APNDICE IV MATERIALES Y MTODOS DETALLADOS

Introduccin.En este apndice se ha visto oportuno describir con detalle los materiales y mtodos utilizados para la localizacin de TGasas y sus sustratos en diferentes tejidos de maz, para el aislamiento, clonaje y la caracterizacin de genes de TGasas de maz, y por ltimo, del subclonaje de genes de TGasa de maz en vectores de expresin en plantas as como la transformacin estable de plantas va infeccin con el fitopatgeno Agrobacterium tumefaciens. 1. ESTUDIO DE LA LOCALIZACIN DE TRANSGLUTAMINASAS EN MAZ (Zea mays L). A. MATERIAL VEGETAL. Las lneas de callo embriognico etiolado de maz utilizadas para los estudios de diferenciacin cloroplstica mediante la eliminacin de fitohormonas exgenas y la exposicin a diferentes tiempos de luz, fueron obtenidas a partir de embriones inmaduros del hbrido HP (Santos, M. A., et al., 1993). Una reserva de tejido calloso fotosinttico con capacidad organognica denominado callo meristemtico de la lnea W64AO2 expuesto por tiempos prolongados a fotoperodo (Torn, J. M., et al., 1984), de donde se detect por primera vez la banda de 58 kDa utilizando anticuerpo contra transglutaminasa de prstata de ratn (Bernet, E., 1998 y Bernet, E., et al., 1999), fue utilizado para las pruebas de inmunolocalizacin subcelular. Para las muestras de hoja se utilizaron plantas etioladas de nueve das de la variedad W64AO2, plantas etioladas de nueve das expuestas una hora y tres das a la luz, plantas de veinte das creciendo en cmara de germinacin y plantas adultas creciendo en el invernadero. B. INDUCCIN IN VITRO Y MANTENIMIENTO DE CALLO EMBRIOGNICO DE MAZ (Zea mays L.) DE LA VARIEDAD HBRIDA HP. Se obtuvo una reserva de callo embriognico de maz, como a continuacin se describe para ser utilizada en los experimentos de diferenciacin cloroplstica. Una vez obtenidas las mazorcas, producto de la polinizacin, se procedi a su esterilizacin para establecer el cultivo axnico mediante una inmersin de 12 minutos en hipoclorito de sodio al 18 % (v/v) en agua, adicionando dos gotas de Tween-80, retirando previamente la cubierta de hojas. Se realizaron de 3 a 4 lavados en agua destilada estril, para posteriormente proceder al aislamiento e inoculacin en medio de cultivo de los embriones con la ayuda de unas pinzas y bistur estriles. Se inocularon en medio de cultivo in vitro y bajo condiciones de oscuridad, 649 embriones cigticos inmaduros de 16 das posteriores a la polinizacin obtenidos de la cruza HXP y 120 embriones de la cruza PXP de plantas de maz creciendo bajo condiciones de invernadero. Del resto de los embriones, se llev un seguimiento en el invernadero hasta obtener semillas maduras. El medio L92 adicionado con STS y MES, pH 5.8, fue utilizado para inducir el callo embriognico de maz de la variedad hbrida HP, a partir de stos embriones cigticos inmaduros. La siguiente composicin corresponde a dicho medio, que fue elaborado para evitar la necrosis temprana del callo y mantener constante el pH del medio. Est compuesto por macro y micronutrientes del medio N6, y por la mezcla de vitaminas de una modificacin al medio MS (Santos, M. A., et al., 1993).

241

Medio L92 adicionado con STS y MES, para 1000 ml. Macronutrientes N6 10X 100 ml 2.799 mM KNO3 0.405 mM (NH4)SO4 0.112 mM CaCl22H20 0.293 mM KH2PO4 0.075 mM MgSO47H20 0.0197 M MnSO44H20 -3 5.216X10 M ZnS047H20 0.0258 M H3BO3 4.819X10-3 M KI 0.099 mM FeS047H20 0.1 mM EDTA-disdico 0.1 % (p/v) 0.69 % (p/v) (6 mM) 0.5 % (p/v) (2.5 mM) 20 % (p/v) (58 mM) 1.0 mM Na(S203)2 0.25 mM AgNO3 2.0 mg/l (26 M) 0.5 mg/l (4 M) 0.5 mg/l (2.4 M) Piridoxina 0.5 mg/l (1.5 M) Tiamina 0.5 mg/l (1 M) Pantotenato clcico 2 mg/l (9 M) 2 % (p/v)

Micronutrientes N6 1000X

1.0 ml

EDTA-Fe Casena hidrolizada Prolina MES Sacarosa STS Glicina (stock 1.0 mg/ml) cido nicotnico (stock 1.0 mg/ml) Vitaminas del medio MS modificado

5.0 ml 0.1 g 0.69 g 0.5 g 20 g 2.5 ml 2.0 ml 0.5 ml 1.0 ml

2, 4-D (stock 1.0 mg/ml) Gelrite

2.0 ml 2.0 g

Las soluciones concentradas se prepararon como se indica en las siguientes Tablas. Stock de macronutrientes N6 10X KNO3 (NH4)SO4 CaCl22H20 KH2PO4 MgSO47H20 Stock de micronutrientes N6 1000X MnSO44H20 ZnS047H20 H3BO3 KI para 1000 ml: 2830 mg 463 mg 166 mg 400 mg 185 mg para 1000 ml: 4.4 mg 1.5 mg 1.6 mg 0.8 mg

Stock de EDTA-Fe para 1000 ml: FeS047H20 5.56 g EDTA-disdico. C10H14N2Na2O8.2H2O 7.46 g NOTA: ambos componentes se disolvieron por separado en agua a 100 C. Se agreg poco a poco la solucin de hierro a la de EDTA y se afor al volumen indicado. Stock de STS Na(S203)2 0.1 M AgNO3 0.1 M NOTA: se mezclaron Na(S203)2 y AgNO3, en una proporcin 4:1, respectivamente. Mezcla de vitaminas del medio Murashige para 1 ml: y Skoog modificado Piridoxina 0.5 mg Tiamina 0.5 mg Pantotenato clcico 0.5 mg

242

Ya elaborado el medio de cultivo, se dosific en tubos de vidrio con tapa autoclavable, con 20 ml de medio, teniendo la precaucin de dejar una inclinacin durante la gelificacin, para evitar que el embrin inoculado en el medio quede expuesto al exceso de agua de dicho medio. Los primeros siete subcultivos se realizaron en este medio, en lapsos de 25 das entre cada subcultivo. Periodo en el cual, se elimin el tejido original que dio origen al callo. Una vez inducido el tejido calloso a partir de embriones cigticos de maz en el medio L92, los callos se pasaron al medio N6Pr2, pH 5.8, y los subcultivos se realizaron cada 20 das, con la finalidad de mantener el tejido indiferenciado. La siguiente composicin corresponde al medio de mantenimiento. Medio N6Pr2, para 1000 ml. Macronutrientes N6 10X 100 ml 2.799 mM KNO3 0.405 mM (NH4)SO4 0.112 mM CaCl22H20 0.293 mM KH2PO4 0.075 mM MgSO47H20 0.0197 M MnSO44H20 5.216X10-3 M ZnS047H20 0.0258 M H3BO3 4.819X10-3 M KI 0.099 mM FeS047H20 0.1 mM EDTA-disdico 0.5 mg/l (2.4 M) Piridoxina 0.5 mg/l (1.5 M) Tiamina 0.5 mg/l (1 M) Pantotenato clcico 7.7 mg/l (100 M) 1.98 mg/l (15 M) 0.69 mg/l (6 M) 2.0 mg/l (9 M) 1.3 mg/l (10 M) 20 % (p/v) (58 mM) 2 % (p/v)

Micronutrientes N6 1000X

1.0 ml

EDTA-Fe Vitaminas MS (modificado) Glicina (stock 1.0 mg/ml) Asparagina (stock 1.0 mg/ml) Prolina (stock 1.0 mg/ml) 2, 4-D. (stock 1.0 mg/ml) cido Nicotnico (stock 1.0 mg/ml) Sacarosa Gerlite

5.0 ml 1.0 ml 7.7 ml 1.98 ml 0.69 ml 2.0 ml 1.3 ml 20 g 2.0 g

C. INMUNOLOCALIZACIN DE TRANSGLUTAMINASAS Y SU COINMUNOLOCALIZACIN CON TRES APOPROTENAS DEL COMPLEJO ANTENA LHCII, EN CALLO EMBRIOGNICO ETIOLADO Y HOJA DE MAZ. C.1. FIJACIN DE TEJIDOS DE MAZ Y SU INCLUSIN EN LA RESINA DE INFILTRACIN (LOWICRYL K4M) PARA LA REALIZACIN DE CORTES ULTRAFINOS Y SU OBSERVACIN AL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET). Propiedades de la resina utilizada: Presenta baja viscosidad a bajas temperaturas (- 35 C). Es una resina polar (hidroflica). Durante la deshidratacin e infiltracin, las muestras de tejido pueden mantenerse parcialmente hidratadas. La polimerizacin puede realizarse con un 5 % en peso de agua de la muestra. Es muy til en tcnicas de inmunomarcage. Polimeriza con luz ultravioleta. La fotopolimerizacin es independiente de la temperatura. Los bloques pueden polimerizar a la misma temperatura en la que se ha producido la infiltracin. Puede tambin polimerizarse a 60 C.

243

La fijacin del tejido. NOTA. En caso de que la finalidad sea el inmunomarcage, la concentracin del fijador o fijadores depender del tipo de antgeno a detectar. Este tipo de fijacin puede hacerse por medio de perfusin, inmersin o la combinacin de ambos. En la fotopolimerizacin cabe tener en cuenta que la muestra no contenga pigmentos o agentes que impidan la penetracin de la luz ultravioleta, como por ejemplo el Osmio. Es importante que las muestras tengan un tamao menor a 0.5 mm3, para una buena infiltracin y polimerizacin de la resina. Para las muestras de tejido de maz, se sigui el mtodo convencional de doble fijacin: 1. Se realiz la fijacin del tejido por inmersin en paraformaldehdo al 4 % (v/v) y glutaraldehdo al 0.5 % (v/v) en tampn fosfato 0.1 M (pH 7.4), durante toda la noche a 4 C. NOTA: la fijacin se obtiene con un mnimo de 2 a 3 horas de incubacin a 4 C. 2. Posteriormente, con la ayuda de una pipeta Pasteur y bajo campana de extraccin, se realizaron cuatro lavados en tampn fosfato 0.1 M a 4 C, de 10 minutos cada uno. 3. Dos lavados ms en NH4Cl 150 mM a 4 C, de 15 minutos cada uno. 4. Y por ltimo, cuatro lavados en tampn fosfato 0.1 M a 4 C, de 10 minutos cada uno. La deshidratacin del tejido. NOTA. Este proceso implica un decremento progresivo de la temperatura a medida que la concentracin del agente deshidratante aumenta (Tcnica PLT: Progressive Lowering of Temperature). Todo el material que se va a utilizar debe estar previamente enfriado, monitoreando la temperatura con una sonda. Durante la deshidratacin e infiltracin, las muestras de tejido se mantuvieron en agitacin constante. La tcnica PLT, que se utiliz para los diferentes tejidos de maz, est descrita en la siguiente tabla: ETANOL (vol. %) 30 50 70 95 100 100 TEMPERATURA ( C) +4 - 20 - 20 - 35 - 35 - 35 TIEMPO (minutos) 30 60 toda la noche 60 60 60

La inclusin de la resina en el tejido. NOTA. El Lowicryl K4M, consta de una mezcla de tres componentes: Crosslinker A, Monomero B y el Iniciador C (por arriba de los 0 C, ha de ser reemplazado por la misma cantidad de Benzoin-etil-eter). El oxgeno interfiere con la polimerizacin. Por esta razn, con la ayuda de una pipeta Pasteur, se hizo burbujear con nitrgeno. La resina, una vez preparada, se almacen a 35 C, para que se estabilizara a la temperatura de trabajo.

244

Las etapas que se siguieron en el proceso de inclusin estn detalladas en la siguiente tabla: PROPORCION RESINA/ETANOL (vol./vol.) 1/3 2/2 3/1 Resina pura Resina pura TEMPERATURA ( C) - 35 - 35 - 35 - 35 - 35 TIEMPO (minutos) 60 60 60 60 toda la noche

NOTA: los tiempos pueden variar segn el tipo de muestra y tamao de la misma. C.2. LA POLIMERIZACIN DE LA RESINA. Para hacer los bloques, se utilizaron cpsulas de gelatina para evitar el contacto con el oxgeno. 1. Se llen la cpsula, previamente lavada, con una porcin de resina. 2. Se transfiri la muestra. 3. Se acab de llenar la cpsula lo mayor posible, a fin de que quede la mnima cantidad de aire. 4. Se esper entre 15 y 60 minutos, antes de conectar la luz ultravioleta. Se expuso la cpsula un tiempo mnimo de 24 horas. NOTA: es recomendable esperar una semana como mnimo, antes de obtener los primeros cortes. Cuanto ms tiempo pase, ser ms sencillo obtener el corte ultrafino. C. 3. LA OBTENCIN DE LOS CORTES Y EL CONTRASTE. Se realizaron cortes semifinos (de 1 a 3 micras de grosor), y para la observacin al microscopio ptico y poder verificar la calidad de la muestra, se realiz el contraste sobre el portaobjetos, en una plancha de calor, con azul de metilo: tetraborato sdico al 0.5% (p/v), en agua destilada. Los cortes ultrafinos (400 a 600 A de grosor), fueron recogidos en rejillas de cobre y contrastados con acetato de uranil al 2% (p/v), en agua destilada, durante 30 minutos y bajo oscuridad, seguido de 10 minutos en citrato de plomo. C. 4. EL MARCAJE CON ANTICUERPO DIFERENTES TEJIDOS DE MAZ. El bloqueo. 1. Se colocaron las rejillas de cobre con la cara hacia abajo sobre una gota de aproximadamente 20 l de la solucin de bloqueo, y se incubaron durante 15 minutos. Se trabaj sobre una superficie de papel parafilm. Solucin de bloqueo: BSA 0.1 g / 10 ml de TBS salino* 10 % (p/v) *TBS salino; 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 en 150 mM NaCl, filtrado en filtro milipore de 0.2 micras. 2. Se transfirieron las rejillas de cobre a una gota de solucin de anticuerpo primario; protena Y chicken anti transglutaminasa cloroplstica de 58 kDa de Helianthus tuberosus, a las diluciones 1:4000, 1:8000, 1:10 000 y 1:16000. El anticuerpo se diluy con la solucin de bloqueo mencionada anteriormente. La incubacin fue de 2 horas a temperatura ambiente. NOTA: tambin puede dejarse durante toda la noche a 4 C. SOBRE SECCIONES ULTRAFINAS DE

245

NOTA. Para las coinmunolocalizaciones, se trabaj a la dilucin; 1:1000, para el anticuerpo primario contra la transglutaminasa de H. tuberosus y la dilucin; 1:500, para los anticuerpos contra las apoprotenas del complejo Lhcb (Rabbit Anti-Lhcb1-3, protena G purificada AgriSera, INC. www.agrisera.com). Para la protena G anti Lhcb1 se utiliz la dilucin 1:3000 partiendo de un stock de 4.6 g/l reconstitudo en agua, para la protena G anti Lhcb2 se utiliz la dilucin 1:5000 partiendo de un stock de 3.6 g/l reconstitudo en agua y para la protena G anti Lhcb3 se utiliz la dilucin 1:2000 partiendo de un stock de 3.6 g/l reconstitudo en agua. Se realizaron dos controles negativos: Se incub una rejilla en esta etapa, nicamente con solucin de bloqueo. Se incub una rejilla en esta etapa, con suero preinmune, a la misma y a mayor concentracin que el antisuero primario. NOTA. Los controles negativos se trataron de igual forma al resto de las rejillas en las siguientes etapas. 3. Para eliminar el exceso de antisuero, se realizaron una serie de cuatro lavados pasando las rejillas por gotas de la solucin de bloqueo, dispuestas en el papel parafilm, de 5 minutos cada lavado. 4. Se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado (oro coloidal de 10 12 nm de dimetro conjugado a un IgY anti chicken, Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC.), como se realiz en el primer paso, a la dilucin 1:30 (dentro del rango recomendado por la casa comercial). La dilucin del anticuerpo se hizo con la solucin de bloqueo. La incubacin fue de una hora a temperatura ambiente. NOTA. Para las coinmunolocalizaciones, se trabaj a con el anticuerpo secundario conjugado al oro coloidal IgY anti chicken, Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC., de 10 nm para el anticuerpo contra la transglutaminasa de H. tuberosus y anti rabbit, de 15 nm para los anticuerpos contra las apoprotenas del complejo Lhcb; Lhcb1, Lhcb2 y Lhcb3, a la dilucin 1:25. 5. Los lavados se realizaron, pasando las rejillas por una serie de tres gotas de TBS 10 mM filtrado, dispuestas en el papel parafilm, de 5 minutos cada lavado. Y por cuatro gotas ms, de agua bidestilada filtrada, de 5 minutos cada lavado. Se dejaron secar. C. 5. EL CONTRASTE Y LA OBSERVACIN AL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET). Se realiz con acetato-duranil acuoso al 2 % (p/v), durante 5 minutos y posteriormente con citrato de plomo segn Reynolds, durante un minuto. Las observaciones se realizaron en un microscopio electrnico de transmisin, operado a 80 kV (Hitachi H 600). Se realizaron observaciones en un rango de 15 000 a 120 000 aumentos. NOTA: a partir del material vegetal mencionado anteriormente, se extrajo protena total y se estudi la presencia de la protena por western blot, utilizando un anticuerpo policlonal contra una transglutaminasa vegetal de Helianthus tuberosus, obtenido con anterioridad.

246

D. INMUNODETECCIN WESTERN BLOT.

DE

TRANSGLUTAMINASAS

MEDIANTE

LA

PRUEBA

DE

D. 1. EXTRACCIN DE PROTENAS TOTALES EN TEJIDOS VEGETALES. 1. Se tritur entre 0.5 a 1 g de tejido previamente congelado en nitrgeno lquido, en mortero fro hasta obtenerse un polvo fino, evitando su descongelamiento. ste proceso de trituracin se realiz con la ayuda de cuarzo en polvo, para optimizar ste proceso. 2. Se verti el polvo a un tubo eppendorf de 2 ml, previamente congelado en nitrgeno lquido, aadiendo inmediatamente 1.0 ml del tampn de extraccin adicionado con inhibidores de cistein y serin-proteasas. Para obtener una proporcin 1:1 de tejido y tampn respectivamente. Tampn de extraccin: Tris-HCl pH 8.5 NaCl SDS 100 mM 10 mM 1% (p/v)

Mezcla de inhibidores de proteasas (para 1.0 ml): PMSF (stock 100 mM) -mercaptoetanol % (v/v) DTT (stock 100 mM) cido amino caproico (stock 1 M) EDTA (stock 0.5 M) Leupeptina (21 Mm) Apoprotena (10 mg/ml) Pepstatina (1.46 mM) 100 l (10 mM) 50 l (9.0 mM) 10 l (1.0 mM) 5.0 l (5.0 mM) 2.0 l (1.0 mM) 2.0 l (100 M) 1.0 l (10 M) 1.0 l (1 M)

3. Se homogeneiz la mezcla a 4C, con la ayuda de un rotador, durante 40 minutos aproximadamente. 4. Se centrifug la mezcla a 14 000 r.p.m., a 4 C, durante 5 minutos. 5. Se recuper el sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo, del que se reserv una alcuota para cuantificar protenas (ver mtodo de Lowry). Se mantuvieron las alcuotas en hielo. 6. Se hicieron alcuotas del sobrenadante, mezclando con tampn de muestra (TM 2X) en una proporcin de 1:1, para obtener una concentracin final TM 1X, y se almacenaron a 20 C hasta su utilizacin. Tampn de muestra 2X: Tris-HCl pH 6.8 Glicerol SDS Azul de bromo-fenol 125 Mm 20% (v/v) 4% (p/v) 0.04% (p/v)

7. En el momento en que se realiz la electroforesis, se aadi -mercaptoetanol para una concentracin del 10% (v/v) y se incub en bao de agua a temperatura de ebullicin, durante 2 minutos. Las alcuotas se mantuvieron en hielo posteriormente.

247

D. 2. CUANTIFICACIN DE PROTENAS (MTODO DE LOWRY). NOTA. ste mtodo colorimtrico utiliza el reactivo de Follin Ciocalteu (Phenolreagenz-Merck), elaborando una curva patrn con un stock de BSA (1 mg/ml). La curva patrn se realiz mezclando los siguientes componentes: BSA (l) 0 10 20 30 40 60 80 100 NaOH 1.0 N (l) 200 200 200 200 200 200 200 200 H20 (l) 800 790 780 770 760 740 720 700 SOLUCIN C (ml)* 5 5 5 5 5 5 5 5 Reactivo de Follin ** (l) 500 500 500 500 500 500 500 500

La muestra problema: Muestra problema (l) 5 10 20 30 NaOH 1.0 N (l) 200 200 200 200 H20 (l) 795 790 780 770 SOLUCIN C (ml)* 5 5 5 5 Reactivo de Follin ** (l) 500 500 500 500

*La disolucin C se prepar mezclando la solucin A y B en una proporcin 50:1 respectivamente. La reaccin qumica ocurri durante 10 minutos de incubacin a temperatura ambiente. Solucin A: Na2C03 al 2% (p/v); en NaOH 0.1 N. Solucin B: CuS04 al 0.5% (p/v) y tartrato de Na-K al 0.1% (p/v); en agua. ** El reactivo de Follin y el BSA se utilizaron diluidos en agua (1:1). Una vez transcurridos los 10 minutos de incubacin con la solucin C, se aadi el reactivo de Follin y se incub por 30 minutos a temperatura ambiente antes de leer la absorbancia. La lectura de la absorbancia se realiz a una longitud de onda de 540 nm, y de ste valor se dedujo la concentracin de protena presente en cada muestra. D. 3. ELECTROFORESIS DE PROTENAS. 1. Preparacin del gel de poliacrilamida. El gel de 1 mm de espesor para el sistema Miniprotean, se prepar a una concentracin estndar de acrilamida del 12 % (p/v). Las soluciones se prepararon como a continuacin se indica: La solucin A, se prepar pesando 30 g de acrilamida y 0.8 g de N,N-metilen-bis-acrilamida y aforando a un volumen de 100 ml con agua. Se le aadi carbn activado y se dejo toda la noche en reposo bajo condiciones de oscuridad. Se filtr en vaco y se almacen a 4 C, en oscuridad. Solucin B: Tris-HCl pH 6.8 SDS Solucin C: Tris-HCl pH 8 SDS 0.25 M 2.0 % (p/v) 0.75 M 0.2 % (p/v)

Solucin APS: en una concentracin de 100 mg/ml, en agua.

248

2. El gel separador se prepar mezclando las soluciones como a continuacin se describe y vertindose en el sistema electrofortico Miniprotean. Solucin A 3.19 ml Solucin C 4.0 ml H20 0.81 ml Plus One TEMED Amersham 10 l APS 30 l NOTA. Una vez realizada la mezcla de las soluciones y el agua, se aadi primero el catalizador (TEMED) y despus el polimerizador (APS). 3. Se verti sobre la mezcla, una capa de isopropanol fro para evitar el contacto con el aire (pues el oxgeno inhibe la polimerizacin). NOTA: tambin se puede emplear agua como aislante. Una vez polimerizado el gel, se extrajo el isopropanol con agua corriente. 4. Posteriormente se prepar el gel concentrador o de deposicin, al 5 % (p/v) de acrilamida, como a continuacin se describe, vertindose sobre el gel separador, y colocando inmediatamente el peine para formar los carriles. Solucin A 0.62 ml Solucin B 2.5 ml H2O 1.84 ml Plus One TEMED Amersham 7.5 l APS 20 l NOTA. Una vez realizada la mezcla de las soluciones y el agua, se aadi primero el catalizador (TEMED) y despus el polimerizador (APS). 5. Una vez polimerizado el gel concentrador, se retir el peine, lavando de 2 a 3 veces cada carril con tampn de corrida (Running Buffer 1X). Tampn de corrida Running Buffer 1X Glicina Tris-HCl SDS 1.9 M 0.25 M 1.0 % (p/v)

El gel de acrilamida al 10 %, para el sistema Miniprotean tambin puede ser preparado como se indica en la siguiente tabla (para 4 geles de 0.75 mm de espesor). STOCKS GEL SEPARADOR % 3.75 ml 3.75 ml 7.5 ml 10 l 50 l GEL DE DEPOSICIN 0.48 ml 1.25 ml 3.26 ml 10 l 25 l

Solucin A 40 (acrilamida/bisacrilamida; 37.5:1. Amresco). Lower Buffer, pH 8.8 Upper Buffer, pH 6.8 H2O Plus One TEMED Amersham APS

Lower Buffer: 1.5 M Tris-HCl, 0.4 % SDS. Ajustar con HCl a pH 8.8. Upper Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 0.4 % SDS. Ajustar a pH 6.8. El gel de acrilamida al 12 %, fue preparado como se indica en la siguiente tabla (para 4 geles de 0.75 mm de espesor).

