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APRESENTAO 1

NTRODUO A TECNOLOGA DE FERMENTAES 2


MCROORGANSMOS DE USO NDUSTRAL 9
ESTERLZAO DE EQUPAMENTO, MEOS DE CULTURA E AR
1
8
CRESCMENTO CELULAR
2
7
CLASSFCAO DOS PROCESSOS
3
7
EMPREGO DE CULTVOS NCADORES STARTERS
4
0
SSTEMAS DE FERMENTAO
4
8
NTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLCA
5
4
SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO 6
SEPARAO DOS PRODUTOS OBTDOS POR FERMENTAO COM LEVEDURAS
7
3
PRODUTOS OBTDOS POR FERMENTAO COM BACTRAS 7
DGESTO ANAERBCA (FERMENTAO METANOGNCA)
7
9
A Biotecnologia um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformao ou
tratamento de materiais de origem biolgica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a
utilizao de organismos vivos ou sistemas biolgicos para a produo industrial e seu uso em
servios de saneamento.
A tendncia atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a
Microbiologia ndustrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de
degradao e sntese. Por semelhana dos conceitos fundamentais que regem o tratamento
biolgico de efluentes, o cultivo de clulas animais e vegetais e a produo de certos
medicamentos. Assim, tambm devido ao seu amplo significado, pode englobar tambm
aspecto igualmente importante da Cincia, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa
forma, os processos de fermentao representa uma elo que liga as
antigas artes de elaborao de alimentos (queijo, vinho,
), mediante o uso de
uma
flora microbiana natural com a moderna industria de fermentao de alimentos que utilizava
cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produo em larga
escala de protenas de organismos unicelulares, produo de antibiticos, produo de clulas
animais e vegetais e a produo compostos qumicos a partir de matrias-primas renovveis
em substituio aos combustveis fsseis, so exemplos de outras reas onde os processos
fermentativos podem ser utilizados.
O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal
estudar alguns elementos essenciais e bsicos dos processos fermentativos: introduo a
microbiologia industrial, sistemas de fermentaes, desenho de fermentadores, cintica de
crescimento, metabolismo microbiano, esterilizao na indstria fementativa, produo de
enzimas, cultivos starters. Objetiva, tambm, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de
fermentao: alcolica, lctica, actica, metanognica.
ntroduo biotecnologia de alimentos
O termo Fermentao deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas
devido a produo de dixido de carbono pela ao das leveduras sobre o extrato de frutas ou
gros de malte;
Significado bioqumico: relata a gerao de energia pelo catabolismo de compostos
orgnicos; Produo de vinho: 10.0 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma
poca e as bebidas alcolicas destiladas surgiram a mais de 10.0 a.C. na China;
Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egpcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, aps
estrusavam e amassavam os gros lavando-os aps para obter a bebida, ainda, utilizavam as
leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pes; Leite e derivados lcteos:
dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estmago de
terneiros jovens coagulava-se (ao enzimtica);
Produtos crneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem j sabia que a
carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne
era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradvel
Este produto foi o precursor da lingia fermentada produzida atualmente. O nome salame
provm da cidade de Salamis, destruda a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha
Grega de Cypros.
Exame microscpico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440
a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se
uma pureza maior nos sedimentos mais recentes.
A necessidade de preservar a carne da caa e de animais domsticos abatidos durante o
inverno e consumidos no vero (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse
solues para a preservao do produto.
1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida
Assim, os produtos crneos fermentados tornaram-se de grande importncia no mercado
alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma caractersticos da
tecnologia usada. Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscpio, foi o
primeiro a examinar em 1856-1857: Louis Pasteur, aps investigaes detalhadas sobre as
leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o
acar em etanol e CO2 quando em anaerobiose.
Pateur tambm observou muitas outras fermentaes: Ex.: observou provavelmente um
Penicillium que fermentava D-tartarato de amnio em uma mistura racmica de D e L-tartarato
(tartarato de Na, K); Observou tambm como uns microrganismos cilndricos produziam
cido butrico somente em condies anaerbias e investigou a produo de cido actico por
fermentao; 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de
um microrganismo frente a outros e previram suas aplicaes teraputicas;
ntroduo biotecnologia de alimentos
1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu tcnicas de cultivo puro assim como outros
mtodos bacteriolgicos clssicos utilizados at hoje; Dois elementos vitais deram inicio a
era moderna da tecnologia de fermentaes industriais: Emprego de fungos e leveduras na
modificao de alimentos e bebidas e os estudos microbiolgicos pioneiros de Pasteur e Kock.
Desenvolvimento de fermentaes em superfcie ou semi-slidas surgiu com o
desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegaes; Capacidade
hidroltica de determinados fungos em hidrolisar o amido e protenas na produo de molho de
soja, este foi o inicio das fermentaes industriais. Cultivo de algas e fungos deu inicio ao
processo industrial de obteno de protenas alimentcias microbianas (SCP - protenas de
organismos unicelulares) e de inculos de microrganismos Produo de vinagre e os estudos
de Pasteur sobre a produo de cidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de
fermentaes que produzissem cidos orgnicos; O desenvolvimento da metodologia de
cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de tcnicas que permitiram estudar as
aplicaes industriais de espcies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos
puros, meios esterilizados e condies asspticas nas fermentaes industriais.
Fermentao de po, queijo e cerveja bem como bebidas alcolicas desenvolveram-se para
satisfazer as exigncias comerciais modernas de produo em grande escala, com qualidade
elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Produo de cultivos
"Starters para produtos lcteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficincia
dos processos, assim como a automao e controle da qualidade na produo de po e
produtos lcteos. Fermentao de po em temperaturas mais elevadas e com maior
quantidade de inoculo;
Uso de amilases microbianas na produo de acares fermentescveis a partir de gros de
amido, proporcionando acares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a
massa de po e produzir textura caracterstica).
Tcnicas de Pasteurizao: permitiram a produo de cerveja em escala industrial fazendo
com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes
complexos produzindo em grande escala.
Tcnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos)
Controle da velocidade de inoculao; Viabilidade e condies de armazenamento das
leveduras; Controle das condies de oxignio dissolvido; Controle da concentrao de
Nitrognio solvel e de acares fermentescveis no lcool; Controle da temperatura do
processo; Fermentao em processos contnuos;
ntroduo biotecnologia de alimentos
ntroduo de inovaes tecnolgicas como: Obteno de cerveja com elevadas
concentraes de mosto; Emprego de cereais no malteados e enzimas microbianas
Produo de cervejas com baixos nveis de carboidratos Aplicao de tcnicas genticas
convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar caractersticas indesejveis.
LEVEDURAS DE PANFCAO Sculo XV os padeiros obtinham suas leveduras nas
cervejarias locais;
Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentao variveis, foram gradualmente
sendo substitudas por leveduras procedentes de fbricas de bebidas alcolicas.
1781 obtm-se as primeiras leveduras de panificao prensadas, obtidas atravs do
processo
"Holands e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado "Viena
Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matria-prima e
30% de lcool. 1879-1919 - avanos substanciais nos processos fermentativos com uso de
biomassa permitindo a obteno industrial de leveduras para panificao de forma
independente de bebidas alcolicas; 1879 - Marquardt introduziu a aerao no processo
fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produo de lcool a
20%.
Adio gradual de acar Surge o primeiro processo de retro-alimentao
Permite elevar a eficincia do processo ate prximo do mximo terico sem a formao
conjunta de lcool.
Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produo de leveduras de
panificao usando melao (todo resduo dos processos industriais da poca) como substrato,
com a finalidade de produzir protena para o consumo humano - Primeiro processo moderno
para produo de SCP.
Durante a Segunda Guerra Mundial, tambm na Alemanha, inicia-se a produo de SCP para
consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melao procedente da produo
de papel e polpa de celulose, obtendo-se os acares (substrato) a partir da hidrlise cida da
madeira. USA, Sua, Taiwan e Rssia passam tambm a utilizar este processo.
CDOS ORGNCOS 1881 inicia-se a produo comercial de cidos orgnicos sendo que
at hoje 50% do cido lctico utilizado a nvel industrial produzido via fermentao usando
Lactobacil1us delbrueckii.
ntroduo biotecnologia de alimentos
cido Ctrico extrado inicialmente a partir do suco de limo e posteriormente sintetizado a
partir do glicerol.
1923 - inicia-se a produo de Citrato via fermentao industrial, atualmente estima-se uma
demanda aproximada de 450.0 toneladas/ms produzidas exclusivamente por fermentao,
inicialmente: Empregava-se cultivo em superfcie de Aspergilius niger como organismo
produtor (citrato).
Aps a 2 Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977
desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente.
Outros cidos orgnicos so produzidos de forma econmica e rentvel por fermentao:
Ex.: produo de Acido Glucnico e Acido Actico, este obtido pela oxidao do etanol
utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o cido Actico em escala industrial produzido
somente por via qumica.
LCOOL E CETONAS Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar
azeites vegetais utilizados na produo de glicerol, componente para produo de explosivos,
desenvolve a primeiro processo fermentativo de produo de glicerol, produzido por leveduras
a partir do etanol em presena de bissulfito de sdio; Durante a Primeira Guerra na nglaterra
desenvolvido o processo de fermentao acetonabutanol por via anaerbia, utilizando
Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava
mtodos de cultivos puros para prevenir a contaminao. Aps a Guerra a demanda deste
produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentao at
os anos 50, sendo substitudo pelo n-butanol produzido a partir do petrleo, cujo preo era mais
baixo que o preo do amido e dos substratos a base de acar utilizados no processo
fermentativo. 1941 - nicia-se a implementao da indstria da fermentao alcolica nos
USA, aps revogarse a proibio da produo de lcool por bioprocessos, sendo responsvel
ento por 7% do lcool industrial produzido
1973 - A crise do petrleo faz surgir projetos para produo de combustveis alternativos.
