B-Tehnici electroforetice

1-DEFINITIE SI PRINCIPII DE FUNCTIONARE

Definitie : electroforeza este o metoda de separatie a partic lelor incarcate electric prin migrare diferentiala sub actiunea unui ca!p electric. Termenul de ionofore"a e utilizat in cazul ionilor de talie mica. Electrofore"a li#era$ en %eine li& i'e dupa Tis(li s (1937), este realizata in optic, prin traversul tubului, asemanator unei cuve de spectrofotometru) : separatia nu este totala, dar frontierele care se formeaza sunt puse in evident prin metode optice (absorbtie U , indice de refractie, fluorescenta...). !ceasta metoda este utilizata in cercetare pentru masurarea mobilitatii electroforetice si pentru verificarea puritatii proteinelor.

Electrofore"a pe s port sau electrofore"a 'e "one permite stabilirea fazei lic"ide gratie utilizarii unui suport poros impregnat cu un solvant tamponat.

Aparat ra : #s port l trebuie sa fie omogen, poros si inerte (aceasta ultima conditie nu este niciodata totalemente realizata).

$e poate utiliza hartie, acetat 'e cel lo"a, )el 'e poliacrila!i'a, )el 'e a)aro"a, )el 'e a!i'on, gel de siliciu ... # se poate realiza pe #an'e ("artie, acetat de celuloza), pe la!e sau in t # ri (gel)

Principii 'e !i)ratie electroforetica : migratia depinde de mai multi factori:

% de !o#ilitatea electroforetica U$ care este dependenta de

sarcina si de )eo!etria particulei. & particula cu sarcina electrica *, plasata intr#un camp electric ' este supusa unei forte F care o antreneaza spre electrodul de semn opus:

(ortele de frecare f, datorateb viscositatii mediului , se opun migratiei particulelor, si de aceea, cu cat particula este mai mare ( r ) ra*on) cu atat viteza de migratie (%) este mai mare:

(N.B. Coeficientul de viscositate

depinde de temperatura)

+n momentul in care aceste doua forte se ec"ilibreaza si particula se deplaszeaza cu viteza constanta se poate scrie:

$e defineste pentru fiecare particule !o#ilitatea +, in mod independent in camp electric, prin relatia :

,obilitatea este o caracteristica a fiecariei particule- si fiecare are capacitatea de a efectua o separare in baza acestei proprietati. $arcina * este funcetia p. isoelectric al particulei si al p. solvantului :se numeste p, isoelectric al unei particule (p.i sau p+) p, pentr care aceasta partic la n !i)rea"a intr- n ca!p electric (definitie e/perimentala). 0entru moleculele de talie mica, se poate presupune valoare p.i si calculand p. isoionic, p. pentru care sarcina neta este nula, plecand de la p1a a diferitelor groupari ionisabile ale moleculeidar aceasta nu este posibila pentru macromolecule, caci mediul ionic modifica notabil sarcina lor reala.

2aca p. 3 p.i 2aca . 4 p.i 2aca p. ) p.i

$arcina net negativa (anion) $arcina net pozitiva (cation) $arcirna net nula

migratie spre anod migratie spre catod (ara migratie

2iferenta p. - p,i determina intensitatea sarcinii * a unei particule :in plus aceasta diferenta este mare in valoarea absoluta.

% a ca!p l i electric E : E - % . + % a c rentilor lichi'elor :

#c rent l 'e electro-en'os!o"a : +n conditii e/perimentale, suportul se incarca negativ- un couc"e mobil de sarcini pozitive se formeaza in solvant, la contactul cu suportul si antreneaza global faze lic"ida spre catod. !cest curent accelereaza sau incetineste migratia moleculelor, urmand ca ele sa migreze spre catod sau spre anod. +n unele cazuri poate fi mai puissant ca fortele electrice, ceea ce face ca proteinele incarcate negativ sa poata migra global spre catod : este adevarat in cazul utilizarii gelului de agaroza si a electroforezei capilare. # curentii de e%aporare : trecerea curentului este insotita de o incalzire a suportului (prin efectul 5oule), ceea ce antreneaza evaporarea apei din faza lic"ida- acest efect este ma/imal la mi6locul bandei- s#a stabilit si un curent lic"idien de la fiecare e/tremitate spre centrul bandei. 0entru limitarea acestui fenomene cuva este inc"isa cu un capac- se pot utiliza cuve refrigerate.

%'

rata !i)rarii:

'-%/t

(' ) distanta, % ) viteza , t )timpul de trecere a curentului) !ceasta formula nu poate fi aplicata in cazul electroforezei pe suport, caci moleculele efectueaza un traiect non lineare in microcanalele suportului poros.

% factorii le)ati 'e nat

ra s portului: adsorbtie, te/tura...

0ETODE FI1ICE DE SEPARARE SI DE ANA2I1A 0ETODE DE DOSARE A BIO0O2ECU2E2OR 3-AP2ICATII

'lectroforeza permite separarea moleculelor incarcate: proteine, peptide, acizi aminati, acizi nucleici si nucleotide. 0ermite in anumite conditii (emploi de micelles de d7tergents ioni8ues) separarea moleculelor non ionice, ca "ormonii sterozi.

3-1-Separarea proteinelor serice pe acetat 'e cel lo"a

Re%elarea fractiunilor poate fi )lo#ala (rosu 0onceau, !mido#sc"9artz, verde de lissamine, albastru de :oomassie) sau specifica (revelarea lipoproteinelor cu un colorant pentru lipide, revelarea unei activitati enzimatice..). Citirea se poate face cu ochi l li#er (analiza calitativa) sau prin 'ensito!etrie (inregistrarea absorbantei in functie de distanta de migratie) - in acest caz, inte)rarea des pics permite o analize cantitativa a fractiunilor- sau doza6ul poate fi efectuat dupa el tia fractiunilor.

