HPLC Araraquara 2012 Site

CONSELHO REGIONAL DE
QUMICA - IV REGIO (SP)

Ministrante: Guilherme Julio Zocolo
Doutor em Qumica Analtica - Unesp/Araraquara
Contatos: gjzocolo1@gmail.com
Araraquara, 15 de setembro de 2012
Princpios e Aplicaes da Cromatografia
Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
Apoio
Observao: A verso original desta apresentao, com slides coloridos, no formato
PDF, est disponvel na seo downloads do site do CRQ-IV (www.crq4.org.br)
facebook.com/crqiv twitter.com/crqiv
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rr
Lquida
de Alta Eficincia (HPLC)
rr
ss
oo
s s
de Alta Eficincia (HPLC)
s s
--
22
00
Dr. Guilherme Julio Zocolo
E mail: gjzocolo1@gmail com
00
11
22
E-mail: gjzocolo1@gmail.com
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal
Aplicaes da Cromatografia Lquida de Alta
Efi i i (HPLC)
MM
Eficincia (HPLC)
Toxicologia
ii
nn
ii
Toxicologia
Cosmticos
cc
uu
rr
HPLC
Frmacos
P ti id
rr
ss
oo
s s
HPLC
Pesticidas
Alimentos
s s
--
22
00
Protenas
Pr-requisito: a amostra deve ser solvel
00
11
22
Aminocidos
Pr requisito: a amostra deve ser solvel
na fase mvel
Corantes
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s
Solvente
Sistema de HPLC
s s
--
22
00
Coluna
Sistema
00
11
22
Injetor
de dados
Bomba
Detector
Descarte
Histrico
MM
Mikhael Semenovich Tswett (1906)
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Mikhael Semenovich Tswett (1906)
MM
Cromatografia
Cromatograma
ii
nn
ii
Mtodo cromatogrfico
B i ht d D t h B t i h G ll h ft
cc
uu
rr
Mtodo fsico-qumico de separao de
Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft
rr
ss
oo
s s
q p
componentes de uma mistura, que envolve a
distribuio diferencial destes em um sistema
s s
--
22
00
distribuio diferencial destes em um sistema
heterogneo bifsico:
1 - FASE ESTACIONRIA;
00
11
22
1 FASE ESTACIONRIA;
2 - FASE MVEL.
Evoluo das Tcnicas Cromatogrficas
MM
1906 Tswett CROMATOGRAFIAEMCOLUNA(CC)
g
ii
nn
ii
( )
extratosvegetais;colunac/CaCO
3
;terdepetrleo
1938 IzmailoveShraiber CROMATOGRAFIAEMCAMADADELGADA(CCD,TLC)
cc
uu
rr
extratosvegetais;placadevidroc/alumina
ERAdaCromatografiaModerna:PrmiosNobel 1937,1938,1939.
rr
ss
oo
s s
1941 MartineSynge CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)
1952 Martin e James CROMATOGRAFIA GASOSA (CG GC) s s
--
22
00
1952 MartineJames CROMATOGRAFIAGASOSA(CG,GC)
Dcadasde1960/1970
Karr Jentoft Gouwn Huber Hulsman Snyder e Kirkiland
00
11
22
Karr,Jentoft,Gouwn,Huber,Hulsman,SnydereKirkiland
CROMATOGRAFIALQUIDADEALTAEFICINCIA(CLAE,HPLC)
Mecanismo de separao cromatogrfica
MM
A separao cromatogrfica obtida a partir de interaes diferenciadas
entre os analitos componentes da mistura, fase estacionria e fase
mvel
ii
nn
ii
mvel.
cc
uu
rr
FASE MVEL
AMOSTRA
FM
FE
rr
ss
oo
s s
FASE
ESTACIONRIA amostra
s s
--
22
0000
11
22
CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
CROMATOGRAFIA:CLASSIFICAOPELAPOLARIDADEDA
FASE ESTACIONRIA
MM
FASEESTACIONRIA
ii
nn
ii
Cromatografia em FASE NORMAL: fase estacionria polar.
Ex.: slica gel
cc
uu
rr
Ex.: slica gel
O Si R OH
OR
rr
ss
oo
s s
Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa
OR
s s
--
22
00
Cromatografia em FASE REVERSA: fase estacionria de baixa
polaridade.
00
11
22
Ex. slica de fase ligada C18
FASE NORMAL: fase estacionria polar
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
00
O Si R OH
OR
00
11
22
OR
