EVALUACION DEL pH EN EL CULTIVO DE Spirulina spp.

(=Arthrospira) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO

ALEX ROLANDO RODRIGUEZ CUESTA FRANCIA CATHERINE TRIANA SERRANO

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al ttulo de

Microbilogo Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogot, D.C. Abril 3 de 2006

NOTA DE ADVERTENCIA Artculo 23 de la Resolucin N. 13 de Julio de 1946 La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos pos sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

Bogot, D.C., agosto 9 de 2006

Seores PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Ciudad.

Estimados seores: Nosotros FRANCIA TRIANA Y ALEX RODRIGUEZ identificados con cdulas de ciudadana No. 52.703.730 y 79.893.892 de Bogot, autores del trabajo de grado titulado Evaluacin del pH en el cultivo de Spirulina spp. (=Arthrospira) bajo condiciones de laboratorio, presentado como requisito para optar al ttulo de Microbilogo Industrial; autorizamos a la Universidad Javeriana a: a) Reproducir el trabajo en medio digital o electrnico con e fin de ofrecerlo como medio para la consulta en la Biblioteca General. _ Si__ b) Poner a disposicin para la consulta con fines acadmicos, en la pgina web de la Facultad, de la Biblioteca General y en redes de informacin con las cuales tenga convenio la Universidad Javeriana. __Si__ c) Enviar el trabajo en formato impreso o digital, en caso de que sea seleccionado para participar en concursos de trabajos de grado. __Si__

d) Distribuir ejemplares de la obra, para la consulta entre las entidades educativas con las que la Facultad tenga convenio de intercambio de informacin, para que este sea consultado en las bibliotecas y centros de documentacin de las respectivas entidades. __Si__ e) Todos los usos, que tengan finalidad acadmica. __Si__

Los derechos morales sobre el trabajo son de los autores de conformidad con lo establecido en el artculo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artculo 11 de la Decisin Andina 351 de 1993, los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. Atendiendo lo anterior, siempre que se consulte la obra, mediante cita bibliogrfica se debe dar crdito al trabajo y a sus autores. Este documento se firma, sin perjuicio de los acuerdos que los autores pacten con la Unidad Acadmica referentes al uso de la obra o a los derechos de propiedad industrial que puedan surgir de la actividad acadmica.

FRANCIA TRIANA CC. No. 52.703.730 de Bogot.

ALEX RODRIGUEZ CC. No. 79.893.892 de Bogot.

EVALUACION DEL pH EN EL CULTIVO DE Spirulina spp. (=Arthrospira) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO

ALEX ROLANDO RODRIGUEZ CUESTA FRANCIA CATHERINE TRIANA SERRANO

APROBADO

CLAUDIA PATRICIA ZAMBRANO Bacteriloga MSc. Director

JAIME BERNAL Qumico Ph.D Codirector

JORGE ROBLES Bilogo Ph.D Jurado

FABIAN CALDERON Microbilogo Industrial MSc. Jurado

EVALUACION DEL pH EN EL CULTIVO DE Spirulina spp. (=Arthrospira) BAJO CONDICIONES DE LABORATORIO

ALEX ROLANDO RODRIGUEZ CUESTA FRANCIA CATHERINE TRIANA SERRANO

APROBADO

ANGELA UMAA Biloga M. Phil. Decana Acadmica

LUIS DAVID GOMEZ Microbilogo MSc. Director de Carrera

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos especialmente la valiosa colaboracin del doctor Jaime Bernal director del Departamento de Qumica de la Facultad de Ciencias y codirector de este proyecto, por su apoyo constante, sus largas horas de atencin y explicaciones y por brindarnos todas las facilidades para realizar nuestro trabajo; as mismo agradecemos al Departamento de Qumica por permitirnos utilizar el laboratorio para llevar a cabo nuestro trabajo, as como tambin los equipos, materiales y reactivos empleados. Agradecemos tambin la colaboracin de Claudia Zambrano, directora de este proyecto, quien siempre atendi nuestras inquietudes y nos brind sus conocimientos en el tema.

Abril 3 de 2006.

TABLA DE CONTENIDO Pg. 1. INTRODUCCION 2. MARCO TEORICO 2.1 Generalidades de las cianobacterias 2.2 Spirulina sp. 2.2.1 Clasificacin taxonmica 2.2.2 Morfologa 2.2.3 Hbitat 2.2.4 Ultra-estructura 2.2.5 Reproduccin y ciclo de vida 2.2.6 Constituyentes fsico-qumicos 2.2.6.1 Protenas 2.2.6.2 Carbohidratos 2.2.6.3 Lpidos 2.2.6.4 Vitaminas 2.2.6.5 Minerales 2.2.6.6 cidos nucleicos 2.2.7 Aplicaciones teraputicas 2.2.7.1 Accin antialrgica 2.2.7.2 Efecto antianmico 2.2.7.3 Accin anticoagulante 2.2.7.4 Accin Antiinflamatoria 2.2.7.5 Efecto Antitxico 2.2.7.6 Proteccin Cardiovascular 2.2.7.7 Inmunoestimulante 2.2.8 Aplicaciones Comerciales 2.2.8.1 Acuacultura 2.2.8.2 Tratamiento de aguas negras 23 23 19 19 20 20 21 21 22 10 12 13 15 17 18 4 5 6 7 9 1 3 3

2.2.9 Produccin Comercial 2.2.10 Condiciones de Crecimiento 2.2.10.1 Cintica de crecimiento 2.2.10.2 Temperatura 2.2.10.3 Iluminacin 2.2.10.4 Agitacin 2.2.10.5 Nutricin 2.2.10.6 pH 2.2.10.7 CO2 3. FORMULACION DEL PORBLEMA Y JUSTIFICACION 4. OBJETIVOS 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Primera etapa experimental 5.1.1 Condiciones Generales . 5.1.2 Microorganismo 5.1.3 Inculo 5.1.4 Ensayos de pH 5.1.5 Mtodo de Determinacin de Biomasa 5.2 Segunda etapa experimental 5.2.1 Ensayo a pH 9.0 5.2.2 Adicin de CO2 en ensayo a pH 9.0 +/- 2 5.2.3 Determinacin de biomasa 5.3 Anlisis Estadstico de Variables 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Primera etapa experimental 6.2 Segunda etapa experimental 7. CONCLUSIONES

24 26 28 28 29 29 31 31 33 34 35 35 36 36 37 38 38 39 43 43

44 51 56

8. RECOMENDACIONES 9. REFERENCIAS 10. ANEXOS

57 58 62

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RESUMEN El estudio del cultivo de Spirulina spp. en condiciones de laboratorio es de inters debido a que en los ltimos aos se han descubierto sus grandes propiedades nutricionales, lo que hace necesario que se determinen factores importantes en su crecimiento como el pH. En este trabajo se busc optimizar este factor para lograr una mejor productividad en cuanto a biomasa g/L; se reporta el efecto que tiene diferentes valores de pH sobre la formacin de biomasa de Spirulina spp., se emplearon valores de pH de 8.2, 8.6, 9.0, 9.4, 9.8 y 10.2. Los ensayos se llevaron a cabo en medio Zarrouk a una temperatura de 25 +/-2C, aireacin constante, fotoperiodo 12:12 h y 58.56 mol quanta m-2 s-1 de irradiancia. Spirulina spp. fue capaz de crecer bajo todos los pH probados, sin embargo fue en el pH 9.0 en el cual present un menor tiempo de adaptacin en las 30 primeras horas de cultivo y uno de los mejores rendimientos a lo largo del cultivo. Se realiz una segunda etapa experimental en la cual se escogi el pH 9.0 de la primera etapa y se implement la adicin de CO2 al cultivo con el fin de evaluar la productividad del mismo, tambin se realiz un control sin CO2 y se determin que estadsticamente no hubo diferencias significativas entre los dos ensayos (p>0.05), sin embargo el control present una cada ms rpida en su crecimiento en el da 33, mientras que el ensayo con CO2 continu su crecimiento. As mismo se determin que la cantidad de CO2 as como el tiempo en la adicin de ste son muy pocos si se comparan con los beneficios que se pueden obtener en cuanto a productividad y por ende a rentabilidad. Palabras clave: biomasa, CO2, pH, Spirulina spp.

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ABSTRACT The study of Spirulina spp. cultures under laboratory conditions is of interest because in recent years its large nutritional properties have been discovered. As such, it is necessary that the effects of important factors such as pH and CO2 be determined on its growth. Two studies were performed. The first study was to analyze the effects of different values of pH (8.2, .8.6, 9.0, 9.4, 9.8 and 10.2) in order to obtain maximum biomass (g/L) productivity. The assays were kept in Zarrouk medium, 25 +/-2C, constant aeration, 12:12 h photoperiod and 58.56 mol quanta m-2 s-1 of irradiance. The Spirulina spp. was able to grow under all pH tests, however at pH 9.0 it had the shortest adaptation period during the first 30 hours of culture and one of the best yields. The second experiment was to determine if CO2 supplementation had any effect on the biomass ad pH. In this test the pH 9.0 culture was selected from the first stage and CO2 addition was implemented to the culture in order to evaluate its productivity. A control without CO2 was also performed. It was observed that initially there were no significant differences between both assays (p>0.05) until the 33rd day, at which time the control had a decline in its growth while the assay with CO2 continued to grow normally. We also determined that the quantity of CO2 and the time of addition are small when compared with the benefits that could be obtained in productivity and profitability. Key words: biomass, CO2, pH, Spirulina spp.

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1. INTRODUCCIN Spirulina spp. es una cianobacteria filamentosa, auttrofa, reconocida tambin como alga verde-azul, y que deriva su nombre de la naturaleza helicoidal o en espiral de sus filamentos. Su alto contenido nutricional justifica que se analice su produccin en cantidades suficientemente altas para permitir su comercializacin en un mbito nacional e internacional. S. maxima contiene entre 50 60% de protena bruta. El espectro de sus aminocidos es similar al de otros microorganismos y patrones protenicos alimenticios como huevos o leche, an cuando es deficiente en metionina, cistena y lisina (Ciferri, 1983; Cohen, 1997). Spirulina spp. es una fuente importante de vitaminas, especialmente vitamina B12 y carotenos; tambin de minerales como el hierro y de cidos grasos esenciales como el gama-linoleico. De hecho, la composicin qumica, de la S. maxima es el factor ms importante para evaluar la utilizacin de esta cianobacteria, como fuente potencial de alimento, lo que hace pertinente que se realicen estudios sobre su crecimiento y produccin. Spirulina spp. puede cultivarse fcilmente, en biorreactores y sistemas acuosos abiertos, naturales y artificiales, en los que el medio de cultivo lquido contiene sales como bicarbonato de sodio y nitratos, que contribuyen a la alcalinidad del medio, uno de los factores ms determinantes en el escalado y produccin. La iluminacin es importante por ser Spirulina spp. organismo fotoautotrfico, y para lograr una adecuada distribucin de nutrientes, se mantiene agitacin por medio mecnico o por burbujeo. Una instancia previa al cultivo industrial es la experimental, con el fin de obtener conocimiento sobre las condiciones ambientales que ms favorecen el crecimiento y cultivo de Spirulina spp.

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A pesar de su importancia nutricional, econmica y biolgica, Spirulina spp. no ha sido suficientemente investigada y desarrollada industrialmente en Colombia. Este trabajo busc evaluar a escala de laboratorio el pH, como principal factor determinante durante el proceso de produccin, establecer alternativas para su manejo, estabilizacin y control, as como mejorar la cintica de crecimiento de Spirulina spp. Para lo anterior, el trabajo consta de una primera etapa, en la cual se midieron diferentes valores de pH inicial, con el objetivo de determinar cul era el que ms favoreca el adecuado desarrollo del cultivo. En una segunda etapa experimental, se suministr CO2 gaseoso al medio de cultivo en una concentracin determinada, con el fin de mantener constante el pH establecido durante la primera etapa experimental, en busca de mejorar el rendimiento de biomasa (g/L) en el medio.

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2. MARCO TERICO 2.1 GENERALIDADES DE LAS CIANOBACTERIAS. Las cianobacterias son organismos desprovistos de membrana nuclear y mitocondrias; difieren de otros procariotes en la composicin de sus cidos grasos, ya que frecuentemente presentan cidos grasos no saturados con dos o ms enlaces dobles. Poseen solamente clorofila-a y un fotosistema II (PS-II). Este fotosistema, as como los pigmentos fotosintticos, los pigmentos accesorios y los componentes del transporte de electrones, estn incluidos en los tilacoides (sistemas membranosos fotosintticos). ntimamente ligados al sistema cloroflico se encuentran unos agregados llamados ficobilisomas o ficobilinas. Estos grnulos contienen en particular, un pigmento esencial para el transporte de energa hacia el PS-II, la ficocianina, protena que posee un grupo prosttico del tipo polipirrol, el cual le confiere un magnfico color azul, as como una fluorescencia roja de excepcional eficiencia. Las cianobacterias asimilan el carbono a travs del ciclo de Calvin y almacenan energa y carbono en forma de glucgeno (Rheinheimer, 1987). Las cianobacterias poseen diferentes esquemas metablicos que tienen en comn, la ausencia del ciclo de Krebs completo. Muchas de ellas, sobre todo las filamentosas, son capaces de reducir (fijar) el nitrgeno atmosfrico, gracias a unas estructuras llamadas heterocistos (Abbayes, 1989). La mayora de las cianobacterias son capaces de desplazarse en los lquidos, debido a vesculas gaseosas, o en el caso de las cianobacterias filamentosas, por deslizamiento de hasta 25 micras por segundo mediante microfibras. La reproduccin en estos organismos se efecta por escisin simple o mltiple, por gemacin o por fragmentacin. Algunas de sus especies producen clulas especializadas (acinetos), resistentes a la sequedad y a la congelacin, que pueden germinar cuando las condiciones se vuelven favorables (Whitton, 1992).

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Las cianobacterias se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, tanto en aguas continentales como en el mar, y por lo general toleran ambientes extremos mejor que las algas; gracias a esto, desempean un papel importante en los fenmenos biolgicos de las aguas superficiales. Existen formas libres y otras fijas. Estas ltimas crecen sobre las plantas y los animales acuticos, as como sobre algunos sustratos inertes como piedras. Algunas especies viven en simbiosis con plantas y animales inferiores (Rheinheimer, 1987; [http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). La fotosntesis es el proceso fotoqumico ms importante en la biosfera, realizado por plantas y cianobacterias, en stas, la energa solar se transforma en energa qumica a travs de la transformacin de molculas de carbono (Figueruelo, 2001). + energa solar
nCO2

en materia orgnica

nH2O

(CH2 O)n + respiracin

nO2

Las cianobacterias (algas verde-azuladas), organismos fottrofos, para formar biomasa necesitan elementos inorgnicos de partida, en su actividad nutricional, tales como, nitrgeno, oxgeno, carbono, hidrgeno, fsforo y azufre, que intervienen en la formacin de carbohidratos, grasas y protenas (Roldn, 1992). 2.2 SPIRULINA SPP. 2.2.1 CLASIFICACION TAXONOMICA Desgraciadamente existe una confusin entre los trminos Espirulina, Spirulina y Arthrospira, la cual proviene a la vez de errores en las determinaciones cientficas de los aos 1950 y de la denominacin comercial de ciertas cianobacterias alimentaras. Los trminos al asignarse en momentos histricos y autores diferentes, pero al argumentar un conjunto de conceptos a favor de uno y otro trmino, parece favorecer con mejores argumentos cientficos la denominacin Arthrospira. El gnero Arthrospira sp. incluye el conjunto de cianobacterias alimentaras vendidas

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comercialmente bajo el nombre de espirulina (spiruline en francs y spirulina en ingls) ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). Los nombres cianobacteria, algas verde-azules o cianofceas, se consideran trminos compatibles. El primero se refiere a la relacin taxonmica y filogentica, mientras el segundo representa la correlacin ecolgica y biolgica. As, segn la revisin actual para este microorganismo, en la tabla 1 encontramos su clasificacin taxonmica (Castenholz, 1989; [http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]).
Tabla 1. Ubicacin taxonmica de S. maxima (Becker, 1982)

Dominio: Bacteria Phylum: Cyanobacteria Clase: Cyanobacteria Orden: Oscillatoriales Familia: Oscilatoriaceae Gnero: Spirulina Especie: S. mxima (=Arthrospira) 2.2.2 MORFOLOGIA

El genero Spirulina spp. pertenece a la familia Oscillatoriaceae, En la figura 1, se observan algunos tipos de filamentos que pueden adoptar en su hbitat Spirulina spp. Las especies ms representativas en diversas investigaciones son: S. maxima y S. platensis, y entre stas existen tambin diferencias morfolgicas en cuanto a los filamentos, las vacuolas y la regularidad externa de la cubierta o la cpsula de cada filamento, que ayudan en la identificacin taxonmica de las diferentes especies (Tomaselli, et al., 1996). Esta familia contiene un grupo homogneo de cianobacterias filamentosas caracterizadas por tener las clulas en forma de espiral (tricomas) y una fina membrana externa mucilaginosa llamada vaina. La figura 2, muestra este tipo de

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caracterstica gracias a la microscopia electrnica de alta resolucin. Las dimensiones celulares, dependen del enrollamiento celular y del largo que puedan llegar a ser los filamentos. Estas dimensiones varan segn la especie. Regularmente los filamentos son solitarios y flotan libremente. Las condiciones ambientales de crecimiento, tambin influirn en su tipo de configuracin, pero siempre permanecer la constante de la morfologa en forma helicoidal (Spiller, et al., 2001).

