NOTA IMPORTANTE: La entidad slo puede hacer uso de esta norma para si misma, por lo que este documento

NO puede ser reproducido, ni almacenado, ni transmitido, en forma electrnica, fotocopia, grabacin o cualquier otra tecnologa, fuera de su propio marco. ININ/ Oficina Nacional de Normalizacin

NORMA CUBANA

NC
ISO 7889:2009 (Publicada por la ISO en 2003)

YOGURT ENUMERACIN DE LOS MICROORGANISMOS CARACTERSTICOS TCNICA DEL CONTEO DE COLONIAS A 37 C (ISO 7889:2003, IDT)

Yogurt Enumeration of characteristic microorganisms Colony count technique at 37 C

ICS: 07.100.30

1. Edicin Febrero 2009 REPRODUCCIN PROHIBIDA

Oficina Nacional de Normalizacin (NC) Calle E No. 261 Vedado, Ciudad de La Habana. Cuba. Telfono: 830-0835 Fax: (537) 836-8048; Correo electrnico: nc@ncnorma.cu; Sitio Web: www.nc.cubaindustria.cu

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Prefacio
La Oficina Nacional de Normalizacin (NC), es el Organismo Nacional de Normalizacin de la Repblica de Cuba y representa al pas ante las organizaciones internacionales y regionales de normalizacin. La elaboracin de las Normas Cubanas y otros documentos normativos relacionados se realiza generalmente a travs de los Comits Tcnicos de Normalizacin. Su aprobacin es competencia de la Oficina Nacional de Normalizacin y se basa en las evidencias del consenso.
Esta Norma Cubana: Ha sido elaborada por el Comit Tcnico de Normalizacin NC/CTN 35 de Leche y Productos lcteos integrado por representantes de las siguientes entidades. Centro Nacional de Inspeccin de la Calidad (CNICA) Laboratorios CUBACONTROL S.A. Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos (INHA) Instituto de Investigaciones en Normalizacin ONN Centro nacional de higiene de los Alimentos (IMV) Oficina Nacional de Normalizacin Ministerio de la Agricultura Alimport - MINCEX Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Ministerio de Comercio Interior - MINCIN Unin Lctea MINAL y sus empresas lcteas. Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA)

Es una adopcin idntica por el mtodo de traduccin de la Norma Internacional ISO 7889: 2003 Yogurt. General guidance for the enumeration of characteristics microorganisms. Colony count technique at 37 C.

NC, 2009
Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de esta publicacin podr ser reproducida o utilizada en alguna forma o por medios electrnicos o mecnicos, incluyendo las fotocopias, fotografas y microfilmes, sin el permiso escrito previo de: Oficina Nacional de Normalizacin (NC) Calle E No. 261, Vedado, Ciudad de La Habana, Habana 4, Cuba. Impreso en Cuba. 2

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YOGURT ENUMERACIN DE LOS MICROORGANISMOS CARACTERSTICOS TCNICA DEL CONTEO DE COLONIAS A 37C 1 Objeto La presente norma especifica un mtodo para la enumeracin de los microorganismos caractersticos del yogur mediante el conteo de colonias a 37 C. El mtodo es aplicable al yogur, donde se encuentran viables los microorganismos Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus. 2 Referencias normativas

Las siguientes normas contienen disposiciones que, al ser citadas en este texto, constituyen disposiciones de esta Norma Cubana. Las ediciones indicadas estaban en vigencia en el momento de esta publicacin. Como toda norma est sujeta a revisin, se recomienda a aquellos que realicen acuerdos sobre la base de ellas que analicen la conveniencia de usar ediciones ms recientes de las normas citadas seguidamente. La Oficina Nacional de Normalizacin posee en todo momento la informacin sobre las normas internacionales, regionales y cubanas en vigencia. NC ISO 6887-1:2002, Microbiology of food and animal feeding stuffs-Preparation of test simples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspensions and decimal dilutions. ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs- General rules for microbiological examinations. ISO 8261/ IDF 122, Milk and milk products- General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination 3 Trminos y definiciones Los siguientes trminos y definiciones se aplican para los propsitos de este documento. 3.1 Microorganismos caractersticos del yogur

El Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y el Streptococcus thermophilus, son detectados bajo las condiciones especificadas en esta Norma Estndar Internacional. 3.2 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Microorganismo termfilo, que forma colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de dimetro desde 1 mm a 3 mm en el medio MRS acidificado, bajo las condiciones especificadas en esta norma. Nota: Al microscopio, estos microorganismos aparecen como bacilos, generalmente cortos, en ocasiones alargados. No forman esporas, son Gram positivos, no mtiles y catalasa negativos. 3.3 Streptococcus thermophilus

Microorganismos termfilos que forman colonias lenticulares de dimetro desde 1 mm a 2 mm en el medio M17, bajo las condiciones especificadas en esta Norma Estndar Internacional.

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Nota: Al microscopio, estos microorganismos aparecen como clulas ovoides o esfricas (de dimetro 0,7 m a 0,9 m), en pares o en cadenas largas. Son Gram positivos y catalasa negativos. 4 Principio Diluciones decimales de la muestra se inoculan en: a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubacin anaerbica a 37 C 1 C por 72 horas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. b) Medio M17 completo seguido por una incubacin a 37 C 1 C por 48 h para el conteo de Streptococcus thermophilus. 4.2 Las colonias son contadas y confirmadas mediante las pruebas apropiadas.

4.3 El nmero de microorganismos caractersticos por gramo de muestra es calculado a partir del nmero de colonias obtenidas en las placas cuyos niveles de dilucin muestren un resultado significativo. 5 Medios de cultivo, diluentes y reactivos Usar solo los reactivos de grado analtico reconocido especificados y agua destilada o desmineralizada o agua con pureza equivalente. Ver tambin ISO 6887-1 e ISO 8261 / IDF 122. 5.1 Diluentes Ver ISO 6887-1 e ISO 8261/ IDF 122 5.2 Medio de cultivo

Usar los medios M17 y MRS frescos, los cuales no debern exponerse directamente a la luz del sol. Si el medio de cultivo preparado no es usado inmediatamente, debe ser enfriado y almacenado de 2 a 4 C, no ms de una semana y bajo condiciones que no produzcan cambios en su composicin. En el caso de los reactivos ver las condiciones de almacenamiento en ISO 7218. 5.2.1 Medio MRS acidificado (Ver bibliografa [7])

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5.2.1.1 Composicin
Peptona 1 (digestin trptica de casena) Extracto de malta Extracto de levadura (seco) Glucosa (C6 H12 O6) Tween 80 (sorbitan mono-oleato) Ortofosfato hidrgeno de dipotasio (K2HPO4) Acetato de sodio trihidratado (CH3CO2Na 3H2O) Citrato de diamonio [C6H6O7 (NH4)2] Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O) Sulfato de manganeso tetrahidratado (MnSO4 4H2O) Agar Agua hasta 1)

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10,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 1,0 ml 2,0 g 5,0 g 2,0 g 0,2 g 0,05 g 1) 9,0 g a 18,0 g 1000 ml

Dependiendo de la fuerza de gel del agar, acorde con las instrucciones del elaborador.