249

STOCKS

Solucin A 40 (acrilamida/bisacrilamida; 37.5:1. Amresco). Lower Buffer, pH 8.8 Upper Buffer, pH 6.8 H2O Plus One TEMED Amersham APS

GEL SEPARADOR % 4.8 ml 8 ml 3.2 ml 20 l 60 l

GEL DE DEPOSICION 0.96 ml 5 ml 3.96 ml 15 l 40 l

6. Se cargo cada uno de los carriles con las alcuotas correspondientes, incluyendo una alcuota de la mezcla de marcadores de peso molecular especficos, anteriormente desnaturalizadas con -mercaptoetanol al 10 % (v/v), aplicando calor. 7. Se aplic corriente (150 voltios), dejando correr las muestras hasta que el marcador de corrida (azul de bromo-fenol) difundi al tampn de corrida por la parte inferior del gel. D. 4. TINCIN DE GELES DE POLIACRILAMIDA CON AZUL DE COOMASIE. 1. Se incub el gel de protenas en azul de Coomasie y en agitacin constante para verificar la calidad y cantidad de protena aplicada al gel. La solucin colorante se prepar pesando 500 g de TCA y 2.0 g de azul de Coomasie aforando a un volumen final de 1000 ml, en agua. 2. Para eliminar el exceso de colorante y poder apreciar el patrn de bandas de protenas, se hicieron varios lavados con cido actico al 7 % (v/v), alternando con una mezcla de cido actico al 7 % (v/v) y metanol al 35 % (v/v). Hasta obtener los mrgenes del gel, completamente translcidos. D. 5. EL WESTERN BLOT. D. 5. 1. LA TRANSFERENCIA DE PROTENAS A LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA. 1. Una vez verificada en el gel de acrilamida teido con azul de Coomasie, la calidad y concentracin de protenas separadas, se procedi a cargar un nuevo gel para su inmediata transferencia a la membrana de nitrocelulosa (Hybond-c extra; supported nitrocellulose membrane; Amersham). 2. Terminada la electroforesis, se equilibr dicho gel en tampn de transferencia durante 30 minutos a temperatura ambiente y en agitacin constante. Tambin se incub en dicho tampn la membrana de nitrocelulosa (9.0 X 6.0 cm aproximadamente, para el sistema Miniprotean). Tampn de transferencia. Tris-HCl 5.82 g/l 48 mM Glicina 2.93 g/l 39 mM Metanol 200 ml/l 20 % SDS 20 % 1.875 ml/l 0.03 % NOTA. No se ajusta el pH (debe de ser de entre 9 y 9.4). No autoclavar. 3. Se mont la transferencia de protenas en un sistema semiseco; Trans-blot SD Semi-dry, como se muestra en la siguiente figura, utilizando papel Extra Thick Blot humedecido en el tampn de transferencia, eliminando el exceso de lquido y las burbujas de aire que se pudieron haber formado entre cada capa, con la ayuda de una varilla de cristal.

250

Sistema de transferencia de protenas a la membrana de nitrocelulosa.

Papel Extra Thick Blot Gel de poliacrilamida Membrana de nitrocelulosa Papel Extra Thick Blot

Aparato de transferencia Trans-blot SD Semidry. 4. La transferencia se llev a cabo durante 40 minutos a 15 voltios como constante. NOTA: aunque estas condiciones pueden variar. El sistema Trans-blot SD Semidry, est diseado para realizar transferencias de 30 minutos de duracin y utilizando un mximo de 25 voltios. NOTA: Tambin se utiliz el sistema de transferencia de protenas Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell de BIO-RAD. Por ste sistema, las transferencias se llevaron a cabo a 90 voltios durante una hora y media a dos horas, a 4 C.

251

5. Se comprob que la transferencia de protenas a la membrana de nitrocelulosa fue efectuada mediante la tincin de la membrana con rojo Poncean. Se utilizaron marcadores de peso molecular no biotinilados, por lo que en este momento, visibles con el colorante, se marcaron con lpiz sobre la membrana. NOTA: tambin se puede comprobar la transferencia, tiendo el gel de poliacrilamida utilizado, con azul de Coomasie (ver protocolo de tincin de geles de poliacrilamida). 6. Se elimin el colorante, lavando la membrana con PBS o agua, en agitacin durante unos minutos. D. 5. 2. LA INCUBACIN CON EL ANTICUERPO. 1. Se bloque la membrana de nitrocelulosa transferida con las muestras de protenas, en leche en polvo desnatada al 5 % (p/v) o BSA al 3 % (p/v) en PBS, durante una hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 C, bajo agitacin constante. NOTA: una vez finalizado el bloqueo, la membrana puede ser secada y almacenada por algunos das a temperatura ambiente o durante tres meses a 2 8 C y evitando su exposicin a la luz. 2. Se realizaron tres lavados con PBS de 5 minutos cada uno, en agitacin constante. 3. Se incub la membrana con el antisuero primario contra la transglutaminasa cloroplstica de 58 kDa de Helianthus tuberosus (AbHt) diludo 1:10000 en PBS o dependiendo del ttulo del anticuerpo (se utilizaron adems dos nuevos anticuerpos, contra un pptido sinttico del extremo carboxilo de la transglutaminasa de maz clonada en este trabajo y contra la transglutaminasa recombinante TGZ4p), durante una hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 C, en agitacin constante. NOTA: si se trabajaron varias membranas al mismo tiempo, se tuvo la precaucin de utilizar el suficiente volumen de disolucin para cubrir completamente dichas membranas. NOTA. Los anticuerpos contra las apoprotenas del complejo antena Lhcb (Rabbit Anti-Lhcb13, protena G purificada AgriSera, INC. www.agrisera.com) se utilizaron a una dilucin de 1: 5000. 4. Se realizaron tres lavados con PBS de 5 minutos cada uno, en agitacin constante. 5. Se incub la membrana durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado a la peroxidasa IgY Anti-Chicken Jackson ImmunoResearch INC., diluido 1:6600 en PBS, en agitacin constante, para detectar el anticuerpo AbHt. NOTA. Para detectar los anticuerpos contra las tres apoprotenas del complejo antena LHCII, el anticuerpo contra el pptido sinttico de TGZ15p y TGZ21p y el anticuerpo contra la protena recombinante TGZ4p, se utiliz el anticuerpo secundario anti rabbit conjugado a la peroxidasa, a una dilucin de 1:10000. 6. Se realizaron cuatro lavados en Tween-20 al 0.3 % (v/v) en PBS, agitando vigorosamente durante algunos segundos. 7. Se realizaron cuatro lavados ms en Tween-20 al 0.l % (v/v) en PBS, agitando vigorosamente durante algunos segundos. 8. Se realizaron dos ltimos lavados en agitacin suave con PBS antes de realizar el revelado.

252

D. 5. 3. EL REVELADO. 1. El revelado se efecto en una cmara oscura que proporciona luz roja. Se elimin el exceso de PBS de la membrana y se coloc sobre el cassette de revelado, con la cara hacia arriba (donde estn las marcas con lpiz del marcador de peso molecular), se tuvo la precaucin de dejar que se escurriese un poco ms el PBS, pero evitando que la membrana se secara por completo. 2. Inmediatamente despus la membrana se coloc en un recipiente que contena suficiente volumen del reactivo ECL para cubrirla, se homogeneiz suavemente durante un minuto en agitacin. NOTA: justo en el momento de su uso, se mezclaron los componentes del reactivo ECL; Luminol y Enhancer (proporcin 1:1), el cual reacciona con la peroxidasa conjugada al anticuerpo secundario, para dar lugar a una reaccin electro-quimio-luminiscente, que revela la pelcula fotogrfica (pelcula Kodak). 3. Posteriormente, la membrana se coloc entre dos filmes transparentes evitando que se formasen arrugas o burbujas de aire. 4. Se expuso una pelcula fotogrfica, durante algunos minutos (10 minutos para muestras de tejidos vegetales), antes de ser revelada. NOTA: el tiempo necesario de exposicin de la pelcula es inversamente proporcional a la concentracin de la protena que ha reaccionado con el ECL. NOTA: el ECL se degrada a los veinte minutos transcurridos desde su preparacin. D. 6. STRIPPING DE PROTENAS TRANSFERIDAS A MEMBRANAS DE NITROCELULOSA. 1. Se realiz un lavado de la membrana en PBST (PBS adicionado con Tween-20 0.1 %) durante 5 minutos. 2. Se incub la membrana en stripping buffer (Glicina 100 mM, pH 2.5), durante 20 minutos a temperatura ambiente. 3. Se realizaron entre 3 y 4 lavados en PBST. 4. Se bloque con leche desnatada en polvo al 5 % (p/v) o BSA al 3 % (p/v) en PBS, incubando durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 C. La membrana queda preparada para ser rehibridada con un nuevo anticuerpo.

253

2. AISLAMIENTO, CLONAJE Y CARACTERIZACIN DE GENES CODIFICANTES PARA TRANSGLUTAMINASAS VEGETALES; UN ESTUDIO COMPARATIVO CON LAS TRANSGLUTAMINASAS DESCRITAS, LA LOCALIZACIN DE HOMLOGOS Y LA OBTENCIN DE UN NUEVO ANTICUERPO. A. MATERIAL VEGETAL. Aislamiento de genes codificantes para transglutaminasas de maz. Se utiliz una librera de cDNA de expresin preparada a partir de ARN purificado de hoja de maz de la variedad B73 de dos semanas de edad, creciendo bajo condiciones de invernadero. Los cDNAs estn clonados en la librera entre los sitios EcoRI y XhoI en Lambda ZAP II, y dirigidos en sentido al gen lacZ. La unin entre la regin 5 y el vector es el sitio EcoRI, y entre la regin 3 es el sitio XhoI. El fago Helper fue obtenido de Stratagene para rescatar el plsmido pBluescript SK del clon Lambda. La alcuota de librera utilizada representa 8X105 recombinantes y ha sido amplificada en una ocasin. Esta librera fue donada por Alice Barkan, del Institute of Molecular Biology, de la Universidad de Oregon y presenta las siguientes propiedades: a. Expresin de protenas de fusin bajo el control del promotor lac. b. Pruebas de escrutinio con cidos nucleicos y anticuerpos. c. Excisin in vivo de fragmentos clonados dentro del fagmido pBluescript SK (-). d. Cepa XL1-Blue como hospedero. e. Fagos nicos o amplificados permiten infectar clulas de E. coli, las cuales son co-infectadas con fagos filamentosos Helper. Dentro de la clula, protenas trans-actuantes del fago Helper reconocen dominios del iniciador y terminador del vector Lambda ZAP II. mbas seales son reconocidas por la protena del gen II del fago Helper y se sintetiza una nueva cadena de ADN a partir de dichas seales de reconocimiento. El ADN es recircularizado y empaquetado como fago filamentoso por las protenas del fago Helper. El plsmido pBbluescript es recuperado por infeccin de la cepa XLOLR creciendo en presencia de ampicilina. Caracterizacin molecular de los genes de transglutaminasas aislados de maz. Se utiliz hoja adulta, de la lnea hbrida andrognica W64AO2 de maz, para la extraccin de ARN total empleada para la tcnica RACE. Para el anlisis southern blot se extrajo ADN de hojas de plntula de maz de la lnea B73. El estudio de la acumulacin del mensajero se realiz con ARN total de hoja de plntulas de maz del triple hbrido Novartis G-5054, de siete das creciendo en cmara de germinacin y de los distintos tejidos empleados en los experimentos de diferenciacin. Estudio de la presencia de transglutaminasas en otras especies. Para la inmunolocalizacin de transglutaminasas en tejido de arroz (Oryza sativa) cultivar Senia, se trabaj con tejido calloso embriognico etiolado y hoja de plntula. Para la deteccin de transglutaminasas por anlisis western blot en Arabidopsis thaliana cultivar Columbia y tabaco (Nicotiana tabacum) variedad petit havane, se utiliz hoja adulta creciendo en el invernadero.

254

B. EL AISLAMIENTO DE GENES A PARTIR DE UNA LIBRERIA DE EXPRESIN B. 1. TITULACIN DE UNA LIBRERA DE EXPRESIN DE cDNA DE HOJA DE MAZ. Condiciones de conservacin de la librera. Para conservarla por seis meses, se almacen a 4 C, con 0.3% (v/v) de cloroformo (aproximadamente una gota). Para conservarla por un tiempo mayor de seis meses, se hicieron alcuotas de 50 l, aadiendo 7% (v/v) de DMSO o bien 50% (v/v) de glicerol antes de congelar a 70 C. NOTA: bajo stas condiciones, se puede mantener el ttulo durante aos. No es necesario extraer el DMSO o el glicerol para usar la librera. NOTA: se uso una alcuota cada vez, mantenindola a 4 C, para evitar someter a toda la librera a cambios de temperatura. El cultivo de la cepa bacteriana. Partiendo de un stock glicerinado al 25% (v/v) de la cepa XL1-Blue, conservada a 70 C. 1. Se rasp un stock del cultivo glicerinado con el asa bacteriolgica y se sembr por estra en una placa de petri que contena medio LB (Luria-Bertani)-agar adicionado con sulfato de magnesio (MgSO4), maltosa y tetraciclina: Medio LB(Luria-Bertani)-agar selectivo pH 7.5, adicionado con MgSO4, maltosa y tetraciclina: Bactotriptona 10 g/l Extracto de levadura 5 g/l NaCl 10 g/l MgSO4 10 mM Agar 15 g/l Tetraciclina* 15 g/ml Maltosa* 0.2% (v/v) *Se esteriliz por filtracin y se aadi al medio estril licuado (a una temperatura aproximada de 50 C). 2. Se incub la placa a 37 C, toda la noche. 3. Se almacen a 4 C, durante un tiempo mximo de dos semanas. 4. Se pic una colonia nica del cultivo anterior y se sembr por estra en una placa de petri con medio fresco. Se incub a 37 C, durante toda la noche y se almacen a 4 C (placa primaria). La titulacin de la librera. 1. Se pic una colonia aislada de la placa primaria con la cepa XL1-Blue y se inocul en un tubo estril que contena 5.0 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido pH 7.5, adicionado con sulfato de magnesio (MgSO4) 10 mM y maltosa 0.2% (v/v). Medio LB (Luria-Bertani) lquido: Bactotriptona 10 g/l Extracto de levadura 5.0 g/l NaCl 10 g/l 2. Se incub en agitacin (250 r.p.m.) a 37 C, durante toda la noche o hasta que el valor de densidad ptica, a 600 nm, fue 1.0.

255

3. Se fundi el medio LB (Luria-Bertani) top-agarosa estril y se le aadi MgSO4 estril (10 mM). NOTA. Tener la precaucin de asegurarse de que haya quedado muy bien fundido. Se alicuot en tubos estriles, volmenes de 3.0 ml y se mantuvieron en un bao de agua a 50 C, durante una hora como mnimo para que permaneciese licuado el medio y para asegurarse de que el medio estuviese a dicha temperatura. Medio LB (Luria-Bertani) top-agarosa: Bactotriptona 10 g/l Extracto de levadura 5.0 g/l NaCl 10 g/l pH 7.5 Agarosa 7.2 g/l 4. Se prepararon las siguientes diluciones de la librera fgica: 2 l de la librera, en 1.0 ml de tampn lambda 1X: dilucin 1 (1:500). 2 l de la dilucin 1, en 1.0 ml de tampn lambda 1X: dilucin 2 (1:250 000). Tampn lambda 10X (para 1000 ml): NaCl 58.3 g 1.0 M MgSO4.7H2O 24.65 g 0.1 M Tris-HCl 1.0 M pH 7.5 350 ml 0.35 M NOTA: se esteriliz por autoclave y se almacen a 4 C, hasta el momento de su uso. 5. Se prepararon cuatro tubos eppendorf como se indica en la siguiente tabla de diluciones, utilizando el cultivo bacteriano obtenido en los pasos 1 y 2. Tabla de diluciones: Tubo Tampn lambda1X (l) 1 (control) 100 2 100 3 100 4 100 Cultivo bacteriano (l) 200 200 200 200 Dilucin 2 del fago (l) 0 2 5 10

6. Los cuatro tubos eppendorf se incubaron en reposo a 37 C, durante 18 minutos. NOTA: en esta etapa ocurre la infeccin del fago. 7. Se verti rpidamente, cada dilucin (infeccin) en cada tubo que contena el medio LB (Luria-Bertani) top-agarosa fundido previamente en el paso 3. Y se vortearon vigorosamente. 8. Se verti el contenido de cada tubo sobre una placa de petri de 90 mm, de medio LB (LuriaBertani)-agar adicionado con MgSO4 10 mM, girando la placa suavemente para extender homogneamente el top-agarosa. NOTA: es necesario, incubar las placas previamente a 37 C (atemperar), durante una hora como mnimo, antes de verter el contenido del top-agarosa fundido, para evitar que se solidifique irregularmente en el momento de entrar en contacto con la superficie del medio. 9. Se dejaron enfriar a temperatura ambiente por unos minutos, justo para que el top-agarosa quedase completamente solidificado. 10. Se incubaron las placas en posicin invertida a 37 C, hasta que aparecieron visiblemente las calvas (zona de lisis fgica). NOTA: aproximadamente entre seis y siete horas, aunque dicho tiempo fue sumamente variable dependiendo de la temperatura a la que se solidific el top agarosa. 11. Se contaron el nmero de calvas de cada placa y se obtuvo una media, aplicando la siguiente igualdad: pfu/ml = nmero de fagos / ml = nmero de calvas / l de librera usados X factor de dilucin X 103.

256

NOTA: si el nmero de calvas resulta excesivo, como en el caso de la mayor concentracin aplicada, no es necesario realizar el conteo de la placa con alta densidad de calvas, ya que se dificultar su conteo y aumentar el factor de error al considerar ste dato cuando se obtiene la media. B. 2. EL ESCRUTINIO CON ANTICUERPO EN LA LIBRERA FGICA DE EXPRESIN LAMBDA ZAP II DE HOJA DE MAZ. Una vez conocido el ttulo de la librera. 1. Se prepararon los cultivos bacterianos a infectar con dicha librera: a. Se inocul una colonia de la placa primaria (cepa XL1-Blue) en un tubo estril que contena 5.0 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido adicionado con sulfato de magnesio (MgS04) 10 mM y maltosa al 0.2% (v/v). Se realiz una replica. b. Se incub el inoculo a 37 C, en agitacin a 200 r.p.m., durante toda la noche o hasta alcanzar una medida de la densidad ptica (600 nm) de 1.0. NOTA: se puede trabajar con una densidad ptica de 0.5, diluyendo con MgSO4 10 mM. 2. Se prepararon once tubos estriles con 4.0 ml de medio LB (Luria-Bertani) top-agarosa licuado en el horno de micro ondas, adicionando 400 l de IPTG 10 mM filtrado (concentracin final 1 mM) y mantenindolos en un bao de agua a 50 C, durante una hora antes de ser utilizados. 3. Se alicuotaron diez tubos eppendorf con 100 l de tampn lambda 1X, conteniendo cada uno 4 1.5X10 pfu de librera fgica. Y se prepar un tubo que slo contena tampn lambda 1X, como control negativo, procesndolo igual que el resto de los tubos. 4. Se mezcl cada dilucin fgica, con 200 l del cultivo bacteriano preparado previamente en el paso 1. Una vez mezclado, se inici la infeccin incubndose en reposo a 37 C, durante 18 minutos. 5. Se verti al lado del mechero de Bunsen, cada alcuota de infeccin en un tubo con medio LB (Luria-Bertani) top-agarosa preparado en el paso 2, y se mezclaron con la ayuda de un vrtex. 6. Se verti inmediatamente y con rapidez, cada mezcla sobre las placas de 90 mm que contenan medio LB (Luria-Bertani) agar con MgSO4 10 mM, moviendo las placas suavemente para extender homogneamente el top-agarosa antes de que ste se solidificase. NOTA: es necesario calentar las placas una hora a 42 C, antes de verter el top-agarosa. Con este proceso se hizo un escrutinio de 45 000 fagos por cada placa. 7. Se enfriaron las placas durante pocos minutos a temperatura ambiente para que solidificasen. 8. Se incubaron inmediatamente despus a 42 C, hasta que aparecieron visiblemente las calvas. La placa control debi presentar un cultivo bacteriano homogneamente extendido sobre todo el top-agarosa y carente de calvas. NOTA: la presencia de calvas en la placa control indica contaminacin de fagos silvestres, por lo que no se debe continuar con el escrutinio hasta eliminar la fuente de contaminacin. Generalmente las lisis de los fagos silvestres se forman horas antes y suelen ser de mayor tamao. El tamao de las calvas de cualquier fago es mayor cuando se desarrollan en medio fresco recientemente preparado.

257

9. Una vez que aparecieron las calvas se coloc, con ayuda de pinzas y guantes, sobre cada placa (a excepcin de la placa control), un disco de papel filtro de nitrocelulosa, cuyo dimetro fue ligeramente menor al de las placas de medio de cultivo, evitando dejar burbujas de aire bajo el filtro. NOTA: la membrana de nitrocelulosa debe estar previamente etiquetada con lpiz y marcada con cuatro puntos asimtricos, esterilizada bajo luz ultravioleta durante 15 minutos, y saturada posteriormente en IPTG 10 mM estril hasta antes de su uso. Es importante eliminar todo el exceso de la solucin de IPTG de cada membrana y dejar evaporar un poco, pero sin secar por completo, justo antes de colocarlas sobre cada placa de medio de lisis. ste ltimo paso es un factor limitante para una buena transferencia de las protenas liberadas en cada punto de lisis hacia la membrana de nitrocelulosa. 10. Una vez colocada cada membrana sobre su placa de lisis correspondiente, se marcaron los cuatro puntos asimtricos en el revs de la placa, de tal forma que las marcas de la membrana y de la placa correspondieron perfectamente. 11. Se incubaron las placas de lisis a 37 C, durante cuatro horas. 12. Se enfriaron las placas de lisis a 4 C, durante una hora, antes de extraer la membrana de nitrocelulosa. Para retirar las membranas, se utilizaron pinzas para realizar esta maniobra en forma rpida y evitando la posibilidad de que se pudiesen mezclar las calvas. NOTA: si el topagarosa an quedase adherido a la membrana, dejar ms tiempo de incubacin a 4 C. Una vez extrada cada membrana de nitrocelulosa, las placas se almacenaron nuevamente a 4 C. 13. Se lavaron las membranas con PBS, para eliminar los residuos de agarosa que pudiesen haber quedado adheridos. 14. Se bloquearon las membranas con leche en polvo desnatada al 5 % (p/v) en PBS y se continu el proceso tal y como se indica en la tcnica de western blot y el revelado, anteriormente descrito. Durante el revelado, se tuvo la precaucin de duplicar con exactitud sobre cada placa fotogrfica, los cuatro puntos marcados en la membrana de nitrocelulosa, para hacerlos coincidir posteriormente. 15. Una vez revelada cada placa fotogrfica, y con la ayuda de un trans-iluminador se procedi a localizar la lisis fgica correspondiente al punto positivo revelado, mediante el alineamiento de la disposicin de marcas de la placa de lisis y su placa fotogrfica correspondiente. 16. Una vez localizada la calva que corresponde al positivo de la placa fotogrfica, se extrajo con la ayuda del extremo ancho de una pipeta Pasteur estril. 17. El cilindro de top-agarosa obtenido, se traspas a un tubo eppendorf estril que contena 1.0 ml de tampn lambda 1X, para conservar el fago, y 20 l de cloroformo puro, para eliminar las bacterias. Se conserv el fago positivo a 4 C. 18. Con la densidad de fagos cribados en cada placa, el fago reconocido por el anticuerpo estuvo contaminado de otros recombinantes adyacentes a ste. Debido a esto, fue necesario repetir toda operacin de escrutinio, partiendo de la alcuota obtenida en el paso anterior, hasta obtener placas en las que todas las lisis fgicas sean reconocidas por el anticuerpo, es decir sean reveladas en la placa fotogrfica. NOTA: en los siguientes cribados se utilizaron capilares para colectar las calvas positivas, obteniendo un cilindro de agarosa de mucho menor dimetro.