Trac7 densitom7tri8ue du prot7inogramme d;un s7rum "umain normal

3-3-Electrofore"a in )el 'e poliacrila!i'a 4PA5E)

0oliacrilamida este un gel fin reticulat, care se pregateste in momentul utilizarii, amestecand acrila!i'a (:.<):.#:&#=.<),care polimerizeaza formand lanturi lineare#is-acrila!i'a (:.<):.#:&#=.#:&#:.):.<), care formeaza punti intre lanturi, obtinandu#se o retea, iar mailles sunt de marimi variable in functie de proportiile de acrilamida di de bis#acrilamida utilizate- gelul obtinut se comporta ca un ta!is !olec lar (macromoleculele migreaza mai putin repede decat cele care sunt mai mari). +n prezenta dodecilsulfatului de sodiu ($2$), detergent anionic care desface structura spatiala si se fi/eaza pe proteine, toate moleculele sunt incarcate de aceeasi maniera, si separarea este doar in functie de !asa !olara : (SDS : :.3 # (:.<)1> # :.< # & # $&3#, =a?), =.@ : pentru denaturarea proteinelor, se utilizeaza pe rind un detergent ca $2$ si un agent reducator care va taia puntile disulfurice, ca # mercaptoetanolul.

3-6-Electrofocali"area 4IEF 7 IsoElectric Foc ssin)8

,igratia este efectuata in gradient de p.- fiecare molecula migreaza pana in l;endroit unde p. este egal cu p.i. $e poate utiliza un gel cu porozitate forte (poliacrilamida sau agaroza), pentru ca marimea nu influenteaza migratia. Aradientul de p. este generat de amfolite, molecule amfotere de sinteza introduse in gel in momentul fabricarii : se utilizeaza un amestec de asemenea molecule, avand p.i intr#o anumita gama (gama larga, e/. 3#9, sau B 7troite, e/. C#D ou D#E,D). !ceste molecule migreaza rapid in gel pana la atingerea unei zone unde sarcina lor devine nula. 'le au atunci o distributie statistica asemanatoare celei care genereaza un gradient de p. sensibil linear pe lungimea gelului. '/ista asemenea molecule cu greutate moleculara mica si solubile (a!foline) si e/ista geluri pe baza de acrilamida modificate continand grupari acide si bazice fi/ate (geluri de i!o#ilines). Electrofocali"area #i'i!ensionala este o metoda care permite obtinerea unei c r#e 'e titra9 a unei proteine date (sarcina ) functia p.). $e prepara un gel in care se stabileste un gradient de p., apoi se depune intr#un sant central solutia de proteine, dupa care se intoarce placa la 9> F si se supune trecerii unui curent electric.

3-:-Electrofore"a #i'i!ensionala
$e separa dupa p.i (une dimension (+'() si dupa masa molara o alta dimensiune (0!A'#$2$)- se pot separa astfel in 6ur de 1>>> proteine din serG

$e poate stabili in acest mod Hcartea de identitate proteicaH a principalelor tesuturi si organe umane. :itirea necesit un sistem informatizat de analiza a imaginilor.

3-;-Electrofore"a in a)aro"a
'ste putin utilizata in cazul proteinelor, caci in acest domeniu gelurile de poliacrilamida sunt satisfacatoare. Aelurile de agaroza sunt utilizate sub forma de Iituri in biologie clinica : sunt destinate aplicatiilor specifice pentru evidentierea unui tip dat de constituant (e/. lipoproteine) sau anumite enzime (de"idrogenaze, esterazeJ), si pentru te"nicile de revelare prin anticorpi (care pot mai usor sa difuzeze au sein du gel, voir ? loin).

3-<-I! noelectrofore"a
Kevelatia este bazata pe o reactie Hantigen#anticorpH. $e pune pe de o parte i! no#lot, care consta in vizualizarea proteinelor in gel (fi/area atc este revelata de un al doilea anticorp marcat). Te"nicile utilizate se fac numai la concentratii adecvate, in prezenta familiilor de anticorpi (policlonali) si datorita bivalentei acestor anticorpi, se formeaza agregate () reactii de imunoprecipitare. !cest precipitat este imediat colorat dupa te"nicile clasice.

+l e/iste en fait tout un ensemble de tec"ni8ues 8ui utilisent des anticorps associ7s L des s7parations 7lectrop"or7ti8ues. &n peut distinguerl les tec"ni8ues suivantes : 2-6-1-Immuno-lectrophorse de ra!ar et "illiams

Mes prot7ines migrent dans un gel d;agarose, puis on les r7vNle par une tec"ni8ue de double diffusion des antigNnes et des anticorps, donnant des arcs de pr7cipitation. !vec un antis7rum total, on peut par e/emple distinguer 3>#C> prot7ines dans le s7rum "umain. &n peut bien sOr l;utiliser 7galement avec un antis7rum sp7cifi8ue.

2-6-2-#lectro-immunodiffusion dou!le ($ lectros%nrse) :ette m7t"ode d7rive en fait de la tec"ni8ue d;immunodiffusion double d;&uc"terlon*. 'lle consiste L acc7l7rer la diffusion par un c"amp 7lectri8ue. Mes conditions 7lectrop"or7ti8ues sont c"oisies de faPon L ce 8ue les antigNnes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est possible car le p.i des +mmunoglobulines est sup7rieur L celui de beaucoup de prot7ines).

2-6-&-#lectro-immunodiffusion monodimensionnelle ('aurell) Mes prot7ines sont d7pos7es sur des gels contenant l;antis7rum. &n se place L p. oQ les +g migrent peu. Mes prot7ines se d7placent et rencontrent les anticorps 8ui forment alors des pr7cipit7s en forme de fus7e appel7s HrocIetsH dont la "auteur est proportionnelle L la concentration en prot7ine. &n utilise une partie des puits pour faire un 7talonnage.

