ME- M- D001 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE EN LECHE Actualizacin 0: 17-FEB-14 Hoja De 1 4

1. OBJETO Este mtodo determina de forma visual y cuantitativa el tiempo de coagulacin de la leche al comparar una muestra con un estndar microbiolgico de actividad conocida. 2. DEFINICONES 2.1Coagulacin: Proceso por el cual una sustancia pierde su liquidez, tornndose similar a un gel en primera instancia y luego slida, sin experimentar un verdadero cambio de estado, mediante la intervencin de protenas especficas. 2.2 IMCU: unidades internacionales de coagulacin de leche por gramo o mililitro. 3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Solucin Stock de Cloruro de Calcio 500g/L 50 g/L 3.2 Solucin de acido actico 1M. 3.3 Acetato de Sodio trihidratado. 3.4 Agua desmineralizada. 3.5 Estndar de Microorganismo o agente coagulante. 3.6 Leche desgrasada, sin caloras en polvo y estril. 3.7 Pipetas volumtricas de 3ml y 0.5ml. 3.8 Beacker de 1000ml y 50ml. 3.9 Baln aforado de 2000ml, 1000ml y 50 ml. 3.10 Termmetro. 3.11 Cronmetro. 3.12 Estufa agitadora. 3.13 Bao de mara. 3.14 Balanza analtica. 4. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO 4.1 Preparacin de solucin buffer pH 5.5 3.1.1 Tomar un baln aforado de 1000ml y pipetear 10 ml de acido actico 1M, posteriormente agregar 10 g de acetato de sodio trihidratado. 3.1.2 Aforar hasta la marca con agua desmineralizada. El pH de esta solucin debe de ser 5.5.Esta solucin deber ser almacenada en un envase cerrado protegido de la luz directa y humedad bajo una temperatura de 15-25C. 4.2 Preparacin de Solucin de trabajo de Cloruro de Calcio 4.2.1 Pesar 2.70g de solucin stock de cloruro de calcio de concentracin 500g/L y agregarlo a un baln aforado de 2000ml y aforar con agua desmineralizada. La concentracin final de esta solucin deber ser de 0.5g/L (esta solucin debe ser preparada en fresco, es decir el da que ser utilizada y podr ser almacenada a 2-18 C). 4.2.3 Si parte de una solucin Stock de cloruro de calcio de concentracin 50g/L, medir 10 mL en un baln aforado de 1000ml y aforar con agua desmineralizada. La concentracin final de esta solucin ser de 0.5g/L (esta solucin debe ser preparada en fresco, es decir el da que ser utilizada y podr ser almacenada 2-18 C).

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4.3 Preparacin de solucin sustrato: 4.3.1 Pesar 110g de leche en polvo libre de grasa, caloras y estril. 4.3.2 Disolverlo en 100ml de solucin de trabajo de cloruro de calcio en un baln aforado de 1000ml. 4.3.3 Agregar 900ml de cloruro de calcio. 4.3.4 Agitar con agitador magntico por 30min evitando la produccin de espuma. Posteriormente incubar a temperatura ambiente en cuarto oscuro por 30 minutos. 4.4 Preparacin del Microorganismo Estndar: 4.4.1 Pesar 2.5g del estndar del microorganismo y diluirlo en 15 ml de solucin buffer en un baln aforado de 50ml. 4.4.2 Posteriormente aforar el baln con solucin buffer. 4.4.3 Pipetear 3ml de la solucin anterior a otro baln aforado de 50ml y aforar nuevamente con solucin buffer. 4.5 Preparacin de la muestra a evaluar: 4.5.1 Servir 3ml (presentacin liquida) o pesar de 3-5g (presentacin solida). 4.5.2 Posteriormente aforar el baln con solucin buffer. 4.5.3 Pipetear 3ml de la solucin anterior a otro baln aforado de 50ml y aforar nuevamente con solucin buffer. 4.5.4 Diluir la muestra con solucin buffer hasta lograr obtener un tiempo de coagulacin de la muestra similar al tiempo de coagulacin de el microorganismo estndar (la diferencia de aparicin de floculo entre el estndar y la muestra no deber sobre pasar de 40 segundos. Si ese fuera el caso se debern realizar varios ensayos alterando la cantidad de volmenes a analizar. 4.6 Determinacin de actividad de coagulacin o formacin del cuajo: 4.6.1 Pipetear 25 ml del sustrato y calentarlo por 12minutos en bao de mara a 32c agitando sin producir espuma. 4.6.2 Agregar rpidamente 0.5ml de la solucin estndar del microorganismo. Activar el cronometro al mismo tiempo sin dejar de agitar. 4.6.3 Observar la muestra y leer en el cronometro el tiempo exacto en el que es observado el primer floculo en el sustrato y anotarlo. 4.6.4 Realizar este procedimiento por duplicado. 4.6.5 Repetir este procedimiento sustituyendo los 0.5ml de la solucin estndar por 0.5ml de la muestra problema. 4.6.6 Realizar este procedimiento por duplicado. (Si la muestra presenta diferencia en 40 segundos, repetir el procedimiento aumentando o disminuyendo los volmenes; puede emplearse 10ml del sustrato y 0.2 ml de solucin estndar del microorganismo o 50ml del sustrato y 1.0ml de la solucin

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estndar del microorganismo, sin embargo es necesario mantener siempre el radio de dilucin de 50:1). 4.7 Realizacin de clculos: Los clculos de la actividad de coagulacin o cuajado de leche, sern determinados mediante la siguiente formula: At= Tst* 0.003* D*Ar Tmx

Donde: At= actividad total de la muestra en IMCU/g mL. Tst= tiempo en segundos de aparicin del floculo empleando el estndar 0.003= Constante de la ecuacin derivada de una simplificacin de la formula. D= dilucin empleada en la muestra problema.** Ar=potencia del estndar del microorganismo empleado (IMCU/g o ml). Tmx= tiempo en segundos de aparicin del floculo empleando la muestra problema. **Clculo de Dilucin de la muestra si se pesan 2.5 g: 50 x 50 = 333.33 2.5g 3ml 4.8 Reporte de resultados: Reportar resultados en RE-M-008 (Registro de anlisis microbiolgicos), en unidades internacionales de coagulacin de leche por gramo (IMCU/g.) 5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA 5.1 ISO 15174:2002 (E) 5.2 IDF 176: 2002 (E) 5.3 REM 008 Registro de anlisis microbiolgico. 5.4 Procedimiento para la elaboracin y control de documentos escritos (PR-A-001).

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