258

B. 3. LA EXCISIN IN VIVO DE LOS FAGOS POSITIVOS INMUNOCRIBADOS (SISTEMA FAGO HELPER, STRATAGENE). B. 3. 1. PREPARACIN DE CLULAS COMPETENTES. NOTA: las cepas XL1-Blue y XLOLR, ambas se seleccionan en medio LB (Luria-Bertani)-agar con 15 g/l de tetraciclina. 1. Se pic una colonia y se inocul en 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido; sin suplementos para la cepa XLOLR, y con sulfato de magnesio MgSO4 10 mM y maltosa al 0.2% (v/v), para la cepa XL1-Blue. 2. Se incubaron toda la noche a 37 C, a 200 r.p.m. 3. Se inocul 1.0 ml de cada cultivo en un matraz de un litro que contena un volumen de 50 ml del mismo medio. 4. Se incubaron a 200 r.p.m., a 37 C, durante 3 horas. 5. Se transfirieron los cultivos bacterianos a un tubo Falcon de 50 ml, tomando antes una alcuota de 500 l y diluyendo en medio LB (Luria-Bertani) lquido (1:1) para leer la densidad ptica (600 nm) en el espectro fotmetro. 6. Se centrifugaron los tubos Falcon a 500 g, a 4 C, durante 15 minutos. 7. Se resuspendi cada pellet bacteriano en MgSO4 10 mM estril, a un volumen adecuado para obtener una densidad ptica de 5.0, en ambas cepas. 8. La suspensin se almacen a 4 C, hasta su uso. B. 3. 2. LA COINFECCIN. 1. Se prepar la siguiente mezcla: Cepa XL1-Blue O.D.600nm 5.0 40 l La alcuota del fago positivo cribado 200 l Stock Fago Helper, ExAssist Interference- 1.0 l Resistant Helper Phage Stratagene system NOTA: el ttulo del fago Helper fue de aprox. 1 X 1010 pfu/ml. 2. Se incub en reposo a 37 C, durante 20 minutos. 3. Se aadi 3.0 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido adicionado con maltosa 0.2% (v/v) y MgSO4 10 mM. 4. Se incub a 37 C, durante tres horas a 250 r.p.m. 5. Se incub a 70 C, durante 20 minutos para inactivar el fago Helper. 6. Se centrifug a 500 g, por 15 minutos y se recuper el sobrenadante conteniendo al fagmido. 7. Se almacen el sobrenadante a 4 C, hasta su uso.

259

B. 3. 3. LA INFECCIN. 1. Se prepar la siguiente mezcla: Cepa XLOLR O.D.600nm 5.0 Sobrenadante conteniendo al fagmido 40 l 100 l

2. Se incub en reposo a 37 C, durante 20 minutos. B. 4. EL CRIBADO DE COLONIAS. 1. Se plaquearon 40 l del volumen de la infeccin de la cepa XLOLR, en placas de petri de 90 mm conteniendo el medio selectivo; LB (Luria-Bertani)-agar adicionado con IPTG, el sustrato Xgal del gen lac Z, y ampicilina. Medio selectivo adicionado con IPTG, X-gal y ampicilina, para 1000 ml de medio LB (LuriaBertani) estril, fundido a 50 C: Stock IPTG (stock 10 mM) Stock X-gal (stock 20 mg/ml) Stock ampicilina (stock 50 mg/ml) 2. Se incubaron toda la noche en estufa a 37 C. 3. Una vez crecidas las colonias, se procedi a aislar ADN plasmdico, como se indica en la tcnica MINIPREP, de aquellas colonias cuyo gen lac Z qued interrumpido durante el proceso de coinfeccin con el fagmido (colonias de apariencia translcida). Las colonias de coloracin azul fueron desechadas. NOTA: las colonias de coloracin blanquecina tambin fueron descartadas, probablemente por la presencia de algn contaminante. C. ANLISIS PARA VERIFICAR EL AISLAMIENTO DE GENES. C. 1. AISLAMIENTO DE PLSMIDOS A PEQUEA ESCALA (MINIPREP). 1. Se pic e inocul una colonia bacteriana en 3 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido adicionado con 50 g/l de ampicilina. NOTA: el antibitico utilizado va en funcin del plsmido que porta la colonia. 2. Se incub a 37 C, 200 r.p.m., toda la noche. 3. Se verti 1.5 ml del cultivo bacteriano en un tubo eppendorf y se centrifug durante un minuto a 12 000 r.p.m. 4. Se decant y se sec el tubo con papel absorbente. Se centrifug nuevamente para eliminar completamente el medio LB (Luria-Bertani) con la ayuda de un capilar. 5. Se resuspendi el pellet bacteriano en 100 l de la disolucin I, previamente enfriada en hielo, y se vorte vigorosamente hasta resuspenderlo. Solucin I. Tris-HCl EDTA, pH 8.0 Glucosa NOTA: se ajust el su uso. 25 mM 10 mM 50 mM pH a 8.0, con HCl 5N, se autoclav 15 minutos y se almacen a 4 C, hasta 10 ml (1 mM) 2 ml (40 g/l) 1 ml (50 g/l)

260

6. Se aadi 200 l de la disolucin de lisis (solucin II), se mezcl por inversin y se incub en hielo durante 5 minutos. Solucin II. SDS 1 % (p/v) NaOH 0.2 N NOTA: el SDS no se mezcl directamente en agua, para evitar su precipitacin. No autoclavar. 7. Se aadi 150 l de la disolucin de acetato de potasio pH 4.8 (solucin III), y se vorte vigorosamente durante 10 segundos. Solucin III. Acetato potsico cido actico glacial NOTA: no autoclavar. 3 M 5 M

8. Se aadi 450 l de la mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1), y se vorte vigorosamente durante un minuto. NOTA: preparacin del fenol: Se licu fenol en polvo a 68 C, en bao de agua. Una vez licuado, se aadi 8-hidroxiquinolina para una concentracin del 0.1% (p/v). Este compuesto de color amarillo es un antioxidante, un inhibidor parcial de RNasas y un quelante de metales inicos. Adems, el color amarillo facilit identificar las fases. Posteriormente, el fenol fue extrado varias veces con un volumen equivalente de tampn (usualmente Tris 1.0 M [pH 8.0], seguido por Tris 0.1 M [pH 8.0] y -mercaptoetanol), hasta que el pH de la fase acuosa fue > 7.6. NOTA: la solucin de fenol puede ser almacenada a 4 C, durante un mes. La mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico (24:1 v/v), se emple para eliminar protenas de las preparaciones de cidos nucleicos. El cloroformo desnaturaliz protenas, mientras que el alcohol isoamlico redujo la espuma durante la extraccin y facilit la separacin de las fases acuosa y orgnica. NOTA: la mezcla es estable y puede ser almacenada a temperatura ambiente. 9. Se centrifug a 12 000 r.p.m., por 5 minutos y se transfiri la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo. 10. Se aadieron 2.5 volmenes de etanol absoluto fro. Se mezcl por inversin y se dej precipitar en hielo durante una hora. 11. Se centrifug a 12 000 r.p.m., durante 5 minutos. NOTA: se puede obviar la hora de precipitacin en hielo y centrifugar inmediatamente durante 10 minutos a mxima velocidad. Esto evita que las sales precipiten junto con los cidos nucleicos. 12. Se lav el pellet resultante con 500 l de etanol al 70% (v/v), agitando por inversin y centrifugando 5 minutos. 13. Se decant y se sec el pellet bajo campana de extraccin. Con la ayuda de un capilar, se elimin todo residuo de agua y etanol, y se termin el secado incubando el pellet en la estufa a 37 C, durante 10 minutos. 14. Se resuspendi el pellet en 50 l de tampn TE 1X, adicionado con RNasa tipo A.

261

Tampn TE 1X, adicionado con RNasa tipo A. Tris-HCl pH 7.5 10 mM EDTA 0.5 M pH 8 1 mM RNasa tipo A 10 mg/ml NOTA: se esteriliz por autoclave antes de adicionar la RNasa. 15. Se incub a temperatura ambiente durante una hora antes de almacenarse a - 20 C. 16. De manera opcional, se aadi 0.5 l del stock de RNasa tipo A (10 mg/ml), y se incub a 37 C, durante 15 minutos. C. 2. LA DIGESTIN DE VECTORES. 1. Para verificar la presencia y determinar el tamao del cDNA clonado en el vector pBluescript, se procedi a digerir con las endonucleasas EcoRI y XhoI que flanquean a dicho inserto. La digestin del vector se realiz aadiendo a una alcuota del ADN plasmdico, los siguientes componentes del kit (para un volumen final de 10 l): Muestra de ADN plasmdico 5 g Tampn TE1X* o H2O Tampn H (Boheringer) Enzima EcoRI (Boheringer) Enzima XhoI (Boheringer) *se emple para ajustar al volumen final. 5.0 3.0 1.0 0.5 0.5 l l l l l

2. Se incub durante una hora a 37 C. NOTA: el tiempo de incubacin va en funcin de la concentracin del ADN empleado. Cada enzima presenta un tampn especfico y una temperatura ptima de actividad. 3. Se carg todo el volumen de digestin en un minigel de agarosa. NOTA: para preparar el marcador de peso molecular de peso conocido Lambda-ADN PstI, se digiri como se describe en la siguiente tabla, para un volumen final de 60 l: Muestra de Lambda-ADN 300 ng/l Tampn H (Roche) Enzima PstI (Roche) H2O Se incub toda la noche a 37 C. C. 3. MINIGEL DE AGAROSA. 1. Se fundi en horno de micro ondas, una mezcla de agarosa al 0.8% (p/v) en TAE 1X o TBE 1X. Y dej enfriar en campana de extraccin, antes de aadir 2.0 l de bromuro de etidio (stock 10 mg/ml). Con 50 ml de agarosa fundida fue suficiente para un gel pequeo. Tampn TAE 50X. Tris-base Acido actico glacial Na2EDTA. 2H2O H2O 242.2 g (2 M) 57.1 ml 37.2 g (200 ml 0.5 M) (0.1 M) hasta un litro 40 mM 1X 2 mM 1X 50 l 6 l 3 l 1 l

262

Tampn TBE 10X. Tris de Boehringer cido brico EDTA 0.5 M. pH 8 H2O

108 g 55 g 40 ml hasta un litro

89 mM 1X 89 mM 1X 2 mM 1X

2. Se verti el gel en la placa de electroforesis y se esper a que solidificase. La cmara electrofortica se llen con TAE 1X o TBE 1X, de tal forma que cubri todo el gel, incluidos los pocillos. 3. Se prepar la muestra de ADN a cargar, como a continuacin se describe: Tampn TE 1X Muestra de ADN o marcador lambda Tampn de corrida Sb 5X Tampn de corrida Sb 5X: Ficoll EDTA SDS Azul de bromofenol 2.0 l 2.0 l 2.0 l 30% (v/v) 40 mM pH 8 0.I % 0.25 % (p/v)

4. Se cargaron las muestras de ADN en el gel y se dej correr la electroforesis a 100 voltios. Y se observaron las bandas de ADN en el trans-iluminador de luz ultravioleta. C. 4. AMPLIFICACIN Y CLONAJE DE UN FRAGMENTO DE cDNA DE MAZ, PARTIENDO DE LA LIBRERA LAMBDA-ZAP II DE HOJA DE MAZ Y DE LOS FAGOS CRIBADOS QUE REACCIONARON CON EL ANTICUERPO. 1. Se realizaron dos reacciones de amplificacin, mezclando los siguientes componentes: NOTA: tambin se realiz una reaccin en paralelo con 1 l de la alcuota de cada fago positivo cribado con el anticuerpo, sin hacer dilucin. Librera de cDNA* 1 l (a partir de la dilucin) 5 l (a partir de la dilucin) dNTPs 1 l 1 l Primer GAP5** 1 l 1 l Primer GAP3** 1 l 1 l H2O 21 l 17 l *La dilucin del stock de la librera de cDNA fue de 1:10, en agua. **El stock del primer fue 100 M, en agua. 2. Las mezclas se incubaron en el termociclador a 95 C, durante 2 minutos. Y se colocaron en hielo. 3. Se aadieron los siguientes componentes: Buffer PCR 10X 5.0 l H2O 19.75 l Taq High Fidelity Polimerase 0.75 l 4. Se someti cada reaccin, al programa de amplificacin diseado para 25 ciclos con los primers GAP5 y GAP3 con el ADN genmico. Se carg cada producto de la reaccin, en un minigel de agarosa para observar los resultados.

263

D. SECUENCIACIN DE LOS CLONES OBTENIDOS EN LA EXCISIN IN VIVO DE LOS FAGOS POSITIVOS INMUNOCRIBADO. D. 1. PURIFICACIN DE ADN PLASMDICO. Este proceso fue empleado para las muestras de ADN plasmdico que se secuenciaron posteriormente. Partiendo de un volumen de 50 l de una extraccin de ADN plasmdico, extrado por miniprep y disuelto en agua o TE 1X adicionado con RNasa tipo A. 1. Se aadi a la muestra, 350 l de tampn TE 1X. 2. Se aadi 40 l de la solucin III; para obtener 1/10 de concentracin final, y se vorte vigorosamente. 3. Se aadi 350 l de una mezcla de fenol:cloroformo:isoamil-alcohol (25:24:1) y se vorte vigorosamente. 4. Se centrifug a 12 000 r.p.m., durante 5 minutos y se recuper la fase acuosa en un tubo eppendorf nuevo. 5. Se aadi a la fase acuosa un volumen de cloroformo puro y se vorte vigorosamente. 6. Se centrifug a 12 000 r.p.m., durante 5 minutos. Se recuper la fase acuosa en un tubo eppendorf nuevo. 7. Se le aadi a la fase acuosa 2.5 volmenes de etanol absoluto fro y se dej precipitar una hora a 4 C. 8. Se centrifug a 12 000 r.p.m., durante 5 minutos. 9. Se realiz un lavado al pellet obtenido, con 500 l de etanol al 70% (v/v). 10. Se resuspendi el pellet en 10 l de agua bidestilada estril. 11. Se tomaron 7.0 l de la suspensin en agua y se aadi de 30 a 40 L de tampn TE 1X (dependiendo de la concentracin), y se almacen a - 20 C. Al volumen restante (3.0 l), se le aadi un volumen de agua y se envi a secuenciar. D. 2. PRECIPITACION DE ADN PLASMDICO. Partiendo de un volumen de 40 l de una extraccin de ADN plasmdico, extrado por miniprep y disuelto en agua o TE 1X. 1. Se aadi 2.5 volmenes de etanol absoluto. 2. Se aadi 1/10 de la solucin III y se mezcl. 3. Se incub durante 5 minutos en hielo. 4. Se centrifug 10 minutos a mxima velocidad. 5. Se decant y se lav el pellet, en 500 l de etanol 70% (v/v). 6. Se dejo secar el pellet. 7. Se resuspendi el pellet resultante en 10 l de agua. 264

8. Se tomaron 3 l de la muestra y ajust con agua al doble del volumen. Se envi a secuenciar. 9. Los 7 l restantes, se resuspendieron en 35 l de TE1X, y se almacenaron a - 20 C. 10. La secuenciacin se llev a cabo de forma automtica utilizando el ABI Prism 377 DNA Sequencer en el Servicio de Secuenciacin del IBMB, Consorci-IRTA, CSIC de Barcelona. Las secuencias obtenidas fueron procesadas con el Software GCG (Genetics Computer Group, Madison, WI, USA). E. LA TCNICA RACE PARA OBTENER LOS FULL-LENGHT DE LOS cDNAs PARCIALES DE LAS TRANSGLUTAMINASAS DE MAIZ OBTENIDAS DE LA LIBRERA FGICA DE EXPRESIN LAMBDA ZAP II. E. 1. EXTRACCIN DE ARN TOTAL DE PLANTAS (PARA LA TCNICA RACE). MTODO FENOL - SDS: El mtodo descrito a continuacin, puede ser empleado para preparar ARN de diversos tejidos eucariotas. ste protocolo est divido en dos etapas: (1) la lisis celular y la eliminacin de protenas mediante la extraccin por fenol/SDS, y (2) la separacin del ARN, del ADN y otras impurezas por precipitacin selectiva en alta concentracin de sales, utilizando LiCl. El uso de fenol en preparaciones de ARN, proviene del mtodo descrito por Kirby (1968). Mientras que el uso de fenol/SDS, fue tomado directamente del protocolo desarrollado por Palmiter (1974). El factor crtico del aislamiento de ARN, es la inactivacin de las RNasas endgenas del tejido y la prevencin de la introduccin de RNasas exgenas. Para ello, el agua, el acetato sdico y las soluciones de LiCl, deben ser tratadas previamente con DEPC (di-etil-pirocarbonato), para inhibir las RNasas. Aplicando 500 l de DEPC (disuelto en etanol absoluto) por cada 500 ml de agua, agitando vigorosamente en campana de extraccin, incubando durante 2 horas para que el DEPC haga su efecto y autoclavando posteriormente para inactivarlo, ya que el DEPC es un supuesto agente carcinognico. Todo material empleado debe ser esterilizado en estufa y se debe trabajar con guantes y bajo condiciones de mayor higiene posible en el laboratorio, con la finalidad de prevenir la introduccin de RNasas exgenas. La calidad tambin vara debido a diferentes niveles de carbohidratos y metabolitos secundarios en el tejido utilizado, pues el trabajar con muestras de tejidos vegetales, puede implicar un alto contenido de material fibroso y niveles altos de carbohidratos, lo que dificulta la extraccin. El rendimiento de ste mtodo vara dependiendo del tipo de tejido vegetal, cuyo rango va desde 3 mg hasta 7 mg de ARN total a partir de 15 gramos de tejido. PRIMERA ETAPA: Lisis celular y eliminacin de protenas. 1. Se colect la muestra de tejido vegetal y se congel inmediatamente en Nitrgeno lquido. Se pes 15.0 g de tejido y se tritur con la ayuda de cuarzo en polvo, en mortero previamente enfriando en Nitrgeno lquido, hasta obtener un polvo fino. Se evit la descongelacin del tejido, aadiendo al mortero Nitrgeno lquido cuando fue necesario. 2. Se transfiri inmediatamente el polvo a una botella Nalgene de 500 ml, que contena 150 ml de tampn de trituracin mezclado con 50 ml de fenol equilibrado en TLE.

265

Tampn de trituracin: Tris-HCl LiCl EDTA SDS pH (ajustado con HCl) Solucin TLE: Tris-HCl LiCl EDTA pH (ajustado con HCl)

0.18 M 0.09 M 4.5 mM 1% (p/v) 8.2 0.2 M 0.1 M 5.0 mM 8.2

NOTA: el fenol licuado se equilibr con solucin TLE, en el da de su preparacin, en una proporcin de 250 ml por cada 15 g de Fenol preparado. Se extrajo con igual volumen de solucin TLE, adicionando 0.5 ml de NaOH 15 M, y posteriormente se extrajo dos veces ms con solucin TLE sin NaOH. 3. Se homogeneiz la mezcla durante dos minutos a velocidad moderada y se aadi 50 ml de cloroformo puro. No fue necesario aadir alcohol isoamlico al cloroformo. 4. Se incub a 50 C, durante 20 minutos, y en agitacin suave. NOTA: todas las extracciones donde se emplea Fenol equilibrado con TLE y cloroformo, deben manipularse en botellas resistentes a stos qumicos. 5. Se centrifug a 10 000 r.p.m., durante 20 minutos a 4 C. 6. Se recuper el mayor volumen que fue posible de la fase acuosa, evitando que se mezclara con la interfase, y se transfiri a una botella nueva Nalgene de 250 ml. 7. Se aadi 50 ml de Fenol equilibrado con TLE y se mezcl bien. 8. Se aadi 50 ml de cloroformo puro y se agit vigorosamente. 9. Se centrifug la mezcla a 10 000 r.p.m., durante 15 minutos a 4 C. 10. Se recuper la fase acuosa en un nuevo recipiente. 11. Se repitieron los pasos 7 al 10, hasta eliminar la interfase. Generalmente despus de tres extracciones. Esto dependi de la manipulacin, durante la recuperacin de la fase acuosa. 12. Se aadi 50 ml de cloroformo puro a la fase acuosa y se mezcl. NOTA: el cloroformo remueve las trazas de Fenol que pudieran permanecer en la fase acuosa, el cual interferira en la siguiente etapa de precipitacin selectiva con Cloruro de Litio. 13. La mezcla se centrifug a 10 000 r.p.m., durante 15 minutos a 4 C. 14. Se recuper la fase acuosa. SEGUNDA ETAPA: Precipitacin selectiva del ARN con LiCl. 1. Se le aadi un tercio de LiCl 8 M, del volumen obtenido de fase acuosa en la etapa anterior, para obtener una concentracin final 2 M de LiCl. 2. Se dej precipitando toda la noche a 4 C. 3. Se colect el precipitado por centrifugacin a 10 000 r.p.m., durante 20 minutos a 4 C. 4. Se lav el pellet con 5 ml de LiCl 2 M.

266

5. Se resuspendi el pellet con 5 ml de agua tratada con DEPC y 1.67 ml de LiCl 8 M, para obtener una concentracin final 2 M de LiCl. 6. Se transfiri la mezcla a un tubo Sarstedt estril de 50 ml y se dej precipitando a 4 C, durante dos horas como mnimo. 7. Se recuper el ARN por centrifugacin a 10 000 r.p.m., durante 20 minutos a 4 C. 8. Se lav el pellet resultante con 5 ml de LiCl 2 M. 9. Se resuspendi el pellet en 2 ml de agua tratada con DEPC. Se aadi 200 l de acetato sdico 3 M, para obtener 0.1 M y 5.5 ml de etanol absoluto, para obtener etanol al 70 %. NOTA: el acetato sdico elimina los polisacridos que precipitan con el ARN. 10. Se dej precipitar a 20 C, durante toda la noche. NOTA: el ARN puede almacenarse en etanol a 20 C 70 C, indefinidamente. 11. Se recuper el ARN, centrifugando a 10 000 r.p.m., durante 15 minutos a 4 C. 12. Se resuspendi el pellet de ARN, en 1.0 ml de agua tratada con DEPC. Se almacen a 80 C. 13. Para cuantificar, se tom una alcuota de la resuspensin de ARN en agua (2 l de ARN) y se mezcl con 198 l de agua. Se midi la absorbancia a 260 y 280 nm. NOTA: la unidad de densidad ptica a 260 nm, equivale a 40 g/ml de ARN. E. 2. PURIFICACIN DEL ARN POLIADENILADO. IMPORTANTE: ste mtodo est diseado para emplear de 150 a 200 g de ARN total. Sin embargo, se utilizaron 1523.5 g (1.52 mg) de ARN total, de la muestra extrada por el mtodo Fenol/SDS en hoja adulta de maz. 1. Se prepar la columna poli-dT, mediante los siguientes lavados: NOTA: los lavados slo son necesarios cuando la columna ha sido utilizada anteriormente con otras muestras. La columna puede ser reutilizada hasta siete veces. Se separaron los componentes de la columna (la solucin eluyente y las partculas cargadas de poli-dT), bajo el campo magntico de un imn y se retir todo el eluyente con la ayuda de una micropipeta. NOTA: no eliminar el eluyente. Se resuspendi la columna con 1 ml de agua tratada con DEPC y procedi a la accin descrita en el paso anterior (a). Se resuspendi la columna, con NaOH 0.1 N (con el fin de eliminar ARN contaminante de otras muestras de tejido) y se procedi como se describe en el primer paso (a). Se realiz un lavado ms con NaOH 0.1 N. Se resuspendi y se lav nuevamente la columna, en 1 ml de agua tratada con DEPC tal y como se describe en el primer paso (a). Se resuspendi y se lav la columna, en 500 l de 2X Binding Buffer. Se resuspendi nuevamente la columna, en 500 l de 2X Binding Buffer y se verific el pH con cinta marcadora. NOTAS: el color de la cinta marcadora debe ser marrn (pH cido). Es fundamental asegurarse de que, entre cada lavado, la columna de poli-dT quede bien seca para mantener el pH y la concentracin de sales, adecuado. Una vez verificado el pH, se descart el eluyente (2X Binding Buffer) y se resuspendi en 250 l de 2X Binding Buffer. La columna se incub una hora en hielo. NOTA: la columna est preparada para ser utilizada. 2. Se mezcl 275 l de la extraccin de ARN total (que equivali a 1.52 mg de ARN total de hoja adulta de maz), con 25 l del 2X Binding Buffer, para obtener un volumen final de 300 l.