2-6-(-#lectro-immunodiffusion !idimensionnelle ('aurell) &n s7pare les prot7ines dans une premiNre dimension en gel d;agarose. &n coule ensuite un gel contenant l;immuns7rum pol*sp7cifi8ue, puis on r7alise la seconde dimension.

3-=-Electrophor>se en cha!ps p ls(s

:ette tec"ni8ue est utilis7e pour l;7lectrop"orNse des mol7cules d;!2= de "aut poids mol7culaire (1D #1>> Ib). 2ans cette gamme de taille (au# delL de <> Ib), les mol7cules ne sont plus s7par7es par les m7t"odes classi8ues, car la migration devient ind7pendante de la taille (le d7placement de ces mol7cules c*clindri8ues a*ant toutes le mRme diamNtre s;effectuant par HreptationH). MSemploi de deu/ c"amps ort"ogonau/ utilis7s en alternance fait 8ue les mol7cules d;!2=, 8ui mettent un certain temps L s;orienter dans le sens du c"amp 7lectri8ue, ne migrent 8ue lors8ue celle#ci est r7alis7e. Me temps n7cessaire L lSorientation est dSautant plus grand 8ue la mol7cule dS!2= est longue.

+l devient alors possible de s7parer les mol7cules en fonction de leur lon) e r. :ette m7t"ode s;avNre trNs utile dans les anal*ses du g7nTme des procar*otes et des eucar*otes.

3-?-Electrophor>se capillaire
:;est une tec"ni8ue r7cente 8ui commence L se d7velopper et 8ui offre essentiellement les avantages de la rapi'it(, de la trNs grande r(sol tion et, partant, de la trNs grande sensi#ilit( de la d7tection. M;7lectrop"orNse utilise un capillaire de silice de diamNtre d;environ D> Um et de longueur 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages 7lev7s (1D #3> I ). :eci aboutit L des vitesses de migration trNs rapides des compos7s dans le capillaires et ceu/#ci sont d7tect7s par absorption U , fluorim7trie ou conductim7trie directement sur le capillaire, donc dans un volume trNs faible. :eci fournit donc une sensibilit7 particuliNrement 7lev7e (on in6ecte seulement 8uel8ues nanolitres de lS7c"antillon).

Mes domaines d;application sont a priori nombreu/ : anal*se de peptides, d;acides amin7s, d;oligonucl7otides,J le nombre de plateau/

est de l;ordre de D>>>>> par mNtre, ce 8ui fournit une r7solution remar8uable (on peut s7parer des peptides diff7rant d;un acide amin7, des m7langes comple/es d;oligonucl7otides, des fragments tr*pti8ues de peptides - la m7t"ode est utilis7e pour tester la puret7 de peptides ou d;oligonucl7otides de s*nt"Nse,J). Ma tec"ni8ue peut 7galement s;appli8uer L des mol7cules non ionis7es en pr7sence de micelles de d7tergents appropri7s. Electrophor>se capillaire en sol tion li#re (($:') 2ans lS7lectrop"orNse capillaire, le courant d;endosmose est la force dominante (il entraVne tous les solut7s 8uelle 8ue soit leur c"arge) et il d7pend des c"arges pr7sentes sur la paroi du capillaire (8ui est fonction du p.)- ce courant diminue L p. acide.

Electrophor>se capillaire !icellaire (,:') Mes micelles de d7tergent ($2$) forment une p"ase pseudo#stationnaire et le solut7 se partage entre celle#ci et la p"ase mobile. Mes substances les plus apolaires sont davantage HretenuesH et la s7paration obtenue s;apparente L celle de la .0M: en p"ase inverse.

Electrofocalisation en (lectrophor>se capillaire (:'#+'()

lectrophorse dADN sur gel dagarose

Introduction Les multiples applications scientifiques et technologiques impliquant l'tude de l'ADN font appel diffrentes techniques. Parmi elles, llectrophorse sur gel dagarose ou de pol acr lamide est une des plus communment utilises car elle permet de sparer des molcules en fonction de leur taille, prala!le indispensa!le dans de multiples applications, notamment pour identifier des fragments dADN dcoups par des en" mes, pour identifier un gne ou pour ta!lir des empreintes gntiques par #outhern $lot. Llectrophorse dADN sur gel dagarose ne prsente gure de difficults techniques et peut %tre utilise aisment en tra&au' pratiques tant luni&ersit quau l ce pour familiariser les tudiants a&ec cette technique essentielle. (n con)onction a&ec di&ers outils informatiques dsormais communs *traitement de te'te, ta!leur, logiciels d'acquisition et de traitement dimages+, lanal se des rsultats peut conduire des d&eloppements importants permettant de mieu' comprendre lintr%t tant scientifique que pratique des technologies de lADN. Diffrentes possi!ilits mettant profit ces di&ers outils sont prsentes ci,dessous. Noter que pour racourcir le temps de chargement de la page, la plupart des images sont

prsentes dans un format rduit. Pour obtenir les images grand format, il faut cliquer sur l'image avec le bouton gauche de la souris. Mise en pratique de llectrophorse dADN sur gel dagarose Traitement des images et dtection de bandes invisibles l'oeil nu onstruction de la courbe Distance de migration ! " #taille de l'ADN$ Dtermination de la longueur de "ragments d'ADN de taille inconnue %ocalisation des sites de restriction et prvision des rsultats In"ormations pratiques o &olutions o 'ournisseurs

-ise en pratique de llectrophorse dADN sur gel dagarose.