5.2.1.2 Preparacin Disolver cada componente por separado en un bao de agua hirviendo (6.7). Enfriar en otro bao de agua a 50 C. Ajustar pH, tal que despus de la esterilizacin est en 5,4 0,1 a 25 C 1 C por adicin de cido actico (5.3.3) chequeando con el pH-metro (6.8). Transferir porciones de 100 ml de medio en frascos de 150 ml (6.10) o porciones 200 ml en frascos de 250 ml. Esterilizar 15 min en autoclave a 121 C 1 C. Nota 1. El MRS es altamente sensitivo al calor, el cual puede causar diferencias de acuerdo a la autoclave usada. Las pruebas comparativas han demostrado que el medio MRS comercial puede mostrar conteos ms bajos que los que muestra el medio MRS preparado acorde con esta norma. Esto puede causar problemas a los productores de yogur, por lo que las autoridades investigan el conteo celular mnimo en este producto. Antes del comienzo del examen bacteriolgico, mezclar completamente la cantidad del medio requerida en un bao de agua hirviendo (6.7). Enfriar en otro bao de agua (6.7). 5.2.2 Medio M17 (Ver bibliografa [8] 5.2.2.1 Medio Bsico 5.2.2.1.1 Composicin 2,5 g 2,5 g 5,0 g 5,0 g 2,5 g 19,0 g 0,2 g 0,5 g 9,0 g a 18,0 g 1) 950 ml

Peptona 1 (digestin trptica de casena) Peptona 2 (digestin peptdica de carne) Peptona 3 (digestin papaina de soya) Extracto de carne Extracto de levadura (seco) -glicerofosfato (sal disdica) (C3H7O6 PNa2) Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O) Acido ascrbico (C6 H8 O6) Agar Agua hasta

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5.2.2.1.2 Preparacin

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Disolver cada componente por separado en un bao de agua hirviendo. Enfriar en oto bao de agua (6.7) a 50 C. Ajustar el pH tal que despus de la esterilizacin est en 6,8 0,1 a 25 C 1 C por adicin de cido actico (5.3) chequeando con el pH-metro (6.8). Transferir porciones de 95 ml de medio en erlenmeyers de 150 ml (6.10). Esterilizar 15 min en autoclave a 121 C 1 C. 5.2.2.2 Solucin de lactosa 5.2.2.2.1 Composicin Lactosa (C12 H22 O11) Agua hasta 5.2.2.2.2 Preparacin Disolver la lactosa en agua. Diluir con agua a 100 ml. Esterilizar por 15 min en autoclave a 121 C 1 C. 5.2.2.3 Medio completo M17 10,0 g 950 ml

5.2.2.3.1 Composicin Medio Bsico (5.2.2.1) Solucin de lactosa 5.2.2.3.2 Preparacin 95,0 g 5,0 ml

Inmediatamente antes del uso, mezclar el medio bsico en bao de agua hirviendo (6.8). Enfriar en otro bao de agua (6.7) a 50 C. Precalentar la solucin de lactosa en bao de agua (6.7) a 50 C. adicionar la solucin de lactosa al medio bsico y mezclar agitando). Enfriar el medio en bao de agua entre 44 C y 47 C. Nota: El medio completo est disponible en el comercio, pero de manera similar al caso del MRS, los resultados pueden diferir significativamente de un suministrador a otro, esto puede causar problemas a los productores de yogur, por lo que las autoridades investigan el conteo celular mnimo en este producto. 5.3 5.3.1 Reactivos para el ajuste del pH Solucin de hidrxido de sodio: c(NaOH)= 0,1 mol/l aproximadamente.

5.3.2 Acido clorhdrico diluido: c (HCL)= 0,1 mol/l aproximadamente. 5.3.3 Acido actico: (CH3COOH), 100% (glacial). 5.4 5.5 Reactivos para tincin: solucin etanlica de azul de metileno, 6 g/l. Reactivos para limpieza de superficies: etanol 70 %.

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6 Equipos y cristalera

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La esterilizacin del equipamiento que est en contacto con la muestra, los diluentes, las diluciones o el medio de cultivo se realizar de acorde a los requerimientos de ISO 8261/ IDF 122. La cristalera deber ser resistente a esterilizaciones repetidas. Se emplear el equipamiento usual de laboratorio microbiolgico (ver ISO 7218) para la preparacin de las muestras y diluciones, como se especifica en ISO 8261/ IDF 122 y en particular lo siguiente. 6.1 Incubadora: capaz de operar a 37 C 1 C.