Figura 1. Tipos de filamentos de Spirulina spp. [http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]

Figura 2. Spirulina subsalsa, 2400X, Visibles rollos apretados de una hlice, 10 M de espesor total. En una muestra de agua de mar (Spiller, S et al., 2001).

2.2.3 HABITAT Lo que diferencia el gnero Spirulina spp. del resto de las cianobacterias, es su muy particular nicho ecolgico, ya que estos microorganismos proliferan en aguas muy mineralizadas, extremadamente alcalinas y en ocasiones calientes. Estas condiciones

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excluyen a la mayora de los seres vivos. El desarrollo de Spirulina spp. en este tipo de medios, se debe a tres fenmenos: 1. Al consumir los carbonatos y bicarbonatos de su medio, la Spirulina spp. tiende a aumentar todava ms la alcalinidad del lquido llegando incluso a un pH 11.5 (Whitton, 1992). 2. Como son altamente pigmentadas y a menudo flotantes, los filamentos de Spirulina spp. forman una pantalla muy eficaz, que priva de luz solar a las raras algas que podran acomodarse a su medio de cultivo, como por ejemplo Chlorella spp., una microalga comestible que prolifera a veces en los cultivos de Spirulina spp. poco concentrados. 3. Se ha demostrado que la Spirulina spp. es capaz de secretar molculas protecas como medio de defensa en su medio natural (Rheinheimer, 1987; Whitton, 1992). 2.2.4 ULTRA-ESTRUCTURA La organizacin estructural procaritica de Spirulina spp., esta conformada en forma general, por dos partes: una perifrica citoplasmtica, coloreada por diversos pigmentos, de ah que se conozca como cromatoplasma; y otra central o cuerpo central llamada ncleoplasma. Dentro de las estructuras que la conforman estn: la cpsula, la pared celular pluri-estratificada, cromatoplasma con su sistema fotosinttico de tilacoides, ribosomas, fibrillas de ADN y numerosas inclusiones. La cpsula tiene una estructura fibrilar y cubre cada filamento protegindolo. La presencia irregular de cpsula alrededor de los filamentos en S. platensis es una diferencia caracterstica morfolgica, al compararla con S. maxima que la tiene regular (Spiller, et al., 2001). El grosor del Tricoma vara de 6 a 12 m, y est compuesto por clulas cilndricas. El dimetro de la hlice vara de 30 a 70 m y la longitud de una sucesin de tricomas est cerca de 500 m, aunque en cultivos agitados la longitud de los filamentos puede ser menor (Tomaselli, et el., 1996). Es importante aclarar que la forma helicoidal de Spirulina spp. predomina en cultivos lquidos, en los cuales se

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contorsiona para dar vueltas en espiral sobre su eje; estos cambios son debidos a la hidratacin o deshidratacin progresiva de oligopeptidos en la capa de peptidoglicano (Tiboni, 1985). La pared de la clula de Spirulina spp. est conformada por cuatro unidades estructurales conocidas como LI, LII, LIII, LIV. La que proporciona mayor rigidez en la estructura de Spirulina spp. es la capa LI, que contiene -1,2-glucano, un polisacrido no muy digerible por seres humanos. La capa LII aporta algo de rigidez por contener peptidoglicano (Snchez, 2003/a). Este microorganismo contiene varios pigmentos funcionales caractersticos: clorofila a, carotenos y ficobilinas, que contienen ficocianina (pigmento azul). Estas sustancias se localizan en el sistema de tilacoides, estructuras anlogas a los cloroplastos y en donde se ubican los fotosistemas I y II. El espacio intertilacoidal es limitado por la presencia de vesculas protecas transparentes que contienen gas, las cuales junto con su estructura tubular, da a Spirulina spp. su capacidad flotante en medios acuticos. Los ribosomas y las fibrillas de ADN se localizan, generalmente en las zonas centrales o ncleoplasma (Gitelson, et al., 1996). Spirulina spp. contiene numerosas inclusiones perifricas tpicas y asociadas a los tilacoides. Esos son: grnulos de cianoficina, los cuerpos polidricos, grnulos de poliglucanos, grnulos de lpidos, grnulos de polifosfatos y metacromatina o volutina. Los grnulos de cianoficina o grnulos de reserva, son importantes debido a su naturaleza qumica y a una serie de pigmentos, localizados en los tabiques transversales, que podran participar en la sntesis de la ficocianina. Los cuerpos polidricos o carboxisomas contienen principalmente la enzima ribulosa 1,5-difosfato carboxilasa que permite la fijacin de CO2 en organismos fotosintticos y lleva probablemente a cabo una funcin de reserva energtica en la clula ( Tiboni, 1985).

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Los grnulos de poliglucano o grnulos de glucgeno, son polmeros de glucosa, pequeos, circulares y extensamente difundidos en el espacio intertilacoidal, y por ser producto de su metabolismo fotosinttico, contribuyen a la formacin de glucoprotena. Los grnulos de lpidos, -grnulos o grnulos osmoflicos forman el depsito de reserva, constituido por poli--hidroxibutirato (PHB), encontrado slo como reserva en organismos procariotas (Abbayes, 1989). 2.2.5 REPRODUCCIN Y CICLO DE VIDA Un aspecto fundamental de la biologa de Spirulina spp. es su ciclo vital, enmarcado por su ubicacin taxonmica, su fisiologa e implicaciones ambientales de cultivo. Todas las clulas dispuestas en filamentos o en rosario, tienen la facultad de multiplicarse por biparticin. Hacia los extremos de los filamentos, la divisin es ms frecuente que en la zona intercalar. Este es un perodo que se puede resumir en tres etapas fundamentales: 1. Fragmentacin de tricomas. 2. La ampliacin de clulas del hormogonio y procesos de maduracin. 3. Alargamiento de tricoma. El tricoma maduro se divide en varios filamentos u hormogonios pequeos, gracias a la formacin previa de clulas especializadas, las llamadas clulas de necridio, que se caracterizan por tomar un aspecto granuloso, sus tabiques transversales se abomban fuertemente y la clula se vuelve bicncava, la materia de la clula se reabsorbe para permitir la fragmentacin. La ruptura celular ocurre por zonas conocidas como disyuntores. Para este proceso, el tricoma crece longitudinalmente y toma su forma tpica helicoidal (Abbayes, 1989; Berry, et al., 2003).

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Figura. 3 Ciclo de vida Spirulina sp. (Snchez, 2003/b)

2.2.6 COMPOSION QUMICA Al estar agrupada como cianobacteria, Spirulina spp. posee un tipo de pared celular caracterstica que logra favorecer su digestibilidad; adicionalmente sus constituyentes son perfectamente asimilables sin necesidad de coccin, ni de cualquier otro tipo de tratamiento. De esta manera, incluso los constituyentes ms frgiles (vitaminas, cidos grasos esenciales, etc) estn disponibles sin degradacin alguna (Becker, 1982). 2.2.6.1 Protenas. El contenido de protenas en Spirulina spp. oscila entre 50 y 70% de su peso seco. Esta concentracin es totalmente excepcional en los microorganismos, e inclusive, las mejores fuentes de protenas vegetales no llegan ms que a la mitad de la misma; as, la harina de soya por ejemplo, contiene no ms del 35 % de protena bruta. En la tabla 2, se muestra comparativamente el contenido proteico entre alimentos clsicos tomados como fuente de protena y Spirulina spp.. El contenido proteico alcanza

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una variacin entre 10 - 15% para Spirulina spp., dependiendo del fotoperodo al momento de la recoleccin; as, los valores ms altos se han obtenido al comienzo del perodo luminoso (Becker, 1982). Desde el punto de vista cualitativo, las protenas de Spirulina spp. contienen todos los aminocidos indispensables, que representan el 47% del peso total de las mismas (Tiboni, 1985). Entre estos, los que se encuentran en concentraciones menores son los azufrados: metionina y cistena, que de todas formas estn presentes en un 80% del valor referencia (con base a la albmina del huevo y a la casena). Parece ser que uno de los mtodos de secado utilizado en la industria, el realizado sobre tambores trmicos, reduce el contenido de metionina en aproximadamente 30%, en relacin con el obtenido mediante pulverizacin (Becker, 1982). El completo espectro de aminocidos indica que el valor biolgico de las protenas de Spirulina spp. es muy alto, y que el ptimo, podra alcanzarse por complementacin con una buena fuente de aminocidos azufrados y eventualmente de lisina y/o histidina. Cereales como el arroz, trigo y mijo o algunas oleaginosas como el ssamo, podran ser excelentes complementos ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). Al contrario de otros microorganismos propuestos como fuente de protenas (levaduras, Chlorella, Scenedesmus etc), Spirulina spp. no contiene paredes celulsicas, sino una cubierta de murena, relativamente frgil (Tiboni, 1985; [http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). simple (casena pura 95.1%) (Becker, 1982).
Tabla 2. Contenido proteico de diferentes alimentos (Snchez, 2003/b)

Este hecho explica la buena

digestibilidad de sus protenas, que es del 83 al 90 %, cuando es sometida a secado

(%) Protena Cruda Spirulina spp. polvo 65 Huevo entero secado 47

Tipo de Alimento

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Levadura de cerveza Leche en polvo Soya entera en harina Queso tipo parmesano Germen de trigo Man Pollo Pescado Carnes de res 2.2.6.2 Carbohidratos

45 37 34 34 27 26 24 22 22

Constituyen globalmente del 15 a 25% de la materia seca en Spirulina spp.. Los glcidos simples nicamente estn presentes en muy pequeas cantidades y estos son glucosa, fructosa y sacarosa; se encuentran tambin polioles, como: glicerol, manitol y sorbitol (Belay, 2002). La parte esencial asimilable de estos compuestos, est constituida por polmeros como glucosanos (1.9% del peso seco) y ramnosanos aminados (9.7%), y tambin glucgeno (0.5%) ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). Desde el punto de vista nutricional, la nica sustancia glucdica interesante por su cantidad en Spirulina spp., es el fosfato de mesoinositol, que constituye una excelente fuente de fsforo orgnico, as como el inositol (350-850 mg/kg materia seca). El contenido de este ltimo, es casi ocho veces mayor al encontrado en la carne de res y muchos cientos de veces el de los vegetales ms ricos en este constituyente (Belay, 2002). Los polisacridos, podran intervenir en los mecanismos de reparacin del ADN, lo que explicara el efecto radioprotector mencionado muchas veces para Spirulina spp. Se han presentado otras explicaciones para aclarar este efecto, como la neutralizacin de los radicales libres, generados por la irradiacin. Esta neutralizacin rpida sera

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debida

prioritariamente

al

-caroteno

([http://www.antenna.ch/manual/

CULTIVO.html]). 2.2.6.3 Lpidos Lpidos totales Aunque se informa de una concentracin de 5.6% a 7% del peso seco en S. platensis y S. maxima, en otras fuentes se seala ms del 11% de lpidos, obtenidos mediante un procedimiento de extraccin mejorado (Belay, 2002; Becker, 1982). Estos lpidos totales pueden ser obtenidos en la fraccin saponificable (83%), en la insaponificable (17%). La fraccin saponificable est compuesta principalmente por 23 % de monogalactosil y de digalactosil diglicridos, 5 % de sulfoquinovosil diglicrido y 25 % de fosfatidilglicerol. Los triglicridos son escasos (0.3%.). Se detecta adems, 4 % de fosfolpidos no definidos (Tiboni, 1985). cidos grasos Se considera que en el hombre, las necesidades en cidos grasos esenciales provenientes de la alimentacin son de 1 a 2% para el adulto, y de 3% para los nios. Actualmente est bien establecido, que el aporte de lpidos esenciales en la alimentacin, influye (entre otros factores) sobre el sistema inmune, tanto humoral como celular. Actualmente se clasifican los cidos grasos esenciales en dos grupos (n 3 y n 6), caracterizados por la posicin de la saturacin ms prxima al grupo metilo terminal. Como los cidos n 3 y n 6 se convierten en el hombre a distintos derivados bioqumicos, que parecen tener efectos antagonistas, algunos especialistas recomiendan actualmente una relacin de n 6/ n 3 entre 4 y 5 respectivamente (Belay, 2002). El cido -linolnico representa del 10 a 20% de los cidos grasos de S. maxima, es decir, 1-2% del peso seco, mientras que en S. platensis, constituye el 40 %, que es

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aproximadamente, el 4 %. Spirulina spp. puede ser considerada como una de las mejores fuentes de este cido, despus de la leche humana y de algunos aceites vegetales poco comunes (aceites de onagre, borraja, pepita de cass y sobretodo de camo) (Becker, 1982). Debe resaltarse la presencia de cido -linolnico, (18:3n6), por el hecho de que no se encuentra en alimentos comunes y por su alto valor alimenticio. Este cido graso, normalmente sintetizado en el hombre (a partir del cido linolico 18:2n6 de origen vegetal), puede ser tambin asimilado directamente, en caso de problemas o insuficiencia de su sntesis endgena. La importancia de estos cidos grasos se debe a su biotransformacin, pues son los precursores de las prostaglandinas, leucotrienos y tromboxanos, mediadores qumicos de las reacciones inflamatorias e inmunitarias (Tiboni, 1985). Estn tambin presentes otros cidos grasos esenciales, como linoleico, (18:2n6). Se destaca tambin una alta proporcin de cido palmtico (16:0), que representa ms del 60% de lpidos en S. maxima, aunque slo un 25% en S. platensis. Existe cierta superioridad en esta ltima cepa en cuanto a su contenido de lpidos, ya que presenta una menor concentracin de cido palmtico (saturado) y una mayor concentracin de cido -linolnico (esencial) ( Snchez, 2003/a). Lpidos insaponificables Aunque algunos trabajos subrayan la ausencia de esteroles, parece ser que estos productos representan 1.5% de la fraccin no polar de los lpidos de S. maxima. Lo que representa una concentracin aproximada al 0.015% del peso seco. Los esteroles identificados son colesterol y en menor cantidad, -sitosterol. En Spirulina platensis se encuentra en pequeas cantidades campesterol y stigmasterol. Algunos de estos esteroles podran estar relacionados con algn tipo de actividad antimicrobiana de Spirulina spp. (Tiboni, 1985).

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2.2.6.4 Vitaminas Provitamina A ( -caroteno) El -caroteno representa 80% de los carotenoides de Spirulina spp.; el resto est compuesto principalmente de ficoxantina y de criptoxantina (Belay, 2002). Se encuentran, entre 700 y 1700 mg de -caroteno y aproximadamente 100 mg de criptoxantina y ficoxantina por kilo de microalga seca; estos dos carotenoides son convertidos en vitamina A por los mamferos. En la tabla 3, se muestra la cantidades de pro-vitamina A y betacarotenos encontrados en Spirulina spp., junto a otras vitaminas esnciales (Snchez, 2003/a). La biodisponibilidad de los carotenoides de Spirulina spp. ha sido demostrada tanto en ratones, como en pollos (Mitchell, et al., 1990). Algunos estudios clnicos han comprobado la excelente utilizacin en el humano: un trabajo efectuado con 5000 nios Indios en edad pre-escolar, demostr la eficacia de suministrar 1 g/da de Spirulina spp. en el tratamiento de la deficiencia crnica de vitamina A. Despus de 5 meses de tratamiento, la proporcin de nios gravemente deficientes de vitamina A, pas de 80% a 10% ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). Este estudio demostr que son suficientes dosis pequeas de Spirulina spp., para reducir considerablemente los riesgos de ceguera y daos neurolgicos consecuentes a la deficiencia de vitamina A en el infante. Debido a que hay un nmero creciente de indicadores que sugieren una serie de efectos anticancergenos de los carotenoides, se han investigado en este aspecto diversos extractos de Spirulina spp., observndose un efecto significativo, preventivo ms que curativo. Este es el caso, de la accin de Spirulina spp. sobre tumores epiteliales orales inducidos experimentalmente con dimetilbenzantraceno (DMBA) (Chamorro, et al., 1996).