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rr
R = CN, Diol, Fenila, NH
2
X=Cl
rr
ss
oo
s s
Quando se utiliza silica-gel
derivatizada com grupos
s s
--
22
00
polares (fenila, ciano, amino,
diol), tais fases estacionrias
podem ser utilizadas tanto
para cromatografia em modo
00
11
22
para cromatografia em modo
normal (fase estacionria polar
eluente apolar) ou em fase
reversa (fase estacionria
apolar eluente polar).
Quim. Nova, Vol. 25, No. 4, 616-623, 2002
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s
Eluem primeiro as substncias
apolares que possuem uma menor
interao com a fase estacionria
s s
--
22
00
interao com a fase estacionria
polar.
00
11
22
Aplicvel a anlise de substncias insolveis em gua: leos,
p g ,
gorduras, lipdios. Destaca-se na separao de ismeros.
Fonte: Waters corporation
Mecanismo de separao cromatogrfica
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Fonte: Adaptado de Waters corporation
Caractersticas das FASES NORMAIS
MM
ii
nn
ii
Vantagens Desvantagens
1. Versatilidade na mudana de
seletividade alterando as fases mveis e
1. Amostras inicas so de difcil separao
e so mais viveis de se separar por fase
cc
uu
rr
seletividade alterando as fases mveis e
estacionrias
e so mais viveis de se separar por fase
reversa
2. Colunas estveis quando se utiliza
solventes no aquosos
2. Controle da fora de eluio menos
previsvel e mais demorado que em fase
rr
ss
oo
s s
solventes no aquosos
reversa
3. Uma grande variedade de substncias
orgnicas so mais solveis nos solventes
3 Pior resoluo
s s
--
22
00
usados em fase normal (til em LC
preparativa)
3. Pior resoluo
4. Decrscimo de presso menor devido 4. Ponto de ebulio reduzido pode gerar
00
11
22
p
baixa viscosidade dos solventes
p g
bolhas
5. til para amostras que possam se
decompor em solues aquosas
5. Alto custo dos solventes orgnicos
Fonte:Adaptado de CROMATOGRAFIA LIQUIDA MODERNA - HPLC/CLAE. LANAS, FERNANDO MAURO
decompor em solues aquosas.
Ganhos e Perdas em
MM
Ganhos e Perdas em
FASE NORMAL
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Fases mveis em Fase Normal
MM
Baixa (solvente A)
Hexano
Fora de Eluio
ii
nn
ii
Mdia
Clorofrmio, acetonitrila, tetrahidrofurano
cc
uu
rr
Forte (solvente B)
Isopropanol, metanol
rr
ss
oo
s s
Reteno aumenta com aumento da polaridade dos solutos.
s s
--
22
00
Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica
00
11
22
Picos assimtricos
cido actico ou frmico para cidos.
Amnia ou trietilamina para bases.
EFEITOS DA FASE MVEL EM FASE NORMAL
MM
Solvente fraco (A): no-polar
0 5 < k < 20
ii
nn
ii
Solvente forte (B): polar
0,5 < k < 20
cc
uu
rr
Seletividade () fortemente influenciada pela proporo do
solvente B utilizado na fase mvel.
rr
ss
oo
s s
Seletividade () ainda mais fortemente influenciada pelo tipo do
l t B tili d f l
s s
--
22
00
solvente B utilizado na fase mvel.
FE s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano
00
11
22
F.E.s (poder de reteno): slica > amino > diol > ciano
FE s (poder de separao): ciano > slica > diol > amino
F.E.s (poder de separao): ciano > slica > diol > amino
Efeitos da variao de solvente POLAR na separao
cromatogrfica
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
00
Condies
cromatogrficas
B: Acetato de etila
00
11
22
B: Acetato de etila
A Ciclohexano
Coluna de silica
150x4,6 mmx5 m
Vazo de 2 mL min
-1
Desenvolvimento de mtodo em FASE NORMAL