Surge o PROLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhes de gales
de etanol/ano, a partir da cana-de-acar. Nos USA inicia-se o "Gasohol Program que
destinava-se a produzir lcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este
projeto fez surgir um nmero muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala
utilizando processos contnuos e descontnuos.
Glutamato Monosdico e a Lisina so os que se produzem em maiores quantidades, cerca de
500.0 e 80.0 toneladas/ms, respectivamente.
A produo de aminocidos resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos
bioqumicos que regulam a biosntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se
superprodues a partir de mutaes e do controle do processo de fermentao.
ntroduo biotecnologia de alimentos
As novas tcnicas passam a: Estimular as clulas para que usem substratos alternativos;
Preveno ou impedimento de reaes laterais; nduo e ativao de enzimas biosintticas;
Reduo ou inibio de atividades enzimticas que poderiam degradar o produto e,
finalmente facilitar a excreo do aminocido pelo microrganismo. As pesquisas que
culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentao para produo de cido
glutmico foram as responsveis pelo grande avano na produo de aminocidos por
fermentao.
Hoje a maioria dos aminocidos comerciais so produzidos por fermentao. Assim como a
de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor.
BOPOLMEROS Goma Xantana - biopolmero mais importante atualmente em funo do
volume de produo, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspenses. Produzido por
fermentao utilizando a bactria Xanthomonas campestris. Outras gomas:
Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Pululano produzido pelo Aureobasidium
pullulans; Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Gelano produzido pela
Pseudomonas elodea
Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando
problemas nos processos de mistura, transferncia de massa e calor em fermentadores. Estes
aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de
fermentao.
POLHDROXBUTRATO (PHB) : polister termoplstico acumulado intracelularmente em
alguns tipos de bactrias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus,
entre outras) at um nvel de 80% da massa seca celular, sua produo permite a fabricao
de plsticos biodegradveis.
A maioria das vitaminas produzida por mtodos qumicos. Entretanto algumas vitaminas
podem ser produzidas por fermentao. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina,
cido flico, cido pantotnico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina.
A sntese qumica da vitamina B12 muito complexa sendo que sua produo comercial s
vivel por via fermentativa utilizando Pseudomonas.
Riboflavina: sua produo por fermentao compete eficazmente com os mtodos de sntese
e semi-sntese, sendo que 30% da demanda mundial produzida por fermentao.
ntroduo biotecnologia de alimentos
Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de
produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentao, perodo muito inferior aos 5 dias
necessrios quando se utiliza Ascomycetes.
Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que
poderiam ter efeito teraputico. 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum,
contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactrias, identificando o
ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactrias. Aps a penicilina ter sido isolada
na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade
antibacteriana desenvolvendo-se ento um processo fermentativo comercial para sua
produo. Este fato marcou o incio da indstria de antibiticos. Seguiu-se ento a
descoberta de
Estreptomicina a partir de espcies de Streptomyces Cefalosporinas a partir de
Cephalosporium acremonium
Com o desenvolvimento a partir de 1940 de tcnicas de gentica microbiana que implicaram
em tcnicas de mutao e seleo de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento
da produo de penicilina de poucas mg/L para at 20g/L de cultivo.
niciam-se tambm, nesta poca, os estudos sobre a produo de metablitos secundrios,
pequenas molculas como os antibiticos que no tm papel importante no crescimento e
manuteno das clulas.
O uso de microrganismo, o domnio das tcnicas microbiolgicas e fermentativas permitiu fazer
transformaes enzimticas altamente seletivas e especificas, representando um grande
avano na produo de frmacos, como os hormnios esterides. 1940 - descobriu-se que a
cortisona, esteride secretado pela glndula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite
reumtica, o que fez desenvolver-se um processo de sntese qumica para sua produo que
requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g;
1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona,
produzindo 11-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da sntese de cortisona casse
para 1 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g.
1980 - ntroduziram-se modificaes no processo e os custos foram diminuindo
gradativamente de forma que hoje estes custos esto prximos de U$ 0,46/g.
Tcnicas semelhantes de biotransformao microbiana permitiram a sntese de outros
esterides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros frmacos
importantes na medicina.
ntroduo biotecnologia de alimentos
ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATVO 1) Formulao do meio de cultura a ser usado no
processo; 2) Esterilizao do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3)
Produo de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador;
4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condies timas para a formao do
produto 5) Extrao do produto e sua purificao; 6) Disposio dos efluentes produzidos no
processo.
v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho
)
;
v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente
)
;
v Leite fermentado (iogurte, queijo
)
;
v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase
)
;
REAS DE APLCAO DA FERMENTACO NDUSTRAL A) ALMENTOS v Massas
fermentadas (po, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingia); v Condimentos
(vinagre, glutamato...) v Aminocidos (lisina, cido glutmico); v Polissacardeos (dextrano)
B) PRODUTOS AGRONDUSTRAS v lcool (industrial e carburante); v Antibiticos de uso
veterinrio; v Biogs; v Hormnios de crescimento vegetal.
C) MEDCAMENTOS v Antibiticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormnios de consumo humano
(insulina); v Aminocidos.
D) CDOS ORGNCOS E SOLVENTES v cido ctrico; v cido actico; v Etanol; v Propanol;
v Butanol; v cido lctico.
Microbiologia industrial
As relaes existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos so muito
importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reaes
qumicas especificas.
As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimtica pode convenientemente ser
manipulada em bio-reatores apropriados.
Por outro lado as clulas microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte
slido, atuam como catalizadores que levam a reaes qumicas concretas, da mesma maneira
que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo.
Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentaes se refere ao cultivo de
microrganismos em grande escala.
A seleo e aplicao dos princpios da engenharia gentica aplicada a microrganismos
apropriados permitem manipular o contedo enzimtico destes em determinadas condies.
Tambm o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocar a induo
da enzima necessria para a degradao desse substrato de crescimento dentro da clula. Ex.:
o cultivo de levedura sobre maltose induzir a biossntese da enzima maltase, (uma
glucosidase) que degrada maltose a glicose, que necessria para a produo de energia
qumica em forma de ATP dentro da levedura.
MCROORGANSMOS DE USO NDUSTRAL ntroduo Os produtos comercialmente
importantes das fermentaes industriais so de 4 categorias: clulas microbianas, molculas
grandes como enzimas e polissacardeos, produtos bsicos e metablitos secundrios que no
so necessrios para o crescimento celular. A produo comercial dos produtos de
fermentao tem utilizado principalmente diversas espcies de bactrias, leveduras e fungos,
ainda que os avanos recentes no desenvolvimento de tcnicas de cultivos tm permitido
utilizar clulas mais complexas nos processos de fermentao.
Microrganismos ndustriais Na natureza existem duas classes principais de clulas, ambas
utilizadas nos processo de fermentao industrial: procariontes - clulas bacterianas;
eucariontes -leveduras, fungos, clulas animais e vegetais.
Os microrganismos tambm se diferenciam em funo de suas exigncias de oxignio,
podendo dividir-se em estritamente aerbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos
filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presena de O2 e os estritamente
anaerbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausncia de O2 e os
microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em
situao de aerobiose e anaerobiose.
As bactrias utilizadas nos processos fermentativos so principalmente quimiorganotrficos,
isto , podem obter sua energia e seu carbono por oxidao dos compostos orgnicos. As
bactrias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em funo de suas resposta a
colorao de Gram. A reproduo se d por diviso assexuada. Os esporos so produzidos
usualmente em resposta
Microbiologia industrial
Prof. Raul Vicenzi 10 as condies adversas do meio, porque so mais resistentes ao calor e
aos compostos txicos que as clulas vegetativas e posteriormente germinam em condies
apropriadas. As bactrias so desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos
fotossintticos
Os fungos (bolores) tambm so quimiorganotrficos e os mais importantes utilizados nas
fermentaes se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos
gneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gneros Thicotherma,
Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos so desprovidos de clorofila ou
outros pigmentos fotossintticos. Sua reproduo pode ser assexuada (esporulao) ou
sexuada.
As leveduras so fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada
(por gemao ou diviso binria) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos
fementativos industriais a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produo de lcool
e nas panificaes. Esta levedura no degrada a lactose, por isso para produzir lcool e
biomassa a partir de soro de leite utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas
necessrias para degradar lactose. Outras leveduras importantes so: Candida utilis e
Endomycopsis fibuliger
Os vrus no tm estrutura celular alguma, possui o material gentico (DNA ou RNA) contido
por uma camada de protena. No possuem atividade metablica e, portanto, no sintetizam
protoplasma nem crescem. Em conseqncia disto sua multiplicao no pode ser feita por um
processo de diviso, como nos microrganismos celulares. Novos vrus so "produzidos pelas
clulas nas quais penetram, de acordo com as informaes contidas no seu cido nuclico.
So agentes submicroscpicos que infecta as plantas, animais e bactrias. Os vrus
bacterianos (bacterifagos) infectam os processos de fermentao de cepas microbianas e
causa srios problemas, particularmente nos cultivos "starter utilizados no processamento de
alimentos.
Clulas animais e clulas vegetais tambm podem ser utilizadas nos processos fermentativos
industriais, principalmente para a produo de antibiticos e hormnios vegetais. Necessitam
de um meio muito nutritivo e so sensveis a flutuaes de fatores externos como temperatura,
pH, O2 e CO2 dissolvidos.
Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos so as mesmas de todos os
seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes
de energia e fonte de material plstico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos
nutritivos: a) os vegetais so fotossintticos (obtm energia da luz solar) e autotrficos, se
nutrem exclusivamente de substncias inorgnicas; b) os animais so quimiotrficos, pois
obtm energia as custas de reaes qumicas e heterotrficos, por exigirem fontes orgnicas
de carbono. Entre os microrganismos h uma grande variedade de tipos intermedirios.
FONTES DE ENERGA a) Algumas bactrias realizam fotossntese, porm no produzem
oxignio. Podem utilizar fontes inorgnicas (liotrficas) ou compostos orgnicos
(organotrficas) como doadores de eltrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das
bactrias so quimiossintticas, obtendo energia as
Microbiologia industrial
Prof. Raul Vicenzi 1 custas de reaes qumicas, nas quais substratos adequados so
oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgnicos (litotrficos)
ou orgnicos (organotrficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactrias, como por
exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo cido sulfrico, podem ser
utilizados na lixiviao de metais, como cobre e urnio. A grande maioria das bactrias e a
totalidade de fungos, leveduras e, tambm, os protozorios so quimiorganotrficos.
Para os autotrficos a nica fonte de carbono necessria o CO2. Para os heterotrficos, h
necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintticas:
Quanto s necessidades de nitrognio h trs categorias principais de microrganismos:
Alguns microrganismos, especialmente bactrias, retiram o nitrognio diretamente da
atmosfera e o converte em nitrognio orgnico. Muitos fungos e quase totalidade das bactrias
utilizam compostos inorgnicos de nitrognio, como amnio e nitratos. Algumas bactrias
exigem fontes orgnicas de nitrognio. De um modo geral, adicionar aminocidos ou
hidrolisados de protenas favorece o crescimento da maioria dos heterotrficos. o Sais de
Amnio, Sais (nitratos); Uria o Lquido da macerao do milho ( 4% N); o Extrato de levedura
e Peptonas (laboratrio) o Ar atmosfrico
o Micronutrientes Cu, Zn, Co, B,
ONS NORGNCOS ESSENCAS Alm de nitrognio, os microrganismos exigem uma srie
de outros elementos, sob a forma de compostos inorgnicos, alguns em quantidade bem
maiores que outros. o Macronutrientes P, S, K, Mg, Ca, Fe FATORES DE CRESCMENTO
So os compostos orgnicos indispensveis a um determinado microorganismo, que ele no
consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo
possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminocidos,
nucleotdios, cidos graxos, entre outros.
Aspecto importante dessa exigncia resulta do fato que, quando um microrganismo exige um
determinado fator, seu crescimento ser limitado pela quantidade desse fator presente no meio.
Microbiologia industrial
Prof. Raul Vicenzi 12
Dentro de certos limites, o crescimento ser proporcional ao teor do composto limitante. sso
permite a elaborao de um mtodo de dosagem de certos compostos, baseados na medida
do crescimento microbiano. Essa a base da dosagem microbiana de uma srie de
substncias, principalmente aminocidos e vitaminas.
A gua no constitui um nutriente, mas absolutamente indispensvel para o crescimento dos
microrganismos. Seu papel mltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de
substncias em soluo atravs da membrana citoplasmtica. Exerce funo na regulao da
presso osmtica e regulao trmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente
pela dessecao, a no ser quando esta precedida pelo congelamento brusco (liofilizao)
Como a gua o oxignio no um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrognio
nos processos de respirao aerbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em
presena de O2 livre: Aerbios exigem oxignio livre; alguns, porm, em pequenas
quantidades no tolerando as presses normais de O2 atmosfrico; Anaerbios no toleram
a presena de O2 livre;
Facultativos crescem na presena ou ausncia de O2. Entre as bactrias encontra-se os trs
tipos de comportamento. Os fungos (bolores) so estritamente aerbios, enquanto as leveduras
so aerbias ou facultativas.
CLASSFCAO DOS MOSTOS SNTTCO: composio conhecida quantitativamente e
qualitativamente usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma
fermentao. O objetivo saber a rota de fermentao, saber quanto e quando e quais os
substratos que esto sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo.
COMPLEXO: composio no bem definida, esto enquadrados os meios naturais tais como:
caldo de cana, melao, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos
naturais.
CARACTERSTCAS DO MOSTO Requerimentos bsicos: 1) Proporcionar o mximo
rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a mxima
concentrao de biomassa ou produto; 3) Permitir o mximo rendimento na formao do
produto; 4) Produzir o mnimo de subprodutos indesejveis; 5) Ser de uma qualidade
permanente e estar disponvel durante o ano todo 6) No sofrer degradao durante a
esterilizao 7) No dever causar problemas em outras etapas do processo fermentativo
particularmente: aerao, agitao, extrao, purificao e tratamentos dos efluentes.
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SUBSTRATOS UTLZADOS NA FERMENTAO ALCOLCA a) Aucaradas: neste grupo
temos as diretamente fermentescveis (contm monossacardeos: Ex.: glicose, frutose, suco de
uva, ma, pra, etc.).
Principal substrato um monossacardeo (glicose) e este metabolizado diretamente at
piruvato.
As matrias-primas indiretamente fermentescveis so aquelas que contm dissacardeos,
predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-acar e melao.
A composio do melao de cana-de-acar varia em funo de fatores como: qualidade da
matria-prima (variedade, idade, sanidade, maturao, queimada ou no, etc); mtodos de
extrao do acar (moagem, clarificao, cozimento, etc);
condies tcnicas das regies aucareiras;
condies e tempo de armazenamento. b) Amilceas: contm em sua composio
polissacardeos (amido) utilizada para produo de vodka, rum, whisky (tem que sofrer
sacarificao).
a) Melao: deve sofrer uma preparao prvia (de 82 Brix
18 -20
Brix)
B
M - b = Quantidade de melao em peso d = volume
litros)
PREPARO DA MATRA-PRMA CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para
calcular os volumes para diluio do melao.
b
B - M = Quantidade de gua em peso d = volume
(litros)
M B = Brix do melao b = Brix da gua (zero) M = Brix desejado (18 20) d = densidade
Ex.: melao: 80 Brix gua; 0 Brix M = 20 Brix dmelao = 1,6284 dgua = 1,0
1,6284
20
0
80 20 = 60 kg de gua = 60
litros
80 20 0 = 20 Kg melao = 12,31 Litros 1,0
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No tanque de diluio controla-se: pH: entre 4,5 5,5 Nutrientes: Sulfato de amnio (1 g/L);
fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimtico} b) Caldo de cana-de-acar: no
necessita diluio pois a cana sofre adio de gua por asperso na moenda para extrao do
acar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20
D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada Brix
desejado
Ex.: Brix do caldo = 20
Volume = 50.0 L Brix desejado = 16
1
6
D = 20 x 50.0 50.0 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16 Brix Aps fazer a diluio
corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando cido sulfrico, ctrico ou ainda suco de limo (caseiro) e
colocam-se os nutrientes.
1) Preparo do mosto: a) Determinao de slidos solveis por refratometria - Para cada grau
acima de 20 C subtrai-se 0,06 por grau;
Ex.: 20 Brix a 25C
5 x 0,06 = 0,3 20 Brix 0,3 = 19,7
Brix
20 Brix a 15C
5 x 0,06 = 0,3 20 Brix + 0,3 = 20,3
Brix
100 g melao
-------- 76 g
SST
Um mosto inicialmente com 76 Brix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. X g
--------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL
Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de gua
RELACO ENTRE DFERENTES GRAUS DE MEDDA. 1 Brix corresponde a 0,54 Baum 1
Baum corresponde a 1,8 Brix 1 Brix corresponde a 0,85 Babo BRX = % de slidos
solveis existentes em uma soluo de sacarose quimicamente pura.
Fermentadores
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O corao de qualquer processo fermentativo sem dvida o fermentador. Uma definio
funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantm
um ambiente favorvel para que se desenvolva um determinado processo biolgico.
A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de ao inoxidvel
brilhante e com uma instrumentao muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores
industriais so assim, outros importantes processos biolgicos industriais, desenvolvidos em
grande escala, so conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados.
Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora
para processos cujas condies so muito sensveis ser necessrio um sistema fechado e
muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorvel.
As condies ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob trs
aspectos diferentes: condies biolgicas, qumicas e fsicas.
Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questo encontram-se
presentes, enquanto que os no produtivos, destrutivos ou no desejveis estejam excludos
do processo. Do ponto de vista de produo importante tambm que os microrganismos
desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a
um ritmo rentvel.
Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema assptico. A
assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos,
diz-se ento esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o
microrganismo desejado denomina-se inoculao.
mplica na composio do meio de crescimento microbiano, que dever conter as
concentraes adequadas de substratos ou nutrientes microbiolgicos, assim como dos
precursores sintticos, livres de substncias inibidoras e mantidas a um pH adequado.
Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle muito importante
quando se projeta um fermentador.
Este parmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condies ao longo da
fermentao, exigem um bom sistema de agitao, o que pode provocar por sua vez a ruptura
dos organismos e de seus agregados.
Quando se mantm um ambiente favorvel os parmetros ambientais no tm que
necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.
Fermentadores
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Fermentao por batelada - caractersticas: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes
condies timas; v Fermentao parece estar programada de acordo com a disponibilidade de
nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apaream de acordo com
estas trocas as sucessivas fases de crescimento
PRNCPAS TPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes
grupos:
v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos esto imersos no meio
de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes lquidos. O fermentador mais simples
consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio lquido.