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Vitamina E (tocoferoles) Aproximadamente se encuentra de 50 a 190 mg de vitamina E por kilo de Spirulina spp. seca; contenido que es comparable al del germen del trigo. Las necesidades cotidianas en humanos de vitamina E seran de 15 U.I es decir, 12 mg de tocoferoles libres. Las propiedades antioxidantes del tocoferol para los cidos grasos insaturados explicara la buena conservacin de Spirulina spp. seca (Belay, 2002). Vitamina B 12 Es necesario subrayar el contenido excepcional, de la Spirulina spp. en vitamina B12 (cobalmina) que es la ms difcil de obtener en un rgimen vegetariano, ya que no la contiene ningn vegetal comn. Es conveniente puntualizar que existe una controversia en lo que respecta a la biodisponibilidad real del complejo B-12 de Spirulina spp. en el hombre. Segn algunas pruebas radioqumicas relativas al factor intrnseco, no se encontr mucha vitamina B anlisis se observaron altos contenidos en B 2002). La carencia en vitamina B12, proviene ya sea de una falta de aportacin (en el caso de los regmenes vegetarianos estrictos) o deficiencia en la absorcin. Por otro lado, parece ser que, algunos estados patolgicos traen consigo una deficiencia en vitamina B12 , como es el caso de infecciones por VIH ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]).
Tabla 3. Contenido de vitaminas en Spirulina spp. (Snchez, 2003/a)
12

"activa" en Spirulina spp. Estos

resultados son diferentes segn las variedades, pues utilizando el mismo mtodo de
12

"activa" en algunas de ellas (Belay,

Vitaminas Pro-vitamina A (-caroteno) Vitamina E Tiamina B1 Riboflavina B2

mg x100 g-1 (peso seco) 2.330.000 IU kg 1 140 100 a-tocoferol equiv. 3.5 4.0

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Niacina B3 Vitamina B6 Vitamina B12 cido flico Biotina cido Pantotenico Vitamina K 2.2.6.5 Minerales

14.0 0.8 0.32 0.01 0.005 0.1 2.2

Los minerales de inters particular en Spirulina spp. son: hierro, magnesio, calcio, fsforo y potasio. La tabla 4, muestra la composicin total de minerales de Spirulina spp.. Debe enfatizarse el alto contenido en hierro de la Spirulina spp., ya que la carencia de este mineral es muy frecuente, sobretodo en mujeres embarazadas y nios, debido a que las buenas fuentes de este elemento, en los alimentos no son muchas. (Belay, 2002). Por otro lado, los cereales completos, clasificados entre las mejores aportadores de hierro, no contienen ms de 150 a 250 mg/kg. Adems, los suplementos administrados en forma de sulfato ferroso, pueden causar problemas de toxicidad y son frecuentemente responsables de diarreas. Los cereales son ricos en cido ftico y en polmeros fosfatados que limitan bastante la biodisponibilidad del hierro. En el caso de Spirulina spp., su biodisponiblidad se ha demostrado tanto en ratones como en el hombre (Chamorro, et al., 1996). El calcio, fsforo y magnesio estn presentes en esta alga en cantidades comparables a las encontradas en la leche. Las cantidades relativas de estos elementos estn equilibradas, lo que excluye el riesgo de descalcificacin por exceso de fsforo. Existe desafortunadamente muy poca informacin sobre el contenido de oligoelementos como el yodo en Spirulina spp., pudiendo obtener por seleccinadaptacin, variedades capaces de fijarlo (Becker, 1982).

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Tabla 4. Contenido de minerales en Spirulina spp. (Belay, 2002)

Mineral Calcio Cromo Cobre Hierro Magnesio Manganeso Fosforo Potasio Sodio Zinc 2.2.6.6 cidos nucleicos

mg 100g-1 700 0.28 1.2 100 400 5.0 800 1400 900 3.0

Tanto para S. platensis como S. maxima, se informan concentraciones de 4.2 a 6% de cidos nucleicos totales en materia seca. La proporcin del ADN sera de un cuarto a un tercio en relacin al ARN. El contenido de cidos nucleicos en Spirulina spp. es muy inferior al de la mayora de microorganismos productores de protena unicelular (Becker,1982). El contenido de cidos nucleicos (ADN y ARN) es un aspecto nutricional importante, ya que la degradacin bioqumica de una parte de sus componentes (purinas: adenina y guanina) produce finalmente cido rico. Tambin puede suceder que una elevacin de las concentraciones de este cido en plasma, puede producir a la larga, clculos renales y crisis de gota. Se admite, generalmente que la dosis mxima permisible a largo plazo de cido nucleico, para un adulto es de alrededor de cuatro gramos por da. Cabe sealar que el ARN produce dos veces ms cido rico que el ADN para un mismo contenido en purinas y que su aumento depende tambin de mltiples factores, como la edad, sexo, o tambin la obesidad (Tiboni, 1985).

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2.2.7 APLICACIONES TERAPEUTICAS El propsito de una revisin sobre trabajos que recojan aspectos farmacolgicos, estn ligados al conocimiento de variadas y posibles aplicaciones farmacuticas de Spirulina spp. y sus componentes (Belay, 2002). 2.2.7.1 Accin Antialrgica En un trabajo publicado por Kim (1998) se sugiere que, Spirulina spp. protege contra el desarrollo de alergias, y ha demostrado que disminuye las reacciones anafilcticas. El experimento consisti en administrar a ratas, un compuesto que desgranula las clulas cebadas, produciendo un choque anafilctico mortal. La inyeccin de suspensin de Spirulina spp. por va intraperitoneal una hora antes de la administracin del compuesto, evit la muerte de los animales en un 100% e inhibi una reaccin de anafilaxia cutnea pasiva. En estos mismos trabajos se demostr que en cultivos de clulas cebadas intraperitoneales, Spirulina spp. bloquea la liberacin de histamina y del factor de necrosis tumoral (TNF-a ) inducida por IgE (Kim, et al., 1998). 2.2.7.2 Efecto Antianmico Spirulina spp. incluida en la dieta de ratas a concentracin del 45% (equivalente al 22% de protena) y proporcionada sola o en combinacin con gluten de trigo durante la primer mitad de la gestacin y la lactancia, aument el contenido de hierro y hemoglobina ms que la de la casena y gluten de trigo juntos, habiendo tambin incrementado el nmero de fetos por madre. As mismo se observ que la prdida tanto del hierro almacenado como del srico en el da 20 de la gestacin fue relativamente mayor que en los grupos alimentados con Spirulina spp. Esto puede deberse a un aumento en la demanda de hierro, debido a que las ratas alimentadas con la microalga, tuvieron un mayor nmero de fetos que los testigos (Chamorro, et al., 1996).

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El estudio muestra un buen potencial hematolgico de Spirulina spp. durante la gestacin y lactancia, por lo que puede servir como un suplemento para combatir la anemia, siendo la disponibilidad del metal en Spirulina spp. comparable al sulfato de hierro estndar. El suplemento de hierro durante el perodo inicial en la gestacin humana es muy importante, ya que el hierro materno pasa a travs de la placenta por transporte activo y una deficiencia da como resultado una carencia en el almacenamiento de este nutriente por parte del neonato (Chamorro, et al., 2002). 2.2.7.3 Accin Anticoagulante La administracin de Spirulina spp. aument en 10,000 veces la actividad antitrombina del cofactor II de la heparina e indujo eficientemente la produccin de un activador de plasmingeno especfico en tejidos a travs de un proceso de translocacin, cuyo mecanismo se desconoce. Debido a que es un polisacrido sulfatado nuevo, diferente de la heparina, es de esperarse que puedan conocerse en el futuro otras actividades biolgicas. Aunque, estos dos efectos fueron estudiados en experimentos in vitro indican que Spirulina spp. tambin podra tener una actividad anticoagulante importante in vivo (Chamorro, et al., 1996). 2.2.7.4 Accin Antiinflamatoria

Dosis de 100 y 200 mg/kg de ficocianina C, obtenida de Spirulina spp. administrada oralmente a ratones, redujeron la inflamacin de las extremidades posteriores, producida por glucosa oxidasa. Tambin se encontr que este pigmento disminuy significativamente el edema producido por cido araquidnico y acetato de 12-Otetradecanoil forbol. Igualmente redujo, el causado por la inoculacin de carragenina en la extremidad posterior de ratas y el granuloma provocado por la implantacin de algodn. Ms recientemente encontraron que la ficocianina C inhibi significativamente el edema y las concentraciones de leucotrieno TB4 inducidos por cido araquidnico. Adems se encontr efecto antiinflamatorio en la colitis, originado en ratas por edema (Romay, 1998).

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Es probable que la actividad antiinflamatoria de Spirulina spp. se deba tambin a sus propiedades antioxidantes, al atrapamiento de radicales libres de oxgeno y tal vez a su efecto inhibitorio, en el metabolismo del cido araquidnico. En relacin a lo anterior, hay bastante evidencia de que ciertos tipos de inflamacin tisular son causados por especies reactivas de oxgeno. En efecto, en los sitios de inflamacin se forman oxidantes tales como radicales superxido e hidroxilo, perxido de hidrgeno y cido hipocloroso (Chamorro, et al., 2002). 2.2.7.5 Efecto Antitxico Administrando Spirulina spp. en dosis de 800 mg/kg a ratones albinos Swiss, antes y despus del tratamiento con acetato de plomo, aument su tiempo de supervivencia y protegi del efecto del metal sobre variables como el peso de los testculos, peso corporal y dimetro tubular de espermatogonias A y B, espermatocitos primarios y secundarios (Chamorro, et al., 2002). Se ha observado que en la intoxicacin con este metal, el cido 5-aminolevulnico genera radicales libres de oxgeno que conducen a muerte celular y por otra parte disminuye la sntesis de DNA. Al ser Spirulina spp. una fuente rica en antioxidantes y capaz de aumentar su sntesis, protege y evita el dao causado por este metal (Belay, 2002). 2.2.7.6 Proteccin Cardiovascular Se evalu en ratas el efecto de la administracin oral de Spirulina spp. durante 2 semanas, sobre las respuestas vasomotoras de anillos de aorta con y sin endotelio. Spirulina spp. tuvo efecto sobre las respuestas vasomotoras dependientes del endotelio y disminuy el tono vascular al incrementar la sntesis y liberacin de xido ntrico as como de un eicosanoide vasodilatador dependiente de la ciclooxigenasa (Paredes, et al., 1998).

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Al disminuir la sntesis y liberacin de un eicosanoide vasoconstrictor, se previenen los efectos vasomotores causados por un dieta rica en fructosa, cuando fue administrada durante 6 semanas. Es probable que los efectos vasomotores de la microalga sean dependientes del endotelio. Resultados de un estudio llevado a cabo con el extracto etanlico de Spirulina maxima, sugieren que hay un aumento en la sntesis o produccin de un prostanoide vasoconstrictor dependiente de ciclooxigenasa por las clulas del tejido vascular liso (Paredes, et al., 1998). 2.2.7.7 Inmunoestimulante Se ha informado que el tratamiento de cultivos de macrfagos de pollo con un extracto de Spirulina spp. aument su capacidad fagoctica intrnseca, aunque no mejor la de partculas opsonizadas. Adems, los macrfagos tratados produjeron una sustancia soluble capaz de matar clulas tumorales (Qureshi et al, 1995). El mismo grupo de investigadores tambin realiz un estudio interesante in vivo sobre el efecto benfico inmunoestimulante de la adicin de Spirulina spp. a la dieta de pollos. Se encontr que la inmunizacin con eritrocitos de carnero (EC), produjo respuestas primarias de anticuerpos similares a la de los que recibieron dieta sin la microalga; sin embargo, los pollos con dieta de Spirulina spp. dieron mejores repuestas secundarias y mejores pruebas in vivo de inmunidad mediada por clulas; as mismo sus macrfagos presentaron mayor actividad fagoctica en cultivo y las clulas del bazo, una mayor actividad de clulas asesinas naturales (Qureshi et al, 1995). El efecto de Spirulina spp. sobre el sistema inmune parece deberse a una estimulacin importante de las actividades del macrfago. Es posible que tambin induzca su capacidad de funcionar como clula presentadora de antgeno, lo que explicara los hallazgos de que Spirulina spp. administrada in vivo, mejora la respuesta inmune de anticuerpos (Chamorro, et al., 1996).

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2.2.8 APLICACIONES COMERCIALES 2.2.8.1 Acuacultura La cra de microcrustceos, moluscos y peces, como consumidores de plancton, requiere procesos de reproduccin y cra artificial a gran escala y por lo tanto es de gran inters tener plantas pilotos de produccin de cianobacterias para la alimentacin de los primeros estados larvales (Belay, 1996). Esta cianobacteria favorece la cra de peces ornamentales especialmente, ya que tiene buen contenido de carotenos y permite mejorar el colorido y vistosidad de estas especies. La cra de microcrustceos tambin se ha implementado para el cultivo de peces, pero se ha comprobado que la eficiencia es mayor con las microalgas y cianobacterias. Los moluscos producidos con base en este tipo de alimentacin no convencional, reduciran los costos de produccin y proporcionaran al mercado alimento de alta calidad con mayores ganancias para el productor (Pedraza, 1989). 2.2.8.2 Tratamiento de aguas negras Spirulina maxima, ha sido utilizada como purificadora de aguas residuales ya que remueve los nitratos, fosfatos, y otros elementos presentes en gran cantidad. En piscinas de oxidacin o estanques se pueden obtener dos productos esenciales: protena vegetal contina y aguas tratadas y recuperadas, evitando la contaminacin y eutroficacin activada por la ozonizacin del agua lo cual permite utilizar el agua para consumo animal e incluso muy cerca de la potabilizacin para consumo humano (Pedraza, 1989). En Israel se aprovechan las aguas de las costas para produccin de microalgas como Spirulina spp. o Scenedesmus spp., tratando de implementar mtodos menos costosos y eficientes para el tratamiento de aguas de desecho industriales y domsticas. En Londres se utilizan las aguas de tratamiento terciario de desechos para producir biomasa y purificarlas (Becker, 1982).

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2.2.9

PRODUCCIN COMERCIAL

La produccin de Spirulina spp. se puede llevar a cabo en sistemas cerrados o abiertos. El primero implica foto-bioreactores y este no se utiliza en la produccin industrial por su complejidad. El segundo sistema, denominado Raceway, debido a su costo de produccin bajo, fcil manejo y alta produccin de biomasa, se escoge con frecuencia para la produccin industrial. Este mtodo utiliza una charca con una isleta central y un motor que opera paletas anchas que permite el desplazamiento continuo del cultivo lquido en la periferia. Si fuera necesario, platos acoplados al sistema de agitacin se pueden introducir para evitar la formacin de puntos muertos (Tiboni, 1985; Whitton, 1992). El proceso productivo tiene cinco etapas: 1. Filtracin y Limpieza: Realizado con un filtro de nylon en la entrada de la charca de agua, para eliminar impurezas slidas de tipo ambiental de mediano tamao. 2. Pre-Concentracin: Buscando obtener la biomasa del alga, se debe lavar para reducir el contenido de sales. 3. Concentracin: En el cual se quita la mayor cantidad posible de agua intrnseca (localizada entre los filamentos). 4. Neutralizacin: La biomasa se neutraliza con la adicin de una solucin cida. 5. Desintegracin: Donde La biomasa es desintegrada por molienda. 6. La Deshidratacin por secado: es un paso adicional, y de gran importancia econmica ya que implica cerca de 20-30% del costo de produccin (Borowitzka, 1999). El control de calidad para Spirulina spp. como alimento incluye las pruebas estndares microbiolgicas y aquellas que confirman la ausencia total de patgenos como Salmonella spp., Shigella spp. o estafilococos. No se ha encontrado contaminacin por amibas disentricas, ni en fuentes naturales como lagos, ni en estanques experimentales. Adicionalmente se puede realizar la prueba qumica de

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composicin y la prueba para metales pesados: pesticidas y materias extraas (los fragmentos de insecto, pelos de roedor y fragmentos de plumas) (Belay, 2002). La microflora alcalina presente en cultivos de Spirulina spp. es generalmente rara y no patgena, como algunas microalgas y bacterias reductoras. De hecho, la alcalinidad del medio pH 8.5 a 11.5 constituye una excelente barrera contra la mayora de los contaminantes, como bacterias, levaduras, hongos y algas (Becker, 1982). Despus de la cosecha y secado, Spirulina spp. no contiene ms de 103 a 106 organismos sobrevivientes por gramo. Este nmero disminuye regularmente con el tiempo de almacenamiento. An en preparaciones provenientes de fuentes naturales (mucho ms contaminadas que los productos cultivados, sobretodo por el hecho del secado tradicional o al sol) despus de un mes, no se encuentran coliformes ni estreptococos (Pedraza, 2000). La conservacin de las preparaciones de Spirulina spp. seca, no parece causar ningn problema, ya que este producto aparenta ser completamente resistente a los hongos. As mismo, jams se han detectado Aspergillus flavus ni aflatoxinas secretada por este hongo que suele atacar las preparaciones secas de tipo alimenticio. La Spirulina spp. industrial contiene menos de 100 esporas de hongos viables por gramo ([http://www.antenna.ch/manual/ CULTIVO.html]). 2.2.10 CONDICIONES DE CRECIMIENTO Actualmente la mayora de las investigaciones de laboratorio propuestas tienen como inicio la utilizacin del medio Zarrouk clsico para el crecimiento y desarrollo de Spirulina spp., aunque en ocasiones se experimenten variables en su composicin para la obtencin de resultados especficos, como pueden ser: la luego biomasa como fuente proteica. obtencin de pigmentos , cidos orgnicos como el gama-linoleico, clorofila, carotenoides y desde

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El trabajo a escala de laboratorio es importante independientemente de la aplicacin que se quiera tener con Spirulina spp. (industrial o farmacolgico), ya que lo que busca es obtener beneficios y conocimientos en el rea industrial y medico-cientfica. 2.2.10.1 Cintica de crecimiento El crecimiento de Spirulina spp. en un cultivo por lotes, bajo condiciones preestablecidas por cada investigador o productor, presenta las siguientes fases de desarrollo: (Becker, 1982) 1. Fase de adaptacin 2. Fase de crecimiento exponencial 3. Fase de crecimiento lineal 4. Fase estacionaria 5. Fase de muerte. Durante la primera fase (fase de adaptacin) el cultivo de Spirulina spp. se acopla a las condiciones establecidas, la tasa de crecimiento especfico es baja y se incrementa paulatinamente con el tiempo del cultivo y la capacidad biolgica de adaptacin de la cepa utilizada. En la segunda fase (fase exponencial), el cultivo de Spirulina spp. se ha adaptado a las condiciones de crecimiento. La intensidad lumnica no es una limitante, y los cambios en la concentracin de nutrientes causada por la adaptacin de Spirulina spp. son tan bajos que el efecto en el crecimiento del cultivo no es significativo. En un cultivo, sin luz ni nutrientes limitados, el incremento en la biomasa de la microalga (expresada como peso seco, nmero de clulas, densidad ptica etc.) por unidad de tiempo, es proporcional a la biomasa inicial del cultivo (Becker, 1982). El crecimiento de Spirulina spp. continua hasta la tercera fase (fase de crecimiento lineal), en la cual la multiplicacin celular se extiende, hasta llegar a ocultarse una clula sobre la otra, lo que produce una disminucin de luz. Este efecto reduce la

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tasa de crecimiento especfico y el incremento de biomasa de Spirulina spp. llega a ser lineal. Esta fase lineal contina hasta llegar a una inhibicin del crecimiento debido al agotamiento de nutrientes; el cultivo alcanza un estado, en el cual la respiracin celular llega a ser una interferencia. Si el cultivo se mantiene rico en nutrientes, esta fase lineal puede permanecer varios das.