6.2 Cabina de incubacin anaerbica o jarra anaerbica: capaz de mantener la temperatura a 37 C 1 C, una atmsfera de 90 % de nitrgeno y 10 % de dixido de carbono. 6.3 Mezclador: tipo peristltico con bolsas plsticas estriles o rotatorio capaz de operar a una frecuencia mnima rotacional de 20 000 min-1, con tubos de centrfuga estriles de fondo redondo de 200 ml de cristal resistente o recipientes de metal con capacidad adecuada. 6.4 Agitador de tubos: por ejemplo un mezclador vortex. 6.5 Equipo contador de colonias: como se especifica en ISO 7218. 6.6 Lupas: aumento x 8 a x 10

6.7 Baos de agua: capaces de operar entre 44 C y 47 C, a 45 C 1 C, a 50 C 1 C, y de llegar a la temperatura de ebullicin. 6.8 pH-metro: preciso a 0,1 unidades de pH a 25 C 1 C (ver tambin ISO7218).

6.9 Frascos de dilucin: de capacidad 50 ml a 250 ml o tubos de dimetro y largo de 18 mm por 180 mm, con tapa de goma o material sinttico. 6.10 Frascos o recipientes: con tapa de goma o material sinttico de capacidad 150 ml a 250ml. 6.11 Tubos de ensayo: con tapas de goma, de capacidad de 20 ml, para conservar el medio de cultivo. 6.12 Pipetas graduadas: para uso bacteriolgico, esterilizadas y calibradas con capacidad de descarga de 1ml 0,02 ml y 10ml 0,2 ml (ver ISO 6887-1). 6.13 Placas petri: de cristal transparente o plsticas, de dimetro 90 mm y 140 mm, de profundidad interna de 10 mm como mnimo. El fondo de las mismas no deber presentar irregularidades que puedan interferir en el conteo de colonias. 6.14 Esptula: de cristal o metal esterilizadas. 7 Muestreo

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea realmente representativa y no haya sido cambiada o daada durante el transporte o almacenamiento. El muestreo no es parte del mtodo especificado en esta Norma Estndar internacional, un mtodo

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de muestreo recomendado se encuentra en ISO 707. 8 Preparacin de la muestra de ensayo

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Preparar la muestra de ensayo de acuerdo a ISO 8261. Tomar las precauciones siguientes antes de abrir la muestra de yogur. Limpiar la superficie externa alrededor del rea de donde ser tomada la muestra, para eliminar cualquier material que pueda contaminarla. El rea puede ser higienizada con etanol 70 % (5.5) para prevenir la contaminacin adicional. Abrir el recipiente aspticamente. 9 Procedimiento General

Para requerimientos generales, ver ISO 8261/ IDF122. Yogures no afrutados Mezclar cuidadosamente el contenido del recipiente de la muestra usando una esptula (6.14). Pesar 10 g 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible [utilizar un tubo de centrfuga de fondo redondo de cristal resistente de 200 ml, o la concavidad del mezclador rotatorio o el recipiente plstico del mezclador peristltico (6.3)]. Yogures afrutados Mezclar el contenido completo del recipiente de la muestra por 1 min, usando el mezclador (6.3). Pesar 10 g 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible como se describe en 9.1.2. Examen microscpico Realizar un examen microscpico preliminar, observando varios campos de un frotis de la muestra (captulo 8), previamente teida con azul de metileno (5.4), para estimar la densidad de los dos tipos de bacterias, cocos y bacilos y seleccionar el rango de dilucin apropiado que ser empleado para el conteo de cada tipo. Preparacin de la dilucin primaria Ver ISO 8261/ IDF 122. Las operaciones descritas en 9.3 a 9.6.4 no debern realizarse a exposicin de la luz solar. Adicionar el diluente (5.2) a la porcin de ensayo (9.1.2 o 9.1.3) hasta una masa de porcin de ensayo de 50 g. Mezclar por 1 min con el mezclador (6.3). Diluir a 100 g con el diluente para obtener una dilucin de 101. Preparacin de diluciones decimales Ver ISO 8261/IDF 122 Duracin del procedimiento Ver ISO 8261/IDF 122 Inoculacin e incubacin