Estes fermentadores forma utilizados de gerao em gerao com muito xito na indstria
cervejeira j que ao formar-se na fase anaerbica da fermentao, uma capa de espuma que
contm
CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a
temperatura durante a fermentao se pode colocar tubos refrigerantes. So muito utilizados
no tratamento biolgico de guas residuais em fluxo lento, onde a superfcie do lquido permite
que se dissolva o
O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitao do lquido que
aumenta a transferncia de gases e mantm a homogeneidade. Nos sistemas anaerbios os
prprios gases da fermentao podem proporcionar a agitao, atravs do desenho do
fermentador (cnico/cerveja) ou por meio mecnico (bombas de recirculao).
v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se
desenvolve sob forma de uma lmina ou capa disposta sobre uma superfcie que est em
contato com o meio nutritivo. Em laboratrios se utiliza o "cultivo em superfcie (placas).
nicialmente a produo de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma
incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfcie na fermentao do cido ctrico
(Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfcie com um meio adequado contendo melao
em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes temperatura constante e com
circulao de ar freqente. Tambm e pode desenvolver pelculas microbianas sobre uma
superfcie de meio slida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plstico
particulado, lminas de plstico onduladas, atravs dos quais se faz passar o meio lquido
sobre a capa de microbiana da superfcie.
v Na prtica, porm, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso tambm aparece uma capa
sobre a superfcie do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de
microrganismos dispersos no meio de cultivo.
Fermentadores
Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de
recuperao do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo:
Esterilizado
r
Refrigerao
Com ou sem ruptura celular
Formulao
Armazena,mento de
Matrias-primas
nculo Volume: 1 a 2 litros
Preparao de Meios
Fermentador de produo
Tanque de Semeadura
(p-de-cuba)
Separao de clulas
Etapas de Recuperao do
Produto
Envasamento e Armazenamento
Tratamento de Efluentes
Utilizao de Subprodutos
- gua - ar
- vapor
gua do
Processo Ar Estril Vapor Energia nculo
Preparado
Esterilizao na indstria fermentativa
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ntroduo
A esterilizao implica a destruio, inativao ou remoo de toda forma de vida microbiana.
sso quer dizer que a esterilizao provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da
capacidade de reproduo no ambiente considerado. No implica, entretanto, a inativao total
das enzimas celulares, toxinas, etc.
Antes de entrarmos na discusso dos mtodos, conveniente fazermos algumas
consideraes em torno dos mecanismos de esterilizao e das caractersticas das populaes
microbianas.
O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilizao empregado. O efeito final,
entretanto, o mesmo. Deve ocorrer a destruio e/ou inativao da(s) enzimaas) envolvida(s)
em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante
bloqueie uma reao enzimtica essencial ou destrua uma molcula vital. Na prtica,
entretanto, agentes com ao to especifica no encontram aplicao como esterilizantes, por
vrios motivos: A heterogeneidade da populao microbiana; a possibilidade da existncia de
microrganismos com capacidade de utilizar outras "rotas metablicas para vencer o bloqueio
estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito especfico; etc., podem ser
mencionados como fatores que justificam a utilizao de agentes capazes de atingir o
microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecfico. Principalmente no caso da
esterilizao de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar
generalizadamente a clula, em vez de se procurar um ponto especfico de sua estrutura
metablica.
Outra considerao importante, no caso da esterilizao de equipamentos, a cessao do
efeito esterilizante no final do processo de esterilizao. Em outras palavras, o agente ou
condio esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilizao.
Terminada a esterilizao, no deve haver ao residual. No caso de fermentao industrial,
por exemplo, uma possvel ao residual pode ser to ou mais prejudicial que a presena de
certos contaminantes. Essas consideraes ajudam a apontar os processos fsicos como os
mtodos de escolha na esterilizao de equipamentos. MTODOS DE ESTERLZAO
Fsicos Qumicos
Calor: - Seco: Flambagem ; ar quente
- mido: vapor fluente, vapor sob presso; tindalizao.
Radiao: - Ultravioleta
- onizantes (RX e ) Filtrao : Membranas
Lquidos, Gases e vapores
Esterilizantes gasosos: xido de etileno (mais eficiente que os demais; utilizado em cmaras
de esterilizao) Formaldedo mais comum -propiolactona- carcinogncia cido peractico
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A escolha do mtodo depende das caractersticas dos produtos a serem esterilizado e do custo
do processo.
Quando se usa agentes qumicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a
temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto
Se bem que os mtodos usuais de esterilizao tenham uma ao generalizada sobre a clula,
o mecanismo pelo qual isso conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do
calor, sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruio dos microrganismos
pelo calor seco no o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor.
Exceto em casos em que haja uma destruio fsica do microrganismo, como o caso da
flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilizao no est bem
elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolizao da clula so
aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuao de foras osmticas.
A adsoro de corantes pelas clulas, a incapacidade de reproduo e, no caso de
microrganismos mveis e a perda da motilidade, so caractersticas que auxiliam na
constatao da perda de viabilidade de clulas individuais.
Enquanto que a inativao pelo calor seco , essencialmente, um processo oxidativo, o uso de
vapor causa uma coagulao das protenas celulares com prejuzo para a organizao
estrutural do microrganismo, afetando a sua competncia fisiolgica.
TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destruir esporos bacterianos
de fermentao simples em meio com concentrao inicial de 1,6 x 105 esporos/mL
Tempo de esterilizao corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela
temperatura especfica e no ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de
aquecimento e resfriamento.
Alm das estruturas primria, secundria e terciria, as molculas de protena podem ser
constitudas por mais de uma cadeia de polipeptdios. A conformao estrutural da molcula
protica
Esterilizao na indstria fermentativa
Prof. Raul Vicenzi 20 estabilizada por ligaes covalentes e no-covalentes. Essas ligaes
reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptdicas, garantindo sua disposio de uma forma
ordenada, compacta e, conseqentemente, de baixa entropia, em vez de uma associao ao
acaso. Entre as ligaes covalentes, o tipo de ocorrncia mais geral a ligao dissulfeto As
ligaes no-covalentes podem ser pontes de hidrognio, ligaes hidrofbicas e inicas. As
ligaes hidrofbicas so as que mais contribuem para a estabilizao da estrutura protica,
pois de um modo geral, 40% dos resduos de aminocidos de uma protena possuem
ramificaes no-polares.
Uma alterao estrutural da molcula de protena , normalmente, acompanhada de uma perda
de atividade biolgica, pois a ao de enzimas pode ser explicada por uma perturbao
conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima.
Considerando-se que as clulas de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60%
de seu peso seco em protenas, e considerando-se, ainda, as funes metablicas e/ou
estruturais desempenhadas por essas protenas na clula microbiana, pode-se perceber, com
facilidade, o efeito que agentes ou condies capazes de desorganizar estruturalmente as
protenas podero exercer sobre a clula.
Se, de um lado, agentes que atuam sobre as protenas so capazes de comprometer
diretamente a competncia fisiolgica, agentes capazes de causar alteraes no material
gentico do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutaes letais. Donde a
possibilidade de se utilizarem, na esterilizao, substncias ou condies que apresentem
maior afinidade pelo cido desoxirribonuclico (DNA).
- Agentes qumicos como propionolactona, cido nitroso, etc., agem sobre o material gentico
das clulas, causando alteraes que tero conseqncias sobre as caractersticas fisiolgicas
do microrganismo. - Radiaes Fazendo-se incidir uma radiao sobre microrganismos, os
componentes celulares podero absorver energia radiante. O efeito letal das radiaes uma
demonstrao da presena, na clula viva, de molculas capazes de absorvera energia
radiante. Protenas e cidos nuclicos, constituintes essenciais da matria viva possuem
estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alteraes fotoqumicas que
ocorrem, em virtude da absoro de luz ultravioleta, so muito prejudiciais s clulas.
Ao tratar de esterilizao, temos de levar em conta, tambm, as caractersticas dos
microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no
equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram
for um meio que no as abrigue e proteja da ao do agente esterilizante, e mais ainda, se
pudermos estar certos de que o agente esterilizante ser capaz de atuar sobre as clulas
microbianas em condies favorveis e por tempo suficiente, ento o problema de esterilizao
ser relativamente simples.
Esterilizao na indstria fermentativa
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FGURA 1 - Esterilizao de um meio de cultura em autoclave a 121 C por 20 minutos. O
tempo total de esterilizao 100 minutos.
CALOR SECO calor seco mata os microrganismos por oxidao dos componentes celulares.
O ar seco no um bom condutor de calor e sua ao no to enrgica quanto a do vapor.
Por esse motivo necessrio uma temperatura e tempo maiores de esterilizao. o emprego
do calor seco ou ar quente, recomendado quando o contato direto ou completo do vapor
sobre presso com o material indesejvel ou improvvel, que o caso de vidraria, leos, ps
e substncias similares.
A esterilizao pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma
temperatura tal que, durante o perodo de aquecimento, haja inativao dos microrganismos
presentes.
A maior resistncia demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um
endurecimento da camada mais externa da clula por meio de coagulao das protemas,
dificultando a penetrao do calor no interior da clula propriamente dita e ulterior coagulao
das protenas plasmticas. Devido muito menor capacidade de penetrao do calor seco,
necessrio aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais
prolongado, o que torna esse mtodo inadequado quando materiais como papel, algodo,
plsticos, etc., esto presentes.