o

(rparation du matriel

)el dagarose ., -langer tampon /$( et agarose raison de 0,1 g d'agarose pour .00 mL de tampon *la proportion dagarose dpend de la taille des molcules dADN sparer+. 2, 3aire fondre l'agarose au four micro,ondes en sur&eillant pour &iter les pro)ections ou au !ain marie. Agiter de temps autre pour homogniser le mlange. 4, Laisser refroidir )usqu' ce quil de&ienne possi!le de saisir le flacon main nue *en&iron 50 67+. 8, Placer les )oints fournis a&ec la cu&e pour fermer le support de gel et positionner le peigne . mm du fond et en&iron . cm de le'trmit du support. 9gler le ni&eau pour que le support de gel soit hori"ontal. Certains peignes sont rglables avec une vis : il y a alors une cale pour rgler leur hauteur. D autres sont pradapts au support et ne ncessitent pas de cale. :, 7ouler lentement le gel sur 4 : mm d'paisseur en &eillant ce quil entoure !ien les dents du peigne. 5, Laisser refroidir, enle&er le peigne et les )oints. Le gel est pr%t pour le dp;t des chantillons. N$ !n peut prparer du gel " l avance et le conserver solide au rfrigrateur dans un flacon en verre #rempli au$ %&' ma$imum(. )u moment de l emploi, refondre le gel au four " micro*ondes #ouvrir le bouchon et surveiller pour viter les pro+ections( ou au bain*marie bouillant #ouvrir le bouchon(.

)el d'agarose *0,1 g<.00 mL+

o

Mise en place du peigne et des *oints de coulage *minicu&e pour gel 1 ' 5,: cm+

(rparation et dp+t des chantillons

Pour se familiariser avec cette technique, le plus simple est d acheter dans le commerce des chantillons d )DN, entier ou digr par des en,ymes de restriction. -es fournisseurs proposent toute une gamme d )DN de diverses sources digr ou non par des en,ymes. -es chantillons d')DN peuvent .tre obtenus en solution dans un tampon /0 #/ris 0D/)( ou lyophiliss. Dans ce cas, il sont remis en solution dans du tampon /0. -es solutions d')DN peuvent .tre conserves indfiniment " * %1 2C. -es chantillons d )DN sont le plus souvent distribus par les fournisseurs avec du colorant de charge qu il suffit de mlanger au$ chantillons avant le dp3t en suivant les proportions indiques par le fabricant. 4ne pipette de prcision est ncessaire pour la suite des oprations. (rotocole = Placer les chantillons dADN pendant 4 min 50,5:67. = Les transfrer sur de la glace pendant 2,4 min. Ces deu$ oprations sont destines " emp.cher la ligation de fragments possdant ventuellement des e$trmits cohsives. Pour le remplissage de puits de 51*5% mm de large bien adapts " un usage pdagogique, une proportion de 6 7- de colorant de charge pour 51 " 56 7- d )DN convient #de fa8on " obtenir de 5 " 9 7g d )DN par puits(. .. -langer le colorant de charge et lADN sur un morceau de parafilm et prle&er le mlange a&ec une micropipette rgle sur le &olume appropri en changeant de c;ne chaque prl&ement. 2. 9emplir les puits en faisant attention de ne pas dchirer le fond du gel a&ec la pointe de la pipette. 4. Placer le support a&ec le gel charg dans la cu&e d'lectrophorse en positionnant les puits du c;t de la cathode *p;le noir+. 8. 9emplir la cu&e de tampon /$( *rutilisa!le plusieurs fois+ en &ersant

dlicatement et trs lentement lorsque le gel commence %tre recou&ert pour &iter les fuites dADN &ers le tampon. :. 3ermer la cu&e, !rancher les fils et mettre sous tension. 5. Laisser migrer )usqu ce que le colorant de charge arri&e pro'imit du !ord du gel *en&iron :: min .00 > pour un gel de 10 mm dans une minicu&e+. ?. 7ouper lalimentation, d!rancher les connections et rcuprer le gel dans son support. )ttention au transport : le gel glisse tr:s facilement de son support.

,lectrophorse d'ADN sur gel d'agarose -. / -0 cm *.: puits+ Noter la migration du colorant de charge de la cathode &ers l'anode o 1vlation des bandes dADN )ttention, le gel doit .tre manipul avec soin car il est tr:s fragile. .. 9ecou&rir le gel a&ec le colorant. 2. Laisser agir de . h une nuit puis &ider le colorant *qui peut %tre rutilis+. Les !andes dADN apparaissent en !leu. -es gels sont observables " ce stade mais on peut vouloir dcolorer le fond pour amliorer la qualit des photographies. .. 9incer dans leau distille pendant quelques heures en changeant leau de temps en temps. 2. Photographier le gel a&ec un appareil numrique ou le scanner. Les clichs ci,dessous, raliss a&ec un scanner, prsentent les rsultats o!tenus pour deu' tailles de gels d'agarose. Noter que le contraste des images a t amlior par traitement numrique des images

afin d'viter la perte d'informations rsultant de la prise de vue. 0n effet, les bandes les moins marques mais nanmoins visibles " l'oeil nu ne sont parfois pas dtectes par l'appareil de prise de vue. )el -. / -0 cm color par le bleu de Nile

Minigel 2 / 34. cm color par le bleu de Nile (istes du minigel 5 . @ 2 @ 4 @ 8 @ ADN gnomique -arqueurs de taille ADN de phage ADN de phage lam!da digr par (co9A et BindAAA lam!da digr par BindAAA de lentille (istes du gel -. / -0 5 *gel destin &aluer la qualit de l'ADN conser& au la!oratoire depuis parfois plusieurs annes a&ec dconglations , reconglations successi&es+ . @ 2 @ 4 @ 8 @ : @ 5 @ ? @ 1 @ P P P # P P # # pC7 (co9A BindAAA BindAAA (co9A (co9A $stAA (co9A D BindAAA -i' E @ .0 @ .. @ .2 @ P P P P (co9A BindAAA BindAAA BindAAA D BindAAA .4 @ P (co9A D BindAAA