267

3. Se incub la mezcla a 65 C, durante 2 minutos. Y se coloc en hielo inmediatamente. 4. Se verti la mezcla en la columna, obtenindose un volumen final de 550 l. 5. La columna se incub a temperatura ambiente en el rotador. NOTA: cuando se trata con muestras de ARN vegetal son necesarios 20 minutos de incubacin, en el caso de muestras provenientes de tejidos animales se requiere de menor tiempo de incubacin. Con esta accin, queda adherido el ARN poliadenilado al poli-dT. 6. Se descart el eluyente (ARN no poliadenilado), bajo el mismo sistema de imn descrito en la primera parte (1a). NOTA: no eliminar el eluyente, ya que puede contener an ARN poliadenilado. Colocarlo en hielo. 7. La columna de poli-dT se lav, aadiendo 500 l de Washing Buffer. Dando un pulso de centrfuga y resuspendiendo con la ayuda de la punta de una micropipeta. 8. Se descart el eluyente (Washing Buffer), con el sistema de imn descrito. 9. Se repiti el lavado en Washing Buffer. 10. Se aadi a la columna, 25 l de tampn de elucin (Elution solution) y se resuspendi con la ayuda de una micropipeta. 11. Se incub a 65 C, durante 2 minutos. 12. Se recuper el eluyente de la columna con el sistema de imn descrito, el cual contena ya el ARN poliadenilado (los ARN mensajeros) purificado, vertindose en un tubo eppendorf nuevo. 13. Para hacer un rendimiento, se resuspendieron en la columna otros 25 l de solucin de elucin, se incub a 65 C, durante 2 minutos y se recuper el eluyente en el mismo tubo colector eppendorf, para obtener un volumen final de 50 l. E. 3. CUANTIFICACIN DEL ARN POLIADENILADO. 1. Se realiz un espectro de absorcin entre 200 y 300 nm, con una alcuota del eluyente recuperado en la etapa anterior (5 l de ARN poliadenilado en 195 l de agua). Tomando en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm, equivale a 40 g/ml de ARN. IMPORTANTE: se obtuvieron con este proceso, 132.8 g/ml (0.132 g/l) de ARN poliadenilado. E. 4. SNTESIS DE LA PRIMERA CADENA DE cDNA A PARTIR DE ARN MENSAJERO. Se puede emplear ARN total, pero en caso de que el ARN mensajero se exprese en niveles muy bajos, es necesario emplear el ARN poliadenilado. 1. Se aadieron los siguientes componentes de la reaccin, a un volumen de 15.5 l: GSP1 (gene-specific primer 1) 10 a 25 ng 1.0 l La muestra de ARN (poliadenilado) 1.0 a 5.0 g 7.8 l H2O tratada con DEPC Aforar hasta 15.5 l 6.7 l NOTA: el stock del primer 1, est a 100 M en agua tratada con DEPC.

268

NOTA: el GSP1 (primer 1), se encuentra ubicado en la posicin 180 - 165 pb del cDNA parcial obtenido de 1744 pares de bases, y presenta la siguiente secuencia nucleotdica: 5-GATTCTCCGTGATAAG- 3 . 2. Se incub la mezcla durante 10 minutos a 70 C, para desnaturalizar el ARN. 3. Se dio un pulso de centrfuga y se coloc en hielo. 4. Se aadieron los siguientes componentes (volumen de 24 l): Tampn de PCR 10X 2.5 l MgCl2 25 mM 2.5 l dNTPs MIX 10 mM 1.0 l DTT 0.1 M 2.5 l 5. Se mezcl suavemente y se dio un pulso de centrfuga. 6. Se incub la mezcla a 42 C, por un minuto. 7. Se aadi 1.0 l (200 unidades) del enzima Transcriptasa reversa (Super Script II RT), obtenindose un volumen final de 25 l. 8. Se mezcl suavemente y se incub a 42 C, durante 50 minutos. NOTA: para transcritos menores de 4 Kb, es suficiente con incubar 30 minutos a 42 C. Y para transcritos de mayor tamao, se requiere por lo menos 50 minutos. Aunque no es conveniente excederse en el tiempo de incubacin (polimerizacin), pues con fragmentos demasiado grandes se dificultar su posterior manipulacin. 9. La incubacin se transfiri a 70 C, por 15 minutos, para detener la reaccin. Se dio un pulso de centrfuga y se coloc la mezcla a 37 C. 10. Se aadi 1 l de RNasa MIX y se mezcl suavemente. Se incub por 30 minutos a 37 C, para eliminar el templado (ARN mensajero). Se dio un pulso de centrfuga y se coloc la mezcla en hielo. NOTA: en este momento se puede almacenar a -20 C. E. 5. PURIFICACION DE LA CADENA SENCILLA DEL cDNA (QIAquick Spin Purification Kit). 1. Se aadieron cinco volmenes (es decir 125 l) del tampn PB, al volumen de la reaccin final de la etapa anterior (ADN de cadena sencilla). Y se verti la mezcla en un tubo columna (QIAquick Spin Purification Kit). 2. Se coloc el tubo columna dentro de un tubo de 2 ml (tubo colector). 3. Para adherir el ADN a la columna, se aplic a la muestra, una presin con la ayuda de una perilla de pipeta Pasteur, hasta que se realiz completamente el filtrado. Se repiti el filtrado una vez ms. El tercer filtrado se realiz al centrifugar a mxima velocidad, durante un minuto. 4. Se descart el eluyente y se coloc la columna sobre el mismo tubo colector. 5. Para hacer los lavados, se aadi a la columna 0.75 ml del tampn PE y se centrifug durante un minuto. NOTA: este tampn debe contener etanol. 6. Una vez centrifugado, se descart el eluyente y se coloc la columna sobre el mismo tubo colector. NOTA: el etanol residual puede haber permanecido en la columna, para ello se realiz una centrifugacin adicional.

269

7. Se coloc la columna en un tubo colector nuevo. Para eluir el ADN, se aadi justo en el centro de la columna, 50 l de tampn EB (Tris-HCl 10 mM pH 8.5). NOTA: tambin puede utilizarse agua como eluyente. 8. Se centrifug durante un minuto a mxima velocidad. 9. Para hacer un rendimiento, se aadi nuevamente tampn EB (30 l) a la columna y se centrifug. NOTA: si se emplearon 50 l del tampn de elucin (EB), se obtendrn aproximadamente 48 l de volumen final. La eficiencia de la elucin depende del pH, siendo el ptimo entre 7.0 y 8.5. Cuando se emplea agua como eluyente, es necesario ajustar su pH y almacenar a 20 C, ya que se degrada. Tambin se puede eluir en tampn TE, aunque el EDTA puede inhibir las subsecuentes reacciones enzimticas. E. 6. SNTESIS DE ADAPTADORES Y SNTESIS DE LA SEGUNDA CADENA DE ADN (TdT; Tailing de cDNA). 1. Se aadieron los siguientes componentes de la reaccin, a un volumen de 24 l: cDNA de cadena sencilla purificado dCTP 2 mM Tailing Buffer 5X H2O 10.0 l 2.5 l 5.0 l 6.5 l

2. Se incub a 94 C, durante 2 minutos. Para desnaturalizar el ADN. 3. Se le dio un pulso de centrifuga y se coloc en hielo. 4. Se aadi 1 l del enzima Terminal deoxi-transferasa. 5. Se incub a 37 C, durante 10 minutos. 6. Se inactiv el enzima, incubando a 65 C, durante 10 minutos. 7. Se le dio un pulso de centrfuga y se coloc en hielo. 8. Para la sntesis de la segunda cadena del cDNA y amplificacin del mismo por PCR, se llevaron a cabo las siguientes pruebas de reaccin en microtubos para termociclador: Reaccin 1, aadir: Tailed cDNA obtenido en el paso anterior dNTPs 10 mM Primer AAP (abridged anchor-primer) GSP1 (gene-specific primer 1) H2O 5.0 l 1.0 l 1.0 l 1.0 l 17 l

Reaccin 2, aadir: Tailed cDNA obtenido en el paso anterior 5.0 l dNTPs 10 mM 1.0 l Primer AAP (abridged anchor-primer) 1.0 l GSP2 (gene-specific primer 2) 1.0 l H2O 17 l NOTA: el stock del primer 2, es 100 M en agua tratada con DEPC.

270

NOTA: el GSP2 (primer 2), ubicado en la posicin 131 - 114 pb del cDNA parcial obtenido de 1744 pares de bases, y presenta la siguiente secuencia nucleotdica: 5-GTTCTCCAGCATCTCCAG- 3 . NOTA: el primer AAP (5 RACE abridged anchor-primer GIBCO BRL), especfico para ADN, presenta la siguiente secuencia nucleotdica: 5-GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG- 3. Cdigo: AUAP (I: Inosina). 9. Se incub en termociclador a 94 C, durante 2 minutos (Nota: 5 minutos como mximo), para desplegar la cadena de ADN. Y se mantuvo en hielo. 10. Se aadi a cada reaccin los siguientes componentes, obteniendo un volumen final de 50 l: Buffer PCR 10X H2O Enzima polimerasa (Taq DNA Polimerase) 5.0 l 19.5 l 0.5 l

11. Cada tubo de reaccin se someti a los siguientes ciclos de amplificacin (tcnica de PCR): PROGRAMA DISEADO PARA 34 CICLOS CON LOS PRIMERS AAP Y GSP1: GRADOS CELSIOS 94 45 72 TIEMPO 30 segundos 30 segundos 2 minutos

PROGRAMA DISEADO PARA 34 CICLOS CON LOS PRIMERS AAP Y GSP2: GRADOS CELSIOS 94 55 72 TIEMPO 30 segundos 30 segundos 2 minutos

12. Al finalizar los 34 ciclos, el programa del termociclador dio un perodo de 7 minutos de incubacin a 72 C, y posteriormente permaneci a 5 C, hasta la colecta de los tubos. 13. Se carg en un minigel de agarosa, cada muestra, para observar el producto final de la tcnica RACE, obtenido por PCR en el paso anterior. NOTA: una vez observada la banda, se llev a cabo la elucin en un gel estndar o de bajo punto de fusin. Posteriormente, se lig el fragmento 5 del cDNA en un vector (pGEM-T para productos de PCR), y se transformaron clulas competentes, con dicho componente. Ms adelante se realizaron cultivos, para el aislamiento de plsmidos (MINIPREPS) y se purificaron para su posterior secuenciacin. 14. Conociendo la secuencia de nucletidos de la regin 5 obtenida en sta tcnica, si an no se obtuvo el full-lenght, se disearon dos nuevos oligos en tandem a partir de dicha regin 5 .Y se contino a partir del paso 8 de ste proceso. NOTA: el GSP3 (primer 3), ubicado en la posicin 93 - 74 del cDNA parcial de 1925 pares de bases, obtenido de la librera fgica y del ARNm mediante la tcnica RACE; presenta la siguiente secuencia nucleotdica: 5-GCTGAGAGCCCGAGCCTGAG- 3 .

271

NOTA: el GSP4 (primer 4), ubicado en la posicin 61 - 41 del cDNA parcial de 1925 pares de bases, obtenido de la librera fgica y del ARNm mediante la tcnica RACE; presenta la siguiente secuencia nucleotdica: 5-GAGGAAGATGAAGAAACAGCG- 3 . E. 7. ELUCIN DE BANDAS DE ADN EN GELES ESTNDAR O DE BAJO PUNTO DE FUSIN. Para recuperar fragmentos de ADN del rango de 70 pb y hasta 10 Kb, se utilizaron los kits de QIAGEN (QIAquick Gel Extraction kit Protocol) o de MACHEREY-NAGEL (NucleoSpin Extract kit), usando microcentrfuga. 1. Se carg 30 l de la muestra de PCR en un carril ancho de un gel de agarosa al 0.8% (p/v), en TAE 1X o TBE 1X, aadiendo 6.0 l de tampn de corrida Sb 5X a dicha muestra. 2. Se aplic corriente (100 voltios), hasta quedar perfectamente separadas las bandas, correspondientes al vector e inserto. 3. Con la ayuda de un bistur y sobre el trans-iluminador de luz ultravioleta, se extrajeron del gel de agarosa, las bandas ADN de inters (vector o inserto), eliminando en lo mayor posible el exceso de agarosa y depositndolo dentro de un tubo eppendorf para pesarlo. 4. Se aadieron 3 volmenes del tampn GQ. NOTA: el volumen mximo del tampn debe ser de 800 l. 5. Se incub a 50 C, para fundir el agarosa, y se observ su color. NOTA: el color amarillo del tampn GQ indica un pH 7.5. Si da una coloracin naranja o violeta se debe aadirse 10 l de acetato de sodio 3 M, pH 5.0 y mezclar. 6. Se dejo enfriar a temperatura ambiente y se le dio un pulso de centrfuga. 7. Se filtr en columna de ADN, aplicando presin con la ayuda de una perilla de pipeta Pasteur. Se realizaron tres rendimientos antes de centrifugar, sin cambiar de tubo colector. 8. Se centrifug a mxima velocidad, durante 30 segundos. Y se elimin el contenido del tubo colector. NOTA: el ADN ha quedado fijado a la columna. 9. Se aadi a la columna, 500 l del tampn GQ y se centrifug nuevamente a mxima velocidad, para lavar la columna de residuos de agarosa. 10. Se lav la columna con 750 l de tampn PE, y se centrifug a mxima velocidad. NOTA: si la banda a eluir se va a emplear para una reaccin de ligacin en un vector, se debe incubar de 2 a 5 minutos antes de centrifugar nuevamente a mxima velocidad. 11. Se le dio un pulso de centrfuga a baja velocidad para eliminar completamente el alcohol que contiene el tampn PE. 12. Se coloc la columna sobre un tubo colector nuevo y se eluy el ADN fijado a la columna, con 30 l del tampn EB, mediante una centrifugacin a mxima velocidad. 13. Se hizo un rendimiento, aplicando 20 l del tampn EB a la columna y centrifugando de nuevo.

272

E. 8. CLONAJE DE PRODUCTOS DE PCR EN EL SISTEMA pGEM-T Easy. IMPORTANTE: Las proporciones adecuadas entre el vector e inserto son 1:1, 1:3 y 1:5, respectivamente. 1. Se realiz la mezcla de reaccin de ligacin a un volumen final de 20 l, con los siguientes componentes de la reaccin: Producto de la PCR (Inserto) o banda purificada por columna QIAGEN o MACHEREY-NAGEL Vector (pGEM-T) Enzima ADN T4 Ligasa 2X Rapid Ligation Buffer H20 3.0 l 1.0 l 1.0 l 10.0 l 5.0 l 5.0 l 1.0 l 1.0 l 10.0 l 3.0 l 8.0 l 1.0 l 1.0 l 10.0 l 0.0 l

3. Se incub a 16 C en bao de agua en tubo eppendorf o termociclador en tubo para PCR, por toda la noche. 4. Se transformaron por choque trmico, clulas competentes de la cepa DH5-. NOTA: no se aadi ms del 10 % del volumen de clulas competentes, del producto de la reaccin de ligacin. 5. Se realiz el cribado de las bacterias transformadas en placas con medio LB (Luria-Bertani) adicionado con el antibitico adecuado. E. 9. PREPARACIN DE CLULAS COMPETENTES DE Escherichia coli (CEPA DH5). Para transformar bacteria con el plsmido apropiado, fue necesario preparar clulas bacterianas competentes para ser transformadas. 1. En 3 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido, se inocul una colonia aislada de la cepa DH5, obtenida previamente en placa con LB (Luria-Bertani)-agar. Se dej crecer a 37 C, en agitacin vigorosa (250 r.p.m), durante toda la noche (16 a 18 horas). 2. Se inocul 1 ml del precultivo, en un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contena 100 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido y se incub a 37 C, durante dos horas a 250 r.p.m., o hasta obtener una densidad ptica de 0.4, a 600 nm. 3. Se enfri el cultivo en hielo, durante 30 minutos. 4. Se transfiri el cultivo en dos tubos Falcon estriles de 50 ml, previamente enfriados en hielo, y se centrifug a 4000 r.p.m., por 10 minutos, a 4 C. 5. Se decant el medio LB (Luria-Bertani) y el pellet fue resuspendido cuidadosamente con 15 ml de Tampn TFB1, para cada 50 ml de cultivo. KOAc 30 mM MnCl2 50 mM CaCl2 10 mM RbCl 100 mM Glicerol 15 % pH 5.8 NOTA: Se ajust el pH con cido actico. Se esteriliz por filtracin. NOTA: almacenar a 4 C. 6. Se mantuvo la suspensin en hielo por 10 minutos y se centrifug nuevamente como en el paso 4.

273

7. Se decant, eliminando por completo el sobrenadante. 8. Se resuspendi el pellet, cuidadosamente con 2 ml de Tampn TFB2, enfriado previamente en hielo. MOPS 1M CaCl2 75 mM RbCl 10 mM Glicerol 15 % pH 7.0 NOTA: Se ajust el pH con NaOH. Se esteriliz por filtracin. NOTA: almacenar a 4 C. 9. Se hicieron alcuotas de 100 l por tubo Eppendorf. Se congelaron en nitrgeno lquido y se almacenaron a 80 C, hasta su utilizacin. NOTA: para verificar la eficiencia de las clulas competentes, se utiliz 10 ng de plsmido control. Una eficiencia adecuada estar entre el 6 7 rango de 10 y 10 transformantes por g de ADN. E. 10. TRANSFORMACIN DE CLULAS COMPETENTES POR CHOQUE TRMICO. Partiendo de una alcuota de clulas competentes de una cepa especfica: DH5-ALFA o BL21. 1. La alcuota de clulas competentes fue descongelada en hielo. 2. Se le aadi a la alcuota, 10 l de la reaccin de ligacin o de la construccin. 3. Se incub la suspensin en hielo por 30 minutos. 4. Se incub la suspensin a 42 C, por 2 minutos. 5. Se incub la suspensin nuevamente en hielo, por 10 minutos. 6. Se aadi 800 l de medio SOB para la cepa DH5-ALFA, o 800 l medio SOC para la cepa BL21. Medio SOB: Bacto-triptona Extracto de levadura NaCl KCl MgCl2* MgSO4* 2% (p/v) 0.5% (p/v) 10 mM 2.5 mM 10 mM 10 mM

Medio SOC: Bacto-triptona 2% (p/v) Extracto lavadura 0.5% (p/v) NaCl 10 mM KCl 10 mM MgCl2* 20 mM MgSO4* 20 mM Glucosa* 20 mM NOTA: sin ajustar el pH, y se esteriliz en autoclave. *esterilizar por filtracin. 7. Se incub la suspensin a 37 C, en agitacin (200 r.p.m.), durante una hora. 8. Se sembraron alcuotas de 100, 300, 400 L del cultivo, en una placa de Petri con medio selectivo. NOTA: para el caso de pBluescript, el medio LB (Luria-Bertani)-agar adicionado con IPTG, X-gal y ampicilina.

274

9. Se incubaron las placas, toda la noche en estufa a 37 C. 10. Una vez crecidas las colonias, se realiz el cribado de colonias para proceder a aislar ADN plasmdico, como se indic en la tcnica miniprep. KIT DE TRANSFORMACIN DE CLULAS SUPERCOMPETENTES (Epicurian Coli SoloPack Gold Supercompetent Cells), STRATAGENE. Este Kit es ideal para la transformacin con plsmidos de tamao grande, incrementa la posibilidad de clonar full-lenght, presenta un 20 a 30% de mayor eficiencia que los mtodos 9 convencionales (1X10 transformantes/g ADN), las clulas competentes previenen la recombinacin, y forman colonias de tamao grande y de rpido crecimiento. 1. Dos tubos de SoloPack Gold cells fueron descongelados en hielo. El primer tubo fue para efectuar la transformacin experimental y el segundo tubo fue el control de transformacin. 2. Cuando el cultivo estuvo descongelado, se giraron los tubos suavemente para mezclar las clulas. 3. Se aadi 1.0 L del Mix de -mercapto etanol (XL10-Gold Kit). 4. Se giraron los tubos suavemente y se incubaron en hielo durante 10 minutos, mezclndolos suavemente cada dos minutos. 5. Se aadi 0.01 a 50 ng de la muestra de ADN a uno de los tubos y se mezcl nuevamente. Al otro tubo, se le aadi 1.0 L del plsmido control pUC18 (diluido 1:10 con agua estril) y se mezcl. NOTA: la concentracin aproximada de las muestras de ADN fue de 0.5 g/l. Se trabaj con 25 ng, por lo que la muestra de ADN se diluy 1:10 en agua estril y se aplicaron 0.5 l a las clulas competentes. 6. Se incubaron los tubos en hielo durante 30 minutos. 7. Se dio el choque trmico, incubando los tubos en un bao de agua a 54 C, durante 60 segundos. 8. Se incubaron en hielo por 2 minutos ms. 9. Se aadi a cada tubo, 150 l de medio NZY+ (precalentado a 42 C) y se incub a 37 C, durante una hora en agitacin (250 r.p.m.). NOTA: para el tubo control (clulas transformadas con el plsmido pUC18), se debe aadir 200 l de medio NZY+. Medio NZY+ (para 1000 ml): Hidrolizado de casena Extracto de levadura NaCl pH MgCl2 1 M* MgSO4 1 M* Glucosa 20% (p/v)* *esterilizar por filtracin. 10 g 5.0 g 5.0 g (85.5 mM) 7.5 12.5 ml (12.5 mM) 12.5 ml (12.5 mM) 20 ml (0.4 %)

10. Se plaquearon 200 l (o menos), de la transformacin experimental en una placa de Petri con el antibitico apropiado, adicionado con X-gal e IPTG. 11. Se plaquearon 5.0 l del control de transformacin. NOTA: el plsmido control pUC18, confiere resistencia a ampicilina.

275

12. Una vez crecidas las colonias, se realiz el cribado de colonias para proceder a aislar ADN plasmdico, como se indic en la tcnica miniprep. F. OBTENCIN Y TITULACIN DE UN ANTICUERPO POLICLONAL CONTRA UN PPTIDO DEL EXTREMO CARBOXILO TERMINAL DE LAS TRANSGLUTAMINASAS DE MAZ OBTENIDAS. F. 1. LA OBTENCIN DEL PEPTIDO CONJUGADO A LA PROTENA KLH. La secuencia peptdica correspondi a 20 aminocidos de la regin carboxilo terminal (Q-485 a A-504; en TGZ15, Q-538 a A-557; en TGZ21) de los enzimas transglutaminasas de maz clonadas anteriormente, y adicionando dos aminocidos en cada extremo: H-QMQRKHLLLHHHRQHHIPPA-C. El pptido sintetizado fue conjugado a la protena KLH o BSA; a razn de 27 moles de pptido por cada mol de protena (Servicio de Sntesis de Pptidos de la Universidad Pompeu Fabra, Barcelona). El conjugado a la KLH fue inoculado en conejo como a continuacin se describe: se realizaron cuatro inoculaciones; la primera inmediatamente despus de la extraccin del suero preinmune, la segunda a los 19 das, la tercera a los 33 das y la cuarta a los 53 das posteriores al primer inoculo. Se realizaron tres extracciones de suero; el preinmune, a los 40 das y a los 61 das despus de realizado el primer inoculo (Servicio de obtencin de anticuerpos del CID de Barcelona). F. 2. TITULACIN DEL ANTICUERPO POLICLONAL CONJUGADO A LA KLH (PAB/18QA). MTODO DMP (Dimetil pimelidato dihidro-cloruro). 1. Se aadi una capa de 100 l de una solucin de antgeno 1 g/ml en tampn carbonato 0.05 M pH 9.6 a cada pocillo de una placa Nunc Maxisorp. Capa de solucin de antgeno: Pptido conjugado a BSA 1 mg/ml en PBS 10 1.2 l mM pH 7.5 Tampn carbonato 0.05 M pH 9.6 12 ml Tampn carbonato, 0.05 M, pH 9.6, para 500 ml: Na2CO3 0.795 g NaHCO3 1.465 g NOTA: se ajust el volumen con H2O MilliQ y se ajust el pH con HCl 1 N o NaOH 1N. Se almacen a 4 C. 2. Se incub toda la noche a 4 C. 3. A temperatura ambiente se prepararon diluciones del suero de conejo en una placa para microtitulo DASLAB, como a continuacin se describe; El stock de anticuerpo fue una dilucin inicial de 1:1000 en PBST (1 l de suero en 999 l de PBST). PBS 10 mM pH 7.5, para 1000 ml: NaCl KH2PO4 Na2HPO4 KCl pH (HCl 1 N o NaOH 1 N) 80 g 0.2 g 1.14 g 0.2 g 7.5

276

NOTA: ajustar el volumen con H20 MilliQ y almacenar a 4 C por 1 a 2 meses. Tween-20, 5 %: Tween-20 H2O MilliQ PBST 10 mM pH 7.5: PBS 10 mM pH 7.5 Tween-20, 5 % NOTA: almacenar a 4 C por 1 a 2 meses. 25 ml 475 ml 495 ml 5 ml

A partir de la dilucin inicial, se prepar una serie de diluciones como se describe en la siguiente tabla: A B C D E F G H 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 cero 300 l de dilucin inicial de suero. Se transfiere 150 pocillo B. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se transfiere 150 pocillo C. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se transfiere 150 pocillo D. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se transfiere 150 pocillo E. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se transfiere 150 pocillo F. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se transfiere 150 pocillo G. 150 l de suero y 150 l de PBST. Se descartan 150 l. 150 l de PBST. l al l al l al l al l al l al

4. Una vez preparadas las diluciones en la placa DASLAB, se realizaron 5 ciclos de lavado de los pocillos de la placa Nunc Maxisorp, con 300 l de PBST, y se aplic 100 l de cada dilucin de suero a cada pocillo. 5. Se cubri la placa con la cubierta plstica adhesiva y se incub por 30 minutos a temperatura ambiente. 6. Se realizaron 5 lavados con 300 l de PBST 10 mM y se aplic 100 l de una solucin de anticuerpo secundario. NOTA: solucin de anticuerpo secundario (anti-Rabbit IgG conjugado a la peroxidasa SIGMA); 2 l de anti-Rabbit IgG en 12 ml de PBST 10 mM (1:6000). 7. Se cubri la placa Nunc y se incub 30 minutos a temperatura ambiente. 8. Se realizaron 5 lavados con 300 l de PBST 10 mM. 9. Se agreg 100 l de solucin sustrato, se cubri la placa protegindola de la luz y se incub por 30 minutos a temperatura ambiente. Solucin sustrato: H2O2 1% 48 l TMB 0.6% 192 l Tampn citrato 12 ml Tetrametil bencidina (TMB) 0.6 %: TMB 6 mg DMSO 1 ml NOTA: almacenar a temperatura ambiente protegida de la luz.