Populaes homogneas de esporos apresentam uma relao linear de inativao com relao
ao tempo de exposio a 125 C. A no-linearidade que ocorre com populaes naturais, pode
ser atribuda a uma heterogeneidade da populao. As relaes no-lineares obtidas com
populaes naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com
resistncias trmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populaes. Alis, essa
heterogeneidade das populaes
Esterilizao na indstria fermentativa
Prof. Raul Vicenzi 2 naturais pode ser devida no s presena de esporos de espcies
diferentes como tambm a diferentes graus de resistncia trmica entre esporos de uma
mesma espcie. A temperatura empregada tem sido 125 C e comum cotar-se a resistncia
trmica de um microrganismo em relao ao D125. A desorganizao molecular que ocorre
nas clulas, devido exposio a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos:
a) ativao direta das molculas pela energia trmica, com alterao conformacional por
quebra de ligaes intramoleculares e interveno subseqente de outras molculas; b) reao
de molculas complexas com oxignio, gua ou vapor de gua (no caso de esterilizao pelo
calor mido).
A exigncia bsica da esterilizao pelo calor seco que todo o material seja sujeito
temperatura esterilizante. As nicas causas possveis de fracasso na esterilizao so o
controle defeituoso da temperatura; a no penetrao do calor; e a presena de
microrganismos com resistncia trmica superior esperada.
CALOR MDO calor mido mata os microrganismos por desnaturao protica, ou seja:
pela coagulao das protenas e enzimas celulares, e tambm a fuso dos lipdeos da
membrana celular; quanto maior a temperatura menor o tempo necessrio; Para destruir
esporos temos que submeter este vapor de gua a uma presso positiva para alcanarmos as
temperaturas de trabalho;
Sempre que possvel usa-se vapor para a esterilizao, pelo seu alto contedo de calor por
unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e
controlvel; por ser de fcil produo e distribuio; e porque, mesmo sendo de aquecimento
rpido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser
controladas. TABELA 2 - Relao entre a presso de vapor de gua em diferentes presses
Obs.: - Para assegurar a temperatura pela presso de trabalho precisamos ter certeza de que
todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar no bom condutor de calor, logo o calor no
penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma presso
inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma presso. Causas da inativao trmica de
bactrias pelo calor mido
Os mecanismos propostos para explicar a influncia letal do calor mido sobre as bactrias
so: (a) coagulao de protenas; (b) inativao de enzimas; (c) desorganizao dos lipdeos
celulares; (d) desorganizao do aparelho gentico; (e) ruptura do RNA.
Esterilizao na indstria fermentativa
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A morte das clulas expostas ao calor exponencial. A base bioqumica desse fenmeno
difcil de ser explicada em termos de acontecimentos especficos na clula. O calor mido age
sobre vrios componentes celulares e, na clula, pode-se observar uma srie de efeitos.
nativao trmica dos esporos
Os esporos so dotados de uma camada interna de mucopeptdeo recoberta por uma capa
protica rica em cistena. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistncia dos esporos:
impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratao do
material protico, com estabilizao conseqente da maior interaproximao dos radicais
hidrofbicos e imobilizao inica.
A inativao dos esporos em presena de vapor de gua deve-se atividade da gua e no
propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de
temperatura, caractersticos da inativao trmica de esporos. s podem ser devidos a
processos de coagulao de protenas
Os princpios bsicos da utilizao da radiao UV so a reduo de microrganismos presentes
no ar e a destruio de clulas depositadas na superfcie do equipamento e expostas
radiao. A radiao UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os nveis de
contaminao.
A ao de radiaes ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um
uma inibio do poder de multiplicao dos mesmos.
Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50C. Os fatores que influenciam na
eficincia da esterilizao so: tempo de contato, temperatura, pH, matria orgnica,
estabilidade ao oxignio umidade, etc. detergentes, lquidos (cidos e lcalis, glutaraldedo,
formaldedo, iodfors, cido peractico) Gases e vapores (oznio, brometo de metila,
formaldedo, -propionolactona, xido de etileno, cido peractico)
De acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a operao que tem por
finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou
microscpicas, saprfita ou no, existentes no meio considerado.
O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia conforme o processo a que se destina.
Algumas vezes totalmente dispensvel (fermentao lctica de hortalias e polvilho;
tratamento biolgicos de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica;
produo de leveduras para panificao; fermentao actica do vinagre); realizada com alto
grau de exigncia (produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios
laboratoriais sempre necessrio (devido ao uso de culturas puras) Em plantas industriais o
calor mido a principal forma de se efetuar a esterilizao. Pode
Esterilizao na indstria fermentativa
Prof. Raul Vicenzi 24 ser feita nos prprios recipientes destinados a fermentao (processo
descontnuo) ou em separado (processo contnuo)
ESTERLZAO EM BATELADA: Vrios meios de cultura so esterilizados no
fermentador a 121 C (para destruir esporos), o tempo calculado em funo dos constituintes
do mosto(pH, material em suspenso, etc) e do tamanho do fermentador. Esterilizar s
vlvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador
Mtodo indireto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da serpentina;
Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve estar livre de
aditivos qumicos OBS.: O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias
potencialmente txicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo
de gerao de vapor. Com injeo direta de vapor no meio de cultura o volume deste
aumentar, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do lquido dentro do
fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio
simultaneamente, evitando perigos de contaminaes; Desvantagem a) Manuteno de
temperaturas altas por perodos longos, favorecendo possveis alteraes no meio; b)
Consumo elevado de vapor e gua de resfriamento; c) Problemas de corroso pelo contato do
equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interaes
qumicas com nutrientes
ESTERLZAO CONTNUA As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas
pela esterilizao contnua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas
diminui o tempo da operao; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vrios
tamanhos Etapa preliminar obrigatria nos processos fermentativos contnuos, tambm tem
valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica
necessria para o processo, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura
tomando bem menor o tempo necessrio para a destruio de todos os microrganismos
quando temperaturas maiores so utilizadas; Na esterilizao em batelada so necessrios
30 a 60 minutos a 121 C, a esterilizao contnua normalmente realizada em 30 a 120
segundos a 140 C; Meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor aumenta o
volume do lquido, para resolver este problema o meio aquecido bombeado atravs de uma
vlvula de expanso e o condensado removido por uma bomba de vcuo at que o meio de
cultura fique com a mesma concentrao de antes da esterilizao.
Esterilizao na indstria fermentativa
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Pode se feita pela injeo direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. Em certos
casos a pasteurizao j p suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. uma
operao rpida utilizando temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Em meio
cidos equivale a uma esterilizao Para pequenas quantidade de meio pode-se lanar mo
da tindalizao.
FGURA 2 - Esquema de esterilizao contnua do meio de cultura em trocadores de calor
A esterilizao do meio pelo calor acarreta alteraes na sua composio qumica. A
experincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilizao de um dado
meio, menor ser a destruio de nutrientes e, conseqentemente, melhores sero os
resultados da fermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma conseqncia
de fato observada experimentalmente de ser a energia de ativao de destruio trmica
dos microrganismos maior do que a de destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de
importncia prtica, tanto na esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de
alimentos.
ESTERLZAO DO AR As fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso,
constituem os processos fermentativos de maior importncia industrial atualmente. Em tais
fermentaes a quantidade de ar introduzida no sistema grande e perfeitamente aceitvel,
que haja grande preocupao quanto a esterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores.
Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentao. - A maior
parte dos processos fermentativos conduzido com agitao vigorosa, e o ar fornecido ao
fermentador deve ser estril. - O nmero de partculas e microrganismos depende da
localizao da indstria, do movimento do ar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.
Esterilizao na indstria fermentativa
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Calor seco - normalmente antieconmica ou de difcil realizao; Radiaes Apenas as
radiaes UV poderiam ter aplicao prtica, porm pouco usada devido ao grande tempo de
exposio. Pode ser usada em pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atua mais como
desinfetante. Filtrao sem dvida o processo mais importante por ser o de maior aplicao
na industria. Filtros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois
tipos principais: Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos
(cartuchos de membranas de steres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material
fibroso (l-de-vidro, ) - Atua na combinao de vrios efeitos fsicos: inrcia, bloqueio, difuso,
separao por gravidade e atrao eletrosttica.
Metabolismo e cintica de crescimento microbiano
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O crescimento dos microrganismos uma parte integral de quase todos os processos de
fermentao. Sabe-se que as bactrias se reproduzem por diviso binria, produzindo duas
clulas de mesmo tamanho, entretanto a reproduo de muitas leveduras se d por
gemao;os mofos crescem por extenso das hifas e a morfologia de seu miclio pode variar
em funo do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfcie de um meio slido produz
uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as
clulas fngicas podem crescer unidas a partculas de nutrientes suspensas na forma de
miclio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na
velocidade de crescimento e na formao de produtos
Quando um microrganismo inoculado em um meio de volume e composio conhecidos, o
cultivo passa por uma srie de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da
inoculao, existe uma fase de latncia, em que o microrganismo se adapta as condies do
meio. Aps um certo perodo de tempo em que a velocidade de crescimento das clulas
aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma velocidade constante mxima ; esta fase se
denomina exponencial ou logartmica. medida que o crescimento continua, os nutrientes se
vo esgotando e os produtos vo sendo excretados pelo organismo, a velocidade de
crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqentemente ao esgotamento
de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto txico; esta fase se denomina estacionria.
FGURA 3 Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontnuo
A velocidade de crescimento varia com o tipo de clula microbiana e tambm em funo das
condies fsico-qumicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a
biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de
duplicao mdio para as clulas animais e vegetal so substancialmente maiores que os de
mofos e leveduras, que por sua vez so maiores que das bactrias.
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O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25
e 35 C. Dentro deste espao o crescimento aumenta com o aumento da temperatura at um
valor mximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de
morte microbiana.
O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimtica. A maioria dos
microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4.
A velocidade de crescimento da clula microbiana depende da atividade de gua (Aw) e da
umidade relativa. As bactrias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em
valores de atividade de gua menores, de at 0,7 como mnimas.