Puits . @ marqueurs de taille @ pC7 mi' *Promega+ Puits 2 .4 @ ADN de phage lam!da digr par di&erses en" mes de restriction. Frigine de l'ADN @ Promega @ P G #igma @ #

/raitement des images et dtection de !andes in&isi!les l'oeil nu

o

Traitement simple

Fn peut amliorer la &isi!ilit des !andes, notamment des moins marques par le colorant, par des traitements numriques des images raliss a&ec un logiciel de traitement d'images * Photo0ditor, Paint ;hop Pro, Photoshop, etc.( . Fn peut )ouer sur la luminosit, sur le contraste, sur l'intensit relati&e des couleurs. Fn peut galement o!tenir une image en ngatif sou&ent plus lisi!le comme ci,dessous.

Minigel
o

Midigel Dtection de bandes invisibles par traitement numrique

Cn logiciel de traitement d'images numriques donne la possi!ilit de mesurer l'intensit lumineuse de chaque pi'el de l'image et celle de ses trois composantes colores. La reprsentation graphique de chacun de ces tracs l'aide d'un logiciel ta!leur comme ('cel permet alors de dtecter des !andes in&isi!les l'oeil nu en reprant les &ariations d'intensit sur les cour!es. La figure ci,dessous prsente les tracs o!tenus a&ec la !ande 2 du minigel ci,dessus *marqueurs de longueur, pC7-i'+. Le logiciel permettant ce t pe de traitement, d&elopp par -. $orie, professeur de #>/, est fourni gracieusement par l'auteur. >ous pou&e" l'o!tenir en lui en&o ant un courrier. Cn autre logiciel, H-esurimH, d&elopp par I.3. -adre et li!rement tlchargea!le sur le site de l'Acadmie d'Amiens permet galement ce t pe de traitement. Fn se rfrera au' ru!riques d'aide disponi!les sur ce site pour son utilisation.

(ro"ils densitomtriques #densit et couleurs 167$ superposs la piste correspondante du gel *Piste . @ marqueurs de taille de l'ADN JpC7 -i', PromegaK+ Noter que E !andes seulement sont &isi!les l'oeil nu mais que les &ariations simultanes des quatre tracs permettent d'identifier deu' !andes supplmentaires *E2: et 5E? paires de !ases respecti&ement+.

Les !andes tant identifies, leur distance de migration est mesure. Pour cela, l'image o!tenue est affiche dans un logiciel de traitement d'image *Photo0ditor, Paint ;hop Pro, Photoshop, etc.( et la distance de chaque !ande au puits est mesure directement a&ec la souris, le logiciel affichant le nom!re de pi'els correspondant. Les &aleurs o!tenues ont t reportes sur le graphique ci,dessus *9f en mm+. 7onnaissant la taille en paires de !ases des fragments d'ADN donne par le fournisseur, il est alors possi!le de construire la cour!e e'primant la distance de migration en fonction de la taille des fragments d'ADN.

7onstruction

de

la

cour!e

Distance

de

migration

*taille

de

l'ADN+

La construction de la cour!e ncessite, d'une part, de disposer des informations donnes par le fournisseur sur la taille des diffrents fragments de restriction prsents dans le mlange et, d'autre part, des mesures ralises prcdemment sur l'image pour dterminer la distance de chaque !ande l'origine, c'est dire au puits de dp;t. N'importe quel ta!leur peut %tre utilis pour entrer les donnes *taille des fragments en a!scisses, distances de migration en ordonnes+ et construire le graphique correspondant *1" ! a#-8log longueur$ 9 b$ qui constitue la cour!e talon permettant ensuite de dterminer la taille de fragments inconnus partir de leur distance de migration. (n outre, la construction de la cour!e permet de &rifier la !onne adquation des rsultats o!tenus a&ec la dimension des fragments de restriction indique par le fournisseur. #ur le graphique ci,dessous gauche on a superpos ainsi les rsultats o!tenus a&ec la piste 2 du minigel ci,dessus et la cour!e thorique. Le trac peut %tre aussi linaris en utilisant en a!scisses le logarithme de la taille des fragments d'ADN comme le montre le graphique ci,dessous droite ou en utilisant une chelle semi logarithmique.

Distance de migration en de la taille des "ragments d'ADN

"onction

Distance de migration en du logarithme de la taille des "ragments d'ADN

"onction

Dtermination
o

de

la

longueur

de

fragments

d'ADN

de

taille

inconnue

Les tracs ci,dessus peu&ent %tre utiliss pour dterminer la taille de fragments d'ADN inconnus spars par

lectrophorse. Pour cela, la distance de migration des !andes de taille inconnue est mesure sur le graphique. Fn a procd de cette faMon pour la piste 4 du minigel ci,dessus *ADN de phage lam!da digr entirement par (co9A et BindAAA+ aprs a&oir identifi par anal se de l'image de la piste les !andes in&isi!les l'oeil nu comme indiqu prcdemment. La figure ci,dessous prsente les rsultats de cette opration.

Les distances de migration rele&es ont t ensuite utilises pour dterminer graphiquement la taille pr&isi!le des fragments en lisant sur la cour!e talon la &aleur des a!scisses correspondantes. La comparaison des &aleurs dduites de cette manire a&ec les indications du fournisseur permet d'&aluer la qualit de la sparation lectrophortique ralise. Le graphique ci,dessous prsente les rsultats o!tenus.

Dtermination graphique de la taille de "ragments de restriction -es deu$ valeurs indiques pour chaque point correspondent respectivement " la valeur dtermine graphiquement et " la valeur thorique attendue pour chaque bande #puisqu'il s'agit ici d'un chantillon d')DN dont les produits de digestion sont connus(.