Durante la cuarta fase (fase estacionaria), con una disminucin de la tasa de crecimiento, el suplemento lumnico en las clulas de Spirulina spp. es limitado y la respiracin aumenta. El metabolismo oxidativo de sntesis de sustancias llega a reducir el constante aumento de biomasa. En este punto del crecimiento, la curva de crecimiento presenta el valor aproximado mximo de concentracin de biomasa de Spirulina spp., aqu se alcanza el equilibrio entre la concentracin mxima de biomasa y la prdida debida a los procesos de degradacin. Durante la quinta fase (fase de muerte) las clulas de Spirulina spp. mueren,

liberando materia orgnica. Esta fase es causada por las condiciones desfavorables del ambiente, sobre el cultivo y el limitado suplemento de luz y nutrientes o la contaminacin de otros microorganismos, este tipo de crecimiento ocurre en sistemas cerrados (Nascimento, 1990, Becker, 1982).

El monitoreo y seguimiento del desarrollo del cultivo de Spirulina spp. es llevado a cabo por espectrofotometra, el mtodo ms utilizado para la estimacin de concentracin de slidos suspendidos (clulas) en una muestra. La exactitud de esta metodologa es alta y confiable, siempre y cuando se tenga en cuenta elementos como: tamao celular, forma, y presencia de precipitados. La lectura para cultivos de Spirulina spp. se lleva a cabo a una longitud de onda de 560 nm (Becker, 1982).

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2.2.10.2 Temperatura La temperatura del lquido de cultivo tiene una influencia directa con la velocidad de crecimiento de Spirulina spp., y es necesario tener como referencia dos tipos de temperatura a escala de laboratorio: la primera, la del medio ambiente y la segunda se refiere al medio lquido de cultivo; esta ltima es importante ya que, Spirulina spp. no inicia su crecimiento de una manera considerable por debajo de 20C. La mxima velocidad de crecimiento se alcanza entre los 35 38 C, por encima de esta temperatura, hay riesgo de la destruccin rpida del cultivo. En general los cambios bruscos de temperatura en el cultivo disminuyen el rendimiento de la biomasa (Gonzlez, 1995). 2.2.10.3 Iluminacin La iluminacin es indispensable para el crecimiento de Spirulina spp. debido al proceso de la fotosntesis, determinante para su constitucin estructural. Un filamento individual de Spirulina spp. no puede soportar una exposicin prolongada a la iluminacin ya que podra ser destruido por fotolisis. De ah, la necesitad de mantener la iluminacin controlada en foto-perodos regulados de tiempo 12/12 (da/noche); cada perodo genera reacciones particulares: en el da, se favorece la asimilacin de CO2 a travs del ciclo de Calvin, lo que permite la formacin de glicgeno como material de reserva en la clula. En la noche ocurren reacciones bioqumicas de sntesis de material proteico. La intensidad lumnica a escala de laboratorio, puede variar entre 2000 y 5000 luxes, dependiendo de la densidad de los cultivos, para lo anterior es necesario tener en cuenta la siguiente equivalencia, 1 lux = 0.01953 molquanta/m2.s (microeistein) (Vonshak, 1984, Gitelson, 1996).

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2.2.10.4 Agitacin Es indispensable agitar el cultivo de Spirulina spp., buscando favorecer la dispersin homognea de la cianobacteria en el lquido y la exposicin a la luz por parte de todos los filamentos, para tener activo su mecanismo fotosinttico. Una agitacin muy brusca puede estropear la Spirulina spp. provocando la aparicin de espuma, que obstaculiza la penetracin de la luz y el intercambio gaseoso del cultivo. Ciertas bombas centrifugas y cascadas de agua que salpican, son especialmente nefastas. En caso de cultivos pequeos (menos de 10 litros), la agitacin puede realizarse a travs de una inyeccin de aire con un compresor de acuario y/o ser complementada con la adicin de CO2. Con este ltimo se puede lograr un doble objetivo: proporcionar agitacin y enriquecer el cultivo con ms carbono disponible para el metabolismo celular (Gonzlez, 1995, Morales, 2002). 2.2.10.5 Nutricin Al igual que todos los organismos, las cianobacterias necesitan nutrientes en el cultivo. En el caso de Spirulina spp., las exigencias nutricionales son pocas al compararse con algas marinas verde-azules y especies de Botryococcus spp. que necesitan vitamina B12 y tiamina para el crecimiento (Becker, E 1982). Las cianobacterias crece en muchos medios lquidos y slidos de cultivo como: BG11, ASM-1, Z8, DOBLEGA, BBM, AA, KMC, Kn Cg-10, D (Whitton, 1992) y para Spirulina spp. los medios de cultivo predilectos son: Zarrouk y SSM (el Medio Salino de Mar) (Gitelson, 1996). El medio Zarrouk es utilizado con frecuencia durante el proceso de aislamiento, mientras el medio de SSM es preferido en la etapa industrial de la produccin. Ocho factores influyen en la productividad del cultivo de Spirulina spp.: luminosidad, temperatura, tamao de inoculo, velocidad de agitacin, slidos disueltos, pH, calidad de agua, presencia de macro y micronutrientes (Ciferri, 1983; Ayala, 1982).

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En cultivos por lotes, el agotamiento de un elemento en el medio de cultivo, posibilita la deficiencia del mismo en la cianobacteria. Por esta razn, la concentracin de minerales en el medio debe ser determinada con frecuencia, con el objetivo de adicionar el nutriente limitante, sin embargo, la tecnologa necesaria para realizar las continuas mediciones aumenta el costo de produccin, lo que lleva a limitar a empresas pequeas (Vonshak, 1984).

La concentracin de sales en el medio de cultivo vara entre 20 y 90 g L-1, siendo la principal fuente de carbono el bicarbonato (HCO-3). Esta sal se disocia en CO2 iones OH- y agua. El CO2 es fijado mediante el ciclo de Calvin para la sntesis de compuestos orgnicos y los iones hidroxilo elevan el valor de pH hasta 11, el cual es tolerado por la cianobacteria. El crecimiento de Spirulina spp. lleva el agotamiento del bicarbonato, el cual puede ser restablecido mediante la adicin continua de CO2 gaseoso, lo que permite mantener estable el valor ptimo de pH (9.2 +/- 0.2) y suministrar una fuente continua de carbonato para el crecimiento (Snchez, 2003/a). Aniones como PO4
-3

SO4

, Cl- y cationes como Na+, K+, Mg+2, Ca+2, son

importantes en el medio de cultivo para el crecimiento de la cianobacteria, por que son requeridos en funciones estructurales y metablicas. Se ha determinado que la relacin entre algunos de estos iones, debe mantenerse en el medio, para evitar antagonismo en la asimilacin de nutrientes, este es el caso de la relacin Na : K que oscila entre 10:1 y 5:1 (Nascimento, 1990). Los micronutrientes son requeridos en cantidades de miligramos o microgramos, actuando fundamentalmente como catalizadores, mediadores o reguladores de reacciones enzimticas y procesos fisiolgicos. Se ha demostrado que la formulacin de EDTA (cido etilendiamino tetractico) en el medio de cultivo, aumenta la solubilidad de iones metlicos como B, Fe, Mn, Co, Cu, Zn, V, Ni, W y Te, lo que permite que estn disponibles como nutrientes para Spirulina spp. (Gonzlez, 1995; Snchez, 2003/a).

42

2.2.10.6 pH La medida de pH en el medio de cultivo es una referencia clave para el desarrollo del cultivo de Spirulina spp.. El medio de cultivo se alcaliniza por el consumo de la fuente de carbono, lo que genera bases como el NaOH. La medicin del pH, puede convertirse en una evaluacin cuantitativa de la cantidad de biomasa en el medio: A mayor biomasa, mayor degradacin de bicarbonato y por consiguiente se eleva la concentracin de grupos hidroxilos en el medio, aumentndose as el pH (Pelizer, 2000). El valor del pH determina entre otros factores la solubilidad del CO2 y algunos minerales que inciden directamente en el crecimiento de Spirulina spp.. El rango de pH ptimo de este microorganismo esta entre 8 11. El desarrollo del pH en el cultivo se ve modificado por factores como: 1. La capacidad buffer del medio utilizado. 2. La cantidad de CO2 disuelto. 3. La temperatura que afecta los gases disueltos. 4. La actividad metablica de Spirulina spp. En cultivos Industriales el pH es mantenido por encima de 9.4, ya que por encima de este valor se evita la contaminacin por parte de otros microorganismos, y en especial de otras algas (Berry, 2003). 2.2.10.7 CO2 La adicin de CO2 al medio de cultivo de Spirulina spp., genera la siguiente reaccin: CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3 2 H + + CO3 - -

43

La adicin de CO2 es propuesta para la regulacin del pH, ya que este parmetro aumenta si la fuente de carbono es insuficiente. Lo que se logra con la adicin de este gas es acelerar la asimilacin de carbono. El CO2 que ingresa al medio tiene un paso rpido, ya que sale para equilibrarse con el atmosfrico. Alrededor del pH 10.5 se inicia la retencin en el medio lquido del CO2. En general la concentracin de este gas es importante, ya que disminuye la alcalinidad y amortigua el pH (De Alva, 1997). Se aconseja que la concentracin de CO2 en los cultivos de Spirulina spp. vare entre 0.05 5% (v/v), y que este material, gaseoso, se suministre a cultivos de laboratorio, por burbujeo y mezclado con aire. Tambin se han propuesto mezclas con otros gases, como el nitrgeno (Morales, 2002).

44

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN Spirulina spp. es una cianobacteria que tiene importancia nutricional y econmica, pero que ha sido industrialmente poco desarrollada en Colombia. Algunas de las limitaciones actuales estn relacionadas con los costos y el rendimiento en la produccin. Lo anterior ha llevado a trabajar sobre las variables de crecimiento, con el fin de modificarlas y lograr mayor rendimiento en los cultivos. Dentro de estas variables se encuentra el pH, el cual se considera altamente selectivo para el crecimiento de Spirulina spp.. La medicin y control de este parmetro durante el cultivo es un indicativo del comportamiento metablico de la cianobacteria (Zambrano, 2005; Snchez, 2003/a; Pelizer, 2000). Un estudio experimental que implic iniciar cultivos de Spirulina spp. con valores diferentes de pH (8.2, 8.6, 9.0, 9.4, 9.8, 10.2), en cultivos a escala de laboratorio, en los que se determin la cintica de crecimiento en cada uno, estableci que pH favoreca la mejor adaptacin de la cepa para un desarrollo rpido y productivo. Adicionalmente se estudi el efecto de la adicin de CO2 al cultivo, sobre la cintica de crecimiento y el control de pH.

45

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General Determinar el valor de pH ms adecuado para el mejor desarrollo de la cintica de crecimiento en Spirulina spp., bajo condiciones de laboratorio en Colombia. 4.2 Objetivos especficos Determinar el pH de partida del cultivo que mejor favorezca el crecimiento de Spirulina spp. bajo condiciones de laboratorio. Determinar el efecto de la adicin de CO2 para evaluar el incremento en la cintica de crecimiento y el mantenimiento del pH en el medio de cultivo de Spirulina spp. bajo condiciones de laboratorio.

46

5. MATERIALES Y METODOS 5.1. Primera etapa experimental 5.1.1Condiciones Generales Todos los ensayos se llevaron a cabo en una cmara de experimentacin rectangular de 70cmx40cmx60cm (largo x ancho x alto) (figura 4), sometido a una condicin lumnica de 58.59 molquanta/m2.s (aprox. 3000 lux), generada por 3 lmparas de luz da, acopladas a un temporizador para generar fotoperiodos de 12h y 12h (luz y oscuridad) y ayudar a mantener la temperatura en 25 +/- 2 C (Pedraza, 1989). La lectura de la temperatura de la cmara se realiz con un termmetro de mximos y mnimos. Los cultivos se mantuvieron en agitacin y conservando el perodos de luz oscuridad antes dicho.

Figura 4. Cmara de experimentacin

47

5.1.2

Microorganismo

Durante el desarrollo del trabajo experimental se utiliz la cepa de la cianobacteria Spirulina spp. (Artrospira), que se obtuvo del Centro Interactivo de Ciencia y Tecnologa de Maloka, (Bogot, Colombia) y que actualmente se mantiene en el Departamento de Qumica de la Pontificia Universidad Javeriana. 5.1.3 Inculo La cepa fue mantenida durante 20 das a una temperatura de 25+/- 2 C y a 3000 lux en medio Zarrouk modificado (anexo 1). Cada 20 das se hizo el recambio del medio de cultivo con el fin de mantener la cepa en fase de crecimiento y en las mejores condiciones. Se utiliz un volumen efectivo de trabajo de 500 mL agitado por aire procedente de un minicompresor. Todos los ensayos se iniciaron con un 10% (v/v) de este inculo (figura 5) (Rafiqul, 2005).

Figura 5. Inculo de Spirulina spp.

48

5.1.4 Ensayos de pH Se evaluaron seis ensayos con valores de pH inicial de 8.2, 8.6, 9.0, 9.4, 9.8 y 10.2; con un volumen efectivo de trabajo de 250mL, agitados por aireacin valorando su pH por triplicado (figura 6 y 7). Durante las primeras 30 horas de cultivo se tomaron muestras cada 2 h en las cuales se determinaron la concentracin de biomasa, por el mtodo espectrofotomtrico a una longitud de onda de 560nm (Becker, 1982). Posteriormente la lectura de absorbancia se realiz cada 24 h. As mismo se determin el valor de pH, por medio de un medidor de pH digital marca HANNA, previa calibracin con soluciones buffer a pH 4.1 y 7.1. Adicionalmente, se determin la concentracin de bicarbonato en cada uno de los ensayos con intervalos de 72 h, empleando la tcnica de aguas descrita por el Instituto Nacional de Salud (anexo 2).

Figura 6. Ensayos a diferentes valores de pH.

49

Figura 7. Sistema de aireacin en cultivos a diferentes pH.

5.1.5. Mtodo de determinacin de Biomasa Para la determinacin de biomasa se utiliz la tcnica de peso seco (anexos 3 y 4) (Snchez, 2003/a). 5.2. Segunda Etapa Experimental Para esta etapa se mantuvieron las mismas condiciones generales descritas en la primera fase experimental. 5.2.1 Ensayo a pH 9.0 De acuerdo a los resultados obtenidos en la primera etapa experimental y teniendo en cuenta el anlisis de crecimiento de la Spirulina spp. durante las 30 primeras horas, as como el valor de la pendiente en cada uno de los ensayos, se eligi el ensayo a pH 9.0+/-0.2 como el ms adecuado para el desarrollo de la segunda etapa. Este ensayo se realiz por triplicado con un volumen efectivo de trabajo de 250mL y con un inculo de 10%. El cultivo se mantuvo en agitacin permanente mediante 3 planchas

50

de agitacin magntica (figura 8); se llev un control, tambin con un volumen efectivo de trabajo de 250mL y mantenido en las mismas condiciones de los ensayos de la primera etapa experimental.

Figura 8. Ensayos a pH 9.0 +/- 2, con adicin de CO2.