Como em qualquer reao qumica, a velocidade de crescimento depende da concentrao de
nutrientes qumicos, e pode ser descrita pela equao de Monod. Os valores tpicos de Ks para
as diversas fontes de carbono esto compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As clulas podem
crescer a velocidades prxima as max quando a fonte de carbono limitante maior que 10 Ks
ou 10 a 100 mg/dm3. As concentraes de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento
devido ao efeito osmtico que tem uma influencia maior sobre as bactrias do que sobre os
mofos
Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento
celular, freqentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado.
Biomassa produzida (g) x/s = ------------------------------ x/s =coeficiente de rendimento de
biomassa Substrato consumido (g)
O crescimento microbiano depende da capacidade da clula para utilizar os nutrientes de meio
ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e tambm os
principais compostos de baixo peso molecular, necessrio para a atividade celular. O
metabolismo intermedirio inclui as reaes que transformam os compostos de carbono e
nitrognio que entram na clula em novo material celular ou em produtos que so excretados.
A sntese desses compostos necessita energia e a maioria das clulas utilizada nas
fermentaes, so heterotrficas e obtm sua energia a partir da quebra de compostos
orgnicos. Nos processos respiratrios ou aerbios, os microrganismos so capazes de oxidar
completamente alguns dos substratos a CO2 e H2O, obtendo o mximo de energia para a
converso dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo
fermentativo ou anaerbio, as clulas so menos eficazes para converter os substratos
orgnicos em material celular e usualmente excretam intermedirios degradados parcialmente.
O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estgios. Aps a
inoculao de uma cultura em um meio nutriente existe um perodo durante o qual o
crescimento parece no ocorrer; este perodo refere-se fase lag e pode ser considerado
como uma fase de adaptao. Seguindo um perodo durante o qual a taxa de crescimento das
clulas aumenta gradualmente, as clulas crescem a uma taxa constante, este perodo
conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as clulas entram
fase estacionria. Aps um
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entra na fase de morte ou declnio. Tanto quanto esta cintica de crescimento, o
comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais so
gerados durante os estgios da curva de crescimento.
Quando um microrganismo inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da diviso
celular, e portanto a produo de biomassa, varia de acordo com uma seqncia caracterstica.
A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inculo e otimizando as
condies fsicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a durao da fermentao
contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mnima aconselhvel.
FGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em
batelada.
Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes
essenciais esto em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do
metabolismo energtico, em calor, ou em compostos requeridos para a reproduo de novas
clulas. Durante a fase exponencial de crescimento a diviso celular ou velocidade de aumento
da biomassa chega a ser mxima e os produtos gerados so essencialmente para o
crescimento das clulas e incluem: aminocidos, nucleotdeos, protenas, cidos nuclicos,
lipdios, carboidratos, etc. Estes produtos so conhecidos como os primeiros produtos do
metabolismo ou METABOLTOS PRMROS e a fase a qual eles so produzidos (fase log ou
exponencial) como trofofase. Tambm se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode
ser considerada como o metablito mais primrio.
Muitos produtos do metabolismo primrio so considerados economicamente importantes e
so produzidos por fermentao.
Durante a desacelerao e na fase estacionria, algumas culturas microbianas sintetizam
compostos os quais no so produzidos durante a trofofase e os quais parecem no ter
nenhuma funo bvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como
METABLTOS SECUNDROS e a fase na qual eles so produzidos (equivalente fase
estacionria) como idiofase. importante salientar que os metablitos secundrios ocorrem em
cultivos contnuos a
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de crescimento, e tambm, da fase onde no tem crescimento celular.
TABELA 3. Produtos do metabolismo primrio microbiano e sua significncia comercial.
Metabolismo Primrio Significncia Comercial
Etanol ngrediente ativo em bebidas alcolicas, usado como combustvel em motores quando
misturado ao petrleo
cido Ctrico Vrios usos na indstria alimentar cido glutmico ntensificador de Flavor Lisina
Suplemento alimentar Nucleotdeos ntensificador de Flavor Fenilalanina Precursor do
Aspartame - Adoante Polissacardeos Aplicao na indstria alimentar Vitaminas Suplementa
Alimentar
Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995.
Os metablitos secundrios so compostos que no so necessrios para a biossntese
celular, no tendo um papel direto no metabolismo energtico. A biossntese destes compostos
est intimamente ligada com o metabolismo primrio das clulas que os produzem, j que
normalmente seus precursores so metablitos primrios ou modificados, como cidos
orgnicos, aminocidos, derivados de acares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado
para os metablitos secundrios "so os compostos no essenciais para o crescimento
exponencial (Wiseman, A.)
Os metablitos secundrios mais importantes do ponto de vista comercial so os antibiticos,
entre eles a Penicilina, cuja produo anual chega a 10.0 ton/ano. As toxinas e os alcalides
representam o resto dos metablitos secundrios de importncia industrial.
Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento
no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que a idiofase que prevalece sobre a
trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos.
A energia necessria aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototrficos),
ou pela oxidao de substncias qumicas (organismos quimiorganotrficos). Nos dois casos a
energia vai ser estocada pela forma de energia de ligao qumica, biologicamente utilizvel.
Trata-se essencialmente da ligao anidridofosfrica do trifosfato de adenosina (ATP), formada
pela fosforilao do difosfato de adenosina (ADP).
A maioria das bactrias, leveduras e mofos so incapazes de efetuar a fotossntese, utilizam a
energia liberada no decorrer das reaes qumicas de oxidao. So chamadas
quimiorganotrficas. As reaes de oxidao podem ser efetuadas de vrios modos:
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Fe++
Fe+++ + e- +
energia
Em todos os casos h perda de eltrons freqentemente acoplada a uma perda de prtons.
Estes eltrons e prtons, aps transferncia mais ou menos longa, feita por intermdio de uma
cadeia de oxireduo, vo reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotrficos
tiram sua energia da oxidao de substncias orgnicas elaboradas, as quais devem
obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotrficos. A
grande maioria dos microrganismos que intervm na biotecnologia faz parte deste grupo.
O sistema de transporte de eltrons mais ou menos complexo e recorre as enzimas
(desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos,
etc.) que so intermedirios aceptores de eltrons (e de prtons); trata-se de um seguimento
de reaes acopladas com oxireduo. No final desta cadeia, eltrons (e prtons) servem para
reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxignio molecular, composto
mineral oxidado ou composto intermedirio do metabolismo. Existe, tambm, um mecanismo
de eliminao de eltrons e prtons prprio de numerosas bactrias anaerbias, sob a forma
de hidrognio, devido a hidrogenase.
Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que h respirao (fala-se s vezes, de via
oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o
que acarreta a formao de metablitos, diz-se que h fermentao. A fermentao traz
geralmente o nome da(s) substncia(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produo for
complexa.
Existem vrios mecanismos de respirao aerbia. O fato comum entre eles que o aceptor
final de prtons o oxignio do ar e no podem intervir seno quando os microrganismos so
cultivados em condies de aerobiose. Para cada par de prtons transformados em gua, h
formao de 3 molculas de ATP, podendo s vezes haver uma oxidao direta. Esta via leva
a formao de de decompor o H2O2. Quando um microrganismo possui esta via, e no tem
catalase, morto pelo oxignio do ar, sendo portanto, um anaerbio estrito.
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Na fermentao propriamente dita, uma substncia orgnica originria da degradao do
substrato serve como aceptor de eltrons (e de prtons). De fato, pode-se considerar que a
mesma substncia que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas
fermentaes podem ser efetuadas em anaerobiose, pois todos os prtons liberados servem
para reduzir um substrato orgnico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo
menos uma parte dos prtons liberados servem para reduzir o oxignio.
Na fase logartmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo:
O nmero de clulas (bactrias e leveduras): A biomassa (actomicetos e fungos).
A velocidade de crescimento se mantm constante durante a fase logartmica, ainda que o
meio se altere pelo consumo de substrato e excreo de metablitos. A velocidade de
crescimento independe da concentrao do substrato, pois um excesso de substrato est
presente. O substrato limitante a substncia que pela mudana de sua concentraao
promove:
mudanas na velocidade de crescimento do microrganismo
mudanas na velocidade de consumo do substrato
mudana na velocidade de formao do produto.
Na pratica podemos dizer que todo o substrato limitante. O processo industrial interrompido
ao final da fase logartmica ou antes da fase de declnio, depende se o processo associado
ou no associado.
A taxa de aumento da biomassa est relacionada com a velocidade especfica de crescimento
d
x
() e a concentrao da biomassa (X) expressa em g/L. ------- = X , onde
d
t
= velocidade mxima da biomassa X = concentrao de biomassa
A taxa do aumento do nmero de clulas est relacionada com a velocidade especfica de
crescimento e com a densidade celuar (N) expressa em clulas/L.
N
------- = N , onde N = densidade celular
d
t
O tempo de gerao (G) uma constante da cepa da clula e depende das condies de
cultivo. o espao de tempo necessrio para que uma clula se duplique. Quando o
microrganismo est na fase exponencial o tempo de gerao constante e dado por:
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G =
--- =
--------------------
t t z 3,322 log Nf/Ni
A sntese do produto se d no interior da clula, para que o substrato seja convertido em
produto, ele deve entrar na clula e ser biotransformado por uma seqncia especfica de
enzimas. Quanto mais complexo o produto, maior ser o nmero de enzimas envolvidas no
metabolismo.
Esquema simplificado do metabolismo celular. S [ X P ] P
ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da clula METABOLSMO -
TRANSFORMACO: o que diferencia o processo qumico do fermentativo. s vezes X =P.