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9.6.1 Transferir, por duplicado, 1ml de cada dilucin (que contiene el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus) a placas petri, con una pipeta estril (6.13). 9.6.2 Para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, verter 15 ml de medio en placas petri con el medio MRS acidificado (5.2.1) mantenido en bao de agua a 45 C (6.7) (6.13). 9.6.3 Para Streptococcus thermophilus, verter 15 ml en placas petri con el medio M17 (5.2.2), calentado en un bao de agua (6.7) a 45 C entre 44 C y 47 C (6.13). 9.6.4 Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio por rotacin de las placas petri (9.6.2 o 9.6.3). Colocarlas en una superficie fra horizontal para que se solidifique esta mezcla. 9.6.5 Incubar las placas petri en posicin invertida. Colocar no ms de 6 por pila. Las pilas de placas debern ser separadas unas de otras, de las paredes y del techo de la incubadora (6.1). 9.6.6 Las placas incubadas sern usadas para la enumeracin de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en una cabina de incubacin anaerbica o jarra anaerbica (6.2) en la incubadora (6.1) a 37 C por 72 h. 9.6.7 Las placas incubadas sern usadas para la incubacin de Streptococcus thermophilus en la incubadora (6.1) a 37C por 48 h. 9.7 Conteo de colonias 9.7.1 Despus del periodo de incubacin especificado (9.6.6 y 9.6.7), contar las colonias que muestren los rasgos de los microorganismos caractersticos [Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (3.2) y Streptococcus thermophilus 3.3)] en las placas que contengan de 15 a 300 colonias (ver anexo A).
Nota: Si ocurren problemas con el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus el medio MRS, el medio LBA 2) desarrollado por NIZO , puede ser usado; ver tambin Anexo A. 2 Nizo Food Research, Kernhemseweg 2, Postbus 20 6710 BA, Ede, The Netherlands.

9.7.2 Examinar las placas bajo condiciones de luz adecuadas, para facilitar el conteo puede emplearse el contador de colonias (6.5). No cometer errores al contar restos de partculas no disueltas o precipitadas de la muestra como colonias. Examinar las colonias dudosas cuidadosamente, empleando una lupa (6.6) del mayor aumento requerido para distinguir las colonias de partculas extraas. 9.8 Confirmacin Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el nmero tomado de las mismas sea igual a la raz cuadrada del conteo total de colonias. Teirlas empleando el mtodo de Gram y confirmar que las mismas, no forman esporas, son bacilos Gram positivos y catalasa negativos (en el caso del crecimiento de estas en el medio MRS), y cadenas de cocos Gram positivos, catalasa negativas (en el caso del crecimiento en el medio M17 (ver ISO 7218). La identificacin de cepas dudosas puede ser chequeada acorde a ISO 9232/IDF 146).

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10 Clculo y expresin de los resultados 10.1 Clculo

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10.1.1 Emplear el conteo de placas que contengan entre 15 y 300 colonias como se refiere en 9.7.1 o 9.7.2. 10.1.2 Calcular el nmero de cada microorganismo caracterstico en la muestra de ensayo usando la siguiente ecuacin: C

N=
Donde: N C n1 n2 d (n1+0,1 n2) d

es el valor numrico del nmero de microorganismos caractersticos por gramo de muestra de ensayo. es el valor numrico de la suma de colonias en todas las placas contadas (10.1.1); es el valor numrico del nmero de placas contadas usando la primera dilucin; es el valor numrico del nmero de placas contadas usando la segunda dilucin; es el valor numrico de la masa , en gramos, de la muestra de ensayo no diluida en la placa con la primera dilucin

