primer ensayo para la segunda fase en T
4
con Cattleya rex y
Phalaenopsis sp.

Figura N 35: Incubacin de las semillas sembradas en los medios de cultivos.

Figuras N 36: Flor de Cattleya rex y Cattleya maxima.

Figura N 34 a: Cattleya rex en medio de
cultivo de desarrollo T4
Figura N 34 b: Phalaenopsis sp. en medio de
cultivo de desarrollo T4

Figura N 37: Flor de Oncidium lanceanum.
GLOSARIO

ANA cido naftalacetico

AUXNA Hormona vegetal que ocasiona el crecimiento de las plantas por
elongacin celular.

CPSULA Fruto seco, con una o ms cavidades que contienen varias
semillas y cuya dehiscencia se efectan segn el plano que no
es perpendicular al eje del fruto.

CITOQUININA Grupo de reguladores de crecimiento que induce a la formacin
de yemas y multiplicacin celular.

DEHISCENCIA Accin de abrirse naturalmente las anteras de una flor o el
pericarpio de un fruto, para dar salida al polen o a la semilla.

ENRAZAR Agregar, nivelar con agua o solucin.

EMBRIN En las plantas fanergamas, esbozo de la futura planta,
contenido en la semilla.

FENOLIZACIN Coloracin marrn del protocormo por muerte a causa de
formacin de fenoles en el medio de cultivo.

IN VTRO Cultivo en vidrio

INHIBICIN Componente de los sistemas de regulacin, fisiolgicos, que
actan en los seres vivos.

LCTV Laboratorio de Cultivo de tejidos Vegetales

PROTOCORMO Estructura diferenciada formada del desarrollo de las semillas,
para luego formarse una plntula en condiciones in Vitro.

SIMBIOSIS Asociacin de individuos animales o vegetales de diferentes
especies, sobre todo si los simbiontes sacan provecho de la vida
en comn.

STOCK Cantidad de componentes que se tienen en una sola solucin.

TESTA Cubierta externa de la semilla, derivada del tegumento y de
consistencia y dureza variables.

TTZ Trifenil tetrazolium

VITRIFICACIN Hacer que algo adquiera las apariencias del vidrio.

TesisParteIyII Engels

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