SADA DO PROCESSO: liberao do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular. S
= concentrao do substrato em g/L X = concentrao de clulas em g/L P = concentrao do
produto em g/L ou mg/L
A velocidade de formao de clulas e dada pela variao da concentrao de clulas em
funo do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade constante e
pode ser calculada pelo numero de clulas (N) por contagem direta dos microrganismos ou por
contagem em placas e ainda pela massa seca de clulas (X). Ela chamada velocidade
especifica de crescimento, calculada por:
ln Nf ln Ni ln Xf ln Xi ln DOf ln DOi = ------------------- ou -------------------- ou
--------------------- tf ti tf - ti tf - ti para [ ] de clulas para Biomassa para densidade tica
FGURA 5- Variao da Concentrao Celular em Funo do Tempo
OBS.: Para microrganismos no filamentosos prefervel utilizar nmero de clulas e para
microrganismos filamentosos, a massa seca de clulas.
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A medida que a clula est se reproduzindo os substratos esto sendo consumidos, a
velocidade de consumo do substrato ser teoricamente constante, enquanto for constante o
crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato no s utilizado
para o crescimento celular, mas tambm para formao de metablitos, em alguns processos o
substrato pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um perodo de tempo, e a
velocidade chamada de velocidade especfica de consumo do substrato e calculada por:
ln Sf ln Si = ------------------- Sf = concentrao de substrato tf ti
FGURA 6 - Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tempo
A velocidade de formao do produto tende a ser constante durante um perodo de tempo.
chamada de velocidade especifica de formao do produto e calculada por:
ln Pf ln Pi = ------------------- Pf = Produto final tf ti
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FGURA 7 - Variao da Concentrao de Produto em Funo do Tempo
funo de trs parmetros: - Concentrao de substrato limitante (S)
- Velocidade mxima de crescimento ( max) - Constante especifica do substrato (ks), equivale
a concentrao em = 0,5 max
a concentrao de substrato que d a metade da velocidade mxima de crescimento. E dada
pela equao de MONOD, que equivale a equao de Henri-Michaelis-Menten para cintica
enzimtica. S = max --------------- Ks = corresponde a metade do max Ks + S
FGURA 8 - Relao entre a Velocidade de crescimento e Concentrao de Substrato
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Existindo vrios substratos limitantes, podemos estender a equao de Monod para:
= max
--------- + --------- + + .......+
-----------
K1.S1 K2.S2 Kn.Sn K1 + S1 K2 + S2 Kn + Sn
- Se existir um excesso de todos os substrato, ento = max e a cultura est na fase log, na
sua velocidade mxima de crescimento.
Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda
fase lag e log com outro tempo de gerao que caracteriza a metabolizao deste segundo
substrato, este fenmeno chamado de DAUXA. sto ocorre porque um dos substratos,
geralmente a glicose, catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos.
As enzimas que catabolizam os outros substratos so induzidas (durante a segunda fase lag)
aps a metabolizao completa do primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da
cadeia de glicose na velocidade mxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30C
ACAR N de UNDADE de
GLCOSE max (h-1) G (h)
FGURA 9 Crescimento triuxico de Fusarium graminearum
Com isto chegamos a concluso que o mximo depende do: microrganismo; condies de
cultivo;
composio do meio de cultura;
temperatura de incubao;
outros fatores (pH, oxignio, etc.)
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TPO 1 - ASSOCADO
No processo associado o produto derivado diretamente do metabolismo primrio, usado para
a produo de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a formao do produto
ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a DOFASE (fase de
formao do produto) no so separadas.
Ex. produo de biomassa, etanol e cido glucnico. Sendo A, B, e C, produtos intermedirios
do metabolismo primrio, a formao do produto pode ser considerada:
FGURA 10 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo
Associado
TPO 2- SEM-ASSOCADO
O Produto derivado de um substrato usado no metabolismo primrio, mas segue uma rota
colateral. A tropofase e a idiofase so separadas. Em fermentao em batelada este tipo de
cintica possui dois pontos importantes: 1) crescimento celular acompanhado de alto consumo
de substrato e pouca ou nenhuma formao de produto; 2) O crescimento diminui e a formao
do produto comea acompanhada de um alto consumo de substrato.
Ex.: produo de cido ctrico e de alguns aminocidos. A reao de formao do produto pode
ser exemplificada como: A B C Metabolismo Primrio
D E Produto
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...
7. TPOS DE FERMENTAO
Alcolica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc
Os microrganismos lcticos utilizados na indstria de alimentos uns so homo e outros
heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas cido lctico (homofermentativos) como
produto da transformao do substrato em questo e, outros produzem cido lctico e uma
gama de outros cidos que ficam incorporados ao produto. Lctica: picles, chucrute, azeitonas
verdes, queijo, leites fermentados, produtos crneos, etc.. Actica: maionese, vinagre, etc.
Propinica: cido propinico.
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8. MPORTNCA DO DESENVOLVMENTO DA ACDEZ a) Controle de contaminaes
indesejveis, antagonismo (patognicos); b) Ajuda na eliminao de umidade. Ex. queijos. c)
Formao do sabor; d) Formao de corpo e textura; e) Facilita a ao de outros aditivos. Ex. a
renina atua melhor em pH cido; f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos
fermentativos; g) Conservao dos produtos (aumenta a vida til ou vida-de-prateleira dos
produtos.); h) Produo de bacteriocinas (protenas que so produzidas a partir de seu
metabolismo)
9. MPORTANCA DO CDO LACTCO NOS PRODUTOS FERMENTADOS a) Preservao
do produto; b) Seleo da flora microbiana, evitando contaminaes; c) Contribui para o sabor,
aroma e flavor dos produtos fermentados; d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.:
a precipitao de protenas em partculas finas facilita a digesto enzimtica; e) Melhora a
utilizao do Clcio, Fsforo e Ferro no organismo (so melhores absorvidos em pH cido); f)
Estimula a secreo do suco gstrico.
10 FATORES MPORTANTES NO DESENVOLVMENTO DA FERMENTAO
A presena de antibiticos constitui um srio problema para obteno de starters lcticos. A
penicilina, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da dieta.
Os resduos desses antibiticos no leite produzem inibio dos microrganismos lcticos ate 96
horas aps a aplicao ter sido feita no animal.
Nveis de 0,05 a 0,10 U.. de penicilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dos
Streptococcus e 0,5 U../mL inibe por completo a fermentao.
Os Lactobacillus so mais resistentes, embora algumas espcies so inibidas por completo
com 5 U../mL de penicilina no leite.
Presena de resduos de sanitizantes (iodforos e amonioquaternrios), os iodforos em baixas
concentraes estimula a presena de cidos enquanto que em nveis maiores (50 a 100 ppm)
a reduzem. Geralmente o cloro ativo em concentraes entre 25 e 200 ppm impedem a
fermentao lctica. Amonioquaternrios, nveis entre 25 e 75 ppm causam diminuio da
velocidade ou deteno da fermentao.
1. MPORTNCA DAS CULTURAS STARTERS PARA NDSTRA
As formas de obteno e estocagem de culturas starters tem proporcionado o aparecimento de
culturas em melhores condies de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das
culturas mantido em plantas de processamento via sub culturas em laboratrio
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O uso de culturas congeladas ou liofilizadas tem tomado possvel inocular o volume de cultura
diretamente no produto ou na preparao deste em uma cuba.
Existem diversas vantagens para o uso de culturas starters concentradas:
A atividade da cultura pode ser cuidadosamente controlada para monitorar a planta de
processamento; A manuteno do estoque de cultura da planta de processamento pode ser
eliminado;
Menos trabalho requerido;
O sistema de rotao de cultura starter fcil de estabelecer ajudando a manter o controle
sobre a bacteriofase; Os recentes desenvolvimentos da cincia e tecnologia de starters esto
gradualmente encontrando novas aplicaes.
As seguintes tendncias certamente figuraro nos futuros negcios da indstria de alimentos:
Uso de bactrias cido lcticas especializadas em trocar ou promover certos tipos de
funcionalidade protica;
Controlar a maturao de produtos fermentados; Produo de novos produtos (diferentes
composies, textura e flavor); Novos produtos lcteos (produtos lcteos puros ou misturada
com cereais); Uma nova gerao de bebidas fermentadas (teraputicas e bebidas
profilticas; novos flavors);
Produtos com baixo teor de gordura; Suplementos dietticos para atletas, crianas e
idosos; Produtos lcteos no alergnicos;. Destoxificao de certos produtos fermentados;
Produtos enriquecidos com antimicrobianos; Disponibilidade de um largo espectro de
bactrias ready-set starter.
Existem inmeros fatores que ajudam a proteger os produtos crneos fermentados da
rancificao pelo oxignio do ar e dentre eles destaca-se a catalase dos micrococcaceae a qual
quebra os perxidos, incluindo o perxido de hidrognio produzido por Lactobacillus, alm
disso, os micrococcaceae tambm ajudam a aromatizar os produtos curados e o presunto cru,
conforme mostra a figura 13.
Figura 13 - Efeito da catalase positiva (micrococcaceae) em produtos curados e produtos crus.
Fonte: Lcke, 1986.
Reduo do Nitrato
Degradao dos Perxidos Hidrlise das gorduras
Desenvolvimento e estabilizao da cor e do produto curado e inibio da rancidez
ntensificao do odor e flavor
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A figura 14 mostram de forma simplificada como os grupos de bactrias so importantes na
carne e nos produtos crneos e como elas podem ser distinguidas entre si.
Os microrganismos mais importantes na fabricao de linguia seca e presunto cru pertencem
aos gneros Lactobacillus. Staphyllococcus e Micrococcus
A funo mais importante das bactrias catalase positivas (particularmente Micrococcaceae)
em produtos crneos curados manter a cor do produto e proteger as gorduras contra o
ataque do oxignio do ar, pois a rancidez um problema maior nos produtos crneos crus do
que nos cozidos. sto e devido ao fato de que muitos Lactobacillus produzem perxidos durante
a cura do produto e nos produtos cozidos no existem enzimas lipolticas.
