CARMEN ANARTE

Separacin de
espermatozoides
LA IMPORTANCIA
DE LA APOPTOSIS:
MACS-ANEXINA V
II SIMPOSIO REPRODUCCIN ASISTIDA
GRUPO HOSPITALARIO QUIRN
Ma!id-Febrero 2014
Carmen Anar! Jimeno
"Quir#n Bilbao$
2
APOPTOSIS
1. Deriva del Griego:
Apo: significa separacin
o derivacin
Ptosis: significa cada
2. Trmino que se usaba en la
ant i gua GRECI A par a
describir la cada de los
ptalos de las flores y la
cada otoal de las hojas de
los rboles
INTRODUCCIN
3
INTRODUCCIN
APOPTOSIS: Proceso ORDENADO de muerte de una clula
Puede verse alterado por diversas causas
Alteraciones intrnsecas
Alteraciones extrnsecas
Es requerida en la espermatognesis
Mantener el balance entre clulas germinales
y clulas de Sertoli.
Asegurar la homeostasis celular
Disminuci#n de can%dad y calidad esperm&%ca
4
Eventos tempranos
Sealizacin por receptores de mem-
brana
Modificacin lpidos de membrana
(fosfatidilserina)
Eventos tardos
Modificacin citoplasma celular
Activacin de caspasa 3
Degradacin ADN nuclear
Formacin cuerpos apoptticos
Fases de la APOPTOSIS
INTRODUCCIN
5
-.||. - | |-.-.. M/C
C+--| , C|--) -.||. - |
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| |.. M/C -- ..--|-
HISTORIA
OBJETIVO GENERAL
1. Seleccin especfica de
espermatozoides eyaculados
MACS
Magnetic Activated
Cell Sorting
MACS
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s

R
1
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8
G
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C
0
5
R
e
v
.3

[ 6 ]
Capa externa
Capa interna
Activacin
Diferenciacin
Apoptosis
Degranulacin
necrosis
Externalizacin de PS
Anexina V MicroBeads
Fosfatidilserina (PS)
Ca
2+

Marcaje con
Anexina V
Microbeads
No apopttico
Apopttico
Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)
7
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v.3

Magnetic Activated Cell Sorting (MACS)
[ 10 ]
Clulas
apoptticas
retenidas en
la columna
Anlisis
por citometra
de flujo
Anlisis de
Anexina-V / IP
(Rawe, 2009)
MACS
8
MINI MACS
SEPARACIN MAGNTICA
MACS
9
MACS
10
MACS
Columnas de Investigacin
Es segura esta Tcnica?
11
Minimizar el tiempo desde la ob-
tencin hasta el R.E.M
Procesar semen a T amb (Gosalvez
et al., Fertil & Steril., 2008)
Seleccionar los spz por Gradientes
de densidad (Lozano et al., Anato-
lian Journal of Obstetrics & Gyne-
cology., 2009) (Sakkas et al., Hum
Reprod., 2000)
MACS
CAPACITACIN DE LA MUESTRA
12
MACS
LA CAPACITACIN ESPERMTICA NO GARANTIZA
LA ELIMINACIN DE SPZ APOPTTICOS
MACS
13
MACS
PUNTO DE CORTE > 15 % PATOLGICO
14
MACS
MUESTRA CAPACITADA
con ms de 1x10
6
spz tras REM
15
MACS
!
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$!
%!
&!
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%

a
p
o
p
t
o
s
i
s

Media del porcentaje de apoptosis en las muestras
en fresco, capacitadas y tras MACS
Fresco
Capacitado
Tras MACS
Anarte et al., Fertil Steril. 2013; 100 (3): S447-448
16

++
+ -
--
- +
FITC-A
PI/PE
17
Paciente 1 Paciente 2
Paciente 3 Paciente 4
18
Posibles Aplicaciones
19
Aplicaciones potenciales de la tcnica
20
Aplicaciones potenciales de la tcnica
21
!
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(!
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*!
+!
,-./0.123/45. 62-720849-8 :.;594<08
Parmetros seminales vs Porcentaje de apoptosis
Fresco
Capacitado
Tras MACS
Anarte et al., Fertil Steril. 2013; 100 (3): S447-448
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Fallos repetidos de TRA?
Fallo de fecundacin?
Aborto de repeticin?
23
Otras posibles aplicaciones MACS
SELECCION NEGATIVA
ESTERILIDAD INMUNOLGICA: Eliminacin de spz con anticuerpos
LEUCOSPERMIAS: Eliminacin de leucocitos (CD45)
SELECCION POSITIVA
INDIVIDUOS JVENES / ONCOLGICOS:
Seleccin y rescate de clulas inmaduras (CD 44)
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NUESTROS RESULTADOS
Enero 2013-Enero 2014
287 determinaciones de apoptosis (CICLOS ICSI)
81 estudios patolgicos (Columnas)
RESULTADOS
38 PRUEBAS DE EMBARAZO POSITIVAS
36 Embarazos CLNICOS
29 Embarazos EVOLUTIVOS
15 RECIN NACIDOS SANOS
TRAS COLUMNAS DE ANEXINA
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Quirn-Bilbao-Reproduccion-Asistida
@QuironBilbao
@CarmenAnarteJim
canarte.bil@quiron.es