Estratgias
MM
A. Coluna Ciano (solvente A:
hexano; solvente B:
Estratgias
ii
nn
ii
;
propanol).
B. Verifique a presena de
d i
cc
uu
rr
cauda nos picos.
C. Mudar a proporo do
solvente B; substituindo
rr
ss
oo
s s
o tipo de solvente B
(diclorometano, ACN) e
sua proporo.Em ltimo
caso substitua o tipo de
s s
--
22
00
caso, substitua o tipo de
coluna (diol, amino,
slica).
D Oti i di d
00
11
22
D. Otimize as condies da
coluna (L; diametro da
particula e vazo da fase
mvel.)
)
Fase ligada amino (NH
2
)
MM
Anlise de esterides em sangue
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Fase ligada amino (NH
2
)
MM
Amostra de suco de frutas:
l j
ii
nn
ii
uva, tomate laranja...
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
FASE REVERSA
MM
Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18.
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Mecanismo de Interao em Fase Reversa
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s Interaes ANALITO X FE e FM X FM s s
--
22
00
Interaes ANALITO X FE e FM X FM
(em ordem decrescente de intensidade):
Van der Waals
00
11
22
Dipolo dipolo
Dipolo dipolo induzido
Dipolo induzido dipolo induzido
Interaes residuais: pte. H
FASE REVERSA:
Fase estacionria de baixa polaridade C2, C4, C8, C18
MM
R = C2, C4, C8 E C18
ii
nn
ii
C2=
cc
uu
rr
X=Cl
C4=
rr
ss
oo
s s
X=Cl
C8=
s s
--
22
00
C18=
00
11
22
Modo de HPLC mais utilizado (~80%): compostos no inicos,
compostos polares a mediamente apolares.
Cromatografia de Fase Reversa (FR)*
MM
FE menos polar que FM.
C l F R C18
ii
nn
ii
Coluna Fase Reversa C18:
Aplicao quase universal
(~ 70% das aplicaes na literatura)
cc
uu
rr
( p )
Permite anlise desde substncias hidrossolveis
e/ou inicas at substncias lipoflicas.
rr
ss
oo
s s
*Vantagens: *Vantagens:
s s
--
22
00
Vantagens: Vantagens:
- Equilbrio mais rpido
- Menor adsoro irreversvel
-gua no influi na reprodutibilidade
00
11
22
g p
-Stios de adsoro mais homogneos
-Eluio em gradiente facilitada
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
MM
Si O Si
Si O Si
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
ii
nn
ii
Si O Si
Si O Si
RP 8, C 8
Fenil
TMS C 1
cc
uu
rr
Si O Si
TMS, C-1
SOLVENTES MAIS COMUNS:
gua
ORDEM DE ELUIO
(crescente)
rr
ss
oo
s s
- gua
- Acetonitrila (ACN)
- MeOH
- Tetraidrofurano (THF)
(crescente)
POLAR APOLAR
s s
--
22
0000
11
22
Cromatografia de Fase Reversa (FR)
FE menos polar que FM
MM
Fraco (solvente A) gua
FE menos polar que FM.
ii
nn
ii
Forte (solvente B)
Metanol, Acetonitrila,
Tetrahidrofurano
cc
uu
rr
Tetrahidrofurano
Nomograma
rr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Agentes de supresso inica melhoram a resoluo cromatogrfica
MM
R-COOH R-COO
-
+ H
+
pKa 4-5
u-OH u-O
-
+ H
+
pKa 10-12
ii
nn
ii
Picos assimtricos
cido actico ou frmico para cidos.
trietilaminaparabases.
cc
uu
rr
trietilamina para bases.
Coluna: BONDAPAK C18
O OH O OH
OH
OH
9. c. ferlico
O OH
Amostras de cidos carboxlicos fenlicos
rr
ss
oo
s s
30 cm X 3,9 mm
FM: gua, com 5% HOAc
Deteco: UV 254nm
Tempo: 30 min.
OH
O
OH
HO
s s
--
22
00
O HO
O OH
O OH
OH
1. cido glico 2. c. protocatecuico
3. c. p-OH-benzico
8. c. o-coumrico 10. c. cinmico
OH
OMe
4. d-Catequina
00
11
22
OH O
OH O
O HO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
6. c. saliclico
5. c. cafeico
7. c. p-coumrico
Aplicao: antidepressivos tricclicos
FASE REVERSA (C18)
MM
Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm
FM: ACN/Tampo 30:70 + 0,2% TEA e
0,2% TFA
( )
ii
nn
ii
O
Tampo Fosfato 25 mM pH 2,5
Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV
cc
uu
rr
O
N
rr
ss
oo
s s
N
C H
3
CH
3
NH
C H
3
CH
4
1 2
s s
--
22
00
N
CH
3
00
11
22
N
C H
3
CH
3
N
C H
3
CH
3
3 4
Aplicao: anlise de tocoferis
FASE REVERSA (C18)
MM
FASE REVERSA (C18)
ii
nn
ii
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm
FM: MeOH a 1,0 mL/min
Detector: UV (
e
: 295 nm)
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
1 o tocoferol
cc
uu
rr
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
1. o-tocoferol
rr
ss
oo
s s
O H
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
3
CH
3
CH
3
2. |-tocoferol
s s
--
22
00
O
CH
3
CH
3
CH
3
3 3
CH
3
C H
3
3. o-tocoferol (vitamina E)
CH
3
00
11
22
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
C H
3
O
4 Vitamina E - acetato
4. Vitamina E - acetato
Aplicaes das Principais Fases Estacionrias
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
FASEESTACIONRIA(NormaiseReversas)
MM
COLUNASCROMATOGRFICAS
ii
nn
ii
tubo:aoinoxidvel316tratado;contmFE
*colunascapilaresenano:tubosdeslicafundida
cc
uu
rr
Coluna guarda (pr-coluna): C18 (5 m)
rr
ss
oo
s s
Coluna analtica:
C-18 250 x 4,6mm x 5m
s s
--
22
00
Coluna semi-preparativa:
C-18 250 x 21,2mm x 10m
00
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
1/37
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Cavalheiro,A.J.IQUNESP
Otimizao dos parmetros envolvidos na
separao cromatogrfica
MM
p g
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
CLCULO DO FATOR DE RETENO (k)
MM
( )
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Equao de Purnell:
A Equao Fundamental da Resoluo em HPLC
MM
Resoluo (Rs)
ii
nn
ii
'
.
) 1 (
.
2
=
k N
Rs
o
cc
uu
rr
) 1 ' ( 4
2
+ k o
rr
ss
oo
s s s s
--
22
00
EFICINCIA
Depende da
configurao
do sistema
00
11
22
SELETIVIDADE RETENO
Dependem das caractersticas da
FATORES FSICOS
1/37
Dependem das caractersticas da
FM e FE do sistema
FATORES QUMICOS
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Efeito da concentrao de metanol no tempo de reteno de
compostos analisados
compostos analisados
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
EfeitodaSeletividade()sobreR
s
MM
2.MudanasnaFE
geralmenteacompanhadapormudanasnaFM
ii
nn
ii
Ex.FE
inicial
=Metil;FE
alternativas
=C8,C18
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
3 Mudanas na temperatura
EfeitodaSeletividade()sobreR
s
MM
3. Mudanas na temperatura
1 C k de 1-2%
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Journal of Chromatography A Volume 814, Issues 12, 24 July 1998, Pages 97104
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Volume de Injeo x Mxima Resoluo
MM
Para evitar a saturao dos stios de interao da coluna, o que pode
causar uma piora na resoluo cromatogrfica , no se deve injetar um
l i 1% d l d l i
ii
nn
ii
volume maior que 1% do volume da coluna vazia.
Clculo do volume mximo
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
dxL, onde d=dimetro em mm e L=comprimento da
l
coluna em cm
Otimizao Cromatogrfica
MM
Modos de eluio em Cromatografia Lquida
ii
nn
ii
Isocrtico
Gradiente
%B %B
cc
uu
rr
tempo tempo Teq.
Teq.
rr
ss
oo
s s
k = (t
R
t
m
)/t
m
+ %B | k
| k | t
k* = (20.F)/(V
m
.%/min)
+ %/min | k*
| k* | t
s s
--
22
00
| k | t
R
| t
R
|W e + Int.
| k* | t
R
| t
R
|W e + Int.