277

Tampn citrato 0.04 M, pH 5.5, para 500 ml: Citrato de Sodio 6.8 g NOTA: se ajust el pH con cido actico y se almacen a 4 C. 10. Se par la reaccin con 50 l de H2SO4 4 N. 11. Se tom la lectura a 450 nm. G. AMPLIFICACIN Y CLONAJE DE UN FRAGMENTO DEL TRANSGLUTAMINASA DE MAZ, PARTIENDO DE ADN GENMICO. cDNA DE LA

Para amplificar un gen o un fragmento a partir de ADN genmico, fue necesario disear dos oligos de secuencia conocida que lo delimiten. De esta forma, para el cDNA codificante para la transglutaminasa de maz, se disearon dos oligos internos que flanquean a la regin repetitiva de dicho gen, y son los siguientes: El primer GAP5, ubicado en la posicin 759 - 776 del Full-lenght de 1925 pares de bases, y presenta la siguiente secuencia: 5 -GCAAGTTGAGCAGATGCGG- 3 El primer GAP3, ubicado en la posicin 1621 - 1638 del Full-lenght de 1925 pares de bases, y presenta la siguiente secuencia: 5 -GCGCTGCATTTGCAGTGC- 3 1. Se mezclaron los siguientes componentes: ADN genmico* 1 l de la dilucin 200 ng dNTPs 10 mM 0.2 mM 1 l GSP1 (gene-specific primer 1): GAP5** 1 l 2 M GSP2 (gene-specific primer 2): GAP3** 1 l 2 M H2O Aforar hasta 25 l *La dilucin empleada fue; 1 l tomado de una alcuota promedio de una extraccin de ADN genmico (mtodo modificado de Dellaporta) de plntula de maz, aadiendo 9 l de agua. **El stock del primer fue 100 M, en agua. 2. La mezcla se incub a 95 C, durante 2 minutos en termociclador. 3. Se coloc en hielo. Y se aadieron los siguientes componentes de la reaccin: Buffer PCR 10X 1X 5.0 l Enzima Taq High Fidelity Polimerase 5 unidades 0.75 l H2O 19.75 l 4. La mezcla se someti al siguiente programa de ciclos de amplificacin (tcnica PCR): PROGRAMA DISEADO PARA 25 CICLOS CON LOS PRIMERS GAP5 Y GAP3: GRADOS CELSIOS 95 68 68 95 68 68 Extensin a 68 TIEMPO 35 segundos 30 segundos 1 minuto 35 segundos 30 segundos 1 minuto 5 segundos

278

5. Al finalizar los 25 ciclos, el programa del termociclador dio un perodo de 7 minutos de incubacin a 72 C, y posteriormente permaneci a 4 C, hasta colectar los microtubos. 6. Se carg un minigel de agarosa para observar el nmero de bandas amplificadas y su concentracin. 7. Se clon cada producto de PCR en un vector tipo pGEM-T o pTZ57R, como se indica a continuacin: Se mont una reaccin de ligacin con 1 l de vector pGEM-T y 9 l del producto de la PCR. NOTA: no fue necesario eluir y purificar las bandas. Componentes de la reaccin de ligacin*: El producto de PCR 9.0 l pGEM-T linealizado Kit 1.0 l 2X Rapid Ligation Buffer 10 l Ligasa Kit 0.7 l *Incubar a 16 C, toda la noche. 8. Se transformaron clulas competentes con el producto de la ligacin, para recuperar los clones, se realizaron minipreps a partir de las colonias escrinadas y se purificaron para ser analizadas mediante su secuenciacin. H. NORTHERN BLOT. H. 1. EXTRACCIN DE ARN TOTAL EN TUBO EPPENDORF; EN TEJIDOS DE MAZ Y SU TRANSFERENCIA A LA MEMBRANA DE NYLON. NOTA: para el Northern Blot, se emple el siguiente mtodo de extraccin de ARN. La extraccin de ARN total empleando el tampn Z6, fue descrito por Logemann y colaboradores en 1987. Este tampn inactiva las ribonucleasas endgenas al tejido durante el proceso de extraccin. Pero la degradacin del ARN extrado se evita utilizando el agua y disoluciones tratadas con DEPC. 1. Se congel el tejido en nitrgeno lquido. Cuando hubo poco material vegetal, se coloc directamente en un tubo eppendorf y se congel inmediatamente. Cuando hubo suficiente cantidad, se coloc en papel de estao, se congel y tritur con la ayuda de un martillo y se coloc el polvo en tubos eppendorf enfriados previamente en nitrgeno lquido. 2. Se macer el tejido hasta obtener un polvo fino con la ayuda del mbolo del homogeneizador, previamente lavado y enfriado en nitrgeno lquido. NOTA: fue importante no dejar descongelar el tejido, para ello se sumergi en nitrgeno lquido el tubo eppendorf cada vez que fuese necesario. 3. Se aadi 200 l del tampn Z6 y 20 l de -mercaptoetanol. Tampn Z6: Guanidina-HCl 8M MES 20 mM EDTA 20 mM pH 7.0 NOTA: la Guanidina-HCl es un agente caotrpico, por lo que para la preparacin del tampn no es necesario el uso del agua tratada con DEPC, ni autoclavar.

279

4. Se mezcl vigorosamente con la ayuda del mbolo del homogeneizador, y se aadi 200 l ms del tampn Z6 (en total 400 l). 5. Se mezcl vigorosamente con la ayuda del mbolo del homogeneizador. 6. Se aadi 400 l de la mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1). 7. Se vorte y se centrifug a 13 000 r.p.m., a 4 C, durante 45 minutos. 8. Se recuper el sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo. 9. De manera opcional: se repitieron los pasos 6, 7 y 8, para muestras de tejido que no fuesen hoja. 10. Se midi el volumen obtenido de la fase acuosa y se aadi 1/10 del volumen de cido actico 1M, tratado con DEPC, y un volumen de etanol absoluto fro. 11. Se dej precipitar a 20 C, durante toda la noche. 12. Se centrifug a 13 000 r.p.m., durante 10 minutos. 13. Se lav el pellet con 500 l de etanol al 70% (v/v), en agua tratada con DEPC. 14. Se aadi 200 400 l de acetato de sodio 3 M, pH 5.2, y se agit vigorosamente en vrtex hasta desprender el pellet y disgregarlo. NOTA: el pellet no se disolver, pero s los polisacridos. 15. Se centrifug a 10 000 r.p.m., durante 10 minutos, y se descart el sobrenadante. 16. Se lav el pellet con 500 l de etanol al 70% (v/v), en agua tratada con DEPC. 17. Se eliminaron los restos de etanol con la ayuda de un capilar de pipeta Pasteur y se resuspendi en 50 a 100 l (volumen necesario para disolver el pellet) de agua tratada con DEPC. 18. Se agit vigorosamente a temperatura ambiente durante 20 minutos. 19. Se incub a 65 C, durante 5 minutos. 20. Se centrifug a 10 000 r.p.m., durante 2 minutos. 21. Se cuantific, tomando una alcuota de la resuspensin de ARN y diluida en agua (2 l de la extraccin de ARN y 198 l de agua), para medir la absorbancia a 260 y 280 nm. NOTA: la unidad de densidad ptica a 260 nm, equivale a 40 g/ml de ARN. H. 2. ELECTROFORESIS DE ARN. 1. Se fundi en horno de micro ondas, 2.1 g de agarosa en 112 ml de agua. Se dej enfriar en campana de extraccin, y se aadi 15 ml de tampn MEN 10X y 24 ml de Formaldehdo al 37%, para un gel mediano con pocillos anchos, evitando que se formasen burbujas. Tampn MEN 10X: MOPS Acetato de sodio EDTA NOTA: se ajust el pH a 7.0, con NAOH. 200 mM 500 mM 10 mM

2. Se verti el gel en la placa de electroforesis y se esper a que solidificase. La cmara electrofortica se llen con tampn MEN 1X, de tal forma que alcanzase el nivel del gel pero que no cubriese los pocillos, los cuales deben permanecer secos y de preferencia an con el peine. Se cubri el gel con un film transparente para evitar que se evaporase el Formaldehdo. 280

3. Se prepararon las muestras de ARN a cargar, como se describe a continuacin: a. Se mezclaron los siguientes componentes: Muestra de ARN total Agua tratada con DEPC 20 g Ajustar a un volumen de 30 l

b. Se aadi a la mezcla, los siguientes componentes: Formamida desionizada 99.5 % Formaldehdo 37% Tampn MEN 10X Bromuro de etidio 1 mg/ml 30 l (39 %) 9.0 l (4 %) 6.0 l (1X) 0.1 l (0.1 ng)

c. Se incubaron las muestras a 65 C, durante 15 minutos. Posteriormente se colocaron en hielo por 3 minutos y se dio un pulso de centrfuga antes de cargar en el gel. d. Se prepar un marcador de corrida con azul de bromo-fenol nicamente. 4. Se retir el peine y el film transparente que cubra el gel, se cargaron las muestras en los carriles correspondientes, se cubri el gel nuevamente con film transparente y se dej correr la electroforesis a 90 voltios, hasta que el marcador de corrida alcanzase el borde del gel. 5. Una vez completada la electroforesis, se verific la calidad y concentracin de las muestras de ARN, en un trans-iluminador de luz ultravioleta. Si no se observ degradacin y si la concentracin de ARN fue equivalente en cada carril, se procedi a realizar la transferencia a la membrana de Nylon, con la finalidad de observar mediante la tcnica de hibridacin con una sonda radioactiva especfica, la presencia del ARN mensajero. H. 3. TRANSFERENCIA DE ARN A LA MEMBRANA DE NYLON (Hybond, Amersham). 1. Bajo el equipo de fotografiar geles (trans-iluminador de luz ultravioleta y cmara polaroid MP4), y con la ayuda de una regla, se retir la zona del gel que no present bandas de ARN, con el fin de reducir el rea; lo cual facilit la manipulacin as como la transferencia. Y se tom la fotografa. 2. Se mont el sistema de transferencia en solucin SSC 10X, humedeciendo con agua la membrana de Nylon, y eliminando con la ayuda de una varilla de vidrio, las burbujas de aire que se pudieron haber formado entre cada capa, se utiliz papel Whatman GB002 y un soporte inerte (vidrio), como se representa en la siguiente figura: Sistema de transferencia de cidos nucleicos a la membrana.

Soporte de vidrio Capas de papel absorbente 2 capas de papel GB002

Peso (kg)

Membrana de Nylon Gel de agarosa Papel GB002 y soporte de vidrio Solucin SSC 10X 281

Solucin SSC 20X: Citrato de sodio pH 7.0 300 mM NaCl 300 mM NOTA: se filtr la solucin SSC 20X al vaco con embudo de porcelana, se autoclav y almacen a temperatura ambiente. NOTA: el soporte de vidrio debe estar apoyado sobre los bordes de un recipiente que contiene suficiente solucin de SSC 10X, como para que los extremos del papel Whatman, que servir de puente para la absorcin del tampn, queden introducidos en dicha solucin. Las capas de papel absorben la solucin salina SCC 10X hacia la parte superior, acarreando poco a poco el ARN o ADN hacia la membrana de Nylon, el cual queda adherido al entrar en contacto con dicha membrana. Para canalizar el flujo de la solucin salina a travs del gel de agarosa, se debe aislar el resto de la superficie rodeando el gel con papel Parafilm o con tiras de placa fotogrfica de desecho. El tamao de la membrana debe ser exactamente igual al del gel para asegurar una transferencia eficiente. 3. Se cambi el papel absorbente una vez quedando humedecido por completo, con la precaucin de conservar intacta una parte de la capa inferior, para evitar cualquier desplazamiento de la membrana o la formacin de burbujas de aire entre las capas de papel. 4. Una vez completada la transferencia (de 24 a 34 horas aproximadamente), se procedi a desmontar el sistema; marcando con lpiz, sobre la membrana, la posicin exacta de cada carril, as como su orientacin con respecto al gel. 5. Antes de continuar, se debi verificar si la transferencia ha sido eficiente. Para ello, se observ bajo el trans-iluminador de luz ultravioleta, si el ARN de cada carril ha sido homogneamente transferido a la membrana. 6. Una vez verificada la transferencia, se procedi a la fijacin del ARN a la membrana, lo cual se consigui incubando a 80 C, durante 2 horas. En este momento, la membrana qued preparada para hibridar. Se almacen a temperatura ambiente y en oscuridad. Otro mtodo utilizado para fijar el ARN a la membrana fue mediante la irradiacin con luz ultravioleta en el sistema UV Stratalinker 2400 de Stratagene, a 120 000 Joules. H. 4. PREPARACIN DE LA SONDA DE ADN ESPECFICA PARA HIBRIDAR MEMBRANAS. NOTA: se utilizaron dos sondas ha hibridar, que consistieron en lo siguiente: (a) La regin 5obtenida por la tcnica RACE (ver la tcnica RACE, para obtener el Full-lenght que se describi anteriormente), clonada en el vector pGEM-T entre las dianas de restriccin EcoRI, que comprende 291 pares de bases: 181 pares de bases de la regin lder y el resto (110 pb) de regin codificante. (b) El cDNA parcial, de 1744 pb, clonado en el vector pBluescript, entre las dianas EcoRI y XhoI. 1. Se digiri el ADN plasmdico con las enzimas que flanquean el inserto, como se describe en la siguiente tabla, incubando a 37 C, durante una hora: Para la regin 5clonada en pGEM-T: ADN plasmdico Tampn TE 1X Tampn especfico (H; Boheringer) Enzima endonucleasa EcoRI 5.0 3.0 1.0 1.0 l l l l

282

Para el cDNA parcial clonado en pBluescript: ADN plasmdico Tampn TE 1X Tampn especfico (H; Boheringer) Enzima endonucleasa EcoRI Enzima endonucleasa XhoI 5.0 3.0 1.0 0.5 0.5 l l l l l

2. Se carg en un gel de agarosa el producto de la digestin, se recuper la banda de inters (inserto liberado) y se continu con el proceso de elucin (ver protocolo de elucin de bandas de ADN en geles estndar o de bajo punto de fusin que se describi anteriormente). Se cargaron 2 l del inserto obtenido, en un gel de agarosa para determinar su concentracin. 3. Se marc radioactivamente el inserto (la sonda) mediante la tcnica de Random Primer DNA Labeling Kit Boehringer, a continuacin descrita: Se mezcl con agua en tubo eppendorf, 200 ng del inserto (3 a 6 l de la muestra, dependiendo de la concentracin), para obtener un volumen final de 12 l. Se desnaturaliz el ADN, incubando a 95 C, durante 5 minutos. Se dio un pulso de centrfuga y se mantuvo en hielo. Se aadi 3 l del MIX de dNTPs (dATP, dGTP, dTTP). Se aadi 2 l del tampn del kit (tubo 6) y 1 l del enzima Klenow (tubo 7). NOTA: las siguientes etapas se realizaron en el rea asignada para trabajar con istopos radioactivos, bajo la proteccin de una pantalla de metacrilato y tomando todas las medidas de precaucin sealadas para sta rea, con el fin de evitar la sobre exposicin y/o contaminacin con dichos istopos. Se cheque el rea de trabajo con un contador de radioactividad antes de comenzar a trabajar, y se coloc sobre la mesa de trabajo papel de estao y encima de ste papel absorbente. Se coloc la sonda dentro de un vial de plomo, se aadi 2 l dCTP marcado con 32P, se verific que el istopo no tuviese ms de una semana almacenado a 4 C, y se mezcl suavemente con ayuda de la punta de una micropipeta y con precaucin para evitar que se contaminase la micropipeta. Se traslad cerrado el vial de Plomo, hasta un bao de agua protegido con la pantalla de metacrilato, se sac el tubo eppendorf y se incub a 37 C, durante una hora o dos horas como mximo, para que se llevase a cabo la reaccin de marcaje. 4. Se purific la sonda marcada, por columna de Sephadex 6-50, DNA Grade Pharmacia Biotec (esta etapa no se trabaj bajo las normas de radioproteccin), como a continuacin se describe: Poco tiempo antes de finalizar el marcaje de la sonda, se prepar una columna de resina de Sephadex: Resina de Sephadex 6-50 (para 250 ml): Sephadex para ADN 10 g 4% SDS 20% (p/v) 1.25 ml 0.1 % TE 1X pH 7.4 250 ml NOTA: no se agit la resina de Sephadex, y se dej reposar toda la noche antes de utilizarla. a. Se coloc una esfera pequea de vidrio dentro de una pipeta Pasteur corta, para obturarla. Y se coloc la pipeta dentro de un tubo eppendorf que funcion como tubo colector. b. Se aadi lentamente, pero evitando que se secase y que se formaran burbujas de aire, la solucin de resina de Sephadex, con la ayuda de una pipeta Pasteur larga y su perilla. c. Durante el llenado de la pipeta Pasteur corta, se fue colectando en tubos eppendorf el goteo del excedente de tampn de la resina, que cay por abajo del capilar de la pipeta.

283

d. Cuando la pipeta Pasteur estuvo casi llena de resina de Sephadex (un poco por arriba del cuello de la pipeta Pasteur), se llen con tampn de la resina, se tap rpidamente con papel Parafilm para anular el efecto de la presin atmosfrica; evitando que se perdiese todo el lquido de la resina y que se secase la columna. NOTA: se puede dejar una pequea burbuja de aire por debajo del papel Parafilm, para verificar el nivel de lquido de la columna. Este proceso se muestra en la siguiente figura: Columna de Sephadex. 1 2 3 4

1) Papel Parafilm y burbuja de aire indicando el nivel del tampn de la resina de Sephadex. 2) Resina de Sephadex y Pipeta Pasteur. 3) Esfera de vidrio. 4) Tubo colector y Tampn de la resina. e. Una vez transcurrido el marcaje de la sonda, se traslad la columna de Sephadex, ya preparada, y los tubos que contenan el sobrante del tampn de la resina, al rea asignada para trabajar con istopos radioactivos. f. Se retir del bao a 37 C, el tubo eppendorf que contena la sonda, y se traslad dentro de su vial de Plomo al rea de trabajo. g. En el rea de trabajo asignada, se retir el papel Parafilm que cubra la columna y se esper a que bajase el nivel del lquido. Inmediatamente despus, se sac el tubo eppendorf del vial de Plomo y se abri con cuidado para extraer todo el contenido (la sonda marcada) con la ayuda de una micropipeta. Se aplic a la columna y se aadi 200 l del tampn de la resina (que se haba colectado durante la preparacin de la columna) y se esper a que bajase nuevamente el nivel del lquido en la columna. h. Se cambi de tubo colector, una vez que la columna dej de gotear y se aadi nuevamente 200 l del tampn de la resina. Se repiti el proceso hasta obtenerse aproximadamente 15 tubos colectores. NOTA: se puede ir midiendo la radioactividad de cada tubo (fraccin) durante el proceso de filtrado, con la finalidad de determinar el nmero de tubos colectores necesario. NOTA: durante el paso por la columna, la sonda marcada se separa de los nucletidos libres por diferencia de peso y tamao, de tal forma que se debe obtener un pico de radioactividad que comienza entre el 3 y 4 tubo colector. i. Para verificar que el marcaje con P ha sido adecuado, se sigui colectando fracciones de 200 l aproximadamente, en las cuales se midi un segundo pico de radioactividad correspondiente al dCTP marcado en forma libre. NOTA: en caso de obviar este ltimo paso, 32 verificar con el contador que el dCTP- P libre ha quedado en la columna. j. Se reuni en un solo tubo, todo el volumen de los tubos que presentaron el primer pico de radioactividad. La sonda se almacen a 4 C, dentro del vial de plomo, hasta su uso. NOTA: la 32 radioactividad del P decae en aproximadamente 15 das. Para purificar la sonda marcada con 32P, tambin se utilizaron las columnas de Amersham (ProbeQuant G-50 Micro Columns), que contienen Sephadex G-50 DNA Grade F. Se sigui
32

284

el protocolo diseado para 50 l de volumen de reaccin. Las columnas fueron preequilibradas en Tampn STE 150 mM, pH 8.0. Tampn STE 150 mM (para 50 ml): NaCl 0.438 g Tampn TE (Tris-HCl 10 mM, 40 ml pH 8.0 y EDTA 1 mM) NOTA: Se ajusta el pH a 8.0 usando HCl o NaOH, y se afora a 50 ml con el Tampn TE, pH 8.0. a. La resina se resuspendi en la columna por vorteo. b. Se gir el tapn de la columna y se rompi el casco de clausura. c. Se coloc la columna sobre un tubo eppendorf de 1.5 ml, utilizado como soporte. d. Se centrifug por un minuto a 735 x g (3000 r.p.m., para una centrfuga de 73 mm de dimetro). e. Se coloc la columna en un tubo nuevo de 1.5 ml y se aplic suavemente y al centro de la resina, 50 l de la sonda radioactiva. NOTA: si el volumen de reaccin (Random Primer) es inferior a 50 l, ajustar a 50 l con tampn STE. Si el volumen de reaccin es superior a 50 l, aplicar slo 50 l a la columna o utilizar ms de una columna para purificar. f. Se centrifug por 2 minutos a 735 x g. La sonda purificada qued colectada en el tubo eppendorf. Se transport el tubo dentro de un vial de plomo. H. 5. PREHIBRIDACIN DE LA MEMBRANA TRANSFERIDA CON ARN. 1. Una vez verificado que el marcaje de la sonda ha sido adecuado, se procedi a prehibridar la membrana en la cual, las muestras de ARN fueron transferidas previamente. 2. La membrana se prehibrid con 20 ml del tampn Church, en una estufa a 65 C, durante 30 minutos y bajo agitacin constante. Tampn Church (para 500 ml): SDS EDTA 0.5 M Fosfato sdico 1 M pH 7.2 35 g 1.0 ml 62.5 ml 7.0% (p/v) 1 mM 0.1 M

H. 6. HIBRIDACIN DE LA MEMBRANA DE ARN (HIBRIDACIN TIPO ADN/ARN). 1. Una vez transcurridos los 30 minutos de prehibridacin, se procedi a desnaturalizar la sonda marcada, incubando a 95 C durante 5 a 10 minutos, bajo la proteccin de la pantalla de metacrilato y haciendo previamente un orificio en la tapa del tubo eppendorf. 2. En el rea asignada para trabajar con istopos radioactivos, y bajo las condiciones de trabajo anteriormente descritas, se elimin el tampn utilizado durante la prehibridacin, se le aadi nuevamente tampn Church al recipiente que contena la membrana. NOTA: es conveniente usar el menor volumen posible de la solucin de hibridacin, para incrementar la seal. 3. Se aadi todo el volumen recuperado del marcaje de la sonda (4X10 cpm aprox.), y se incub en la estufa a 65 C, toda la noche y bajo agitacin constante. NOTA: de esta forma, se aplic un exceso de radioactividad a la membrana.
7

285

H. 7. LOS LAVADOS Y EL REVELADO. 1. Se procedi a eliminar toda la sonda que no qued hidridada en la membrana. Para ello, se realizaron cambios del tampn de lavado cada 20 minutos, incubando a 65 C y con agitacin constante, hasta que el tampn de lavado dej de marcar radioactividad en el contador. Tampn de lavados (para 1000 ml): SDS 20% (p/v) 50 ml EDTA 0.5 M 2 ml Tampn fosfato 1 M pH 7.2 20 ml 1% 1 mM 20 mM

NOTA: la solucin de hibridacin, que se descart antes de iniciar los lavados, contena an la mayor parte de la sonda radioactiva, la cual se almacen a 20 C, para ser reutilizada una segunda vez o ser eliminada como residuo radioactivo (en su nicho correspondiente hasta que decay el nivel de radioactividad), as como la solucin de lavado que an marc radioactividad. 2. Una vez realizado el ltimo lavado, se retir de la membrana todo el volumen de la solucin de lavado, y se procedi al revelado. Para esto, se protegi la membrana sellndola con papel plstico, se coloc sobre un cassette de revelado y se expuso, en la cmara oscura, a una placa de auto radiografa sensible (Kodak). Se almacen a 70 C, hasta su revelado. El tiempo de exposicin dependi de la cantidad de sonda marcada que hibrid en la membrana, y se observ escaneando la membrana con el contador. NOTA: recordando que la radioactividad decae con el transcurso del tiempo, se expusieron varias placas fotogrficas hasta obtener el mejor revelado. NOTA: la membrana fue deshibridada para ser reutilizada, esto se consigui haciendo primeramente un lavado con agua a temperatura de ebullicin, y posteriormente varios lavados con agua en la estufa a 65 C, en agitacin constante, hasta que no quedase radioactividad residual. Se verific con el contador o cualquier otro sistema que revele la presencia de radioactividad (Equipo de Phospho-imager). I. SOUTHERN BLOT. I. 1. EXTRACCIN DE ADN GENMICO: MTODO MODIFICADO DE DELLAPORTA. 1. Se trituraron en mortero y con la ayuda de cuarzo en polvo, 0.2 g de hoja de plntula de maz de la variedad B73, congelado en nitrgeno lquido. NOTA: se mantuvo continuamente fro, ya que la eficiencia del mtodo depende de este paso. 2. Se verti el polvo fino obtenido del material vegetal en un tubo eppendorf de 1.5 l y se aadi 400 l de tampn de extraccin, se agit por inversin y posteriormente se incub a 4 C, bajo agitacin en un Rotador Tipo N, durante 10 minutos. Tampn de extraccin: Componentes para preparar 100 ml: Urea NaCl Tris-HCl EDTA Sarkosil 42 g 6.25 ml 5.0 ml 4.0 ml 10 ml (stock NaCl 5 M) (stock Tris-HCl 1 M pH 8.0) (stock EDTA 0.5 M pH 8.0) (stock Sarkosil 10% p/v) para preparar 30 ml: 12.6 g 1.8 ml 1.5 ml 1.2 ml 3.0 ml Concentracin final 7.0 M 0.3 M 50 mM 20 mM 1% (v/v)

3. Se aadi 500 l de fenol/cloroformo (1:1), se agit por inversin y en un Rotator Tipo N, durante 5 minutos, a temperatura ambiente. NOTA: tambin se puede emplear fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1). 4. Se centrifug a 13 000 r.p.m., durante 5 minutos a temperatura ambiente.