Se efectu un seguimiento diario a cada una de las rplicas y al control, en el cual se determin la concentracin de biomasa, por el mtodo espectrofotomtrico a una longitud de onda de 560nm (Becker, 1982). Igualmente se realiz la lectura de valores de pH, por medio de un medidor de pH digital marca HANNA, previa calibracin con soluciones buffer a pH 4.1 y 7.1. 5.2.2. Adicin de CO2 en Ensayo a pH 9.0 +/-0.2 El pH de cada rplica fue mantenido por adicin interrumpida de CO2, con el fin de no exceder el valor de pH establecido. El gas se incorpor al medio procedente de un tanque de CO2 con un regulador, sometido a una presin de 25lb/pulg2, (figura 9) conectado a un frasco de vidrio, dentro del cual se coloc lana de vidrio con el fin de evitar que ingresaran impurezas slidas o lquidas al medio, acompaantes del gas. Al frasco se le adapt un tapn de goma con tres salidas que correspondan a cada

51

una de las rplicas; en cada salida se coloc un tubo de vidrio, al cual se le conect una manguera de caucho por la cual circulaba el gas, hasta llegar a cada uno de los ensayos (figura 10).

Figura 9. Regulador de salida de CO2.

Figura 10. Sistema de adicin de CO2 en cultivos a pH 9.0 +/- 0.2.

52

El flujo de CO2 se midi por desplazamiento de agua en cada una de las salidas de este gas, para lo cual se monto un experimento que consisti en tres probetas de 100 mL cada una y de tres vasos de precipitado de 250 mL, los cuales se colocaron en la forma como se muestra en la figura 11 y 12, con el fin de determinar la cantidad de CO2 desplazada de la probeta y as relacionar el flujo que estaba ingresando a cada una de las rplicas. Obtenidos estos datos se aplic la ecuacin de los gases reales para obtener el valor de las moles suministradas al cultivo en un tiempo determinado (8 s): _n2 a_ P + V2 En donde: P = presin ambiental corregida (descontando la del vapor de agua) n = moles de CO2 a = Constante de CO2 (3.592 atm*L2/mol2) b = Constante de CO2 (0.04267 L/mol) V = volumen (0.05L) R = Constante de los gases (0.08207 atm*L/mol*K) T = temperatura en grados Kelvin (293K) (Lange,N., 1961) Al despejar la ecuacin se obtuvo que la cantidad de moles de CO2 suministrada al cultivo fue de 1.49X10-3 moles en 8 segundos, es decir 1.86X10-4 moles por segundo. Este clculo se realiz por medio del diseo de un programa en Excel.

V nb

= nRT

53

Figura 11. Equipo para determinar el flujo de CO2

Figura 12. Montaje para determinar el flujo de CO2

.

54

Es bien sabido (Pelizer, 2003) que la disminucin de pH afecta negativamente el crecimiento de la Spirulina spp., tal comportamiento fue causa para disear experimentos en los cuales se disminua el tiempo de inyeccin de CO2 al cultivo hasta 3 minutos en cada una de las rplicas, proceso que se llevaba a cabo cada 72 horas aproximadamente. 5.2.3. Determinacin de Biomasa Para la determinacin de biomasa se utilizaron dos tcnicas: peso seco y anlisis de clorofila (anexos 3, 4 y 5). 5.3. Anlisis Estadstico de Variables Para la primera etapa experimental, con el propsito de escoger el valor de pH que mejor se relacionaba con la produccin de biomasa, se utilizaron como criterios de anlisis el factor de crecimiento y el coeficiente de determinacin. Para la segunda etapa experimental se busc analizar si existan diferencias significativas entre la produccin de biomasa en el ensayo con el pH seleccionado de la primera etapa y el control. Para esto se utiliz como herramienta estadstica una prueba T de student para comparar las medias poblacionales. En las dos etapas experimentales la variable respuesta, que se expresa como velocidad especifica de crecimiento (h-1), se realiz un anlisis de regresin de los datos de logaritmo natural de peso seco (g/L) vs tiempo en cada uno de los ensayos. As, la velocidad se estableci como la pendiente de la regresin, con un coeficiente de regresin (r2) cercano a 1.

55

6. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Primera etapa experimental El estudio del crecimiento del cultivo de la Spirulina spp., durante las primeras 30 h permiti determinar la cintica del proceso en su fase de adaptacin, factor determinante para el conocimiento del desarrollo de esta cianobacteria. Al evaluar el desarrollo del cultivo hasta su culminacin, en todos los ensayos con diferentes valores de pH, se observaron las etapas de crecimiento bien definidas: fase de adaptacin, fase exponencial y fase estacionaria, lo cual demostr que Spirulina spp. es capaz de crecer bajo un intervalo amplio de valores de pH, teniendo como principal caracterstica la alcalinizacin del medio. Aunque tal comportamiento demuestra una gran adaptabilidad de la cianobacteria a diferentes pH, tambin se observ que este parmetro afecta la produccin de biomasa al constituirse en factor limitante del crecimiento lo cual est de acuerdo con hallazgos anteriores (Pelizer, 2002). Durante la fase lag, el cultivo de Spirulina spp. se acopl a las condiciones establecidas, la tasa de crecimiento fue baja pero se increment paulatinamente con el tiempo de cultivo, comportamiento semejante al encontrado por Becker, (1982). En los ensayos experimentales, para valores de pH de 8,2 y 8,6, se presentaron fases de adaptacin ms prolongadas (aproximadamente de 15h) que la correspondiente al control (12h) (grfica 1). Esta conducta puede explicarse porque la Spirulina spp. se ve favorecida por alcalinidad relativamente alta (Tiboni, 1985), y en el caso especifico estudiado esta variable no fue suficientemente alta para favorecer el crecimiento. Por el contrario para los ensayos evaluados con un pH de partida de 9.0, 9.4 y 9.8 la fase de adaptacin fue menor, aproximadamente 8 h, 10 h y 9 h respectivamente, con respecto a la del control de 12 h (grfica 2); posiblemente porque las condiciones de

56

alcalinidad favorecan de mejor manera el aumento progresivo de la biomasa. Para esta etapa es importante considerar el pH en el cual se presente un menor tiempo de adaptacin, con el fin de obtener un mayor rendimiento en el periodo productivo. Se ha asegurado que el intervalo ptimo de pH para una buena preservacin en la viabilidad de las clulas de Spirulina spp. en medio Zarrouk es de 9.4 10.3 (Monaselidze, 2002), sin embargo los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que a un pH inferior al intervalo anterior (pH 9.0), se obtiene la menor fase de adaptacin con respecto a los valores establecidos para otros ensayos y para el control (grfica 1). En el caso del ensayo a pH 10.2, se present la fase de adaptacin ms prolongada (18 h) con respecto a todos los ensayos y al control, resultado indicativo de que las condiciones muy alcalinas tampoco son favorables para e8l buen desarrollo del cultivo (grfica 2). Los datos obtenidos durante estas primeras 30 horas de cultivo se presentan en el anexo 6.
pH 8,2 g/L 0,08 0,07 Biomasa (g/L) 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo de Cultivo (horas)
Grfica 1. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 8,2-8,6-9,0-control (30 horas de cultivo).

pH 8,6 g/L

pH 9,0 g/L

Control g/L

57

pH 9,4 g/L 0,12 0,10 Biomasa (g/L) 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0 5 10

pH 9,8 g/L

pH 10,2 g/L

Control g/L

15

20

25

30

35

Tiempo de Cultivo (horas)

Grfica 2. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 9,4-9,8-10,2-control (30 horas de cultivo).

El desarrollo de los cultivos en la fase exponencial, mostr una duracin que oscil entre los 21 das y 23 das aproximadamente (grfica 3 y 4), a excepcin del cultivo a pH 10.2 (16 das). En los ensayos con este ltimo pH, debido al rpido crecimiento durante el cultivo (tiempo de duplicacin: 4.68 h-1) con respecto al control, se observ aceleracin de la etapa endgena o muerte generada por una mayor produccin de desechos y de iones -OH que afectan la viabilidad celular de la Spirulina spp. lo que produce la muerte (Zambrano, 2005). Durante la fase exponencial se observ que la velocidad de crecimiento () y el tiempo de duplicacin (h-1) no presentaron diferencias significativas entre los ensayos experimentales realizados y el control (tabla 5). El comportamiento descrito anteriormente de la Spirulina spp. se evidencia tambin en la mxima biomasa alcanzada: los ensayos con pH de partida 8.2, 8,6 y 10.2 fueron menores al control; mientras que los ensayos a que iniciaron a pH 9.0, 9.4 y 9.8 presentaron concentraciones de biomasa superiores a los ensayos iniciales y al

58

control, (tabla 5).

Lo anterior concuerda con estudios recientes en

donde se

optimizaron las condiciones ambientales en el laboratorio dando como resultado un crecimiento de biomasa de 2.7 g/L (Rafiqul, 2005). Todos los datos obtenidos durante el desarrollo del cultivo se presentan en el anexo 7.

pH 8,2 g/L 2,50 2,00 Biomasa (g/L) 1,50 1,00 0,50 0,00 0 5 10

pH 8,6 g/L

pH 9,0 g/L

Control g/L

15

20

25

30

35

40

Tiempo de Cultivo (dias)

Grfica 3. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 8,2-8,6-9,0 control (35 das de cultivo).

59

pH-9,4 g/L 2,500 2,000 Biomasa (g/L) 1,500 1,000 0,500 0,000 0 5 10

pH-9,8 g/L

pH-10,2 g/L

Control g/L

15

20

25

30

35

40

Tiempo de Cultivo (das)

Grfica 4. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 9,4-9,6 8-10,2 y control (35 das de cultivo).

Tabla 5. Principales parmetros cinticos obtenidos del crecimiento de Spirulina spp. en los ensayos a diferentes pH Velocidad de crecimiento () 0,11 0,10 0,10 0,10 0,10 0,14 0,11 Tiempo de duplicacin (h-1) 5,92 6,52 6,61 6,66 6,66 4,68 6,17 Mxima biomasa (g/L) 1.58 1.77 2.01 2.27 2.30 1.81 2.06

Ensayos pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control

En cuanto al valor del pH con respecto al tiempo, se observ en todos los ensayos realizados, que aument paralelamente al crecimiento de la cianobacteria, tendencia que tambin se evidenci en el control (grficas 5 y 6), as que existe una relacin directamente proporcional entre estas dos variables. Adicionalmente, relacionando el pH y la biomasa (anexo 8 y 9), se observa que en la medida que aumenta la biomasa aumenta el pH tanto en los ensayos como en el control. Lo anterior puede explicarse

60

por el tipo de metabolismo fotosinttico que tiene la cianobacteria. Se cree (Berry, 2003) que Spirulina spp. libera grupos OH al medio alcalinizndolo a lo largo de su crecimiento, esta alcalinidad protege el cultivo contra contaminacin por otros microorganismos y en especial de otras microalgas.
-

pH 8,2 11,00 10,50 10,00 pH 9,50 9,00 8,50 8,00 0 10

pH 8,6

pH 9,0

pH control

20 das

30

40

Grfica 5. Comportamiento del pH en ensayos a pH: 8.2, 8.6, 9.0 y control (35 das de cultivo)

pH 9,4 11,5 11 pH 10,5 10 9,5 9 0 10

pH 9,8

pH 10,2

pH control

20 das

30

40

Grfica 6. Comportamiento del pH en ensayos a pH: 9.4, 9.8, 10.2 y control (35 das de cultivo)

61

De otro lado de acuerdo a los resultados obtenidos del anlisis estadstico entre las variables pH y biomasa, se determin que en el ensayo a pH 9,0 aunque no se obtuvo un factor de crecimiento muy alto, si se present uno de los mayores grados de asociacin con respecto al coeficiente de correlacin (tabla 6), lo cual junto con la menor fase de adaptacin durante las 30 primeras horas, hicieron que fuera escogido para continuar con la segunda etapa experimental.
Tabla 6. Relacin entre factor de crecimiento y coeficiente de determinacin Ensayos pH 8,2 8,6 9 9,4 9,8 10,2 Factor de crecimiento 1,8977 2,0945 2,4432 2,3468 3,1016 4,2421 Coeficiente de determinacin 0,987 0,9619 0,9772 0,9216 0,851 0,8508

En cuanto al porcentaje de bicarbonato consumido, se observ que los resultados de los ensayos llevados a cabo con pH iniciales de 9,0, 9,4 y 9,8 se semejaron a los del control (tabla 7). El consumo de bicarbonato en los cultivos con pH de partida 8,2 y 8,6 fue menor con respecto al control; posiblemente por la dificultad de Spirulina spp. para adaptarse rpidamente a tales grados de acidez, como se observ en las primeras 30 horas de cultivo (Falquet, 1996). Para el caso del ensayo con pH inicial de 10,2 el porcentaje de bicarbonato fue mucho menor (61%) que el control (74 %) lo que refuerza la idea de que a este pH la fase endgena fue acelerada por el exceso de alcalinidad. Los datos y grfica de consumo de bicarbonato se presentan en el anexo 10.

62

Tabla 7. Porcentaje de bicarbonato consumido por Spirulina spp. con diferentes valores de pH incial Ensayos pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control
Concentracin final de bicarbonato (mg/L CaCO3) Bicarbonato Consumido (%) por S. maxima

9316 9383 10175 10197 10224 8370 10229

68 69 74 75 75 61 74

6.2. Segunda etapa experimental En esta etapa se evalu el comportamiento de Spirulina spp. en el ensayo a pH 9,0 +/0.2 con adicin de CO2 de acuerdo a los resultados obtenidos en la primera etapa experimental. Cuando se incorpor CO2 de manera interrumpida al cultivo, se observ un aumento en la concentracin de biomasa con respecto al control (2,8g/L contra 2,1g/L respectivamente) hacia el final de la prueba. Sin embargo aunque no hubo una diferencia significativa en este parmetro (p>0.05) (anexo 11), si se present en el tiempo de cultivo, el cual fue de 33 das para el control, mientras que el ensayo con adicin de CO2 continu su crecimiento hasta cuatro das despus de la cada del control sin entrar en fase estacionaria (grfica 7), lo que hace prever que si se hubiera seguido midiendo la cantidad de biomasa, sta habra presentado una mayor concentracin comparada con la del control. Este comportamiento indica que, con la misma concentracin de bicarbonato inicial, se puede obtener una mayor productividad al adicionar CO2, lo cual resulta muy ventajoso si se piensa en una produccin a gran escala. (Contreras et al, 2003 ). Esta diferencia implica un mejor desempeo de la Spirulina spp. bajo la adicin de CO2, ya que ste es asimilado del medio durante su crecimiento, recuperndose rpidamente por la adicin de CO2 artificial, de manera que la fuente de carbono es abundante. El CO2 penetra en la clula del microorganismo haciendo que crezca de una manera ms constante comparada con el control (Zambrano, 2005). Sin embargo no todo el CO2 es retenido

63

en el medio sino que es liberado a la atmsfera debido a su alta presin parcial (De Alava, et al., 1997).

pH 9,0 3,5 3 Biomasa (g/L) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20

Control

25

30

35

40

Tiempo De Cultivo (das)

Grfica 7. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayo a pH 9,0 +/- 0.2 con CO2 y control a pH 9,2 (37 das de cultivo)

As mismo, al evaluar el comportamiento del pH a lo largo de esta etapa se observ que este parmetro se mantuvo controlado, debido a la adicin de CO2; el valor permaneci entre 8,80 y 9.20 (anexo 12). Esto se explica ya que la adicin de CO2 al cultivo implica que haya un descenso en el valor de pH, al disolverse el gas y reaccionar con el agua segn la reaccin: CO2(gas) + H2O(liq) (HO)2CO(disuelto) H3O(+) (disuelto) + HOCOO(-)(disuelto)

(HO)2CO(disuelto) + H2O(liq)

La estructura HOCOO(-) corresponde al anin bicarbonato que puede ser utilizado por la clula como fuente de carbono. El consumo de este anin desplaza los dos

64

equilibrios anteriores hacia los productos, lo cual implica mayor produccin de ms catin hidronio (H3O+), factor de disminucin del pH (Lange, N., 1961). Por lo tanto, la adicin continua de CO2, va a afectar el desarrollo de las clulas. La adicin de CO2 permite que haya un amortiguamiento en el aumento brusco del pH del medio, al mismo tiempo que el gas es asimilado por las clulas, sin afectar de el proceso de fotosntesis, el cual puede continuar permitiendo que se incrementen los valores de pH (De Alava et al., 1997). Se sabe que cuando se lleva a cabo el escalamiento de fotobiorreactores, el pH del medio de cultivo puede variar significativamente. La concentracin de CO2 puede ser controlada mediante su inyeccin en las zonas donde la concentracin ya no permite la capacidad fijadora mxima. El pH tambin se controla al mismo tiempo debido al conocido equilibrio del CO2 con el agua. En la grfica 8, se observa que a pH 9,0 se encuentra presente la mayor cantidad de bicarbonato, facilitando la disponibilidad para que la cianobacteria lo metabolice y se reproduzca (Contreras et al., 2003).