Ejemplo: Una dilucin factor de 10-2 significa que 10-2 g o 10-2 ml de la muestra de ensayo no diluida (en estado diluido) ha sido puesta en la placa. Nota: La primera dilucin es la dilucin con el ms alto contenido de la muestra de ensayo. En el caso de tres diluciones, calcular el nmero de cada microorganismo caracterstico en la muestra de ensayo empleando la siguiente ecuacin. C N= (n1+0,1 n2+ 0,01 n3) d Donde: n3 es el valor numrico del nmero de placas contadas usando la tercera dilucin. 10.2 Expresin de los resultados 10.2.1 Redondear el resultado obtenido en 10.1.2 a dos cifras significativas. Para un nmero de tres cifras, redondear la tercera cifra al cero ms cercano. Si la tercera cifra es 5 , redondear a una cifra por debajo si la segunda cifra es par, y a la cifra por encima, si la segunda cifra es impar. Ejemplo: Redondear: 234 a 230 235 a 240 225 a 220 245 a 240

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10.2.2 Si hay solamente conteos menores de 10, reportar el nmero de microorganismos por gramo como: menor que 10 x 1/d (siendo d el valor correspondiente a la dilucin ms baja). 10.2.3 Si hay solo conteos que exceden las 300 colonias, hacer un conteo estimado de las placas que tengan un conteo ms cercano de 300 colonias y multiplicar por el recproco del valor correspondiente a la dilucin ms alta. Reportado como: nmero mnimo estimado por gramo 10.2.4 Los resultados debern ser expresados como un nmero de 1,0 a 9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada. 10.2.5 El nmero total de microorganismos caractersticos, N, por gramo de muestra es igual a: N= NL+ NS Donde: NL es el valor numrico del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo calculado en 10.1.2; NS el valor numrico del Streptococcus thermophilus, por gramo calculado en 10.1.2. 10.3 Ejemplos de clculos 10.3.1 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Asumir que en un conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se obtuvieron los siguientes resultados (fueron incubadas dos placas petri por dilucin): Dilucin 10 -5: 295 y 245 colonias; Dilucin 10 -6: 33 y 44 colonias; entonces C _______________ (n1 + 0,1 n2) d 295 + 245 + 33 + 40 _____________________ (2 + 0,1 x 2) 10-5 613 _____________ 2,2 x 10 -5

N=

N=

278,6 x 105

De acuerdo con 10.2.1, esto es igual a 280 x 10-5 por gramo. El nmero estimado de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, expresado en acuerdo con 10.2.4, es 2,8 107 . 10.3.2 Streptococcus thermophilus De manera similar para Streptococcus thermophilus, un nmero estimado de 4,9 x 108 por gramo de yogur fue obtenido.

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En adicin al nmero total de microorganismos caractersticos es igual a: N = (2,8x107) + (4,9 x 108)= 5,18 x 108 por gramo el cual redondeado segn 10.2.4 es: N = 5,2 x108 por gramo de muestra. 11 Precisin

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11.1 General Tomando una distribucin de los microorganismos en el sustrato, el lmite confiable de este mtodo vara de acuerdo al conteo de colonias examinadas de 16 % a 52 %. En la prctica a veces pueden ser encontradas mayores variaciones. En varios estudios de colaboracin de acuerdo a IDF 135, la desviacin estndar de la repetibilidad (sR) aparece como 0,20 unidades log y la desviacin estndar de la reproducibilidad aparece como 0,35 unidades log de acuerdo a ISO 5725-1 e ISO 5725-2. Ms informacin acerca del lmite confiable para la estimacin de pequeos nmeros microorganismos se muestra en ISO 7218. Nota IDF 135 es basada en ISO 5725. 11.2 Repetibilidad Las experiencias indican que si dos ensayos independientes con la misma muestra, frecuentemente excede la ms baja en 30 %, los procedimientos debern ser re-examinados para determinar las fuentes de error. 12 Reporte de ensayo El reporte de ensayo especificar: a) b) c) d) Toda la informacin requerida para el examen completo de la muestra; El mtodo de muestreo usado, si es conocido; El mtodo de ensayo empleado, con referencia a esta Norma Estndar Internacional; Todos los detalles de operacin no especificados en esta Norma, o considerados como opcionales, juntos con los detalles de algn incidente, el cual tenga influencia en el resultado (s); e) El resultado(s) de ensayo obtenido o si la repetibilidad ha sido chequeada, el resultado final de la repeticin obtenido.