286

5. Se recuper la fase acuosa. NOTA: si esta no est del todo limpia, repetir los pasos 3 y 4. 6. Se aadi a la fase acuosa 0.3 V de NH4Oac 10 M, y se agit por inversin. 7. Se aadi 0.6 V de isopropanol fro y se agit por inversin. 8. Se centrifug a 12 000 r.p.m., durante 10 minutos. 9. Se lav el pellet resultante con 500 l de etanol 70% (v/v), se decant y se sec perfectamente. 10. Se resuspendi el pellet en TE 1X, en un volumen de 50 l. 11. Se incub a 65 C, durante 10 a 15 minutos. 12. Se aadi 1.0 l del stock concentrado de RNAasa. 13. Se incub a 37 C, durante 1 hora. Y se almacen a 4 C. I. 2. CUANTIFICACIN DE ADN: NOTA: Se corrieron las muestras de ADN y un marcador de peso molecular (ej. lambda-ADN digerido con PstI) en un gel de agarosa al 0.8% (p/v), para comprobar que no estuviesen degradadas. La banda de ADN genmico debe localizarse por encima del marcador de 11 kb. Tambin se cuantific por ste mtodo electrofortico. 2. Se obtuvieron las lecturas de la absorbancia a 260 y 280 nm en el espectrofotmetro, como a continuacin se describe. Se aadi 198 l agua bidestilada, a cada celdillas de cuarzo. Se colocaron en la cmara del espectrofotmetro y se seguieron las siguientes opciones del men principal: Photometric Opcin 1: marcar 260 Opcin 5: marcar dos lecturas; 260 y 280 Opcin 6: imprimir la tabla de resultados (lectura a 260 nm, lectura a 280 nm y la relacin 260 / 280 volver al men principal Espectrum Opcin 1: marcar un rango mayor de 260-280 nm (300 y 200 ) Scaning Condition set Baseline (para el autocero) volver al men principal Photometric. Se retir la primer celdilla de cuarzo y se carg con 198 l agua bidestilada y 2 l de la muestra de ADN a cuantificar. Se resuspendi bien la mezcla. Se midi la absorbancia. NOTA: la relacin 260/280, debe ser de 1.8. Se sabe que cuando la lectura a 260 nm es igual a la unidad, la concentracin de ADN es de 50 g /ml. Y se deduce la siguiente frmula: [ADN g/l] = A (FD) K / 1000 l donde: A = la absorbancia a 260 nm. FD = factor de dilucin (100). K = constante (50 g). I. 3. DIGESTIN DE ADN GENMICO. 1. Se digirieron 20 g de ADN genmico de maz (variedad B73), para un volumen final de 50 l, como se indica en la siguiente tabla: ADN genmico Tampn especfico 10X Endonucleasa de restriccin* Tampn TE 1X 20 g 5 l 2 l ajustar al volumen, sin considerar el volumen del enzima.

287

*se dosific con 0.5 l del enzima, cada 2 horas. La ltima alcuota se incuba toda la noche. NOTA: se utilizaron stocks de enzimas concentrados (5 000 10 000 unidades). Las endonucleasas de restriccin utilizadas fueron las siguientes: BamHI Tampn B Boheringer EcoRI Tampn H Boheringer XhoI Tampn H Boheringer HindIII Tampn B Boheringer El cDNA de la enzima transglutaminasa presenta esta diana de corte en su mapa de restriccin. 2. Una vez hecha la mezcla, se incub a la temperatura ptima especfica para cada enzima, como se especifica arriba. Y se almacen a 4 C. NOTA: todas las enzimas utilizadas tienen una temperatura ptima de 37 C. 3. Para verificar la concentracin de la muestra de ADN, se corri en un minigel de agarosa el mnimo volumen (1 l) y slo durante unos pocos minutos para asegurarse de observar una nica banda y para comprobar que el enzima a digiri eficientemente el ADN, se corri totalmente la electroforesis para observar si se present el barrido caracterstico. I. 4. PRECIPITACIN DE ADN GENMICO DIGERIDO CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN. De manera opcional, se concentr en un solo tubo eppendorf, todo el volumen obtenido de cada alcuota de 20 g de ADN genmico digerido con el enzima especfica. 1. Se colocaron en un solo tubo eppendorf todas las alcuotas de ADN digerido con la endonucleasa especfica. 2. Se aadi 1/10 de volumen, de acetato de sodio 3M, pH 5.2 y 2 volmenes de etanol absoluto. 3. Se recuper el precipitado por centrifugacin a 12 000 r.p.m., durante 10 minutos. 4. Se lav el pellet con etanol 70% (v/v). 5. Se disolvi el pellet en 40 l de TE 1X, y se incub a 65 C, durante 5 minutos. 6. Se carg 1 l de la muestra en un minigel de agarosa para determinar su concentracin. I. 5. ELECTROFORESIS DE ADN GENMICO DIGERIDO CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN. 1. Se fundi en horno de micro ondas, agarosa al 0.9% (p/v) en TBE 0.5X, sin adicionarle bromuro de etidio. Se dej enfriar un poco en campana de extraccin. NOTA: se prepararon 120 ml para un gel grande. Tampn TBE: Tris de Boehringer cido brico EDTA (Stock 0.5 M, pH 8) NOTA. No autoclavar. Concentrado TBE 10X: Tris de Boehringer cido brico EDTA (Stock 0.5 M, pH 8) 0.089 M 0.089 M 2 mM

108 g/l 55 g/l 40 ml

288

2. Se verti el gel en la placa de electroforesis grande, se coloc el peine con carriles anchos y se esper a que solidificase. La cmara electrofortica se llen con tampn TBE 0.5X, de tal forma que alcanzase el nivel del gel, y cubriendo los pocillos. 3. Se carg todo el volumen de la alcuota de la digestin (20 g) en el caso de que no se haya hecho la precipitacin con acetato de sodio, en los carriles correspondientes, aadiendo previamente a cada muestra 4 l del tampn de corrida 6X. NOTA: se carg en ambos extremos del gel, el marcador de peso molecular ( Lambda ADN digerido con PstI). 4. Se dej correr la electroforesis a 100 voltios. Cuando la corrida electrofortica alcanz los 2/3 del gel, se aadi 6 l de bromuro de etidio (1 mg/ml). NOTA: se tuvo la precaucin de no aplicar el bromuro de etidio directamente sobre el gel, y de mezclar bien con el tampn de corrida antes de continuar con la electroforesis. La electroforesis se detuvo cuando alcanz aproximadamente 2.0 cm del borde del gel. 5. Se tom la fotografa del gel bajo el trasluminador de luz ultravioleta. Y con la ayuda de una punta de micropipeta, se marc el gel haciendo un orificio en la posicin de cada marcador de peso molecular. 6. Se depuriniz el gel de ADN genmico digerido para facilitar la transferencia de los fragmentos de alto peso molecular, incubando con HCl 0.25 N por 5 a 10 minutos, agitando lentamente y lavando posteriormente con agua para eliminar el exceso de HCl. I. 6. TRANSFERENCIA DEL ADN A LA MEMBRANA DE NYLON (Hybond, Amersham). 1. Se incub el gel en solucin desnaturalizante, en agitacin lenta durante 30 minutos. Solucin desnaturalizante: NaOH 0.5 N NaCl 1.5 M 2. Se transfiri el gel con mucho cuidado a la solucin neutralizante, y se incub en agitacin lenta por 30 minutos. Solucin neutralizante: Tris-HCl pH 7.4 NaCl 0.5 M 1.5 M

3. Se repiti esta ltima etapa incubando 15 minutos ms. 4. Se coloc el gel en posicin invertida sobre papel Whatman GB004, que sirvi de puente para la absorcin del tampn, y se mont el sistema de transferencia en solucin SSC 10X, humedeciendo con agua la membrana y eliminando las burbujas de aire que se pudieron haber formado entre cada capa, tal y como se describi en la figura del sistema de transferencia de cidos nucleicos a la membrana (Transferencia de ARN a la membrana de nylon). Se utiliz papel GB004, y se sigui todas las recomendaciones anteriormente sealadas. NOTA: la transferencia debe durar 24 horas. El papel Whatman ha de estar sobre un soporte inerte (vidrio), y es importante tener la precaucin de que la membrana de Nylon sea exactamente del mismo tamao que el gel, pues esto puede ser un factor que determine la eficiencia de la transferencia. 5. Una vez finalizada la transferencia, se procedi a desmontar el sistema; marcando con lpiz, sobre la membrana, la posicin exacta de cada carril, as como su orientacin con respecto al gel. Y se fij el ADN a la membrana, incubando la membrana en una estufa a 80 C, durante 2 horas. NOTA: la membrana est preparada para ser hibridada. Almacenar a temperatura ambiente en oscuridad, hasta su uso.

289

Otro mtodo utilizado para fijar el ADN a la membrana fue mediante la irradiacin con luz ultravioleta en el sistema UV Stratalinker 2400 de Stratagene, a 120 000 Joules. I. 7. EL MARCAJE DE LA SONDA. NOTA: la sonda ha hibridar consisti en el cDNA parcial de 1744 pb, clonado en el vector pBluescript, entre las dianas EcoRI y XhoI. 1. Se digiri 5 l de ADN plasmdico que contena el inserto, con las enzimas que lo flanquean; 0.5 l de EcoRI y 0.5 l de XhoI, en tampn H (Boheringer). Se incub a 37 C, durante una hora. 2. La banda de ADN correspondiente al inserto, fue eluda en un gel de agarosa (ver protocolo de elucin de bandas de ADN en geles estndar o de bajo punto de fusin, descrito anteriormente). Se cargaron en un gel de agarosa, 2 l del inserto obtenido para determinar su concentracin. 3. Se marc radioactivamente el inserto (la sonda) mediante la tcnica de Random Primer DNA Labeling Kit Boehringer, como se describe a continuacin: a. Se mezcl en tubo eppendorf, 2.0 l (200 ng) del inserto con 9.0 l agua. Se incub C, durante 10 minutos. Se dio un pulso de centrfuga y se mantuvo en hielo. b. Se aadi 1 l de dGTP y 1 l de dTTP. c. Se aadi 2 l del tampn del kit (tubo no. 6) y 1 l del enzima Klenow; 5 unidades/l (tubo no. 7). NOTA: las siguientes etapas se realizaron en el rea asignada para trabajar con istopos radioactivos, bajo la proteccin de una pantalla de metacrilato y tomando todas las medidas de precaucin sealadas para sta rea. d. Se coloc la sonda dentro de un vial de Plomo, se le aadi 2 l de dCTP y 2 l de dATP marcados con 32P, se verific que los istopos no tuviesen ms de una semana almacenados a 4 C, y se mezcl suavemente con ayuda de la punta de una micropipeta y con precaucin para evitar que se contaminase dicha micropipeta. e. Se traslad cerrado el vial de Plomo, hasta un bao de agua protegido con la pantalla de metacrilato, se sac el tubo eppendorf y se incub a 37 C, durante una hora o dos horas como mximo. 4. Se purific la sonda marcada, por columna de Sephadex 6-50, DNA Grade Pharmacia Biotec, como se ha descrito anteriormente para el Northern Blot. I. 8. PREHIBRIDACIN DE LA MEMBRANA TRANSFERIDA CON ADN GENMICO. 1. Una vez verificado que el marcaje de la sonda ha sido realizado, se procedi a prehibridar la membrana con el ADN transferido. 2. Se hidrat la membrana con agua antes de prehibridarla. 3. Se prehibrid la membrana con tampn de hibridacin, incubndola en la estufa a 42 C, durante una hora y bajo agitacin constante. NOTA: es importante que la solucin de hibridacin cubra bien la membrana de Nylon. a 95

290

Solucin de hibridacin (para 1000 ml): NaHPO4 pH 7.2 SDS (BIO-RAD Electrophoresis Purity Reagment) EDTA NaCl PEG-6000 Formamida

0.25 M 7% (p/v) 1 mM 0.25 M 10% (p/v) 0.04% (v/v)

La solucin de hibridacin se prepar mezclando dos soluciones, como a continuacin se describe. Solucin A (disolver en 100 ml de agua): NaHPO4 pH 7.2 250 ml (stock NaHPO4 1M pH 7.2) SDS 70 g EDTA 2 ml (stock EDTA 0.5 M) NaCl 50 ml (stock NaCl 5 M) Solucin B: 100 g de PEG-6000 (disolver en 200 ml de agua). Se mezclaron ambas soluciones (A y B), y bajo campana de extraccin se aadi 400 l de Formamida y 10 ml de la solucin de ADN de esperma de salmn previamente desnaturalizado a 95 C, durante 10 minutos. Se alicuot y se almacen a 20 C, hasta su uso. NOTA: la hibridacin de ADN se realiz segn el mtodo descrito por Amasino (1986). ste mtodo utiliza PEG en el tampn de hibridacin, incrementando la velocidad de la hibridacin. El uso de Formamida permite mantener desnaturalizada la sonda sin necesidad de incrementar la temperatura de hibridacin por encima de los 42 C. I. 9. HIBRIDACIN DE LA MEMBRANA DE ADN (HIBRIDACIN TIPO ADN/ADN). 1. Se desnaturaliz la sonda incubando a 95 C, durante 10 minutos, bajo la proteccin de la pantalla de metacrilato y haciendo previamente un orificio en la tapa del tubo eppendorf. 2. Se desech el tampn que haba sido empleado para prehibridar la membrana y se le aadi nuevo tampn de hidridacin, hasta cubrir completamente la membrana. 3. En el rea asignada para trabajar con istopos radioactivos, se aadi todo el volumen de la sonda recuperado durante la filtracin, y se incub en la estufa a 42 C, durante toda la noche y en agitacin constante. I. 10. LAVADOS BAJO CONDICIONES DE ALTA ASTRINGENCIA Y EL REVELADO. Se realizaron los lavados hasta eliminar la radioactividad del tampn, como a continuacin se describe. NOTA: ir chequeando el nivel de radioactividad del tampn entre cada lavado. 1. Se realiz el primer lavado a 42 C, con la solucin SSC 3X / 0.5% SDS, durante 10 minutos y en agitacin constante. 2. Se realiz el segundo lavado a 65 C, con la solucin SSC 3X / 0.5% SDS, durante 15 minutos y en agitacin constante. 3. Se realizaron dos lavados ms a 65 C, con la solucin SSC 3X / O.5% SDS, durante 10 minutos y en agitacin constante. 4. Se realiz un ltimo lavado a 65 C, con la solucin SSC 2X / 0.5% SDS, durante 15 minutos y en agitacin constante.

291

5. Se sell la membrana con papel plstico transparente y se coloc sobre un cassette de revelado con pantalla, se expuso una placa de autoradiografa por una noche antes de revelar. NOTA: se realizaron varias exposiciones con la finalidad de obtener el ptimo revelado. J. EXPRESIN DE TRANSGLUTAMINASAS EN Escherichia coli TRANSFECTADA CON LOS DOS FAGOS POSITIVOS CRIBADOS DE LA LIBRERA LAMBDA ZAP II; Y LA MEDICIN DE PUTRESCINA CONJUGADA. 1. Se pic un glicerinado del 25% (v/v), de la cepa XL1-Blue de Escherichia coli, y se sembr por estra en una placa con medio LB (Luria-Bertani) adicionado con sulfato de magnesio (MgSO4), maltosa al 0.2% (v/v) y 15 g/ml de tetraciclina. 2. Se incub el inoculo, toda la noche a 37 C. 3. Se realiz una segunda siembra a partir del cultivo anterior, para obtener la placa primaria. Se mantuvo el cultivo a 4 C. 4. Se pic una colonia nica y se inocul en 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido, adicionado con 50 l de MgS04 1 M y 50 l de maltosa al 20% (p/v). 5. Se incub el inoculo toda la noche a 37 C, a 200 r.p.m. 6. Al da siguiente se realizaron las siguientes diluciones del stock del fago purificado (obtenido durante el escrutinio con anticuerpo) de la librera de expresin que contiene el cDNA parcial codificante para la transglutaminasa de maz, como a continuacin se describe: 1 l stock del fago positivo en 100 l de Lambda Buffer 1X estril 2 l stock del fago positivo en 100 l de Lambda Buffer 1X estril 4 l stock del fago positivo en 100 l de Lambda Buffer 1X estril 7. Se mezcl cada dilucin del fago con 200 l del cultivo bacteriano obtenido el da anterior. 8. Se incub la infeccin a 37 C, durante 18 minutos en reposo. 9. Se inocul todo el volumen de la infeccin, en 2.5 ml de medio LB (Luria-Bertani) lquido estril que contena Magnesio. Se adicion 250 l de IPTG 10 mM estril (para obtener una concentracin final de 1 mM). 10. Se incub a 37 C, a 150 a 200 r.p.m., hasta obtener un lisado total del cultivo bacteriano (aproximadamente fue de 5 a 6 horas). NOTA: el tiempo de incubacin depende de la concentracin del fago empleada. 11. Si transcurridas seis horas, an persisti el crecimiento bacteriano en alguna de las suspenciones; se centrifug por 5 minutos a mxima velocidad, para eliminar las bacterias. 12. Se tom una alcuota del lisado para cuantificar protenas (Mtodo de Lowry). 13. Se aadi 50 l de tampn de extraccin sin SDS adicionado con inhibidores de proteasas (ver mtodo de extraccin de protenas totales de tejidos vegetales), por cada 100 l de la suspensin de lisis. NOTA: el medio LB (Luria-Bertani) mezclado con el tampn de extraccin present un pH de 8. 14. Se almacenaron alcuotas a 20 C para realizar western blots y a 4 C, toda la noche, para realizar ensayos de actividad enzimtica. NOTA: se realiz el ensayo de actividad enzimtica para detectar actividad tipo transglutaminasa como se utiliza para muestras de tejidos vegetales, a partir del paso 5. Se efectu el ensayo enzimtico con 500 a 600 g de protena total extrada, proveniente del

292

sobrenadante del paso anterior. Son necesarios de 500 a 600 g de protena total para detectar actividad enzimtica tipo transglutaminasa en vegetales. Se tom en cuenta la dilucin realizada con el tampn de extraccin; si se cuantific 4 g/l de protena, al hacer la dilucin en el tampn de extraccin, se obtuvo 2.6 g/l de protena total. 15. Se aadi a cada alcuota de 500 a 600 g, 100 l de una solucin que contena; Tris-HCl 200 mM (pH 8.0), 0.6 mM de putrescina fria (no marcada radiactivamente) y 3 mM de CaCl2 (como fuente de Calcio). NOTA: a partir de este momento, se trabaj en un rea delimitada para trabajar con H o C . 16. Se aadi a la mezcla, 3 l de putrescina tritiada, que equivalen a 110 KBq, y se enras con Tris-HCl 200 mM hasta un volumen final de 300 l. 17. El ensayo se llev a cabo en un bao de agua a 30 C, durante 30 minutos bajo condiciones de luz. 18. Se detuvo la reaccin enzimtica (la conjugacin de poliaminas a protenas) precipitando con 300 l de TCA fro al 10% (p/v), que a su vez contena 5 mM de putrescina fra (no marcada radioactivamente). Se dej precipitando por una noche a 4 C. 19. Al da siguiente, se centrifug a 14 000 r.p.m., durante 10 minutos, descartando el sobrenadante en un contenedor adecuado y debidamente etiquetado para ser manejado como residuo radioactivo. 20. El pellet resultante, se resuspendi bien en 300 l de NaOH 0.1 N y se llev a cabo la reaccin de hidrlisis en un bao de agua a 60 C, durante 2 horas. NOTA: tambin puede llevarse a cabo a 37 C, durante toda la noche. 21. Despus de la hidrlisis, se aadi nuevamente 300 l de TCA fro al 10% (p/v), que a su vez contiene 5 mM de putrescina fra. Y se dej precipitando por una noche a 4 C. 22. Se repitieron los pasos 10, 11 y 12, tres veces ms. La ltima vez no se aadi putrescina fra al TCA. 23. Al aadir NaOH por tercera vez e incubar a 60 C, la muestra se expuso en el contador de centelleo para la lectura, en una proporcin de 300 l de NaOH por 4.0 ml de lquido de centelleo Unisolve. NOTA: las unidades del valor absoluto de actividad enzimtica medido en ste ensayo, estn dadas en picomoles de putrescina conjugada por cada miligramo de protena utilizada por unidad de tiempo (es decir, cada hora). Y la frmula simplificada deducida queda como sigue: pmols putrescina / mg protena x hora = dpmo ( V ) Put nM / mg prot (dpmPut) X 6 donde: dpmo V Put nM mg prot dpmPut El valor obtenido en el contador de centelleo. El volumen del ensayo. Es una constante (300 ml). Nanomoles de putrescina no radioactiva utilizada en el ensayo (200 000 nM). Miligramos de protena total cargada en el ensayo. Los microlitros de putrescina tritiada utilizados en el ensayo multiplicados por la constante 2.2X106. NOTA: 1 l de putrescina tritiada = 1Ci = 2.2X106. Se multiplica X2, debido a que la duracin del ensayo es de 30 minutos.
3 14

24. Para realizar la inmunodeteccin, las alcuotas almacenadas a 20 C, se trataron como se describe en los protocolos para extracciones de protenas totales a partir de tejidos (electroforesis y western blot).

