Prctica No.

1 Mtodos de Cuantificacin de Protenas

Universidad Autnoma de Nuevo Len Facultad de Ciencias Qumicas

Qumico Farmacutico Bilogo

Prcticas de Bioqumica
Dr. Isaas Balderas Rentera Grupo: 01 Equipo: 06

Prctica # 1 MTODOS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Integrantes: Anah Carrillo Aguirre Erika Leticia Castillo Gonzlez Santiago Roel Hernndez Quezada

1532099 1546583 1519613

Fecha de Realizacin de Prctica: Mircoles, 12 de febrero de 2014. San Nicols de los Garza, N.L. Fecha de Entrega: Mircoles, 19 de febrero del 2014.

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Introduccin Sabiendo que las macromolculas protenas son destacadas por sus funciones y estructuras. Son esenciales para la vida. Dado por entendido la importancia de las protenas en el mundo Bioqumico se vuelve esencial explorar las alternativas que hay para estudiar las protenas desde su cuantificacin, hasta su caracterizacin e incluso modificacin. Existen varios mtodos para la determinacin de concentracin de protenas como el espectrofotomtrico con una absorcin a 280nm. Ejemplo de esto estn estos mtodos de Lowry-Biuret; formndose un complejo coloreado de cobre con el enlace peptdico. Tambin en el de Lowry adems del complejo tambin se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. Fundamento El mtodo a utilizar se basa en un principio diferente empleando un colorante hidrofbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de cido fosfrico teniendo un color pardo y cuando se encuentra en el entorno hidrofbico del interior de una protena, toma un color azul intenso que se mide fcilmente. Este mtodo depende, de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas; es sensible a la presencia de contaminantes como restos de detergentes y lquidos orgnicos como el metanol. Es muy rpida y fcil de emplear, ms sensible que la medida de absorbancia a 280nm. Objetivo Determinar la concentracin de protenas en una muestra de leche descremada de vaca por el mtodo de Bradford.

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Diagrama de Flujo de las operaciones realizadas en la prctica. a)

Curva de calibracin a partir del estndar.

g de protena L Albumina L de agua L Total

0 0 300 300

20 20 280 300

30 30 270 300

40 40 260 300

50 50 250 300

60 60 240 300

70 70 230 300

3mL del reactivo Bradford L de agua Predestinados L de Albumina Predestinados

b)
Preparacin de la MP 1:20

Leche diluidas Volumen de la leche (L) Volumen de agua (L) Volumen Total (L)

A 20 280 300

B 40 260 300

C 60 240 300

3mL del reactivo Bradford L de Leche Descremada Predestinados L de Agua Predestinados

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c)

Lectura de estndares y MP

Observaciones La muestra era color blanca. Al agregarle el reactivo de Bradford se torn color azul. Segn como iba aumentando la concentracin de la muestra el color azul se estaba haciendo ms intenso. Las paredes de las celdas se mancharon de color azul, creo que ese puede ser un factor para que varen los resultados de las concentraciones y las absorbancias. Anah Carrillo Aguirre Al preparar los estndares de albmina bovina y de las diluciones de la muestra de leche descremada de vaca, a simple vista se puede inferir que la coloracin depende de la concentracin, pues los estndares y diluciones con ms cantidad de muestra o protena eran las que tenan un color ms intenso. El blanco present absorbancia, as que se utiliz para corregir las dems absorbancias de todas las preparaciones de la prctica. Erika Leticia Castillo Gonzlez Los estndares preparados pasaron a la lectura en nuestro espectrofotmetro teniendo una recta con un r= 0.9936, pudiendo haber descartado el estndar 7 que se nos desfasaba un poco de la recta, que puede ser eliminado para mayor sensibilidad. Sabiendo que con 5 o 6 muestras son suficientes para la realizacin de la curva. Al momento de trabajar con nuestra MP de leche descremada de vaca tambin presento ese color azul intenso al agregarle el reactivo de Bradford. Al pasar a la lectura, fue correcta ya que los g fueron ascendentes como lo fue el volumen

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aadido de nuestra muestra, dando como resultado los 2.3467 g de protena por cada 100mL de leche. Santiago R. Hernndez Quezada Grficas y clculos
[ ] g/300L 0 20 30 40 50 60 70 Absorbancia Absorbancia corregida 0.632 0 0.899 0.267 1.034 0.402 1.141 0.509 1.232 0.6 1.331 0.699 1.39 0.758

Curva estndar de albmina bovina

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 Conc. g de protena 60 80 y = 0.0098x + 0.0973 R = 0.9873 Absorbancia corregida Linear (Absorbancia corregida)

r= 0.9936

Conc. g protena Absorbancia Absorbancia corregida 20 0.956 0.324 40 1.18 0.548 60 1.443 0.811