00
11
22
Otimizao Cromatogrfica
M d I ti G di t ?
MM
Modo Isocrtico ou Gradiente?
Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:
ii
nn
ii
Gradiente exploratrio utilizado para testes iniciais:
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 mm
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN 60
cc
uu
rr
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Amostra: < 50 uL; 50-100 mg
(0 5 - 1 mg/mL) rr
ss
oo
s s
Modo Isocrtico possvel
tr/tg < 0 25 1 < k < 10
Modo gradiente ser
i
(0,5 1 mg/mL)
s s
--
22
00
tr/tg < 0,25 1 < k < 10
tr/tg < 0,40 0,5 < k < 20
necessrio se:
tr/tg > 0,40
00
11
22
Onde tr = tr do ltimo pico - tr do primeiro pico
/tg = tempo total de gradiente exploratro
FASE REVERSA C-18 - AVALIAO DA AMOSTRA
GRADIENTE EXPLORATRIO
MM
Modo Isocrtico possvel
Atr/tg < 0,25 1 < k < 10
Atr/tg < 0,40 0,5 < k < 20
Amostra muito retina, muito apolar
Usar THF ou fase reversa no aquosa (NARP)
ii
nn
ii
Usar THF ou fase reversa no-aquosa (NARP).
Usar coluna menos lipoflica.
cc
uu
rr
Modo gradiente ser necessrio
Atr/tg > 0,40
rr
ss
oo
s s
Amostra muito polar.
cidos/Bases/Aucares
Controlar pH, fora inica.
on-par. Troca nica.
s s
--
22
00
Amostra complexa
Coluna RP C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
00
11
22
Amostra complexa
Gradiente Linear: 5 a 100 % de ACN, 60
Fluxo: 2,0 mL/min.
Detetor: DAD ou 254 nm
Amostra: < 50 L; 50 100 g
Amostra: < 50 L; 50-100 g
(0,5 - 1 mg/mL)
Amostra fcil modo isocrtico possvel
MM
At
R
/t
G
= (24 19)/60 = 0,083 < 0,25
t 19 i t 24 i
ii
nn
ii
t
Rp
= 19 min. t
Ru
= 24 min.
Gradiente Exploratrio
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2 0 mL/min
cc
uu
rr
Eluio isocrtica possvel
1 < k < 10
2,0 mL/min.
rr
ss
oo
s s
k = 7 %ACN = 1 7 t
R
= 1 7 24 = 40 8 % k = 20 %ACN = 1 7 t
R
- 10 = 30 8 %
s s
--
22
00
k
u
7 % ACN 1,7.t
Ru
1,7.24 40,8 %
ACN/gua 40:60
k
u
20 % ACN 1,7.t
Ru
10 30,8 %
ACN/gua 30:70
00
11
22
Resoluo satisfatria CAVALHEIRO, A.J. (IQ-UNESP)
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - I
MM
At
R
/t
G
= (24 9,5)/60 = 0,24 < 0,25
t = 9 5 min t = 24 min
ii
nn
ii
El i i ti l
t
Rp
= 9,5 min. t
Ru
= 24 min.
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
2,0 mL/min.
cc
uu
rr
1 < k < 10
rr
ss
oo
s s
k
u
= 7 % ACN = 1,7.t
Ru
= 1,7.24 = 40,8 % k
u
= 20 % ACN = 1,7.t
Ru
- 10 = 30,8 %
s s
--
22
00
ACN/gua 40:60 ACN/gua 30:70
00
11
22
Resoluo insatisfatria
Amostra mais difcil modo isocrtico possvel - II
Otimizao da FM
MM
Otimizao da FM
Gradiente Exploratrio 1
1
ii
nn
ii
8
k
u
= 7 k
u
= 20
ACN/gua 40:60
2
ACN/gua 30:70
3
cc
uu
rr
2 3
8
ACN
ACN/MeOHgua 6 ACN/MeOHgua 7
rr
ss
oo
s s
6 7 9
ACN/MeOH
4
20:25:55
5
15:20:65
s s
--
22
00
4 5 10
MeOH
MeOHgua 50:50
4
MeOHgua 40:60
5
00
11
22
%MeOH = 1,22 + 1,37(%ACN) - 0,004(%ACN)
2
ACN/MeOHgua
23:30:47
J. Chromatogr. A, 721:15 1996.
Amostra mais difcil modo gradiente - I
MM
At
R
/t
G
= (23 2)/60 = 0,35 < 0,40
ii
nn
ii
t
Rp
= 2 min. t
Ru
= 23 min.
0,5 < k < 20
C18, 150 x 4,6 mm, 5 m
5 a 100 % de ACN, 60
cc
uu
rr
Modo gradiente
2,0 mL/min.
rr
ss
oo
s s
Modo gradiente
%I
ACN
= 1,65.t
Rp
9 = 1,65.2 9 = -5,7 0%
%F
ACN
= 1,65.t
Rp
+ 10,3 = 1,65.23 +10 = 48%
% / i 48/10 4 8 k* 20 F/(V % i ) 8 3 % / i 48/30 1 6 k* 20 F/(V % i ) 12 5 s s
--
22
00
%
ACN
/min = 48/10 = 4,8 k* ~ 20.F/(V
m
.%min) ~ 8,3 %
ACN
/min = 48/30 = 1,6 k* ~ 20.F/(V
m
.%min) ~ 12,5
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30