293

J. 1. MICROENSAYO COLORIMTRICO PARA TRANSGLUTAMINASAS (TG-Covtest TCMA, CovalAb Kit); UNA PRUEBA CON LOS FAGOS POSITIVOS DE LA LIBRERA DE MAZ. Las transglutaminasas (EC. 2.3.213, R-glutamil-pptido amino -glutamil transferasa) son una familia de enzimas calcio dependientes las cuales catalizan la reaccin acil transferasa entre el grupo -carboxamida del pptido unido a la glutamina y varias aminas primarias. El grupo -amino de residuos de lisina al igual que algunas poliaminas son donadores del grupo amino fisiolgicos, pero algunas aminas no fisiolgicas pueden tambin ser usadas por el enzima. En vertebrados, las transglutaminasas estn ampliamente distribuidas en varios rganos, tejidos y fluidos corporales. Las transglutaminasas estn involucradas en una variedad de funciones incluyendo la coagulacin de la sangre, la formacin de la envoltura de la epidermis, las callosidades, el pelo y uas, la estabilizacin de la matriz intra y extracelular y el cross-linking de las envolturas celulares durante la apoptosis. Todos los ensayos enzimticos para las transglutaminasas mencionadas antes fueron llevados 2+ a cabo bajo condiciones ptimas de pH, Ca y substratos, con dimetil caseina como primer substrato y putrescina marcada o dansil cadaverina como segundo substrato. En orden a aproximar la cuantificacin de la acividad ha sido medido el amonio liberado durante la formacin del enlace isopeptdico. stas tcnicas requieren de mucho tiempo y son muy elaboradas. Para resolver stos problemas, ha sido desarrollado ste microensayo de tres etapas. Esta prueba utiliza el pptido CBZ-Gln-Gly, como primer substrato y la Biotin-cadaverina como segundo substrato. En la primera etapa, las muestras que se sospecha presentan la transglutaminasa, son incubadas con Calcio, DTT y Cadaverina biotinilada dentro de las celdillas de la microplaca, en las cuales el pptido (primer substrato) ha sido unido covalentemente. En presencia de transglutaminasa, la Cadaverina biotinilada es incorporada en el residuo Glutamil del pptido, para formar -glutamil biotin-cadaverina. En la segunda etapa es aadida a las celdillas la peroxidasa marcada con Streptavidina. En la tercera etapa la actividad peroxidasa es revelada usando H202 como substrato y la Tetrametil-bensidina como aceptor de electrones. NOTA: se realizaron duplicados de los controles y de las muestras a identificar actividad transglutaminasa. 1. Se aadi 150 l de la dilucin del tampn (10X), a cada pocillo y se incub la microplaca por lo menos 30 minutos a 37 C. Tampn 10X (CovalAb): La solucin concentrada puede ser almacenada entre los 2 y 8 C. Se diluy 1:10 en agua destilada justo antes de ser utilizada. 2. Se descart el tampn de cada pocillo y se aadi 50 l de la Biotin-cadaverina. Biotin-cadaverina (CovalAb): La solucin concentrada (5X) liofilizada fue reconstituda con 4 ml de agua destilada y se conserv a 4 C o entre los 2 y 8 C. Se diluy 1:5 en agua destilada justo antes de ser utilizada. NOTA: la dilucin en agua puede ser conservada por mas de dos das a 4 C. 3. Se aadi 50 l de la muestra problema y los controles positivos a los pocillos correspondientes. El control positivo fue una muestra de transglutaminasa purificada de cerdo de guinea, comnmente usada como control positivo en los laboratorios especializados. Se aadi 10 l del inhibidor de la actividad transglutaminasa en el pocillo correspondiente, utilizado como primer control negativo. Primer control negativo (CovalAb): La muestra proporcionada por el kit est preparada para ser utilizada inmediatemente. Se puede almacenar entre los 2 y 8 C.

294

4. La placa se incub a 37 C, durante 15 minutos. 5. Se lavaron los pocillos tres veces con el tampn PBST o TBST (conteniendo 0.1% de Tween-20). 6. Se aadi a cada pocillo 100 l de la solucin trazadora diluda en el tampn diluyente. Solucin trazadora (CovalAb): La solucin concentrada puede ser conservada entre los 2 y 8 C. Se diluy 1:2000 con el tampn diluyente (10X), justo antes de su uso. Tampn diluyente 10X (CovalAb): Esta solucin puede se conservada entre los 2 y 8 C. Se diluy 1:10 en agua destilada, justo antes de su uso. 7. Se incub a 37 C, durante 15 minutos. 8. Se lavaron los pocillos tres veces con el tampn PBST o TBST. 9. Se aadi a cada pocillo, 100 l de la solucin substrato-HRP/cromgeno. Solucin substrato-HRP/cromgeno (CovalAb): mbas soluciones estn preparadas para su utilizacin inmediata o almacenarlas entre los 2 y 8 C. Se aadi a 2 ml del substrarto-HRP, y una gota del cromgeno, justo antes de ser utilizada. 10. Se incub entre 2 a 10 minutos, a temperatura ambiente. 11. Se aadi a cada pocillo, 50 l del agente bloqueante. Agente bloqueante (CovalAb): La muestra proporcionada por el Kit est preparada para ser utilizada inmediatemente. Se puede almacenar entre los 2 y 8 C. 12. Se midi la absorbancia de cada pocillo, a 450 nm. NOTA: algunos experimentos empleando transglutaminasa purificada de cerdo de guinea (2 unidades por mg de protena), muestran que 0.6 mU corresponden a un valor de absorbancia de 1 0.05 OD a 450 nm. Una unidad del enzima, cataliza la formacin de 1 mol de Hidroxamato a pH 6.0, a 37 C, usando L-cido glutmico -mono-hidroxamato como el estndar (Folk and Cole, 1966). Si otra transglutaminasa estndar ha sido empleada en este ensayo, los valores de referencia pueden diferir.

295

3. TRANSFORMACIN GENTICA TRANSGLUTAMINASAS DE MAZ. A. MATERIAL VEGETAL.

EN

TABACO,

ARABIDOPSIS

ARROZ

CON

Para generar plantas transgnicas, se realizaron construcciones que portan el gen de la transglutaminasa de maz en pauta de lectura abierta, el cual fue fusionado en orientacin en sentido y antisentido downstream al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) en el sistema de vectores pGreen; con el gen marcador NptII que confiere resistencia a la kanamicina pGreen0029 y el gen marcador bar que confiere resistencia a la fosfinotricina pGreen0229. Se incorporaron stas construcciones al tipo silvestre de tabaco (Nicotiana tabacum) cultivar petit havane SR1, Arabidopsis thaliana cultivar Columbia y arroz (Oryza sativa) cultivar Senia. B. SUBCLONAJE DE LA TRANSGLUTAMINASA DE MAZ EN VECTORES DE EXPRESIN EN PLANTAS; EL SISTEMA pGreen. B. 1. AISLAMIENTO DE PLSMIDO A PEQUEA ESCALA (MINIPREP). Para purificar muestras de ADN plasmdico que fueron utilizadas para subclonajes, se siguieron los protocolos que se indican en los kits de QIAGEN (QIAprep Miniprep Handbook) o de MACHEREY-NAGEL (NucleoSpin Plasmid), que emplean membranas de silica-gel para la absorcin selectiva del ADN plasmdico en un tampn de alta concentracin salina y de baja salinidad para su elusin, utilizando una microcentrfuga. Estos protocolos estn diseados para purificar ms de 20 g de ADN plasmdico de alto nmero de copias, partiendo de 1 a 5 ml de medio de cultivo de E. coli, en LB (Luria-Bertani). B. 2. EXTRACCIN DE PLSMIDO A MEDIANA Y GRAN ESCALA (MIDI Y MAXIPREP). Para preparaciones mayores de 200 g de ADN plasmdico, se utiliz el protocolo de QIAGEN (HiSpeed Plasmid Purification Handbook; Midi and Maxi kits), partiendo de volmenes de 50 y 150 ml de cultivo de E. coli en LB (Luria-Bertani), respectivamente, para plsmidos de alto nmero de copias. B. 3. DIGESTIN DE GRANDES VOLMENES DE ADN PLASMIDICO PARA EL CLONAJE. (Para linealizar vectores, o liberar el inserto clonado). NOTA: partiendo de 50 l de volumen de una extraccin de ADN plasmdico, se colectaron 10 l para almacenar y mantener la construccin (ver protocolo de transformacin de clulas competentes). 1. Se dosificaron los 40 l restantes de la miniprep, en cuatro tubos eppendorf, de la siguiente manera (para un volumen final de 15 l en cada tubo): Alcuota de ADN plasmdico (Miniprep o midiprep) TE 1X o H2O Tampn especfico del enzima Enzima endonucleasa A 10 l 2.5 l 1.5 l 1.0 l

2. Se incub a la temperatura ptima del enzima, que generalmente es de 37 C. 3. Se carg 1.0 l de la muestra digerida, en un gel de agarosa para determinar su concentracin y verificar que el plsmido quedo linealizado y verificar el tamao del fragmento.

296

4. Se mezclaron las cuatro digestiones en un solo tubo y se dosific nuevamente en cuatro tubos eppendorf. Se aadieron los siguientes componentes en cada tubo, para un volumen final de 35 l, como se indica a continuacin: Alcuota de la digestin TE 1X o H2O Tampn especfico del enzima Enzima endonucleasa B 15 l 14 l 3.5 l 2.5 l

NOTA: los tampones en los cuales trabajan los enzimas de restriccin, presentan diferentes concentraciones de sales. Por ello, se trabaj primero con el enzima que requiere un tampn con mayor cantidad de sales. NOTA: tambin se trabaj con los volmenes de digestin a continuacin descritos. Primera digestin para un volumen final de 50 l: Miniprep o midiprep 40 l Tampn 5 l Enzima 2.5 l H2O 2.5 l NOTA: se tomaron 2 l para observar en el gel de agarosa. Segunda digestin para un volumen final de 60 l: Volumen de la digestin 48 l Tampn 6 l Enzima 2.5 l H2O 3.5 l 5. Se incub a la temperatura ptima del enzima. 6. Se mezclaron las alcuotas en un solo tubo eppendorf (si fue el caso) y se realiz el procedimiento de purificacin de bandas en gel de agarosa como a continuacin se describe. B. 4. ELUCIN DE BANDAS DE ADN EN GELES ESTNDAR O DE BAJO PUNTO DE FUSIN. Para recuperar fragmentos de ADN del rango de 70 pb y hasta 10 Kb, se utilizaron los kits de QIAGEN (QIAquick Gel Extraction kit Protocol) o de MACHEREY-NAGEL (NucleoSpin Extract kit), usando microcentrfuga. A partir de las alcuotas de digestiones de grandes volmenes de plsmido: 1. Se carg de 30 a 80 l de la digestin en un carril ancho del gel de agarosa al 0.8% (p/v), en TAE 1X o TBE 1X, aadiendo 6.0 l de tampn de corrida Sb 5X a dicha muestra. 2. Se aplic corriente (100 voltios), hasta que quedasen perfectamente separadas las bandas, correspondientes al vector e inserto. 3. Con la ayuda de un bistur y sobre el transluminador de luz ultravioleta, se extrajeron del gel de agarosa, las bandas ADN de inters (vector o inserto), eliminando en lo mayor posible el exceso de agarosa y depositndolo dentro de un tubo eppendorf para pesarlo. 4. Se aadieron 3 volmenes del tampn GQ. NOTA: el volumen mximo del tampn debe ser de 800 l.

297

5. Se incub a 50 C, para fundir el agarosa, y se observ su color. NOTA: el color amarillo del tampn GQ indica un pH 7.5. Si da una coloracin naranja o violeta se debe aadirse 10 l de acetato de sodio 3 M, pH 5.0 y mezclar. 6. Se dejo enfriar a temperatura ambiente y se le dio un pulso de centrfuga. 7. Se filtr en columna de ADN, aplicando presin con la ayuda de una perilla de pipeta Pasteur. Se realizaron tres rendimientos antes de centrifugar, sin cambiar de tubo colector. 8. Se centrifug a mxima velocidad, durante 30 segundos. Y se elimin el contenido del tubo colector. NOTA: el ADN ha quedado fijado a la columna. 9. Se aadi a la columna, 500 l del tampn GQ y se centrifug nuevamente a mxima velocidad, para lavar la columna de residuos de agarosa. 10. Se lav la columna con 750 l de tampn PE, y se centrifug a mxima velocidad. NOTA: si la banda a eluir se va a emplear para una reaccin de ligacin en un vector, se debe incubar de 2 a 5 minutos antes de centrifugar nuevamente a mxima velocidad. 11. Se le dio un pulso de centrfuga a baja velocidad para eliminar completamente el alcohol que contiene el tampn PE. 12. Se coloc la columna sobre un tubo colector nuevo y se eluy el ADN fijado a la columna, con 30 l del tampn EB, mediante una centrifugacin a mxima velocidad. 13. Se hizo un rendimiento, aplicando 20 l del tampn EB a la columna y centrifugando de nuevo. B. 5. CUANTIFICACIN DE BANDAS DE ADN EN GELES DE AGAROSA. 1. Se cargaron 1 l de cada elusin de ADN, junto con un patrn de diluciones (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160) del Lambda-ADN de concentracin conocida (300 ng/l), a fin de comparar y determinar la concentracin aproximada de cada muestra de ADN problema. B. 6. LIGACIN Y TRANSFORMACIN DE CLULAS DH5- . Tomando en cuenta los tamaos del vector e inserto, se trabaj con la siguiente frmula para determinar la cantidad de nanogramos (ng) de inserto a utilizar. ng inserto = ng vector X tamao del inserto en pares de bases / tamao del vector proporcin utilizada de inserto con respecto a la concentracin del vector (1:1, 1:3 1:5). Donde la cantidad de ng de vector es una constante (20, 40 60 ng). 1. De esta forma, se estableci los siguientes volmenes de reacciones de ligacin: 1 l de PEG 4000. 1 l de Tampn de Ligasa 10X. 0.7 l de Ligasa T4. El volumen en l equivalente a 20, 40 60 ng de vector. El volumen en l equivalente a los ng de inserto obtenidos segn la frmula. Los l de agua necesarios para ajustar un volumen final predeterminado (10, 20 30 l). 2. Se mezcl cuidadosamente y se incub a 22 C en tubos de PCR en el termociclador durante toda la noche. X

298

3. Se transformaron clulas competentes DH-5 mediante el choque trmico descrito anterormente. Se plaque en medio selectivo marcado por el plsmido utilizado. 4. A partir de las colonias bacterianas obtenidas, se realizaron cultivos lquidos y se extrajo plsmido para comprobar por patrn de digestin y por reaccin de secuenciacin, la presencia del inserto. 5. Se amplific el plsmido verificado por secuenciacin por medio de mini o midiprep, con la finalidad de utilizarlo posteriormente para la transformacin de una cepa del fitopatgeno Agrobacterium tumefaciens. C. PREPARACIN DE Agrobacterium tumefaciens. UN SISTEMA BINARIO PARA LA TRANSFORMACIN ESTABLE EN PLANTAS SUSCEPTIBLES A LA INFECCIN. Para preparar clulas competentes del gnero Agrobacterium, se sigui el procedimiento que a continuacin se describe; 1. A partir de un cultivo glicerinado almacenado a 80 C, de la cepa C58C1 con vector binario (pGV2260) con resistencia a rifampicina-gentamicina. Se realiz un estriado en placa y se incub en estufa a 28 C durante tres das para obtener colonias aisladas. 2. Se inocul una colonia en un tubo Falcon de 50 ml que contena 5 ml de medio LB (LuriaBertani) adicionado con 50 g/ml de rifampicina. Se incub toda la noche a 28 C a 250 r.p.m. 3. Se diluy 1:100, inoculando 2 ml del cultivo en un matraz de 1000 ml que contena 200 ml de medio adicionado con rifampicina y se incub toda la noche a 28 C, bajo agitacin hasta obtener una densidad ptica de 0.5 a 0.8, a 600 nm. 4. Se dej enfriar el matraz en hielo, por 15 a 30 minutos. 5. Se centrifug todo el volumen a 3000 r.p.m., por 20 minutos a 4 C y se decant inmediatamente. 6. El pellet bacteriano obtenido fue resuspendido cuidadosamente con agua destilada estril enfriada en hielo, en un volumen del cultivo inicial (200 ml). 7. Se centrifug nuevamente a 3000 r.p.m., por 20 minutos a 4 C y se decant. 8. Se resuspendi el pellet bacteriano en de volumen del cultivo inicial (100 ml), nuevamente con agua enfriada en hielo. 9. Se centrifug a 3000 r.p.m., por 20 minutos a 4 C y se decant. 10. Se resuspendi el pellet bacteriano en 1/50 de volumen del cultivo inicial (4 ml) con una solucin de glicerol al 10 % estril enfriada en hielo. 11. Se centrifug a 3000 r.p.m., por 20 minutos a 4 C y se decant. 12. Se resuspendi el pellet bacteriano en 1/100 de volumen del cultivo inicial (2 ml) con una solucin estril de glicerol al 10 %, enfriada en hielo. NOTA. la concentracin final de clulas competentes ha de ser 1 a 3 X1010 clulas por mililitro. 13. Se hicieron alcuotas de 100 l y se congelaron a 70 C, hasta su uso. A partir de un glicerinado de clulas competentes, se realizaron transformaciones por choque trmico como a continuacin se describe:

299

C. 1. TRANSFORMACIN DE Agrobacterium tumefaciens POR CHOQUE TRMICO. 1. Se aadi aproximadamente 1 g de ADN (construccin para expresin en plantas) a cada glicerinado. 2. Se dej descongelar en hielo, durante dos a tres horas. 3. Se incub a 42 C en bao, por 90 segundos. 4. Se incub en hielo nuevamente, por 10 min. 5. Se aadi 500 l de medio LB (Luria-Bertani). 6. Se dej crecer durante tres horas a 28 C a 250 r.p.m. 7. Se plaque en medio selectivo con 50 g/ml de rifampicina y 25 g/ml kanamicina, y se incub durante tres das a 28 C. C. 2. OBTENCIN DE CLULAS ELECTROCOMPETENTES ( Agrobacterium sp.). 1. Se inocul 400 ml de medio LB (Luria-Bertani) adicionado con rifampicina con 1/100 de volumen de cultivo fresco crecido toda la noche a 28 C. 2. Se incub a 250 r.p.m., a 28 C hasta alcanzar una O.D. de 0.5 a 600 nm. 3. Se incub el cultivo durante 30 minutos en hielo, y se centrifug a 4000 g por 10 minutos a 4 C. 4. Se decant el pellet bacteriano cuidadosemente y se resuspendi en 1 litro de agua estril enfriada previamente en hielo. 5. Se centrifug nuevamente y se decant. 6. Se resuspendi el pellet en 250 ml de agua estril enfriada previamente en hielo, se centrifug y decant nuevamente. 7. Se resuspendi el pellet en 10 ml de una solucin estril de glicerol al 10%, enfriada previamente en hielo. Se centrifug y decant nuevamente. 8. Se resuspendi el pellet en 1 ml de la solucin de glicerol al 10% (la concentracin de 10 clulas oscila entre 1 a 3X10 clulas/ml), se hicieron alcuotas de 50 l y se congelaron a 70 C. Las alcuotas pueden ser almacenadas en buenas condiciones hasta 6 meses bajo stas condiciones. C. 3. LA TRANSFORMACIN DE Agrobacterium POR ELECTROPORACIN. 1. Se descongelaron en hielo las alcuotas de 50 l de clulas electrocompetentes de Agrobacterium. 2. Se diluy 1:10 en agua, un stock de plsmido extrado por kit de mini o midiprep, de las construcciones en pGreen obtenidas con anterioridad, y se agreg 1 l de la dilucin a cada alcuota de bacterias. 3. Se incub 5 minutos ms en hielo y se aplicaron a las cubetas de electroporacin, mantenindolas todo el tiempo en hielo.

300

4. Se electropor en cubetas de 0.2 cm a 1.7 Kv en el aparato E. coli Pulser BIORAD, aadiendo a la cubeta inmediatamente despus, 1 ml de medio SOC o LB (Luria-Bertani) sin antibiticos. 5. Dichas alcuotas se pasaron a un tubo eppendorf y se incubaron durante 2 horas en la estufa de 28 C, en reposo. 6. Se plaquearon volmenes de 50, 100 y 200 l en medio LB (Luria-Bertani) adicionado con 50 g/ml de rifampicina y 25 g/ml kanamicina. Se incub en estufa a 28 C durante tres das para poder observar las colonias transformantes. D. TRANSFORMACIN ESTABLE DE TABACO VIA Agrobacterium tumefaciens. D. 1. LA INFECCIN DE HOJAS DE TABACO CULTIVAR petit havane. 1. Se inocul una colonia de Agrobacterium supuestamente transformada en 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) que contena 50 g/ml de rifampicina y 25 g/ml kanamicina. 2. Se incub toda la noche a 28 C, a 250 r.p.m. 3. Se tom una alcuota de 2 l del cultivo para verificar la transformacin por medio de PCR. A continuacin se describe sta reaccin: H2O 21 l DnTPs MIX 1 l Primer A * 1 l Primer B * 1 l Cultivo bacteriano ** 1 l * 2.5 l del stock concentrado (100 pmol/l) y 97.5 l de H2O. ** 2 l del cultivo crecido toda la noche a partir de una colonia y 10 l de H2O. Se mezcl bien, se incub a 94 C por 5 minutos y en hielo se aadieron 25 l del MIX preparado de enzima polimerasa: MIX 1 X para la reaccin: H2O 15.75 l Tampn 10X Ex TaqTM (libre de Mg++) 5 l Enzima Takara Ex TaqTM 0.25 l MgCl2 4 l Se mezcl bien y se proces en termociclador por 36 ciclos. Se observ la banda amplificada correspondiente al gen en gel de agarosa. 4. El cultivo bacteriano comprobado por PCR, fue diluido 1:100 en matraz Erlenmeyer, con 200 ml del mismo medio empleado para el cultivo de 5 ml y se incub toda la noche a 28 C, a 250 r.p.m. 5. Se tom una muestra para leer la absorbancia a 600 nm. NOTA: el blanco consisti de 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) adicionado con 5 l de rifampicina y 2.5 l de kanamicina. La muestra del cultivo bacteriano se diluy 1:1 en medio utilizado como blanco. 6. Se vertieron 50 ml del cultivo bacteriano en un tubo Falcon y se centrifug 10 minutos a 3500 r.p.m. y se decant. 7. Se resuspendi el pellet bacteriano en medio MS lquido 0.5X, para obtener una densidad ptica de 0.5 a 600 nm. Ej. Si el valor de la absorbancia fue de 2, es necesario resuspender el pellet bacteriano cuatro veces el volumen del cultivo original (50 ml).

301

8. Se agreg 100 M de Acetosiringona, y se incub a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la infeccin del material vegetal. Ej. A partir de un stock filtrado 1 M de Acetosiringona, aadir 20 l para 200 ml de medio MS. 9. Se obtuvieron explantes de hoja de tabaco de la variedad petit havane SR1, creciendo seis semanas aproximadamente en cultivo in vitro, eliminando la nervadura central. 10. Una vez obtenido los explantes, se procedi a la infeccin con Agrobacterium, mediante simple inmersin de la hoja en la suspensin bacteriana preparada anteriormente. 11. Los explantes de hojas se colocaron sobre un papel secante estril para eliminar el exceso de bacteria y se inocularon en medio para regeneracin va organognesis. El medio de regeneracin est compuesto como a continuacin se indica: MS (Macro y micronutrientes y vitaminas) 4.4 g/l DUCHEFA BIOCHEMIE Sacarosa 30 g/l BAP 1 mg/l NAA 0.1 mg/l pH ajustado con KOH 1 N 5.8 Agar-agar 7 g/l 12. Se cocultiv con Agrobacterium, durante cuatro das en oscuridad, a 25 C. 13. Se transfirieron los explantes de hoja en medio selectivo que contena 0.75 y 1.5 mg/l de PPT (GLUFOSINATE-AMMONIUM PESTANAL SIGMA-ALDRICH), y 100 mg/l de Timentina (Clavulanato de Potasio) DUCHEFA, para eliminar la bacteria. Se realizaron subcultivos en medio fresco cada semana. 14. Los brotes obtenidos se transfirieron a medio fresco en presencia del agente selectivo y el antibitico, hasta su elongacin y enraizamiento espontneo. NOTA: tambin se indujo el enraizamiento aadiendo al medio 2 g/l de carbn activo. 15. Una vez obtenidas plantas T0 regeneradas, se pasaron a tierra y continuaron su desarrollo en el invernadero para la etapa de floracin y fructificacin. D. 2. SELECCIN DE LNEAS TRANSGNICAS DE TABACO. Las semillas obtenidas despus de ste proceso se testaron inoculando para su germinacin en medio selectivo MS adicionado con 3 mg/l de PPT (cuatro veces la concentracin inicialmente utilizada para seleccionar brotes adventicios durante la organognesis), 30 g/l de sacarosa y 100 mg/l de Timentina. Las plantas obtenidas corresponden a la generacin T1. El proceso de esterilizacin de semillas de tabaco fue el siguiente: a. Se aadi a un tubo eppendorf la cantidad de semillas equivalente a un volumen de 50-100 l. b. Se incubaron por 20 minutos en una solucin de Tween-20 al 0.1% en agua bajo agitacin. c. Se realizaron dos lavados con la solucin de Tween-20 al 0.1% y posteriormente se aadi 3 ml de etanol al 70 % (v/v) agitando vigorosamente durante 5 minutos. d. Se elimin el etanol con la ayuda de una pipeta Pasteur estril y se aadi inmediatamente 1 ml de agua estril. Se realiz un lavado con agua estril. e. Se elimin el agua y se lav durante 10 minutos con una solucin de hipoclorito de sodio al 15 % (v/v) y Tween-20 al 0.1 % (v/v) bajo agitacin vigorosa. f. Se realizaron cuatro lavados con agua estril.