Localisation des sites de restriction et pr&ision des rsultats

o

Les squences d'ADN conser&es dans les !anques de donnes internationales *(-$L, Nen!anO, etc.+ sont accessi!les directement partir des ser&eurs Pe! oQ elles peu&ent %tre tlcharges aisment. Pour les e'emples donns ici, la squence d'ADN du !actriophage lam!da est tlchargea!le directement partir de cette page *au format html ou au format te'te .t't utilisa!le directement a&ec un traitement de te'te+ en cliquant sur le lien correspondant. Le gnome du phage lam!da comporte 81 :02 paires de !ases et a une masse molculaire de 4.,: ' .0 5

daltons. squence du gnome du phage lam!da *html+ squence du gnome du phage lam!da *t't+ Cne fois la squence charge, on peut entreprendre de localiser les sites de restriction dans le gnome du phage lam!da dont l'ADN a t utilis pour raliser l'lectrophorse. L'en" me (co9A reconnaRt la squence @ ::)AATT :: :: TTAA):: L'en" me BindAAA reconnaRt la squence @ ::AA) TT:: ::TT )AA:: La fonction rechercher de tout traitement de te'te ou du na&igateur permet de localiser les sites de restriction si on lui indique la squence retrou&er. Noter que la squence ne doit pas comporter d'espaces entre les nuclotides pour que la fonction HrechercherH puisse trou&er tous les sites de restriction. Dans ces conditions, la recherche de la squence NAA//7 conduit identifier cinq sites de restriction situs respecti&ement 2.225, 25.08, 4.?8?, 4E.51, 88E?2 gnrant si' fragments. De la m%me faMon, la recherche de la squence AAN7// conduit identifier si' sites de restriction situs respecti&ement 24.40, 2:.:?,2?8?E, 451E:, 4?8:E, 88.8., gnrant sept fragments. Al est intressant d'essa er de pr&oir le nom!re de fragments produits thoriquement par l'action simultane des deu' en" mes et de le comparer au nom!re de fragments o!tenus lors de l'lectrophorse.

Anformations pratiques
o

#olutions

Tampon T7, #Tris borate ,DTA$ p; 24< Pour .000 mL deau distille @ ,. /ris.B7l Jtris*h dro' mth l+aminomthaneK E0 mmol.L @ .0,1E g Acide !orique E0 mmol.L,. @ :,:5 g ,. (D/A 2 mmol.L @ 0,?8 g *sel disodique de lacide th lne diamine ttraactique+ Tampon T, #Tris ,DTA$ p; =43 Pour .00 mL deau distille @ /ris.B7l Jtris*h dro' mth l+aminomthaneK . mol.L ,. @ .2,. g (D/A *sel disodique de lacide th lne diamine ttraactique+ 0,. mol.L,. @ 4,?2 g olorant de charge p; 2 Pour .0 mL deau distille @ $leu de !romophnol 4 mmol.L,. @ 0,2 g ,. #accharose .,: mol.L @ :,. g /ris. B7l .0 mmol.L,. @ 0,0. g

#olution de coloration pour les gels

&olution stoc> *concentre .00 fois+ conser&er au rfrigrateur @ Dissoudre .0 mg de !leu de Nile dans : mL deau distille. &olution de coloration @ . mL de la solution stocO pour .00 mL deau distille.

;elon la taille de la cuve de coloration, prparer %11 " '11 m- de la solution de coloration

lectrophorse de protines sur gel dagarose support : protocole gnral

Antroduction Protocole #olutions 3ournisseurs Antroduction

L'lectrophorse est une technique !iochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques diffrentes migrent des &itesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique. #i lide dutiliser cette caractristique pour sparer des molcules remonte la fin du di',neu&ime sicle, c'est le !iochimiste sudois Arne /iselius *.E02,.E?.+, pri' No!el de chimie en .E81, qui russit le premier sparer par cette technique les protines contenues dans des liquides !iologiques comple'es comme le srum sanguin et le lait. Au)ourdhui, llectrophorse est de&enue une technique de routine dans les la!oratoires oQ on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques. Llectrophorse des protines peut %tre ralise sur des supports &aris, notamment sur gel de pol acr lamide ou sur gel dagarose selon les informations recherches. Llectrophorse de protines sur gel dagarose est la technique la plus aise et la moins coSteuse mettre en Tu&re dans un ta!lissement denseignement a&ec un matriel limit. (lle ncessite simplement une cu&e lectrophorse et une alimentation continue. Fn peut utiliser une cu&e pour lectrophorse clinique dont le coSt est modr ou une cu&e pour minigel comme celles utilises pour llectrophorse de lADN. #i on ne dispose pas dune alimentation pour lectrophorse, on peut utiliser la place une alimentation continue !asse tension ou un ensem!le de piles en srie. Al faut noter que, dans ce cas, il sera ncessaire de laisser les protines migrer pendant plus longtemps pour o!tenir les m%mes rsultats *ainsi, a&ec une tension continue de .2 >, il faut en&iron une dou"aine dheures de migration quand il ne faut quune heure .20 >+. Dans lenseignement, outre la comprhension de ses aspects techniques et de ses applications, llectrophorse se r&le un outil e'tr%mement utile. Ainsi, l'identification des protines de di&ers chantillons naturels *e'traits cellulaires, srums, !lanc dTuf,

lait, etc.+ ou raliss artificiellement dans un !ut pdagogique permet de concrtiser des notions a!straites dans des domaines aussi &aris que le mta!olisme, limmunologie ou l&olution. Di&ers supports d'lectrophorse peu&ent %tre utiliss, comme les gels d'agarose supports, les !andes d'actate de cellulose ou les gels d'agarose couls par l'utilisateur. Fn trou&era dans cette page le protocole d'lectrophorse adapt au' gels supports du commerce, pr%ts l'emploi et di&ers e'emples d'applications pdagogiques sont prsents dans les pages des rsultats. Fn trou&era en outre un e'emple d'lectrophorse sur !ande d'actate de cellulose *sparation des hmoglo!ines A et #+.