o
C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60
o
C
00
11
22
Resoluo insatisfatria
Amostra mais difcil modo gradiente - II
MM
ii
nn
ii
k* = 5 k*= 17
Ajustar % I e % F
cc
uu
rr
2 3
8
35
o
C
5 %/min 1,6 %/min
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 30
o
C
0 a 47 % de ACN, 30
2,0 mL/min. - 60
o
C
rr
ss
oo
s s
6 7 9
0 a 47 % de ACN, 10
2,0 mL/min. - 60
o
C
0 a 47 % de ACN, 36
2 0 mL/min - 60
o
C
s s
--
22
00
4 5 10
65
o
C
,
2,0 mL/min. - 60 C
00
11
22
0 a 47 % de ACN, 72
2,0 mL/min. - 60
o
C
Col. 30 cm - 3,5 m
Gradiente - Otimizao
1 Aj % i i % i
MM
1. Ajustar % Inicial e % Final de B
2. Otimizar k* (considerar t
G
)
3. Verificar influncia do solvente B
ii
nn
ii
4. Avaliar influncia da temperatura
5. Ajustar configurao da coluna
6 O t i i
cc
uu
rr
6. Outras variveis
Ajustar % Inicial e % Final de B
Mistura de Herbicidas: 9 fenilurias e 6
s-triazinas (J. Chromat. , 261:329 1983)
rr
ss
oo
s s
0-100% MeOH
50 min. (2%/min.)
40-100% MeOH
30 min. (2%/min.)
60-100% MeOH
20 min. (2%/min.)
s s
--
22
00
50-100% MeOH
25 min. (2%/min.)
50-70% MeOH
10 min. (2%/min.)
50-80% MeOH
15 min. (2%/min.)
00
11
22
MM
2 Oti i k* ( id t )
ii
nn
ii
G
)
cc
uu
rr
6. Outras variveis
rr
ss
oo
s s
Verificar influncia do solvente B
Col.: C18 - 10 m
30 x 0,42 cm
1 mL/min - t.a.
Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)
s s
--
22
00
100
% ACN
100
% MeOH
10
% MeOH
20
% ACN
Mistura de fenis (J. Chromatogr., 214:35 1981)
00
11
22
0
60 min. tempo
0
60 min. tempo
0
60 min. tempo
MM
G
)
ii
nn
ii
cc
uu
rr
Aj t fi d l
rr
ss
oo
s s
Ajustar configurao da coluna: comprimento, partcula, fluxo
25 cm - 10 m
2 mL/min - 1040 psi
25 cm - 10 m
1 mL/min - 520 psi Coluna C18 d.i. 0,46 cm
FM: 40 a 77% MeOH a 0,7%/min
Rs = 1,1 Rs = 1,3
s s
--
22
0000
11
22
Mistura de Herbicidas:
9 fenilurias e 6 s-triazinas
50 cm - 10 m
2 mL/min - 2080 psi
25 cm - 5 m
1 mL/min - 2080 psi
Rs = 1,5 Rs = 2
9 fenilurias e 6 s triazinas
(J. Chromat. , 261:329 1983)
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
PermitemvenceraresistnciapassagemdaFMexercidapelaspartculasdaFE.
Funo:proporcionarfluxoconstanteereprodutveldeFMatodoosistema.
ii
nn
ii
u o p p p
CARACTERSTICASDESEJVEIS:
cc
uu
rr
composiodaFMefluxoprecisoseexatos
vazocontnuaelivredepulsaes
rr
ss
oo
s s
respostarpidaaalteraesnofluxoecomposiodaFM gradientedeeluio!!
pressomxima:700atm(10.000psi)
s s
--
22
00
maiorparteconstrudaemaoinox316;outrosmateriais:titnio,peek,teflon
inrciaqumicaasolventescomuns
00
11
22
manutenosimples
reservatriodesolventeilimitado
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
BOMBASDEVOLUME(FLUXO)CONSTANTE
ii
nn
ii
BombasmaisutilizadasemCLAE
Vantagem:
cc
uu
rr
Capacidadederepetiodosvolumesoufluxose,consequentemente,das
reasdospicos,mesmocommudanasnaviscosidadedaFMoubloqueioda
colunaporpartculas.
rr
ss
oo
s s
p p
s s
--
22
0000
11
22
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
ii
nn
ii
BOMBADOTIPOSERINGA
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Conselho Regional de Qumica IV Regio (SP) Apoio: Caixa Econmica Federal Lanas,2009
Collins;Braga;Bonato,2006
BOMBASDEALTAPRESSO
MM
BOMBA DO TIPO PISTO RECIPROCANTE OU ALTERNANTE
ii
nn
ii
BOMBADOTIPOPISTORECIPROCANTEOUALTERNANTE
cc
uu
rr
pistoconectadoaomotorpormeio
deengrenagense1EXCNTRICO
rr
ss
oo
s s
escoamvolumesconstantesdeformanocontnuaoupulsante