Grfica 8. Efecto del pH en la concentracin de CO2. (Red Iberoamericana de potabilizacin y depuracin de aguas, 2002)

65

Por otro lado, un factor importante a tener en cuenta en el desarrollo del cultivo, fue la determinacin de clorofila producida durante el crecimiento de la Spirulina spp. Este parmetro puede estimarse en el anlisis de la biomasa producida por la microalga, puesto que es otro mtodo para su determinacin (Becker, 1982). El comportamiento de la clorofila tuvo un mayor incremento en el ensayo llevado a cabo con adicin de CO2 comparndolo con el control, puesto que la mxima concentracin de clorofila a alcanzada en el ensayo a pH 9,0 +/- 0.2, fue de 317 mg/L, mientras que para el control fue de 287 mg/L (grfica 9). De esta forma, se observa que el ensayo con adicin de CO2 present un mayor incremento en la formacin de biomasa, factor que est directamente relacionado con la produccin de clorofila. Los datos encontrados para la determinacin de clorofila se encuentran en el anexo 4.

pH 9,0+/- 2 350
Clorofila a, (m g/L)

Control

300 250 200 150 100 50 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo de cultivo (dias)

Grfica 9 . Produccin de Clorofila a (mg/L) en ensayos a pH 9,0 +/- 0.2 y control a pH 9,2

Un factor adicional de importancia, al suministrar CO2 a los cultivos, es el aumento de rendimientos, ya que aunque conlleva un valor adicional, ste puede generar beneficios en la produccin lo que se refleja en los costos. El tiempo total de adicin

66

de CO2 en los 37 das de cultivo fue de 40 minutos aproximadamente, lo cual indica que con una poca cantidad del gas, se obtiene una muy buena productividad a nivel de biomasa, que es el principal objetivo cuando se hacen implementaciones a gran escala. Teniendo en cuenta los gastos generados a escala de laboratorio, se hizo una relacin de lo que puede implicar una prueba a escala piloto de 10L sin adicin de CO2 y con la adicin de ste.; los costos aproximados se presentan en las tablas 8 y 9.
Tabla 8. Costos sin adicin de CO2

Costos Aireadores Mangueras aireadoras Lmparas Medio de Cultivo Recipiente de cultivo Material de lab. Total

Laboratorio $ 100.000 $ 10.000 $ 60.000 $ 60.000 $ $ 70.000 $ 300.000

Escala piloto $ 700.000 $ 100.000 $ 240.000 $ 240.000 $ 600.000 $ 180.000 $ 2.060.000

Fuente: Oxiaced Ltda. (2006).

Tabla 9. Costos implementacin de CO2

Costos Valor gas CO2 Alquiler cilindro Alquiler regulador Mangueras aireadores Medio de Cultivo Recipiente de Cultivo Lmparas Material de lab Total

Laboratorio $ 50.000 $ 40.500 $ 40.500 $ 10.000 $ 60.000 $ $ $ 60.000 70.000 331.000

Escala piloto $ 300.000 $ 162.000 $ 262.000 $ 100.000 $ 240.000 $ 800.000 $ 240.000 $ 300.000 $ 2.404.000

Fuente: Oxiaced Ltda. (2006).

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7. CONCLUSIONES El ensayo a pH 9,0 result ser el ms adecuado en el incremento de la biomasa de Spirulina spp., bajo las condiciones establecidas. Los ensayos a pH menos alcalinos resultaron poco benficos para el desarrollo de la cianobacteria, ya que no se obtuvo una buena produccin de biomasa. En el ensayo a pH 10,2 se present el menor incremento de biomasa, as como tambin propici una rpida cada en el cultivo, demostrando que pH muy alcalinos afectan significativamente el desarrollo de la Spirulina spp. El consumo de bicarbonato fue una variable determinante que permiti conocer la productividad y rendimientos en cada uno de los ensayos realizados, ya que est directamente relacionada con esos parmetros. La adicin de CO2 fue benfica para el cultivo, ya que con poco tiempo de exposicin del cultivo al gas, se produjo una mayor concentracin de biomasa y se mantuvo en una fase de crecimiento constante. Este factor es de gran importancia a la hora de realizar un cultivo a gran escala, puesto que aunque se genera un valor adicional por la implementacin del gas, se obtiene una mayor productividad. La determinacin de clorofila en la segunda etapa experimental permiti conocer el desarrollo de los cultivos, ya que su concentracin es directamente proporcional a la cantidad de biomasa presente en el medio. Se estableci un diseo para la determinacin del pH ms adecuado para cualquier cepa de Spirulina spp.

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8. RECOMENDACIONES Para posteriores investigaciones, utilizando la cepa en estudio, es conveniente limitar el rango de pH a valores alcalinos entre 8,8 y 9,2. Desarrollar proyectos de investigacin a escala piloto con esta cianobacteria, empleando el CO2 por periodos de tiempo en el cultivo con el fin de enriquecerlo y aumentar su productividad. Con el fin de lograr una disminucin en los costos de implementacin y mantenimiento de los cultivos, sera muy provechoso emplear otras fuentes de CO2, como las fuentes naturales.

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9. REFERENCIAS Antenna Technology, [en lnea]. Cultivo artesanal de spirulina- Jean Falquet. [Francia] http:// www.antenna.ch/manual/CULTIVO. html [Consulta: Octubre 21 de 2004] Ayala, F., Bravo, R. 1982. An improved cheap culture medium for the blue-green microalgae Spirulina. European J. Appl. Microbiol. Biotechnology 15:198-199. Abbayes, H. 1989. Botnica: Vegetales inferiores. Ed. Reverte S.A. Guadalajara. Mxico. Pp. 68 95. Becker, E.W., Venkataraman, L.V. 1982. Biotechnology and exploitation of algae The Indian Approach -. Gesellschaft fiir Technische Zusammenarbeit (GTZ) Agency for Technical cooperation (GTZ) Belay, A., Kato, T., Ota, Y. 1996. Spirulina (Arthospira): potential application as an animal feed supplement. J Appl Phycol, 1996; 8:303-311. Belay, A. 2002. The potential application of Spirulina ( Artrhospira ) as a nutritional and therapeutic supplement in health management. J. Ame. Nutra. Assoc. 5 (2): 27- 49. Berry, S., Bolychevtseva, Y.V., Rogner, M., Karapetyan, N.V. 2003. Photosynthetic and respiratory electron transport in the alkaliphilic cyanobacterium Arthrospira ( Spirulina )platensis. Photosy. Res. 78: 67 76. Borowitzka, M.A. 1999. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. Jour. Biotech. 70: 313 321. Castenholz, R.W., Waterbury, J.B. 1989. Oxygenic photosynthetic bacteria. Section 19, In: Staley, J.T., Bryant, M.P., Pfenning, N., Holt, J.G., Eds. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 3, Williams and Wilkins Co, Baltimore, USA. pp 1710-1806. Ciferri, O. 1983. Spirulina, the edible microorganism. Microbiol. Rev 47:551-578. Cohen, Z. 1997. The Chemicals of spirulina. In: Vonshak, A, (Ed) Spirulina platenses(Arthospira): Physiology, cell biology and biotechnology. Taylor and Franers. London. U.K pp 213 - 216 Chamorro, G., Salazar. M., Favila. L., Bourges. H. 1996. Farmacologa y toxicologa del alga Spirulina sp. Rev. Invest. Clin. 48: 389 399.

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10. ANEXOS ANEXO 1 Medio Zarrouk modificado Elementos NaHCO3 NaNO3 K2HPO4 NaCl K2SO4 MgSO4.7H2O FeSO4.5H2O CaCl2. 2H2O EDTA g./L 17 2.5 0.5 1 1 0.2 0.01 0.04 0.11

Solucin de Oligoelementos Elementos H3BO3 MnCl2.4H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O MoO3 Co(NO3)2.6H2O Formulado por: Snchez, 2003/a. g./L 2.86 1.80 0.08 0.22 0.01 4.4 mg/l

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ANEXO 2 METODO PARA DETERMINACION DE ALCALINIDAD En una probeta se midieron 100mL de medio y se colocaron en un Erlenmeyer de 250mL. Se adicionaron 3 gotas del indicador (fenolftalena) y la mezcla se agit suavemente. Luego de que se present cambio de color en la muestra, sta se titul desde una bureta que contena cido sulfrico 0.02N, gota a gota y con agitacin moderada hasta que se obtuviera la desaparicin completa de color. Se calcul el valor respectivo para la alcalinidad a la fenolftalena, a partir del gasto de cido sulfrico del paso anterior. Se midieron en una probeta otros 100 mL de la muestra diluida en 100 mL con agua destilada, y se colocaron en un erlenmeyer de 250 mL. Se agregaron 4 gotas del indicador mixto (verde de bromocresol y rojo de metilo) y se mezclaron. Si apareca un color anaranjado, la alcalinidad total era igual a cero, pero si el color desarrollado era azul se continuaba con el siguiente paso. Se titulo la muestra azul desde una bureta que contena acido sulfrico 0.002N gota a gota y con agitacin moderada hasta la aparicin de color anaranjado. Finalmente se calculo el valor para la alcalinidad total a partir del acido sulfrico consumido en la titulacin, como se indica en los clculos (Roa, 1991). CALCULO: F en (mg/L CaCO3) = F= alcalinidad a la fenolftaleina A x B x C x 1000 M

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A= mL del cido sulfrico gastados en la titulacin B= Concentracin normal de acido sulfrico utilizado C= Peso equivalente gramo de carbonato de calcio (CaCO3), patrn para la expresin del resultado. 1000= factor de conversin a mg/L M= volumen en mL de la muestra titulada.

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ANEXO 3 CURVA PATRON Y DATOS OBTENIDOS EN LA DETERMINACION DE PESO SECO

CURVA PATRON PESO SECO
0.0300 0.0250

PESO SECO g/25m L

y = 0.016x R 2 = 0.9963

0.0200 0.0150 0.0100 0.0050 0.0000 0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

ABSORBANCIA

Concentracin % Transmitancia 1.5

Peso filtro vaco (g) 0.0816 0.0815 0.0812 0.0820 0.0817 0.0815 0.0815 0.0812 0.0815 0.0820 0.0818 0.0813 0.0817 0.0815 0.0820

20

40

60

80

CURVA PATRON PESO SECO Peso filtro + Peso seco X Spirulina Spirulina (g) (g)/25mL 0.1020 0.0348 0.1023 0.0208 0.0258 0.1030 0.0218 0.0948 0.0128 0.0944 0.0127 0.0126 0.0939 0.0124 0.0875 0.0060 0.0869 0.0057 0.0060 0.0877 0.0062 0.0848 0.0028 0.0843 0.0025 0.0025 0.0835 0.0022 0.0829 0.0012 0.0825 0.0010 0.0011 0.0830 0.0010

DS

Peso seco (g) en 1lt

0.0078

1.0323

0.0002

0.5054

0.0003

0.2387

0.0003

0.1

0.0001

0.0427

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ANEXO 4 METODOS DE DETERMINACION DE BIOMASA Mtodo del Peso Seco Elaboracin de la curva patrn para la determinacin de peso seco: Se utilizaron papeles de filtro Whatman GF/C de 47mm de dimetro, previamente deshidratados a 105C por 2 horas y se pesaron (M1). Se prepararon suspensiones patrn de la cianobacteria con concentraciones equivalentes a los siguientes valores de transmitancia: 1.5, 20, 40, 60 y 80%. De las suspensiones bacterianas, preparadas segn descripcin consignada en el numeral anterior, se filtraron alcuotas de 25 mL y el residuo (filamentos de Spirulina spp.) se lav cuatro veces con cantidades pequeas (1 mL) de agua acidulada (pH: 4.0) para remover las sales remantes sobre el filtro. El papel que contena la muestra se calent a 105C por 2 horas, se coloc en desecador por 20 minutos y se pes (M2). Cada ensayo se realiz por triplicado. La curva se traz con los datos de absorbancia versus peso seco (g) en 25 mL de cultivo. El peso seco (g) se tom como la diferencia entre el peso del papel de filtro con la muestra seca (M2) y el correspondiente al papel de filtro vaco (M1) (Snchez, 2003). Determinacin de peso seco: A partir de la ecuacin obtenida de la curva patrn de peso seco, se determin el peso seco en cada uno de los ensayos, extrapolando la lectura de absorbancia obtenida en los diferentes pH. Mtodo para la Determinacin de Clorofila La determinacin de clorofila por el mtodo de pigmentos, se realiz en dos etapas segn procedimiento de Duque (1988).

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Extraccin de pigmentos: Para efectuar la extraccin de la clorofila, se tomaron 10 mL de muestra y se centrifugarn a 8000 r.p.m durante 25 minutos y una temperatura de 5C; bajo estas condiciones se asegura que la mayora de las clulas de la cianobacteria que se hallen en la muestra queden sedimentadas. Se descart el sobrenadante y se aadieron 5 mL de alcohol metlico, agitando fuertemente para lograr que todo el sedimento quedara resuspendido en el alcohol y as facilitar una mejor extraccin de los pigmentos. El tubo que contena la suspensin de Spirulina spp. en metanol y que estaba cubierto con laminilla de aluminio, para evitar la fotooxidacin de las clorofilas, se almacen en un refrigerador a 5C durante 24 horas, al cabo de las cuales se volvi a centrifugar la suspensin alcohlica a 10.000 r.p.m, por 25 minutos y a 5C, para lograr que el lquido sobrenadante quedara exento de slidos. Determinacin colorimtrica: Una vez extrados los pigmentos con la segunda centrifugacin descrita en la seccin anterior, se determino la densidad ptica (D.O) en un espectrofotmetro a tres longitudes de onda: 665 nm para la clorofila a, 645 para la clorofila b y 630 para la clorofila c; tambin se tom una medida a 750 nm para hacer correccin de la turbidez del medio. El clculo de las densidades pticas para los tres pigmentos se efectu segn la frmula: (D750nm 0.002) para las longitudes 665nm, 645 nm, 630 nm. Para encontrar la concentracin de clorofilas expresada en mg/L de metanol se utilizaron las siguientes correlaciones (Parsons and Strickland, 1963) Clorofila a: (11.6)(D665) (0.14)(D630) (1.31)(D645) Clorofila b: (20.7)(D645) (4.34)(D665) (4.42)(D630) Clorofila c: (55.0)(D630) (16.3)(D645) (4.64)(D665)

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ANEXO 5 DATOS DE PRODUCCIN DE CLOROFILA EN mg/L

Das 4 7 11 14 18 21 25 28 30 32

pH 9,0+/- 2 mg/L 120,111 156,889 198,667 251,667 248,222 262,778 301,000 297,556 310,889 317,000

Control mg/L 109,00 137,11 183,78 213,78 221,44 237,11 234,67 272,78 287,56 261,67

80

ANEXO 6 DATOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS DURANTE LAS 30 PRIMERAS HORAS DE CULTIVO (BIOMASA g/L)

Hora

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) 0,020 0,020 0,016 0,042 0,036 0,036 0,016 0,022 0,022 0,022 0,042 0,036 0,036 0,022 0,020 0,020 0,020 0,042 0,036 0,036 0,020 0,022 0,022 0,023 0,042 0,036 0,036 0,023 0,022 0,022 0,027 0,042 0,036 0,036 0,027 0,020 0,020 0,027 0,042 0,036 0,036 0,027 0,022 0,022 0,025 0,042 0,036 0,036 0,025 0,022 0,022 0,031 0,042 0,036 0,036 0,031 0,022 0,022 0,032 0,042 0,036 0,036 0,032 0,020 0,020 0,034 0,042 0,042 0,036 0,034 0,020 0,025 0,034 0,048 0,042 0,036 0,034 0,022 0,025 0,036 0,048 0,048 0,036 0,038 0,022 0,022 0,038 0,048 0,048 0,036 0,038 0,022 0,022 0,038 0,048 0,048 0,036 0,040 0,027 0,031 0,040 0,055 0,055 0,036 0,040 0,031 0,031 0,040 0,061 0,061 0,036 0,046 0,027 0,040 0,044 0,061 0,061 0,036 0,046 0,031 0,031 0,044 0,061 0,061 0,042 0,048 0,031 0,031 0,046 0,067 0,067 0,042 0,051 0,031 0,031 0,046 0,067 0,067 0,036 0,052 0,034 0,034 0,048 0,074 0,074 0,042 0,060 0,031 0,034 0,051 0,080 0,074 0,042 0,061 0,034 0,031 0,052 0,080 0,074 0,036 0,065 0,040 0,031 0,054 0,087 0,074 0,042 0,065 0,037 0,042 0,056 0,087 0,080 0,048 0,068 0,037 0,043 0,059 0,093 0,080 0,055 0,068 0,037 0,043 0,064 0,093 0,087 0,055 0,070 0,037 0,044 0,067 0,099 0,087 0,061 0,071 0,037 0,044 0,071 0,099 -0,039 0,061 0,073 0,037 0,045 0,073 0,099 0,087 0,061 0,071

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ANEXO 7 DATOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS DURANTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (BIOMASA g/L)