No forma esporos
Atividade Lipolitica dos Micrococcus
Micrococcaceae so tambm usados como starters devido a sua atividade lipoltica que dar
uma contribuio essencial ao flavor do produto. Os micrococcus tm uma grande atividade
lipolitica sendo capazes de atacar cidos graxos de cadeia longa ou curta, triglicrides de 16 a
18 tomos de carbono. Observou-se que o mximo de atividade lipoltica do micrococcus
ocorreu a pH 7,0 e a 32 C e esta atividade decresce com o decrscimo do pH e temperatura.
Por exemplo a pH 5,5 e 1 C nenhuma atividade lipoltica extracelular foi observada sobre
diversos triglicrides e gordura de suno.
Talon (1993), testou Staphylococcus warnieri 854, 863 e 864, Sraphylococcus saprophyticus
M252 e 852 e Micrococcus varians M204 com relao a sua atividade lipolitica e percebeu que
amostra inoculada com Micrococcus varians teve uma atividade menor que as outras bactrias
testadas, no entanto, segundo o mesmo autor, a diferena entre estas cepas no pode ser
explicada
Coccus Bastonetes
Catalase negativa Catalase positiva
No forma esporos
Forma esporos
Obrigatoriamente anaerbia
Aerotolerante anaerobia
Micrococcus
Staphylococcus Catalase negativa Catalase positiva
Obriga toriament e anaerbia
Aerotolerante anaerobia
Aerbio obrigatrio Aerbio ou anerbio facultativo
Bacillus Clostridium
Lactobacillus
Anaerbio facultativo Aerbio
Brochothrix
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Prof. Raul Vicenzi 46 pelo seu crescimento, embora microccocus varians tenha mostrado o
maior crescimento, sua atividade lipoltica foi inferior as demais bacterias, sendo
Staphylococcus saprophyticcus 852 a capa que apresentou a maior atividade lipoltica.
Conforme relata Talon (1993), a produo de lipases por Micrococcus varians depende do
O2, pois nenhuma atividade lipolitica pode ser detectada quando esta cepa foi cultivada sem
agitao e aerao.
Debevere (1976), j relatava que Micrococcus varians necessita crescer sob agitao e
aerao para hidrolisar gordura de suno. Esta atividade pode ser evidenciada pelo decrscimo
dos cidos graxos insaturados ao final da incubao e pode ser devido ao metabolismo
bacteriano ou a oxidao, pois as bactrias forem obtidas sob condies de agitao e aerao
apropriadas.
Outros autores tambm mostraram que Micrococcus varians foi capaz de produzir em adio a
oxidao outros compostos carbonlicos a partir de cidos graxos saturados (Talon, 1993).
O flavor tpico dos salames devido a produo de cidos durante a fermentao, ao sal e a
diferentes compostos derivados ao catabolismo dos aucares ou ainda a compostos
produzidos durante a maturao da carne estes compostos podem ser de origem no
enzimtica, como durante a oxidao dos lipdios ou pode ser resultado de uma Esta catlise e
devida a enzimas endgenas no caso dos produtos onde so usados starters como o presunto
curado mas depende tambm de enzimas exgenas no caso dos produtos.
Efeito dos Cultivos Starters em Embutidos Secos
As bactrias lcticas inibem, pela formao de cido lctico, o desenvolvimento de
microrganismos indesejveis e melhoram a textura dos embutidos secos. Em troca. a
microbiota catalase positiva, melhora a cor, aroma e proteo do produto frente ao efeito
prejudicial do oxignio. Para tanto, depende do tipo de produto desejado a convenincia do
emprego de cultivos starters e quais deles devem ser empregados.
Formao de Cor e Flavor
A formao de cor no produto curado resultado de uma srie de reaes desencadeadas
pelas bactrias nitrato redutoras, principal caracterstica do gnero Micrococcus e
Staphylococcus que inicialmente, reduzem o nitrato a nitrito e, posteriormente, devido
produo de cido pelas bactrias acidificantes (acidolcticas) ocorre a queda do pH, a reao
prossegue e os nitritos so decompostos a xido ntrico para entao reagir com a mioglobina,
formando nitromioglobina que vai conferir a cor caracterstica dos produtos curados, conforme
mostra a figura 15.
Ao bacteriana
(Nitrato de Sdio) PH = 5,4 a 6,0
HNO2 + NAOH NaNO2 + H2O (cido nitroso)
NO + Mioglobina Nitrosomioglobina FGURA 15- Esquema das reaes de formao de cor
pela ao das bactrias nitrato redutoras.
Fonte: Coretti, 1971
Cultivos starters na industria de alimentos
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As reaes de formao de cor so fortemente influenciadas pela velocidade e intensidade de
acidificao que, quando muito intensa, resulta na inibio dos microrganismos redutores do
nitrato. Em conseqncia, o produto apresenta o centro de cor cinza.
Ocasionalmente pode surgir um defeito chamado nitrite burn quando houver uma fase de
latncia muito grande dos microrganismos lcticos, os microrganismos sensveis ao cido e
redutores de nitrato reduzem quantidades excessivas deste. Posteriormente, as bactrias
lcticas reduzem o pH e uma colorao marrom-esverdeada torna-se aparente. Um balano
dinmico entre microrganismos redutores de nitrato e microrganismos lcticos previne este tipo
de deteriorao.
A formao do flavor no produto curado, importante contribuio dos Micrococacceae, pode ser
produzido de 4 maneiras:
Oxidao lipdica Fermentao dos acares
Catabolismo derivado de aminocidos como a valina, leucina ou isoleucina;
Alimentao do animal,
Outra importante contribuio desta espcie a produo de catalase a qual remove o H2O2
produzido nelas bactrias acidolticas, pois este representa um forte agente oxidante
exercendo efeitos adversos sobre a cor, aroma e vida de prateleira dos produtos curados.
Micrococcus sp so inicialmente cultivados em Agar nutriente ou em caldo de levedura.
ncubao a 30-37 C, com crescimento abundante. As culturas podem ser estocadas em
refrigerador (5C) em tubos hermeticamente fechados por 3 a 5 meses ou em meio lquido com
uma camada superficial de parafina por 1 a 2 anos ou ainda na forma liofilizada por 5 anos ou
mais.
Para uma cultura starter ter significncia comercial preciso um tratamento de preservao
para que as clulas mantenham sua viabilidade e atividade fermentativa durante o transporte e
estocagem. A liofilizao freqentemente utilizada como metodologia conveniente para este
fim. A exposio das clulas a este tratamento e a subseqente reidratao podem ter efeito
adversos sobre as clulas, tais como aumento da fase lag e reduo da atividade fermentativa.
A imobilizao da bactria em um gel de polmero (prolas de alginato de clcio com glicerol
1M e um crioprotetor) antes da liofilizao, confere as prolas de gel uma proteo adicional
durante o processo de liofilizao e proporciona um melhor controle do ambiente ao qual as
clulas sero expostas durante a reidratao e sobre a inoculao direta no substrato para
fermentao.
Sistemas de Fermentao
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O termo fermentao no sentido mais amplo possvel, pode ser definido como todo o processo
no qual microrganismos catalisam a converso de uma dada substncia num determinado
produto. O processo de converso pode requerer ou no oxignio, e os prprios
microrganismos podem estar includos entre os produtos formados.
Os processos fermentativos podem ser classificados de acordo com a maneira atravs da qual
o substrato adicionado e o produto retirado. Assim sendo, numa fermentao descontnua,
o substrato pe inicialmente carregado num recipiente e, ao trmino do processo, o produto
retirado do mesmo. Em uma operao contnua a matria-prima adicionada com uma vazo
constante e o meio fermentado retirado com a mesma vazo de alimentao. Devem ainda
ser mencionados os processos semicontnuos, nos quais a adio do meio e a retirada do
produto so efetuadas intermitentemente. Tais processos podem ser considerados como
intermedirios entre os descontnuos e os contnuos.
O sistema descontinuo e considerado um sistema fechado exceto pela adio de oxignio, um
agente antiespumante e um acido ou base para controlar o pH. Contm uma quantidade
limitada de meio, em que o inculo passa por um numero de fases (curva de crescimento).
Utiliza-se sempre um inoculo novo, depois de terminada a fermentao retira-se o produto e o
resto vai fora; tem elevado custo.
Os processos descontnuos podem ser classificados em trs grandes grupos:
Processo em cada dorna recebe o inculo; Processos com recirculao dos microrganismos;
Processo por meio de cortes.
No primeiro caso cada fermentador recebe um inculo recentemente preparado. Desde que a
tcnica de preparo do p-de-cuba tenha sido adequadamente obedecida, este sistema de
trabalho o que oferece melhores condies para uma boa fermentao, uma vez que cada
fermentador recebe uma suspenso de microrganismos de elevada atividade e, praticamente,
isenta de clulas contaminantes.
Na fermentao com circulao ou aproveitamento dos microrganismos, procede-se da
seguinte maneira: No incio de funcionamento da instalao, algumas dornas so inoculadas
com pde-cuba; o meio, uma vez completamente fermentado, centrifugado, obtendo-se
assim uma suspenso de microrganismos de elevada concentrao; a suspenso obtida
quase sempre submetida a um tratamento com vistas a eliminao de clulas inativas e de
microrganismos contaminantes e ento, utilizada como inculo de outro fermentador. Quando
bem conduzida, essa tcnica pode ser desenvolvida durante meses consecutivos sem
necessidade de preparo de novo pde-cuba.