bomba mais empregada em CLAE at almente
s s
--
22
00
bombamaisempregadaemCLAEatualmente
adequadaparapresseselevadas
00
11
22
reservatriodeFM:ilimitado
movimentosdopistonacmarageramPULSOS
aplicaes:CLAEanalticaepreparativa
Lanas,2009
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
INJETORES MANUAIS
MM
INJETORESMANUAIS
amostradeveseraplicadanacolunapressurizadanaformadeumabandaestreita
ii
nn
ii
vlvuladeintroduodeamostramaiscomum:vlvulade6prticos(orifcios)
aladeamostragemouloop:comprimentoedimetrointernodefinemseuvolume
loop para escala analtica
(L)
cc
uu
rr
( )
rr
ss
oo
s s
loop para escala preparativa
(mL)
s s
--
22
0000
11
22
http://www.restek.com/hplcsixport/6_Port_Injector_content.html
SISTEMASDEINTRODUODEAMOSTRAS(INJETORES)
MM
INJETORESMANUAIS
VISOESQUEMTICADOFUNCIONAMENTODAVLVULADE6PRTICOS
ii
nn
ii
sada da amostra
POSIODECARGA
LOAD
cc
uu
rr
entrada da amostra
sada da amostra
ala de amostragem (loop)
2
3
rr
ss
oo
s s
entrada do eluente
1
4
6
s s
--
22
00
coluna
5
1
2
3
4
6
00
11
22
4
5
6
1/37
POSIODEINJEO
INJECT
DETECTORES
MM
Funo do detector: identificar a presena de substncias de
interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica
ii
nn
ii
interesse que estejam eluindo da coluna cromatogrfica.
Caracterstica desejveis:
cc
uu
rr
- alta sensibilidade e baixo limite de deteco
- ampla faixa de linearidade
rr
ss
oo
s s
- confivel e reprodutvel
-fcil de operar e manter
-informao qualitativa e quantitativa
s s
--
22
00
informao qualitativa e quantitativa
-no destruio do soluto
-insensibilidade a mudanas na FM e de T
t id li lt d t d l t
00
11
22
- resposta rpida e linear a alteraes das concentraes dos solutos
-baixo nvel de rudo
CLASSIFICAO
MM
De acordo com as propriedades medidas:
Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de
ii
nn
ii
Detectores de propriedades do eluente: medem a variao de
propriedades do eluente (ex. constante dieltrica)
Detectores de propriedades do analito: medem propriedade fsica ou
qumica do analito (ex fluorescncia)
cc
uu
rr
qumica do analito (ex. fluorescncia)
De acordo com o tipo de resposta:
Detectores sensveis concentrao: resposta proporcional
rr
ss
oo
s s
etecto es se s e s co ce t ao esposta p opo c o a
concentrao de um componente no eluente (ex. UV, fluorescncia).
Detectores sensveis ao fluxo de massa: resposta proporcional
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
s s
--
22
00
quantidade de massa do componente da amostra que chega ao detector
por unidade de tempo (ex. eletroqumico, espalhamento de luz).
De acordo com a seletividade:
00
11
22
Detectores universais
Detectores seletivos
Detectores especficos
Detectores especficos
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTORESBASEADOSNAABSORODELUZ
MM
C O S S OS SO O U
UV/VIS
ii
nn
ii
Faixas de utilizadas:
Ultravioleta: 190 - 400 nm
cc
uu
rr
Visvel: 400 - 800 nm
Espectro eletromagntico
rr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
1/37
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
1/37
DETECTORES
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTORES
MM
LEI DE LAMBERT-BEER
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s
Leitura = Unidade de Absorbncia (UA)
1 UA = Depreciao da luz incidente em 90 %
s s
--
22
00
Comprimento de onda
S l t
mximo
00
11
22
Solvente
pH
mximo
Temperatura
> Sensibilidade
DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODEONDAFIXO
MM