Absorbancia

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Curva estndar de albmina bovina

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 y = 0.0098x + 0.0973 R = 0.9873 Absorbancia corregida Linear (Absorbancia corregida)

Absorbancia

40

60

C 80

Conc. g de protena

Por extrapolacin, se calcula el valor de concentracin, sin tomar en cuenta las diluciones anteriores a la medicin, es decir, se calcula x:
Conc. g leche X g protena 20 23 40 46 60 73

Utilizando la ecuacin de la recta:

Para un resultado ms exacto, se obtiene x de la ecuacin y posteriormente se consideran las diluciones anteriores: Para la dilucin con 20 L de leche ( )( ) ( )( )

)(

)(

)(

Para la dilucin con 40 L de leche ( )( ) ( )( )

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)(

)(

)(

Para la dilucin con 60 L de leche ( )( ) ( )( )

( Promedio

)(

)(

)(

Conclusiones En conclusin, se cumpli con el objetivo de la prctica al determinar la concentracin promedio de la protena en la leche descremada por el mtodo de Bradford que fue de 2.3467g en 100 mL de leche. Adems de obtener un valor de r de 0.9936, que es un valor aceptable, ya que este debe ser lo ms cercano al 1. Creemos que la concentracin de las muestras pudo ser afectada por la influencia de ciertos factores que pudieron originar que los resultados obtenidos no fueron los esperados como: la manipulacin inadecuada de los materiales de laboratorio, la calibracin del espectrofotmetro o que la muestra se quedaba adherida a las celdas. Cuestionario 1. Qu aminocidos permiten la formacin de puentes disulfuro en una protena? Los dos aminocidos azufrados son la metionina y la cistena, que puede formarse a partir de la metionina. Ambos son bastante inestables frente a condiciones de oxidacin. Los puentes disulfuro se forman por la oxidacin de un par de residuos de la cistena. El conjunto resultante de dos cistenas se llama cistina. 2. Investigue la relacin que existe entre Daltons y Aminocidos. El Dalton (D) es la unidad de masa que define el tamao de una protena.

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Un Dalton equivale a una unidad de masa atmica: 1D = 1 uma. Por lo general, la masa molar se calcula multiplicando el nmero de residuos que contiene la protena por la masa molar promedio de un residuo, que es 110. De aqu que una protena con 250 residuos de aminocidos tiene una masa molar de 27,500 D (250 x 110) o 27.5 kD. 3. Describe el mtodo BCA para cuantificar protenas. El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. Protena + Cu2+ Cu1+ Cu1+ + BCA Complejo prpura BCA - Cu1+ Forma de preparacin: Aadir 1 ml del reactivo BCA a los tubos estndar y muestras problemas preparadas. Incubar 10 min a 60 C y leer Absorbancia a 562 nm frente al blanco. 4. Escribe qu aminocidos le confieren a las protenas la capacidad de absorber luz en el UV. Existen tres aminocidos que absorben luz Ultravioleta a 280 nm y son Triptfano, Fenilalanina y Tirosina. Si la ley de Lambert-Beer establece que A = kc, es decir, que la absorcin de luz incidente por una solucin es proporcional a la concentracin de esta. Significa que mientras ms concentrada est una solucin menor ser la luz que pase por ella. Una protena que tenga estos tres aminocidos podr absorber luz UV y podr tener distintas absorciones cuando este a distintas concentraciones. Sin embargo, a una concentracin constante la mayor o menor absorbancia que experimente, ser una medida del despliegue o empaquetamiento que experimente la protena al mostrar o esconder estos aminocidos frente a los cambios de conformacin que experimente, ya sea por efecto de la temperatura o el pH del medio Bibliografa http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/aminoacids/aminoacidos.html consulta: 18/02/2014 7:36p.m.

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http://books.google.com.mx/books?id=HRr4MNH2YssC&pg=PA35&lpg=PA35&dq =dalton+aminoacidos&source=bl&ots=LTyFL6yidA&sig=XS5oHbzJI7mHFj5zUj5Cr 8vOqEo&hl=es419&sa=X&ei=swsEU_bdKtH8yAGZkIDADw&ved=0CCYQ6AEwAA#v=onepage& q=dalton%20aminoacidos&f=false consulta: 18/02/2014 8:40p.m. http://www.oocities.org/pelabzen/proteinas.html consulta: 18/02/2014 8:43p.m. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%9 3N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf consulta: 18/02/2014 8:58p.m. http://www.med.ufro.cl/clases_apuntes/cs_basica/bioquimica_dr_rocha/CCAPITULO_2-vinc-segunda-edicion.pdf consulta: 18/02/2014 9:18p.m.