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ANEXO A (informativo) Notas en procedimiento

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Cualquiera de los dos medio de cultivos recomendados (MRS acidificado y M17) es completamente selectivo. La mayora de las cepas no forman colonias visibles en el medio MRS acidificado en diluciones normalmente usadas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Sin embargo, cuando el nmero de lactobacilos en la muestra de yogur es considerado ms bajo que el nmero de estreptococos, diluciones bajas han sido usadas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Bajo estas condiciones, algunos S. thermophilus pueden formar colonias muy pequeas o de puntas de alfiler en las placas con el medio MRS acidificado, estas colonias pueden ser fcilmente diferenciadas a simple vista de las del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ( por ser de mayor tamao) y puede chequearse adicionalmente con el microscopio. Adems algunas cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus muestran un crecimiento pobre o nulo en MRS, esto dificulta algunas veces el conteo diferencial de este microorganismo. Cuando cepas de S. thermophilus crecen lentamente o no crecen, se recomiendan algunas condiciones especficas: -Incubacin a temperaturas ms altas (39 C a 42 C por 24 h aerbicamente); -Disminuir el contenido en -glicerofosfato; -Modificacin del pH; -Mucho cuidado en el proceso de agitacin Cuando las cepas del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crezcan muy lentamente o no crezcan, se recomiendan algunas condiciones especficas: -Incubacin por ms de 3 das, hasta 5 o 6 das; -Incubacin a temperaturas ms altas (40 a 42 C y 45 C por 48 h anaerbicamente); -Modificacin del pH; -Mucho cuidado en el proceso de agitacin Ambiente de gas (CO2 enriquecido, CO2 solo, etc.). Cuando el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crece anaerbicamente en yogur no puede ser enumerado en MRS. Este problema no ocurre cuando se usa el medio LBA (ver nota 9.7.1) bajo condiciones anaerbicas a 50 C 0,5 C por 72 h. Por otro lado el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, no forma colonias visibles en el medio M17, empleando las diluciones que normalmente se utilizan para el conteo de S. thermophilus. Esto confirma los hechos explicados anteriormente (ver referencia [9]). Algunas cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, pueden sin embargo formar pequeas colonias de puntas de alfiler en el medio M17, especialmente en muestras de yogur que presenten un mayo nmero de lactobacilos comparado con el nmero de estreptococos. Estas rugosas y pequeas colonias tienen usualmente un aspecto lanoso y pueden ser fcilmente distinguidas a simple vista (aun mejor con lupa) y chequeada adicionalmente al microscopio de las del S. thermophilus, las cuales son de mayor tamao. La seleccin del medio, la preparacin de la muestra, los procedimientos de incubacin y el conteo son los puntos ms crticos del ensayo. Una vez que los tcnicos se familiarizan con los mtodos, la precisin aumenta significativamente. Adems cepas de ensayo no apropiadas pueden ser usadas para probar la selectividad de las cepas, a partir de que las empleadas en yogur son numerosas y difieren de aquellas empleadas

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en los ensayos, de forma tal que algunas cepas de determinadas especies por ejemplo S. thermophilus, pueden crecer en medio selectivos para otras especies (por ejemplo Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus).

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Bibliografa

NC-ISO 7889:2009

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