Protocole

Les gels pr%ts l'emploi prsentent l'a&antage d'%tre couls sur un support plastique ce qui, d'une part, &ite de les prparer et facilite leur manipulation et, d'autre part, permet de conser&er indfiniment les rsultats aprs coloration et schage. Als sont fournis en outre a&ec les produits ncessaires pour prparer le tampon et le colorant. L'incon&nient est qu'ils re&iennent plus cher que les gels couls par l'utilisateur. 7omme pour les autres mthodes d'lectrophorse, il faut disposer d'une cu&e dans laquelle est plac le gel et d'une alimentation continue. Fn peut utiliser une minicu&e identique celle utilise pour l'lectrophorse de l'ADN ou une cu&e pour lectrophorse clinique, meilleur march. Dans le premier cas, la cu&e tant conMue pour un gel immerg, on remplit les deu' rser&oirs a&ec le tampon d'lectrophorse et on ta!lit le contact lectrique entre gel et tampon par des ponts de papier filtre tremps dans le tampon. Al en est de m%me si l'on utilise une cu&e pour lectrophorse clinique car ce t pe de cu&e est conMu initialement pour des !andes d'actate de cellulose suffisamment souples pour que les e'trmits plongent dans les rser&oirs de tampon alors que les gels supports sont couls sur un support rigide. Cne cu&e pour lectrophorse clinique est forme de deu' rser&oirs de tampon spars munis chacun d'une lectrode de platine. 7haque support de gel est plac che&al au dessus de la cloison qui spare les deu' rser&oirs. Le protocole uve pour lectrophorse d'lectrophorse *cou&ercle enle&. /aille relle @ 22 cm+ comporte le dp;t des chantillons, la mise en place

clinique

des gels, la migration lectrophortique, la fi'ation du gel et sa coloration puis une dcoloration du fond. Cne fois schs, les gels peu&ent %tre conser&s indfiniment.
o

Prparation

du

gel

et

dp;t

des

chantillons

Les gels supports pr%ts l'emploi sont constitus d'une mince couche d'agarose coule sur un support plastique de .00 mm ' ?: mm permettant leur manipulation aise. )el d'agarose pr?t l'emploi Cne fois le gel sorti de son em!allage, la "one de dp;t est essore a&ec une !ande de papier filtre pour faciliter la diffusion des chantillons lors du dp;t. La !ande est ensuite retire et )ete et on dispose la m%me place un masque de dp;t form d'une !ande de plastique comportant .0 fentes.

,ssorage de la @one de dp+t

Mise en place du masque de dp+t

Cn &olume de : UL des chantillons anal ser est Le liquide non a!sor! par le gel est ensuite essor a&ec une dpos sur les fentes et a!andonn pendant : minutes autre !ande de papier filtre et le masque de dp;t est )et. pour assurer leur diffusion au ni&eau de la "one de dp;t.

Dp+t des chantillons Le gel est alors mis en place dans la cu&e et le contact lectrique entre le tampon plac dans les deu' rser&oirs et le gel est assur par des !andes de papier filtre trempes dans le tampon.

,ssorage du liquide en e/cs Aprs fermeture du cou&ercle et mise en marche de l'alimentation, la migration des protines dmarre. La tension applique au gel et le temps de migration dpendent de la nature des chantillons anal ser.

)el en place dans la cuve

o

,nsemble du dispositi" d'lectrophorse

3i'ation

et

coloration

Cne fois la migration lectrophortique termine, le gel est plong pendant di' minutes dans le fi'ateur, sch puis plong pendant .0 minutes dans le colorant. Cne succession de !ains dans la solution de dcoloration permet ensuite d'liminer la coloration du fond de faMon faire apparaRtre les !andes correspondant au' di&erses protines spares.

Dcoloration du "ond

Le gel est ensuite sch ce qui permet de le conser&er dans de !onnes conditions. Noter que cette page ne constituant qu'un guide technique pour mener !ien l'lectrophorse, des e'emples de rsultats ainsi que la manire de les e'ploiter sur le plan pdagogique sont prsents dans les pages de rsultats.

&chage "inal du gel

#olutions
o

Tampon Tris barbital /ris *h dro' mth l+ aminomthane @ ?,2 g Acide dith l!ar!iturique @ .,12 g Dith l!ar!iturate de sodium @ .0,2 g (th lmercurithiosalic late @ 0,02 g (au distille @ . L olorant Noir amido @ .,2: g Acide actique : V @ :00 mL

'i/ateur -thanol @ E0 mL Acide actique glacial @ 20 mL (au distille @ E0 mL

Dcolorant Acide actique : V

N$ -es gels supports <=!>=D= sont fournis dans un coffret comportant 51 gels, les bandes de papier filtre, les masques et les produits ncessaires pour prparer le tampon et le colorant.