ii
nn
ii
cc
uu
rr

rr
ss
oo
s s
s s
--
22
00
00
11
22

DETECTORNOUV/VISDECOMPRIMENTODE
MM
ONDAVARIVEL
ii
nn
ii
cc
uu
rr

rr
ss
oo
s s
s s
--
22
00
Lmpadas: deutrio UV
00
11
22
Lmpadas: deutrio UV
tungstnio - visvel
DETECTORNOUV/VISCOMARRANJODE
MM
/
FOTODIODOS(DAD)
ii
nn
ii
arranjo de diodos: srie de fotodiodos posicionados lado a lado num cristal de
silcio de modo que cada difratado pela grade atinja um diodo.
cc
uu
rr
a absorbncia de uma amostra pode ser determinada em todos os de modo
simultneo.
rr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTOR DETECTOR - -UV/VIS UV/VIS
MM
Qual o comprimento de onda ideal para a
ii
nn
ii
anlise quantitativa ?
cc
uu
rr
223 252 280
OH OH
O O
500
mAU
rr
ss
oo
s s
215 nm
223 nm 252 nm 280 nm
300
s s
--
22
00
100
250 300 350
nm
00
11
22
== >> c = c = > sensibilidade > sensibilidade
max max
c c sensibilidade sensibilidade
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DetectorEletroqumico
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTORES
MM
Espectrmetrosdemassas(HPLCMS/MS)
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
DETECTORES
MM
Comparaodarespostadealgunsdetectores
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Algumas Dicas
MM
Algumas Dicas
TAMPES EM CLAE
ii
nn
ii
< 3,1 2,1
H
3
PO
4
/KH
2
PO
4
ou K
2
HPO
4
210 nm (0,1%) 1,5-2,5 >> 2
cido Trifuoractico (TFA)
UV limite Faixa pK
a
Tampo
cc
uu
rr
230 nm (10 mM) 2,1-6,4
3,1
4,7
cido ctrico/K
3
citrato
< 200 nm (0,1 %) 6,2-8,2
11,3-13,3
7,2
12,3
rr
ss
oo
s s
< 200 nm (10 mM) 5 4 7 4 6 4
KHCO ou K CO /cido actico
210 nm (10 mM) 3,8-5,8 4,8
cido actico/Acetato de K
210 nm (10 mM) 2,8-4,8 3,8
cido frmico/Formiato de K
5,4
s s
--
22
00
215 nm (10 mM)
225 nm (10 mM)
5,8-7,8
8,0-10,0
6,8
9,0
Bis-tris propano.HCl/Bis-tris propano
< 200 nm (10 mM) 5,4-7,4
9,3-11,3
6,4
10,3
KHCO
3
ou K
2
CO
3
/cido actico
00
11
22
< 200 nm (10 mM) 10 0-12 0 11 0
Et N HCl/Et N
215 nm (10 mM) 9,1-11,1 10,1
1-Me-Piperidina.HCl/1-Me-Piperidina
200 nm (10 mM) 8,2-10,2 9,2
NH
4
Cl/NH
3
205 nm (10 mM) 7,3-9,3 8,3
Tris.HCl/Tris
< 200 nm (10 mM) 10,0-12,0 11,0
Et
3
N.HCl/Et
3
N
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Algumas Dicas
MM
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Algumas Dicas
MM
T ( i ) % H O % M OH
Gradiente otimizado
ii
nn
ii
Tempo (min) % H
2
O % MeOH
0 70 30
15 35 65
Tempo de equilbrio de 3 min
cc
uu
rr
17 0 100
20 70 30
25 70 30
rr
ss
oo
s s
Tempo de equilbrio de 8 min
Fique atento ao tempo
de equilbrio da sua coluna
s s
--
22
00
cido cetico 0,1 % foi usado como
supressor inico
00
11
22
O d f HPLC
MM
O que voc no deve fazer em HPLC
ii
nn
ii
cc
uu
rrrr
ss
oo
s s s s
--
22
0000
11
22
Agradecimentos
MM
Agradecimentos
Ao Conselho Regional de Qumica - CRQ-IV
ii
nn
ii
g
Aos Participantes do Curso
cc
uu
rr
Contato
Guilherme Julio Zocolo
rr
ss
oo
s s
E-mail: gjzocolo1@gmail.com
s s
--
22
00
Quaisquer dvidas estarei sempre a
disposio
00
11
22
Minicursos CRQIV Princpios da HPLC

Apoio Caixa Econmica Federal

Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

Dinmica 1

1. O entendimento do processo cromatogrfico e dos fatores de reteno (k), seletividade () e
eficincia (N) fundamental para o desenvolvimento racional de um mtodo cromatogrfico.
Assim sendo, explicar objetivamente:

a) O que fora de eluio e qual a sua influncia na distribuio de cada componente
de uma mistura de substncias orgnicas entre as fases estacionria (FE) e mvel
(FM);

b) O que seletividade cromatogrfica? Cite exemplos de solventes e adsorventes com
seletividades diferentes.

c) O que eficincia cromatogrfica?

2. Quais as vantagens e desvantagens do uso dos modos de eluio isocrtico e gradiente?

3. Para avaliar a qualidade de uma coluna de CLAE, quais parmetros (cite pelo menos trs)
devem ser freqentemente monitorados e o que eles podem indicar?

Minicursos CRQIV Princpios da HPLC

Apoio Caixa Econmica Federal

Princpios da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

Dinmica 2

1. a. Qual a caracterstica mais importante de um detetor em sistema de cromatografia
lquida? Por que? Quais detetores satisfazem essa caracterstica?

b. Considerando sensibilidade e seletividade, que detetores seriam mais indicados
para analise quantitativa em CLAE das misturas abaixo:

I. lcoois e aminas saturados industria de alimentos.

II. Antioxidantes polifenlicos presente em medicamentos fitoterpicos.

III. Hidrocarbonetos policclicos aromticos presentes na fuligem resultante
da queima da cana-de-acar amostra ambiental concentraes
na ordem de ng mL
-1
(ppb)

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