DIA

pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 DIA pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa Biomasa (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) 0,021 0,038 0,049 0,076 0,185 0,211 0,255 0,267 0,327 0,413 0,450 0,500 0,528 0,628 0,747 0,832 0,908 1,014 1,120 1,330 1,373 1,457 1,570 1,580 1,521 1,527 1,525 0,025 0,073 0,109 0,140 0,211 0,255 0,298 0,340 0,414 0,479 0,522 0,568 0,611 0,653 0,814 0,920 1,005 1,132 1,239 1,457 1,523 1,672 1,757 1,776 1,693 1,689 1,687 0,031 0,080 0,129 0,176 0,313 0,355 0,389 0,403 0,418 0,522 0,615 0,657 0,750 0,776 1,005 1,111 1,257 1,363 1,512 1,788 1,903 1,945 2,015 2,018 2,003 2,003 2,005 1 2 3 4 5 9 10 11 12 15 16 17 18 19 22 23 24 25 26 29 30 31 32 33 36 37 38 0,042 0,087 0,125 0,214 0,284 0,424 0,481 0,500 0,564 0,780 0,882 0,952 0,997 1,048 1,252 1,404 1,493 1,595 1,704 2,003 2,130 2,206 2,277 2,277 2,194 2,168 2,130 0,036 0,080 0,125 0,214 0,284 0,418 0,469 0,519 0,564 0,812 0,908 1,003 1,073 1,124 1,334 1,436 1,570 1,678 1,799 2,149 2,251 2,308 2,308 2,257 2,200 2,187 2,130 0,036 0,036 0,125 0,138 0,258 0,488 0,704 0,780 0,882 0,997 1,099 1,188 1,334 1,423 1,608 1,678 1,754 1,818 1,818 1,761 1,710 1,678 1,678 1,678 1,678 1,678 1,678 0,036 0,074 0,099 0,176 0,233 0,341 0,399 0,443 0,507 0,653 0,755 0,831 0,908 0,971 1,118 1,264 1,341 1,455 1,557 1,882 1,977 2,054 2,060 2,060 2,041 2,041 2,047

1 2 3 4 7 8 9 10 11 14 15 16 17 18 21 22 23 24 25 28 29 30 31 32 33 34 35

82

ANEXO 8 DATOS DE pH Y BIOMASA (g/L) OBTENIDOS DURANTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO

pH 8,2 8,2 8,45 8,76 9,08 9,31 9,44 9,51 9,63 9,77 9,91 9,97 9,95 10,1 10,1 10,2 10,2 10,2 10,3 10,3 10,4 10,4 10,4 10,5 10,5 10,4 10,4 10,4 pH 8,2
Biomasa

pH 8,6 8,6 8,98 9,2 9,5 9,63 9,74 9,81 9,91 9,99 10,2 10,2 10,2 10,3 10,2 10,3 10,3 10,3 10,3 10,4 10,4 10,4 10,5 10,5 10,5 10,5 10,5 10,5

pH 8,6
Biomasa

pH 9 9 9,44 9,63 9,7 9,92 10,1 10,1 10,2 10,2 10,3 10,4 10,4 10,4 10,4 10,5 10,5 10,5 10,5 10,6 10,6 10,7 10,7 10,7 10,8 10,7 10,7 10,7

pH 9,0
Biomasa

pH 9,4 9,4 9,45 9,52 9,55 9,62 9,75 9,85 9,91 10,1 10,2 10,2 10,3 10,3 10,4 10,5 10,6 10,6 10,6 10,6 10,6 10,6 10,7 10,7 10,7 10,7 10,6 10,5

pH 9,4
Biomasa

pH 9,8 9,8 9,84 9,85 9,87 9,87 9,93 10,1 10,1 10,2 10,3 10,3 10,4 10,4 10,4 10,6 10,6 10,6 10,6 10,7 10,7 10,8 10,8 10,8 10,7 10,7 10,6 10,5

g/L 0,021 0,038 0,049 0,076 0,185 0,211 0,255 0,267 0,327 0,413 0,45 0,5 0,528 0,628 0,747 0,832 0,908 1,014 1,12 1,33 1,373 1,457 1,57 1,58 1,521 1,527 1,525

g/L 0,025 0,073 0,109 0,14 0,211 0,255 0,298 0,34 0,414 0,479 0,522 0,568 0,611 0,653 0,814 0,92 1,005 1,132 1,239 1,457 1,523 1,672 1,757 1,776 1,693 1,689 1,687

g/L 0,031 0,08 0,129 0,176 0,313 0,355 0,389 0,403 0,418 0,522 0,615 0,657 0,75 0,776 1,005 1,111 1,257 1,363 1,512 1,788 1,903 1,945 2,015 2,018 2,003 2,003 2,005

g/L 0,042 0,087 0,125 0,214 0,284 0,424 0,481 0,5 0,564 0,78 0,882 0,952 0,997 1,048 1,252 1,404 1,493 1,595 1,704 2,003 2,13 2,206 2,277 2,277 2,194 2,168 2,13

pH pH 10,2 pH Control 10,2 Control Biomasa Biomasa Biomasa g/L g/L g/L 0,036 10,2 0,036 9.10 0,036 0,08 10,2 0,036 9.52 0,074 0,125 10,2 0,125 9.68 0,099 0,214 10,3 0,138 9.74 0,176 0,284 10,4 0,258 9.97 0,233 0,418 10,6 0,488 10.10 0,341 0,469 10,6 0,704 10,13 0,399 0,519 10,6 0,78 10,19 0,443 0,564 10,6 0,882 10.29 0,507 0,812 10,8 0,997 10,34 0,653 0,908 10,8 1,099 10,36 0,755 1,003 10,8 1,188 10,38 0,831 1,073 10,8 1,334 10,41 0,908 1,124 10,8 1,423 10.48 0,971 1,334 10,9 1,608 10,48 1,118 1,436 10,9 1,678 10,51 1,264 1,57 10,9 1,754 10,53 1,341 1,678 11,1 1,818 10.59 1,455 1,799 11,1 1,818 10.62 1,557 2,149 11 1,761 10.68 1,882 2,251 10,9 1,71 10.72 1,977 2,308 10,9 1,678 10.75 2,054 2,308 10,9 1,678 10.79 2,06 2,257 10,8 1,678 10.79 2,06 2,2 10,8 1,678 10,69 2,041 2,187 10,7 1,678 10.55 2,041 2,13 10,7 1,678 10.53 2,047

pH 9,8

83

ANEXO 9 GRAFICAS DE pH VS BIOMASA

pH 8,2 g/L 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 8,00 Exponencial (pH 8,2 g/L)

Biomasa (g/L)

8,50

9,00

9,50 pH

10,00

10,50

y = 3E-09e1,8977x R2 = 0,987

11,00

Grfica 1. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 8,2

pH 8,6 g/L 2,10 1,80 1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00 9,00

Exponencial (pH 8,6 g/L)

Biomasa (g/L)

9,50

10,00 pH

10,50 11,00 y = 4E-10e2,0945x R2 = 0,9619

Grfica 2. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 8,6

pH 9,0 g/L 2,40 2,10 1,80 1,50 1,20 0,90 0,60 0,30 0,00 9,00 Exponencial (pH 9,0 g/L)

Bioamsa (g/L)

9,50

10,00 pH

10,50 11,00 y = 8E-12e2,4436x R2 = 0,9772

Grfica 3. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 9,0

84

pH 9,4 g/L 3,00 Biomasa (g/L) 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 9,3 9,8

Exponencial (pH 9,4 g/L)

10,3 pH

10,8 y = 3E-11e2,3468x R2 = 0,9216

Grfica 4. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 9,4

pH 9,8 g/L 3,50 3,00

Biomasa (g/L)

Exponencial (pH 9,8 g/L)

2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 9,7 9,9 10,1 10,3 pH 10,5 10,7 10,9 y = 9E-15e3,1016x R2 = 0,851

Grfica 5. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 9,8

pH 10,2 g/L 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 10,2

Exponencial (pH 10,2 g/L)

Biomasa( g/L)

10,4

10,6 pH

10,8

11 11,2 y = 1E-20e4,2421x R2 = 0,8508

Grfica 6. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en ensayo a pH 10,2

85

Control g/L 2,7 2,4 2,1 1,8 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0 9 9,5

Exponencial (Control g/L)

Biomasa (g/L)

10 pH

10,5 11 y = 1E-12e2,618x R2 = 0,9878

Grfica 7. Produccin de biomasa y comportamiento de pH en el control

86

ANEXO 10 DATOS OBTENIDOS Y CURVA DE CONSUMO DE BICARBONATO

Da

1 5 9 13 17 21 25 30

pH 8,2 (mg/L) CaCO3 13680 13480 12760 11100 9350 6535 5480 4364

pH 8,6 (mg/L) CaCO3 13680 13472 12225 11028 9113 6140 5323 4297

pH 9,0 (mg/L) CaCO3 13680 13336 12940 10965 9017 5639 4965 3505

pH 9,4 (mg/L) CaCO3 13680 12956 11425 10380 9257 7140 5236 3483

pH 9,8 (mg/L) CaCO3 13680 12948 11419 10370 9225 7121 5128 3456

pH 10,2 (mg/L) CaCO3 13680 12930 10150 8640 7245 6368 5421 5310

Control (mg/L) CaCO3 13680 13154 12740 10632 8860 5248 4465 3451

CONSUMO DE BICARBONATO EN CULTIVOS DE Spirulina maxima

16000 14000 12000 mg/L CaCO3 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 10 20 Tiempo (das) 30 40 pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control

87

ANEXO 11 ANALISIS ESTADISTICO DE VARIABLES

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas desiguales Variable 1 1,066999166 0,54675636 29 0 55 -1,463423548 0,074521727 1,673033694 0,149043454 2,004044291 Variable 2 1,366139142 0,664976338 29

Media Varianza Observaciones Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas)

88

ANEXO 12 DATOS OBTENIDOS EN LOS ENSAYOS CON CO2 Y CONTROL DURANTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (BIOMASA g/L)

Da

1 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 18 19 20 22 23 25 26 27 28 29 30 32 34 35 36 37

CO2 Biomasa (g/L) 0,143 0,320 0,391 0,425 0,517 0,549 0,596 0,711 0,772 0,828 0,851 0,932 1,002 1,134 1,227 1,338 1,432 1,563 1,692 1,777 1,866 1,987 2,129 2,252 2,432 2,592 2,628 2,727 2,806

pH CO2 8,90 8,83 9,03 9,10 9,25 9,06 9,21 9,09 9,18 9,06 9,32 9,15 9,16 9,25 8,89 9,12 9,20 9,08 9,05 9,15 9,06 9,01 9,12 9,18 9,12 9,18 9,19 9,17 8,99

CONTROL Biomasa (g/L) 0,074 0,159 0,186 0,207 0,238 0,272 0,327 0,369 0,421 0,510 0,577 0,662 0,745 0,831 0,930 1,034 1,189 1,299 1,444 1,546 1,695 1,836 1,954 2,061 2,166 2,172 2,054 2,004 1,981

pH Control 9,21 9,50 9,63 9,64 9,73 9,78 9,80 9,78 9,70 9,80 9,98 10,11 10,08 10,02 10,01 10,10 10,08 10,10 10,12 10,14 10,15 10,11 10,27 10,26 10,26 9,88 9,87 9,78 9,75

89

EVALUACION DEL pH EN EL CULTIVO DE Spirulina spp.(=Arthrospira) BAJOCONDICIONES DE LABORATORIO Francia Triana, Alex Rodrguez, Jaime Bernal1, Claudia Zambrano1
1

Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana,

Carrera 7 No. 43-88, Bogot, D.C. E-mail: francia_triana@yahoo.com; alexr22@starmedia.com; jabernal@javeriana.edu.co; claudia.zambrano@javeriana.edu.co RESUMEN El estudio del cultivo de Spirulina spp. en condiciones de laboratorio es de inters debido a que en los ltimos aos se han descubierto sus grandes propiedades nutricionales, lo que hace necesario que se determinen factores importantes en su crecimiento como el pH. En este trabajo se busc optimizar este factor para lograr una mejor productividad en cuanto a biomasa g/L; se reporta el efecto que tiene diferentes valores de pH sobre la formacin de biomasa de Spirulina spp., se emplearon valores de pH de 8.2, 8.6, 9.0, 9.4, 9.8 y 10.2. Los ensayos se llevaron a cabo en medio Zarrouk a una temperatura de 25 +/-2C, aireacin constante, fotoperiodo 12:12 h y 58.56 mol quanta m-2 s-1 de irradiancia. Spirulina spp. fue capaz de crecer bajo todos los pH probados, sin embargo fue en el pH 9.0 en el cual present un menor tiempo de adaptacin en las 30 primeras horas de cultivo y uno de los mejores rendimientos a lo largo del cultivo. Se realiz una segunda etapa experimental en la cual se escogi el pH 9.0 de la primera etapa y se implement la adicin de CO2 al cultivo con el fin de evaluar la productividad del mismo, tambin se realiz un control sin CO2 y se determin que estadsticamente no hubo diferencias significativas entre los dos ensayos (p>0.05), sin embargo el control present una cada ms rpida en su crecimiento en el da 33, mientras que el ensayo con CO2 continu su

90

crecimiento. As mismo se determin que la cantidad de CO2 as como el tiempo en la adicin de ste son muy pocos si se comparan con los beneficios que se pueden obtener en cuanto a productividad y por ende a rentabilidad. Palabras clave: biomasa, CO2, pH, Spirulina spp. ABSTRACT The study of Spirulina spp. cultures under laboratory conditions is of interest because in recent years its large nutritional properties have been discovered. As such, it is necessary that the effects of important factors such as pH and CO2 be determined on its growth. Two studies were performed. The first study was to analyze the effects of different values of pH (8.2, .8.6, 9.0, 9.4, 9.8 and 10.2) in order to obtain maximum biomass (g/L) productivity. The assays were kept in Zarrouk medium, 25 +/-2C, constant aeration, 12:12 h photoperiod and 58.56 mol quanta m-2 s-1 of irradiance. The Spirulina spp. was able to grow under all pH tests, however at pH 9.0 it had the shortest adaptation period during the first 30 hours of culture and one of the best yields.

The second experiment was to determine if CO2 supplementation had any effect on the biomass and pH. In this test the pH 9.0 culture was selected from the first stage and CO2 addition was implemented to the culture in order to evaluate its productivity. A control without CO2 was also performed. It was observed that initially there were no significant differences between both assays (p>0.05) until the 33rd day, at which time the control had a decline in its growth while the assay with CO2 continued to grow normally. We also determined that the quantity of CO2 and the time of addition are small when compared with the benefits that could be obtained in productivity and profitability.

Key words: biomass, CO2, pH, Spirulina spp.

91

INTRODUCCION Spirulina spp. es una cianobacteria filamentosa, auttrofa, reconocida tambin como alga verde-azul, y que deriva su nombre de la naturaleza helicoidal o en espiral de sus filamentos. Su alto contenido nutricional justifica que se analice su produccin en cantidades suficientemente altas para permitir su comercializacin en un mbito nacional e internacional. S. maxima contiene entre 50 60% de protena bruta. El espectro de sus aminocidos es similar al de otros microorganismos y patrones protenicos alimenticios como huevos o leche, an cuando es deficiente en metionina, cistena y lisina (Ciferri, 1983; Cohen, 1997). Spirulina spp. es una fuente importante de vitaminas, especialmente vitamina B12 y carotenos; tambin de minerales como el hierro y de cidos grasos esenciales como el gama-linoleico. De hecho, la composicin qumica, de la S. maxima es el factor ms importante para evaluar la utilizacin de esta cianobacteria, como fuente potencial de

alimento, lo que hace pertinente que se realicen estudios sobre su crecimiento y produccin. Spirulina spp. puede cultivarse fcilmente, en biorreactores y sistemas acuosos abiertos, naturales y artificiales, en los que el medio de cultivo lquido contiene sales como

bicarbonato de sodio y nitratos, que contribuyen a la alcalinidad del medio, uno de los factores ms determinantes en el escalado y produccin. La iluminacin es importante por ser Spirulina spp. organismo fotoautotrfico, y para lograr una adecuada distribucin de nutrientes, se mantiene agitacin por medio mecnico o por burbujeo. Una instancia previa al cultivo industrial es la experimental, con el fin de obtener conocimiento sobre las condiciones ambientales que ms favorecen el crecimiento y cultivo de Spirulina spp.. A pesar de su importancia nutricional, econmica y biolgica, Spirulina spp. no ha sido suficientemente investigada y desarrollada industrialmente en Colombia. Este trabajo busc evaluar a escala de laboratorio el pH, como principal factor determinante durante el proceso

92

de produccin, establecer alternativas para su manejo, estabilizacin y control, as como mejorar la cintica de crecimiento de Spirulina spp.. Para lo anterior, el trabajo consta de una primera etapa, en la cual se midieron diferentes valores de pH inicial, con el objetivo de determinar cul era el que ms favoreca el adecuado desarrollo del cultivo. En una segunda etapa experimental, se suministr CO2 gaseoso al medio de cultivo en una concentracin determinada, con el fin de mantener constante el pH establecido durante la primera etapa experimental, en busca de mejorar el rendimiento de biomasa (g/L) en el medio.