302

NOTA: las semillas pueden permanecer en agua estril hasta el momento de sembrarlas en placa. g. Se aadi 2.5 ml de una suspensin estril de agarosa al 0.1 % (p/v) en agua. h. Se verti la suspensin sobre las placas de medio selectivo; 3.0 mg/l de PPT (GLUFOSINATE-AMMONIUM PESTANAL SIGMA-ALDRICH) y se dej secar. i. Se incubaron las placas en fotoperodo en el cuarto de cultivos vegetales. NOTA. Tambin se puede esterilizar semillas en seco, utilizando una mezcla de 100 ml de leja comercial (Hipoclorito de sodio: NaClO) y 3 ml de HCl al 37 %, durante 4 a 5 horas en cmara. NaClO + HCl NaOH + Cl2

NOTA. La siguiente generacin de tabaco, la T2, se seleccion sembrando semillas en el medio selectivo adicionado con 5.0 mg/l de PPT (GLUFOSINATE-AMMONIUM PESTANAL SIGMA-ALDRICH). E. TRANSFORMACIN ESTABLE DE Arabidopsis thaliana CULTIVAR COLUMBIA 0, MEDIANTE Agrobacterium tumefaciens. E. 1. PREPARACIN DE Agrobacterium tumefaciens Y LA INFECCIN DE ARABIDOPSIS. 1. Se inocul un cultivo de 5 ml adicionado con 50 g/ml de rifampicina y 25 g/ml kanamicina con una colonia transformada de Agrobacterium, y se incub a 28 C en agitacin durante toda la noche. 2. Se diluy al da siguiente 1:250 en 500 ml del mismo medio y se incub toda la noche a 28 C en agitacin hasta obtener una densidad ptica de 0.5 a 0.8. 3. Se centrifug los 500 ml de medio de cultivo de Agrobacterium durante 10 minutos a 5000 r.p.m., a 4 C. 4. Se elimin el sobrenadante y el pellet bacteriano fue resuspendido en un volumen final de 300 ml de agua miliQ adicionando 5 % de sacarosa y 0.02 % de seluet. 5. Se realizaron inmersiones con dicha suspensin, con inflorescencias jvenes de plantas adultas de Arabidopsis thaliana creciendo en tiestos en cmara bioclimtica en fotoperodo de da largo. Las inmersiones fueron de 5 minutos para cada tiesto. 6. Se colocaron los tiestos en posicin horizontal y se dejaron en oscuridad durante 2 das. Posteriormente las plantas se pasaron nuevamente a la cmara bioclimtica hasta la colecta de semillas. E. 2. SELECCIN DE LNEAS TRANSGNICAS DE Arabidopsis thaliana. La seleccin de lneas transgnicas de Arabidopsis thaliana se realiz mediante la siembra de semillas de la generacin T1 obtenida directamente a partir de la inflorescencia infectada con la cepa transformada de Agrobacterium tumefaciens, en medio selectivo adicionado con 25 mg/l de kanamicina.

303

Las semillas se esterilizaron e inocularon en el medio GM 0.5X, como a continuacin se describe: 1. Se incubaron durante 20 minutos, volmenes de 50 - 100 l de semillas, en 1 ml de una solucin de Tween-20 al 0.1 % en agua. 2. Se elimin la solucin de Tween-20 y se realizaron dos lavados ms. 3. Se aadi etanol al 70% (v/v) vorteando durante 5 minutos. 4. Se realiz inmediatamente un lavado con agua estil y se aadi una solucin de hipoclorito de sodio al 20 % y Tween-20 al 0.1 % en agua, se incub durante 10 minutos vorteando de vez en cuando. 5. Se lavaron cuatro veces con agua destilada estril, con la ayuda de una pipeta Pasteur estril. 6. Se agreg 2.5 ml de una suspensin estril de agarosa al 0.1 %. 7. Se verti la suspensin sobre las placas de medio selectivo y se dej secar. 8. Se incubaron a 4 C en oscuridad, durante 4 das y se pasaron posteriormente a la cmara de germinacin, a 22 C con fotoperodo de da largo. NOTA: para la germinacin de semillas obtenidas posterior a la transformacin de inflorescencias de Arabidopsis thaliana va Agrobacterium se emple el medio selectivo GM 0.5 X. 1000 ml de medio GM 1X Concentrado de micro y macro elementos y 4.4 g vitaminas del medio MS (DUCHEFA). MES 0.5 g pH ajustado con KOH 1 N 5.7 a 5.8 Bacto-agar 8g 0.5X 2.2 g 0.25 g 5.7 a 5.8 8g

NOTA. El medio fue adicionado con 100 mg/l de Timentina para eliminar Agrobacterium y 25 mg/l de kanamicina para seleccionar las semillas resistentes. Las plntulas obtenidas de pasaron a tiestos en invernadero con fotoperodo de da corto. NOTA. Tambin se puede esterilizar semillas en seco, utilizando una mezcla de 100 ml de leja comercial (Hipoclorito de sodio: NaClO) y 3 ml de HCl al 37 %, durante 4 a 5 horas en cmara. NaClO + HCl NaOH + Cl2

9. Las plantas de la generacin T1 resistentes, obtenidas en el primer proceso de seleccin se transplantaron a invernadero para su maduracin y posterior cosecha de semillas de la generacin T2. 10. Se sembraron 100 semillas de cada lnea (planta) de la generacin T2 en medio selectivo adicionado con 25 mg/l de kanamicina. 11. Se cuantificaron las plantas resistentes obtenidas en la generacin T2 para determinar el tipo de segregacin de cada lnea.

304

F. TRANSFORMACIN ESTABLE DE ARROZ (Oryza sativa) CULTIVAR SENIA VIA AGROBACTERIUM. F. 1. INDUCCIN DE CALLO EMBRIOGNICO A PARTIR DE EMBRIN CIGTICO MADURO. Protocolo modificado del CIRAD-Montpellier, France. Desinfeccin de granos maduros de arroz: 1. Se elimin la cscara de 100 a 200 granos sanos de arroz. 2. Se sumergieron en etanol al 70 % (v/v) durante un minuto en la campana de flujo laminar. 3. Se transfirieron los granos a un matraz Erlenmeyer estril que contena de 30 a 40 ml de leja comercial diluda al 30 % con agua estril. NOTA: se puede aadir una gota de detergente de uso comn. 4. Se mantuvo en sta solucin durante 30 minutos, mezclando de vez en cuando. 5. Se lavaron los granos sucesivas veces con abundante agua estril hasta utilizar un litro. Se mantuvieron una hora en agua estril. 6. Se secaron los granos en papel filtro estril. Inoculacin de granos: 1. Una vez desinfectados, los granos fueron sembrados en placa con medio de induccin (NB), a razn de 12 granos por placa. NOTA: la placa se deja abierta para eliminar el exceso de agua. El medio de induccin NB est compuesto por los siguientes elementos, para un litro: Macro-elementos del medio 1 N6 10 X Macro-elementos del medio 2 N6 10 X Macro-elementos del medio 3 N6 10 X Micro-elementos del medio B5 1000X FeEDTA MS 200X cido nicotnico Piridoxina Tiamina Inositol Prolina Glutamina Caseina hidrolizada Sacarosa 2,4-D pH (ajustado con KOH) Fitagel 100 ml 100 ml 100 ml 1 ml 5 ml 1 mg 1 mg 10 mg 100 mg 500 mg 500 mg 300 mg 30 g 2.5 mg 5.8 2.6 g

305

Macro 1 MgSO4.7H2O (NH4)2 SO4 KNO3 Macro 2 CaCl2.2H2O Macro 3 KH2PO4 Micro B5 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O H3BO3 KI MnSO4.H2O NaMoO4.2H2O ZnSO4.7H2O FeEDTA FeSO4.7H2O NaEDTA

Medio N6 10X, para 1000 ml 185.3 mg 463 mg 2.83 g Medio N6 10X, para 1000 ml 166 mg Medio N6 10X, para 1000 ml 400 mg Medio B5 1000X, para 1000 ml 0.025 mg 0.025 mg 3 mg 0.75 mg 10 mg 0.25 mg 2 mg MS 200X, para 1000 ml 27.85 mg 37.25 mg

2. Se incub a 28 C en oscuridad durante 30 a 35 das. 3. Despus de ste perodo, el escutelo del embrin ha formado un callo primario de tipo compacto de entre 0.5 a 1 cm de dimetro. A partir de stos callos primarios se pueden formar y separar pequeas unidades esfricas embriognicas compactas de entre 0.5 a 1 mm, las cuales fueron transferidas a medio (NB) fresco en placas, a razn de 15 unidades por placa. NOTA: el callo primario puede mantenerse en la misma placa sin subcultivar, ya que puede formar nuevas unidades embriognicas. 4. Se incubaron las unidades embriognicas en oscuridad a 28 C durante 15 das. 5. Despus de ste perodo, las unidades embriognicas habrn proliferado en tres tipos de callo; a) unidades de talla inferior a 0.8 mm, las cuales fueron transferidas a medio fresco (NB) a razn de 15 por placa e incubados 14 das, b) unidades esfricas de apariencia globular de entre 0.8 a 1.6 mm aproximadamente, las cuales fueron utilizadas para la transformacin y c) unidades de forma compleja y de un tamao superior a los 2 mm que fueron eliminados. NOTA: despus de 14 das de incubacin, las unidades de talla pequea se desarrollaron y formaron nuevamente los tres tipos de callos mencionados anteriormente. Este comportamiento permite seleccionar hasta en tres ocasiones el tipo de callo idneo para la transformacin. 6. Los callos globurales se transfirieron a medio NB fresco y se mantuvieron a 28 C entre 2 y 4 das. NOTA: se realizaron transformaciones partir de un glicerinado de clulas electro-competentes de Agrobacterium tumefaciens por el mtodo de electroporacin como a continuacin se describe:

306

F. 2. INFECCIN DE CALLOS DE ARROZ POR AGROBACTERIUM. 1. Se realiz la transformacin partir de un glicerinado de clulas electro-competentes de Agrobacterium tumefaciens por el mtodo de electroporacin arriba descrito. 2. Se inocul una colonia de Agrobacterium supuestamente transformada en 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) que contena 50 g/ml de rifampicina y 25 g/ml kanamicina. 3. Se incub toda la noche a 28 C, a 250 r.p.m. 4. Se tom una alcuota de 2 l del cultivo para verificar la transformacin por medio de PCR: A continuacin se describe la reaccin de PCR para verificar la transformacin de Agrobacterium: H2O dNTPs MIX Primer A * Primer B * Cultivo bacteriano ** 21 l 1 l 1 l 1 l 1 l

* 2.5 l del stock concentrado (100 pmol/l) y 97.5 l de H2O. ** 2 l del cultivo crecido toda la noche a partir de una colonia y 10 l de H2O. Se mezcl bien, se incub a 94 C por 5 minutos y en hielo se aadieron 25 l del MIX preparado de enzima polimerasa: MIX 1X para la reaccin: H2O Tampn 10X Ex TaqTM (libre de Mg++) Enzima Takara Ex TaqTM MgCl2 15.75 l 5 l 0.25 l 4 l

Se mezcl bien y se proces en termociclador por 36 ciclos, a 65 C. Se observ la banda amplificada correspondiente al gen en gel de agarosa. 5. El cultivo bacteriano transformado y verificado por PCR, fue diluido 1:100 en matraz Erlenmeyer, con 200 ml del mismo medio empleado para el cultivo de 5 ml y se incub toda la noche a 28 C, a 250 r.p.m. 6. Se tom una muestra para leer la absorbancia a 600 nm. NOTA: el blanco consisti de 5 ml de medio LB (Luria-Bertani) adicionado con 5 l de rifampicina y 2.5 l de kanamicina. La muestra del cultivo bacteriano se diluy 1:1 en medio utilizado como blanco. 7. Se verti cierto volumen del cultivo bacteriano en un tubo Falcon, para obtener una densidad ptica de 0.8 a 600 nm en 25 ml de solucin, se centrifug 10 minutos a 3500 r.p.m. y se decant. 8. Se resuspendi el pellet bacteriano en 25 ml de medio de cocultivo lquido (R2L),

307

El medio R2L presenta los siguientes componentes, para un litro: Macro-elementos I R2 10X Macro-elementos II R2 10X Micro-elementos R2 1000X Vitaminas del medio B5 FeNa-EDTA R2 100X Tiamina Glucosa 2,4-D Acetosyringona (filtrado) pH Macro-elementos I R2 KNO3 (NH4)2SO4 NaH2PO4.H2O MgSO4.7H2O Macro-elementos II R2 CaCl2.2H2O Micro-elementos R2 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O Fe-EDTA R2 100X FeSO4.7H2O Na2EDTA 100 ml 100 ml 1 ml 25 ml 10 ml 1 mg 10 g 2.5 mg (19.62 mg) 100 M 5.2 10X, para 1000 ml 4g 330 mg 312 mg 246 mg 10X, para 1000 ml 146 mg 1000X, para 1000 ml 1.6 mg 2.2 mg 2.83 mg 0.2 mg 0.125 mg 100X, para 1000 ml 12.5 mg 1.8 mg

9. Se transfirieron entre 100 y 150 callos seleccionados de arroz para cada construccin, en una placa donde fue vertida la suspensin bacteriana a 0.8 de densidad ptica y se mantuvo en agitacin suave por 10 minutos. 10. Se descart la suspensin bacteriana con la ayuda de una pipeta Pasteur y se secaron muy bien los callos en varias capas de papel filtro estril. 11. Se inocularon de 10 a 12 callos por placa con medio de cocultivo slido R2-CS, y se incubaron durante 3 das a 25 C en oscuridad. El medio R2-CS slido presenta los siguientes componentes, para un litro: Macro-elementos I R2 10X Macro-elementos II R2 10X Micro-elementos R2 1000X Vitaminas del medio B5 FeNa-EDTA R2 100X Tiamina Glucosa 2,4-D Acetosyringona (filtrado) pH Agarosa tipo I 100 ml 100 ml 1 ml 25 ml 10 ml 1 mg 10 g 2.5 mg (19.62 mg) 100 M 5.2 7g

308

12. Se transfirieron los callos a medio no selectivo R2S, y se incubaron a 28 C en oscuridad. Se eliminaron los callos que presentaron an crecimiento de Agrobacterium a manera de halo. El medio R2S contiene los siguientes elementos y proporciones por litro: Macro-elementos I R2 Macro-elementos II R2 Micro-elementos R2 Vitaminas del medio B5 FeNa-EDTA R2 Tiamina Sacarosa 2, 4-D pH (ajustado con KOH) Cefotaxima (filtrado) Vancomicina (filtrado) Agarosa tipo I 100 ml 100 ml 1 ml 25 ml 10 ml 1 mg 30 g 2.5 mg 6 400 mg 100 mg 7g

13. Pasados 12 das, se transfirieron slo callos que presentaron aparente infeccin por la bacteria fitopatgena en forma de reas necrosadas a medio NBS no selectivo, y se incubaron a 28 C en oscuridad, durante 10 das (puede ser entre 8 y 12 das). El medio NBS contiene los siguientes elementos y proporciones para un litro: Macro-elementos del medio 1 N6 10 X Macro-elementos del medio 2 N6 10 X Macro-elementos del medio 3 N6 10 X Micro-elementos del medio B5 FeEDTA stock 100X Acido nicotnico Piridoxina Prolina Glutamina Tiamina Inositol Casena hidrolizada Sacarosa 2,4-D pH (ajustado con KOH) Cefotaxima Vancomicina Agarosa tipo I 100 ml 100 ml 100 ml 1 ml 5 ml 1 mg 1 mg 500 mg 500 mg 10 mg 100 mg 300 mg 30 g 2.5 mg 6 400 mg 100 mg 7g

14. Pasados los diez das, se disgregaron slo los callos que proliferaron a partir de las reas necrosadas y se incubaron a 28 C en oscuridad durante 8 das. 15. Transcurridos ocho das, se continu con la disgregacin en medio NBS fresco de los callos originados slo a partir de las zonas en apariencia infectadas por el fitopatgeno. Y se mantuvieron a 28 C por ocho das ms. 16. Una vez proliferado ste callo, se transfiri a medio de pre-regeneracin (PR-Ag) no selectivo, disgregando y seleccionando slo los callos compactos. En ste medio se mantuvieron durante 8 das (nunca ms de diez das), en condiciones de oscuridad y a 28 C.

309

El medio PR-Ag no selectivo contiene los siguientes elementos y proporciones para un litro: Macro-elementos del medio 1 N6 10 X Macro-elementos del medio 2 N6 10 X Macro-elementos del medio 3 N6 10 X Micro-elementos del medio B5 FeEDTA Prolina cido nicotnico Glutamina Tiamina Piridoxina Casena hidrolizada Sacarosa ABA BAP ANA pH (ajustado con KOH) Agarosa tipo I Cefotaxima Vancomicina 100 ml 100 ml 100ml 1 ml 5 ml 500 mg 1 mg 500 mg 10 mg 1 mg 300 mg 30 g 5 mg 2 mg 1 mg 5.8 7g 100 mg 100 mg

16. Pasado ste tiempo, los callos se pasaron a medio de regeneracin (RN), y se mantuvieron 2 das en oscuridad a 28 C. El medio RN no selectivo contiene los siguientes elementos y proporciones para un litro: Macro-elementos del medio 1 N6 10 X Macro-elementos del medio 2 N6 10 X Macro-elementos del medio 3 N6 10 X Micro-elementos del medio B5 FeEDTA Prolina cido nicotnico Glutamina Tiamina Piridoxina Casena hidrolizada Sacarosa BAP ANA pH (ajustado con KOH) Fitagel 100 ml 100 ml 100ml 1 ml 5 ml 500 mg 1 mg 500 mg 10 mg 1 mg 300 mg 30 g 3 mg 0.5 mg 5.8 4.5 g

17. Pasados dos das, se transfirieron a condiciones de fotoperiodo 16 horas luz y 8 horas oscuridad, a 28 C, y se mantuvieron en placa entre 2 y 3 semanas de diferenciacin. 18. Las plntulas regeneradas de arroz, se transfirieron a jarras donde permanecieron entre 10 y 15 das bajo las mismas condiciones de temperatura y fotoperiodo, para la etapa de elongacin y enraizamiento. Medio de enraizamiento: Sales y vitaminas del medio MS DUCHEFA Sacarosa pH (ajustado con KOH) Fitagel 1X 50 g/l 5.8 2.6 g/l

310

19. Las plntulas obtenidas, se transfirieron a invernadero, sembrando dos manojos de plntulas por tiesto donde se aclimataron cubrindolas en cmara hmeda durante una semana y maduraron en un perodo de entre 2 y 3 meses para la floracin y 6 semanas de maduracin de la semilla. F. 3. SELECCIN DE PLANTAS TRANSGNICAS DE ARROZ. 1. A los 40 das del traslado al invernadero de las plantas regeneradas en la etapa anterior, se realiz el ensayo de resistencia aplicando 3.95 ml del herbicida comercial de contacto Finale COMPO; glufosinato de amonio al 20 % p/v (Peas, C. G. 2005) por litro de agua y una gota de Tween 80. sta solucin equivale a 0.08 % 8 mg/ml de glufosinato de amonio. Se detuvo el programa de riego durante tres das. 2. Una semana mas tarde, se realizaron las observaciones para determinar las plantas que presentaron o no, resistencia al herbicida; clasificndolas segn el grado de resistencia de la siguiente manera: susceptibles, intermedias y resistentes, siempre tomando como referencia las plantas tipo silvestre controles. 3. Se cosecharon las semillas de cada una de stas plantas (lneas) para evaluar la generacin T1. Las semillas se seleccionaron y sembraron en almcigos con sustrato adecuado; nueve semillas por cada lnea. Cuando las plntulas alcanzaron el estadio de 3 a 4 hojas, se realiz una nica aspersin con la solucin de Finale anteriormente descrita. Se detuvo el programa de riego durante tres das y una semana ms tarde se llev a cabo la evaluacin de las plntulas teniendo la precaucin de compararlas con las plantas tipo silvestre controles y con alguna lnea que present susceptibilidad evidente en la generacin anterior. G. EVALUACIN DE LNEAS TRANSGNICAS. G. 1. ANLISIS PCR. Se realizaron anlisis PCR del ADN genmico extrado (DNeasy Plant Mini Kit 50) de hoja adulta, para detectar el cDNA integrado al ADN genmico en lneas de plantas regeneradas de explantes infectados con Agrobacterium. Para ste anlisis, se utilizaron los oligos diseados para amplificar y clonar en sentido y antisentido el cDNA parcial de la transglutaminasa de maz. Y se muestran a continuacin: Construccin en sentido: Oligo para la diana BamHI: 5 - GCCCGGGGGATCCGCTCATCGTGGACATCTAG - 3 Oligo para la diana EcoRI: 5 - GCTGCAGGAATTCTCACCATATTTGTCTGCTC - 3 Construccin en antisentido: Oligo para EcoRI: 5 - GCTGCAGGAATTCGCTCATCGTGGACATCTAG - 3 Oligo para BamHI: 5 - GCCCGGGGGATCCTCACCATATTTGTCTGCTC - 3 En la siguiente tabla, se indica la reaccin de PCR. H2O dNTPs MIX Oligo A Oligo B ADN genmico 21 l 1 l 1 pmol 1 pmol 50 ng

311

Se desnaturaliz en ADN a 95 C por 5 minutos y se aadi la siguiente mezcla de reactivos. H2O Tampn 10X Enzima Takara Ex Taq Mg++ 25 mM 15 l por reaccin 5 l por reaccin 0.2 unidades por reaccin 2.5 mM por reaccin

El nmero de ciclos fue de 40 a 45, y las condiciones de temperatura fueron de 65 a 68 C. G. 2. DETECCIN DE LA PROTENA TRANSGLUTAMINASA DE MAZ EXPRESADA EN SISTEMAS HETERLOGOS VEGETALES (TABACO Y ARROZ). El mtodo de extraccin para las plantas supuestamente transgnicas est descrito en la metodologa del captulo I. G. 2. 1. CUANTIFICACIN POR BRADFORD. 1. Se prepar el reactivo colorante BioRad diluyendo una parte con cuatro partes de agua bidestilada. 2. Se filtr la dilucin en doble papel filtro Watman no. 1. NOTA: almacenar a temperatura ambiente como mximo por dos semanas. 3. Se prepararon cuatro diluciones de BSA: 0.2, 0.4, 0.6 y 0.9 mg/ml. Si se parte de un stock cuya concentracin es 10 mg/ml, preparar la siguiente tabla de diluciones: BSA (l) 2 4 6 9 H2O (l) 98 96 94 91

4. Se prepararon tres diluciones de cada muestra problema, como se indica en la siguiente tabla: Muestra problema (l) 5 10 15 H2O (l) 95 90 85

5. Se pipete 100 l de cada concentracin estndar de BSA y de cada muestra problema en un tubo de cristal. 6. Se agreg 5 ml del colorante diluido anteriormente, a cada tubo y se vorte. 7. Se incub a temperatura ambiente durante 15 minutos. NOTA: no mantener las muestras por ms de una hora, ya que la absorbancia aumento con el tiempo. 8. Se ley la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. Se extrapolaron las lecturas para obtener la concentracin en mg/ml de protena total de cada muestra problema.

312

G. 2. 2. WESTERN BLOT. En hoja de tabaco transgnico: 1. Las muestras de protena total extradas de hoja de tabaco separadas por electroforesis en gel de acrilamida al 10%, fueron transferidas a la membrana de nitrocelulosa (Hybond-c extra; supported nitrocellulose membrane; Amersham). La membrana fue incubada 15 minutos en tampn de transferencia a temperatura ambiente y en agitacin constante. 2. Se mont la transferencia de protenas en el sistema semiseco; Trans-blot SD Semi-dry. 3. La transferencia se llev a cabo durante 50 minutos a 15 voltios como constante. 4. Se comprob que la transferencia de protenas a la membrana de nitrocelulosa fue efectuada mediante la tincin de la membrana con rojo Poncean. 5. Se bloque la membrana de nitrocelulosa transferida con leche en polvo desnatada al 5 % en PBS, durante una hora a temperatura ambiente, bajo agitacin constante. 6. Se realiz un lavado con PBS de 5 minutos, en agitacin constante. 7. Se incub la membrana con el antisuero primario contra la transglutaminasa cloroplstica de 58 kD de Helianthus tuberosus diludo 1:5000 en PBS, durante una hora a temperatura ambiente, en agitacin constante. NOTA: tambin se realizaron pruebas con el antisuero primario contra la TGZ4 (transglutaminasa de maz con a repeats sobre-expresada en E. coli) diludo 1:5000 en PBS. 8. Se realizaron tres lavados con PBS de 5 minutos cada uno, en agitacin constante. 9. Se incub durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado a la peroxidasa IgY Anti-Chicken Jackson ImmunoResearch Inc., diludo 1:6600 en PBS, en agitacin constante, o para el TGZ4 el ECL Anti-rabbit IgG conjugado a la peroxidasa Amersham Biosciences diludo 1:14 000 en PBS. 10. Se realizaron tres lavados en Tween-20 al 0.3 % (v/v) en PBS, agitando vigorosamente durante algunos segundos. 11. Se realizaron dos lavados en Tween-20 al 0.l % (v/v) en PBS, agitando vigorosamente durante algunos segundos. 12. Se realizaron dos ltimos lavados en agitacin suave con PBS antes de realizar el revelado. 13. Se expuso la pelcula fotogrfica, durante 10 minutos, antes de ser revelada.

313