MATERIALES Y METODOS Primera etapa experimental Condiciones Generales Todos los ensayos se llevaron a cabo en una cmara de experimentacin rectangular de 70cmx40cmx60cm (largo x ancho x alto) (figura 3), sometido a una condicin lumnica de 58.59 molquanta/m2.s (aprox. 3000 lux), generada por 3 lmparas de luz da, acopladas a un temporizador para generar fotoperiodos de 12h y 12h (luz y oscuridad) y ayudar a mantener la temperatura en 25 +/- 2 C (Pedraza, 1989). La lectura de la temperatura de la cmara se realiz con un termmetro de mximos y mnimos. Los cultivos se mantuvieron en agitacin y conservando el perodos de luz - oscuridad antes dicho. Microorganismo Durante el desarrollo del trabajo experimental se utiliz la cepa de la cianobacteria Spirulina spp. (Artrospira), que se obtuvo del Centro Interactivo de Ciencia y Tecnologa de Maloka, (Bogot, Colombia) y que actualmente se mantiene en el Departamento de Qumica de la Pontificia Universidad Javeriana. Inculo La cepa fue mantenida durante 20 das a una temperatura de 25+/- 2 C y a 3000 lux en medio Zarrouk modificado (anexo 1). Cada 20 das se hizo el recambio del medio de cultivo

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con el fin de mantener la cepa en fase de crecimiento y en las mejores condiciones. Se utiliz un volumen efectivo de trabajo de 500 mL agitado por aire procedente de un minicompresor. Todos los ensayos se iniciaron con un 10% (v/v) de este inculo. Ensayos de pH Se evaluaron seis ensayos con valores de pH inicial de 8.2, 8.6, 9.0, 9.4, 9.8 y 10.2; con un volumen efectivo de trabajo de 250mL, agitados por aireacin valorando triplicado. Durante las primeras 30 horas de cultivo se tomaron muestras cada 2 h en las cuales se determinaron la concentracin de biomasa, por el mtodo espectrofotomtrico a una longitud de onda de 560nm (Becker, 1982). Posteriormente la lectura de absorbancia se realiz cada 24 h. As mismo se determin el valor de pH, por medio de un medidor de pH digital marca HANNA, previa calibracin con soluciones buffer a pH 4.1 y 7.1. Adicionalmente, se determin la concentracin de bicarbonato en cada uno de los ensayos con intervalos de 72 h, empleando la tcnica de aguas descrita por el Instituto Nacional de Salud. Mtodo de determinacin de Biomasa Para la determinacin de biomasa se utiliz la tcnica de peso seco Segunda Etapa Experimental Para esta etapa se mantuvieron las mismas condiciones generales descritas en la primera fase experimental. Ensayo a pH 9.0 De acuerdo a los resultados obtenidos en la primera etapa experimental y teniendo en cuenta el anlisis de crecimiento de la Spirulina spp. durante las 30 primeras horas, as como el valor de la pendiente en cada uno de los ensayos, se eligi el ensayo a pH 9.0+/-0.2 como el ms adecuado para el desarrollo de la segunda etapa. Este ensayo se realiz por triplicado con un su pH por

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volumen efectivo de trabajo de 250mL y con un inculo de 10%. El cultivo se mantuvo en agitacin permanente mediante 3 planchas de agitacin magntica; se llev un control, tambin con un volumen efectivo de trabajo de 250mL y mantenido en las mismas condiciones de los ensayos de la primera etapa experimental. Se efectu un seguimiento diario a cada una de las rplicas y al control, en el cual se determin la concentracin de biomasa, por el mtodo espectrofotomtrico a una longitud de onda de 560nm (Becker, 1982). Igualmente se realiz la lectura de valores de pH, por medio de un medidor de pH digital marca HANNA, previa calibracin con soluciones buffer a pH 4.1 y 7.1. Adicin de CO2 en Ensayo a pH 9.0 +/-0.2 El pH de cada rplica fue mantenido por adicin interrumpida de CO2, con el fin de no exceder el valor de pH establecido. El gas se incorpor al medio procedente de un tanque de CO2 con un regulador, sometido a una presin de 25lb/pulg2, conectado a un frasco de vidrio, dentro del cual se coloc lana de vidrio con el fin de evitar que ingresaran impurezas slidas o lquidas al medio, acompaantes del gas. Al frasco se le adapt un tapn de goma con tres salidas que correspondan a cada una de las rplicas; en cada salida se coloc un tubo de vidrio, al cual se le conect una manguera de caucho por la cual circulaba el gas, hasta llegar a cada uno de los ensayos. El flujo de CO2 se midi por desplazamiento de agua en cada una de las salidas de este gas, para lo cual se monto un experimento que consisti en tres probetas de 100 mL cada una y de tres vasos de precipitado de 250 mL, los cuales se colocaron en la forma como se muestra en la figura 10 y 11, con el fin de determinar la cantidad de CO2 desplazada de la probeta y as relacionar el flujo que estaba ingresando a cada una de las rplicas. Obtenidos estos datos se aplic la ecuacin de los gases reales para obtener el valor de las moles suministradas al cultivo en un tiempo determinado (8 s):

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_n2 a_ P + V2 Determinacin de Biomasa

V nb

= nRT

Para la determinacin de biomasa se utilizaron dos tcnicas: peso seco y anlisis de clorofila. Anlisis Estadstico de Variables Para la primera etapa experimental, con el propsito de escoger el valor de pH que mejor se relacionaba con la produccin de biomasa, se utilizaron como criterios de anlisis el factor de crecimiento y el coeficiente de determinacin. Para la segunda etapa experimental se busc analizar si existan diferencias significativas entre la produccin de biomasa en el ensayo con el pH seleccionado de la primera etapa y el control. Para esto se utiliz como herramienta estadstica una prueba T de Student para comparar las medias poblacionales. En las dos etapas experimentales la variable respuesta, que se expresa como velocidad especifica de crecimiento (h-1), se realiz un anlisis de regresin de los datos de logaritmo natural de peso seco (g/L) vs tiempo en cada uno de los ensayos. As, la velocidad se estableci como la pendiente de la regresin, con un coeficiente de regresin (r2) cercano a 1. RESULTADOS Y DISCUSION Primera etapa experimental El estudio del crecimiento del cultivo de la Spirulina spp., durante las primeras 30 h permiti determinar la cintica del proceso en su fase de adaptacin. Al evaluar el desarrollo del cultivo hasta su culminacin, en todos los ensayos con diferentes valores de pH, se observaron las etapas de crecimiento bien definidas: fase de adaptacin, fase exponencial y fase estacionaria, lo cual demostr que Spirulina spp. es capaz de crecer bajo un intervalo amplio de valores de pH, teniendo como principal caracterstica la alcalinizacin del medio. Aunque tal comportamiento demuestra una gran adaptabilidad de la

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cianobacteria a diferentes pH, tambin se observ que este parmetro afecta la produccin de biomasa al constituirse en factor limitante del crecimiento lo cual est de acuerdo con hallazgos anteriores (Pelizer, 2002). Durante la fase lag, el cultivo de Spirulina spp. se acopl a las condiciones establecidas, la tasa de crecimiento fue baja pero se increment paulatinamente con el tiempo de cultivo, comportamiento semejante al encontrado por Becker, (1982). En los ensayos experimentales, para valores de pH de 8,2 y 8,6, se presentaron fases de adaptacin ms prolongadas (aproximadamente de 15h) que la correspondiente al control (12h) (grfica 1). Esta conducta puede explicarse porque la Spirulina spp. se ve favorecida por alcalinidad relativamente alta (Tiboni, 1985), y en el caso especifico estudiado esta variable no fue suficientemente alta para favorecer el crecimiento. Por el contrario para los ensayos evaluados con un pH de partida de 9.0, 9.4 y 9.8 la fase de adaptacin fue menor, aproximadamente 8 h, 10 h y 9 h respectivamente, con respecto a la del control de 12 h (grfica 2); posiblemente porque las condiciones de alcalinidad favorecan de mejor manera el aumento progresivo de la biomasa. Para esta etapa es importante considerar el pH en el cual se presente un menor tiempo de adaptacin, con el fin de obtener un mayor rendimiento en el periodo productivo. Se ha asegurado que el intervalo ptimo de pH para una buena preservacin en la viabilidad de las clulas de Spirulina spp. en medio Zarrouk es de 9.4 10.3 (Monaselidze, 2002), sin embargo los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que a un pH inferior al intervalo anterior (pH 9.0), se obtiene la menor fase de adaptacin con respecto a los valores establecidos para otros ensayos y para el control (grfica 1). En el caso del ensayo a pH 10.2, se present la fase de adaptacin ms prolongada (18 h) con respecto a todos los ensayos y al control, resultado indicativo de que las condiciones muy alcalinas tampoco son favorables para el buen desarrollo del cultivo (grfica 2).

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pH 8,2 g/L 0,08 0,07 Biomasa (g/L) 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 0 5 10

pH 8,6 g/L

pH 9,0 g/L

Control g/L

15

20

25

30

35

Tiempo de Cultivo (horas)

Grfica 1. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 8,2-8,6-9,0-control (30 horas de cultivo).
pH 9,4 g/L 0,12 0,10 Biomasa (g/L) 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo de Cultivo (horas) pH 9,8 g/L pH 10,2 g/L Control g/L

Grfica 2. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayos a pH: 9,4-9,8-10,2-control (30 horas de cultivo).

El desarrollo de los cultivos en la fase exponencial, mostr una duracin que oscil entre los 21 das y 23 das aproximadamente, a excepcin del cultivo a pH 10.2 (16 das). En los ensayos con este ltimo pH, debido al rpido crecimiento durante el cultivo (tiempo de duplicacin: 4.68 h-1) con respecto al control, se observ aceleracin de la etapa endgena o muerte generada por una mayor produccin de desechos y de iones -OH que afectan la viabilidad celular de la Spirulina spp. lo que produce la muerte (Zambrano, 2005). Durante

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la fase exponencial se observ que la velocidad de crecimiento () y el tiempo de duplicacin (h-1) no presentaron diferencias significativas entre los ensayos experimentales realizados y el control (tabla 1). El comportamiento descrito anteriormente de la Spirulina spp. se evidencia tambin en la mxima biomasa alcanzada: los ensayos con pH de partida 8.2, 8,6 y 10.2 fueron menores al control; mientras que los ensayos a que iniciaron a pH 9.0, 9.4 y 9.8 presentaron

concentraciones de biomasa superiores a los ensayos iniciales y al control, (tabla 1). Lo anterior concuerda con estudios recientes en donde se optimizaron las condiciones

ambientales en el laboratorio dando como resultado un crecimiento de biomasa de 2.7 g/L (Rafiqul, 2005).
Tabla 1. Principales parmetros cinticos obtenidos del crecimiento de Spirulina spp. en los ensayos a diferentes pH

Ensayos pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control

Velocidad de crecimiento () 0,11 0,10 0,10 0,10 0,10 0,14 0,11

Tiempo de duplicacin (h-1) 5,92 6,52 6,61 6,66 6,66 4,68 6,17

Mxima biomasa (g/L) 1.58 1.77 2.01 2.27 2.30 1.81 2.06

En cuanto al valor del pH con respecto al tiempo, se observ en todos los ensayos realizados, que aument paralelamente al crecimiento de la cianobacteria, tendencia que tambin se evidenci en el control, as que existe una relacin directamente proporcional entre estas dos variables. De la misma forma se observ en el comportamiento de pH con respecto a la biomasa, tanto en los ensayos como en el control, en donde a medida que aumentaba la concentracin de la biomasa se incrementaba el valor de pH. Lo anterior puede explicarse por el tipo de metabolismo fotosinttico que tiene el microorganismo. Se cree (Berry, 2003) que Spirulina spp. libera grupos -OH al medio alcalinizndolo a lo largo de su crecimiento,

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esta alcalinidad protege el cultivo contra contaminacin por otros microorganismos y en especial de otras microalgas. De otro lado en los resultados obtenidos del anlisis estadstico entre las variables pH y biomasa, se determin que en el ensayo a pH 9,0 aunque no se obtuvo un factor de crecimiento muy alto, si se present el mayor grado de asociacin con respecto al coeficiente de correlacin (tabla 2), lo cual, al igual que la menor fase de adaptacin durante las 30 primeras horas, hicieron que fuera escogido para continuar con la segunda etapa experimental.
Tabla 2. Relacin entre factor de crecimiento y coeficiente de determinacin

Ensayos pH 8,2 8,6 9 9,4 9,8 10,2

Factor de crecimiento 1,8977 2,0945 2,4432 2,3468 3,1016 4,2421

Coeficiente de determinacin 0,987 0,9619 0,9772 0,9216 0,851 0,8508

En cuanto al porcentaje de bicarbonato consumido, se observ que los resultados de los ensayos llevados a cabo con pH iniciales de 9,0, 9,4 y 9,8 se semejaron a los del control (tabla 3). El consumo de bicarbonato en los cultivos con pH de partida 8,2 y 8,6 fue menor con respecto al control; posiblemente por la dificultad de Spirulina spp. para adaptarse rpidamente a tales grados de acidez, como se observ en las primeras 30 horas de cultivo (Falquet, 1996). Para el caso del ensayo con pH inicial de 10,2 el porcentaje de bicarbonato fue mucho menor (61%) que el control (74 %) lo que refuerza la idea de que a este pH la fase endgena fue acelerada por el exceso de alcalinidad.

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Tabla 3. Porcentaje de bicarbonato consumido por Spirulina spp. con diferentes valores de pH incial

Ensayos pH 8,2 pH 8,6 pH 9,0 pH 9,4 pH 9,8 pH 10,2 Control

Concentracin final de bicarbonato (mg/L CaCO3) 9316 9383 10175 10197 10224 8370 10229

Bicarbonato Consumido (%) por S. maxima 68 69 74 75 75 61 74

Segunda etapa experimental En esta etapa se evalu el comportamiento de Spirulina spp. en el ensayo a pH 9,0 +/-0.2 con adicin de CO2s, el cual fue elegido de la primera etapa experimental de acuerdo al crecimiento observado durante las 30 primeras horas, as como a su factor de crecimiento y coeficiente de correlacin como se mencion anteriormente. Cuando se incorpor CO2 de manera interrumpida al cultivo, se observ un aumento en la concentracin de biomasa con respecto al control (2,8g/L contra 2,1g/L respectivamente), sin embargo aunque no hubo una diferencia significativa en este parmetro (p>0.05), si se present en el tiempo de cultivo, el cual fue de 33 das para el control, mientras que el ensayo con adicin de CO2 continu su crecimiento hasta cuatro das despus de la cada del control sin entrar en fase estacionaria (grfica 3), lo que hace prever que si se hubiera seguido midiendo la cantidad de biomasa, sta habra presentado una mayor concentracin comparada con la del control. Este comportamiento indica que con la misma concentracin de bicarbonato inicial, se puede obtener una mayor productividad al adicionar CO2, lo cual resulta muy ventajoso si se piensa en una produccin a gran escala. (Contreras et al, 2003 ). Esta diferencia implica un mejor desempeo de la Spirulina spp. bajo la adicin de CO2, ya que ste es asimilado del medio durante su crecimiento, recuperndose rpidamente por la adicin de CO2 artificial, de manera que la fuente de carbono es abundante. El CO2 penetra en la clula del

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microorganismo haciendo que crezca de una manera ms constante comparada con el control. Sin embargo no todo el CO2 es retenido en el medio sino que es liberado a la atmsfera debido a su alta presin parcial (De Alava, et al., 1997).
pH 9,0 3,5 3 Biomasa (g/L) 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Tiempo De Cultivo (das) Control

Grfica 3. Produccin de biomasa (g/L) de Spirulina spp. en ensayo a pH 9,0 +/-0.2 con CO2 y control a pH 9,2 (37 das de cultivo)

As mismo, al evaluar el comportamiento del pH a lo largo de esta etapa se observ que este parmetro se mantuvo controlado, debido a la adicin de CO2; el valor permaneci entre 8,80 y 9.20. Esto se explica ya que la adicin de CO2 al cultivo implica que haya un descenso en el valor de pH, al disolverse el gas y reaccionar con el agua segn la reaccin: CO2(gas) + H2O(liq) (HO)2CO(disuelto) + H2O(liq) (HO)2CO(disuelto) H3O(+) (disuelto) + HOCOO(-)(disuelto)

La adicin de CO2 permite que haya un amortiguamiento en el aumento brusco del pH del medio, al mismo tiempo que el gas es asimilado por las clulas, sin afectar de el proceso de fotosntesis, el cual puede continuar permitiendo que se incrementen los valores de pH (De Alava et al., 1997). Por otro lado un factor importante a tener en cuenta en el desarrollo del cultivo fue la determinacin de clorofila producida durante el crecimiento de la Spirulina spp. Este parmetro puede estimarse en el anlisis de la biomasa producida por la microalga, puesto

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que es otro mtodo para su determinacin (Becker, 1982). El comportamiento de la clorofila tuvo un mayor incremento en el ensayo llevado a cabo con adicin de CO2 con respecto al control, puesto que la mxima concentracin de clorofila a alcanzada en el ensayo a pH 9,0 +/- 0.2, fue de 317 mg/L, mientras que para el control fue de 287 mg/L. De esta forma se observa que el ensayo con adicin de CO2 present un mayor incremento en la formacin de biomasa, factor que est directamente relacionado con la produccin de clorofila. Un factor adicional de importancia, al suministrar CO2 a los cultivos, es el aumento de rendimientos, ya que aunque conlleva un valor adicional, ste puede generar beneficios en la produccin que se van reflejar en los costos. El tiempo total de adicin de CO2 en los 37 das de cultivo fue de 40 minutos aproximadamente, lo cual indica que con una poca cantidad del gas se obtiene una muy buena productividad a nivel de biomasa, que es el principal objetivo cuando se hacen implementaciones a gran escala.

AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue realizado gracias a la valiosa colaboracin de Jaime Bernal director del Departamento de Qumica de la facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana y codirector de este proyecto, as como tambin a Claudia Zambrano directora del mismo. REFERENCIAS

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