Comparaison du profil lectrophortique du srum de diffrents animaux

Principes et protocole 9sultats et e'ploitation 3ournisseurs

Principes et protocole

Le srum correspond au plasma sanguin dpour&u de son fi!rinogne. L'lectrophorse du srum peut %tre ut en main de la technique et pour montrer l'intr%t d'identifier les protines d'un mlange et de mener leur a outre, la comparaison des profils lectrophortiques de liquides !iologiques ou d'e'traits tissulaires appart permet aussi d'apprcier leur parent &oluti&e, les animau' les plus proches sur le plan &olutif pr ressem!lent da&antage que les animau' dont le degr de parent est Al est possi!le de se procurer dans le commerce du srum pro&enant de diffrentes espces d'oiseau' Happro&isionnementH+. 7e t pe de liquide !iologique prsente l'a&antage de pou&oir %tre utilis dir particulire. Aprs identification des protines du srum humain, on peut chercher identifier les prot diffrents srums tests. $ien que les rsultats prsents ci,dessous aient t o!tenus a&ec des gels d'agarose pr%ts l'emploi co protocole gnral, des rsultats similaires peu&ent %tre o!tenus a&ec un gel d'agarose coul par l'utilisateur o comme une !ande d'actate de cellulose. Al faut cependant noter que la rsolution des protines est meille Dans l'e'emple ci,dessous, les di' pistes d'un gel d'agarose support *-idigel Protines, $AF-ADA+ ont srum du commerce pro&enant de trois oiseau' et de sept mammifres et l'lectrophorse a t mene .80 >

9sultats et e'ploitation

&paration lectrophortique des protines de srums *. @ canard G 2 @ ch&re G 4 @ poule G 8 @ co!a e G : @ lapin G 5 @ singe G ? @ chien G 1 @ che&al G E @ pigeon G .0 @ ho

Les protines sriques sont identifies che" l'homme pour ser&ir de rfrence et le profil densitomtrique est gratuits, Digispec *3. $orie+ et >esurim #?.@. >adre( peu&ent %tre utiliss pour cela. Le premier p densitomtrique partir d'une image au format .!mp o!tenue a&ec un appareil photo numrique ou un s galement d'effectuer l'anal se densitomtrique partir d'une image au format .!mp mais il est capa!le en o Pour se procurer Digispec @ le demander par un courrier lectronique Pour se procurer >esurim @ se connecter par Anternet sur le site #>/ de l'Acadmie d'Amiens tlchargea!le.

Noter que Digispec fournit un fichier te'te *.t't+ qui est ensuite repris dans un logiciel ta!leur comme 0$ graphique tandis que >esurim fournit directement le profil. Noter galement que les images ci,dessous ont de dessin en superposant la piste anal se a&ec le profil densitomtrique et en a)outant &entuel

AnalAse densitomtrique *profil o!tenu a&ec Digispec+

du

srum

humain

AnalAse densitomtrique *profil o!tenu a&ec >esurim+

La comparaison des diffrents srums peut %tre mene par un simple e'amen &isuel des pistes d'lectrophorse, mais la comparaison des profils densitomtriques apporte da&antage de prcision. #ur la figure ci, dessous, on a superpos les pistes correspondant neuf des di' srums a&ec les profils correspondants. Le srum de ch&re n'a pas t retenu pour cette tude car, s'agissant d'un immunsrum produit pour fournir des anticorps, il tait e'cessi&ement concentr en immunoglo!ulines.

L'anal se des profils lectrophortiques montre deu' groupes de profils, celui des mammifres et celui des oiseau'. Fn constate que la srumal!umine est prsente che" toutes les espces testes a&ec une concentration nota!lement plus le&e che" les mammifres. 7he" ces derniers, on o!ser&e en outre une plus grande di&ersit de protines (ro"ils densitomtriques de B sr sriques qui montrent plusieurs !andes de mo!ilit &oisine ou identique suggrant l'e'istence de plusieurs protines homologues a!sentes du srum des trois oiseau' tests. Noter que le srum du che&al utilis ici montre une importante concentration en immunoglo!ulines.

Identification des phnotypes molculaires et des gnotypes par lectrophorse de l hmoglo!ine

Principe Protocole 9sultats ('ploitation 3ournisseurs Principe

Plusieurs maladies hrditaires qualifies d'hmoglo!inopathies, comme les thalassmies et la drpanoc tose, affectent l'un des deu' gnes codant les chaRnes de l'hmoglo!ine humaine adulte, hmoprotine ttramrique constitue de deu' chaRnes alpha et de deu' chaRnes !%ta. La drpanoc tose est une affection gntique due une mutation ponctuelle dans le gne codant la chaRne !%ta. (lle est caractrise par la su!stitution de l'acide glutamique en position 5 de la structure primaire par une &aline. Al en rsulte une hmoglo!ine anormale *B!#+ qui a tendance pol mriser lorsque la pression partielle en dio' gne diminue, en particulier dans le sang priphrique, contrairement l'hmoglo!ine normale *B!A+ qui ne prsente pas cette proprit. La prsence de cette hmoglo!ine anormale dans les glo!ules rouges a!outit une pathologie qui peut %tre plus ou moins gra&e en fonction de di&ers autres facteurs gntiques et en&ironnementau', principalement che" les homo" gotes, et elle peut %tre dtecte par l'o!ser&ation microscopique du sang qui contient des hmaties dformes, qualifies de falciformes *en forme de faucille+. La simple su!stitution de la &aline en position 5 dans la structure primaire de la chaRne !%ta confre l'hmoglo!ine # une charge lectrique glo!ale infrieure celle de l'hmoglo!ine A. Al en rsulte que lorsque les deu' hmoglo!ines sont places sur un gel d'lectrophorse, elles ne migrent pas de la m%me faMon ce qui permet de les identifier dans un simple hmol sat de glo!ules rouges. Fn peut aisment en dduire le phnot pe molculaire du porteur et en dduire son gnot pe. Dans l'enseignement de la !iologie, le cas de la drpanoc tose est protot pique. (n effet, il constitue non seulement un e'emple historique de &rification du !ien fond du Hdogme central de la !iologie molculaireH, mais aussi des relations comple'es entre gnot pe et phnot pe qui inter&iennent dans l'&olution parce que l'allle mut, !ien que mor!ide, s'est maintenu un tau' le& dans le pool gnique de certaines populations en raison de l'a&antage slectif qu'il confre dans les "ones d'endmie du paludisme. (n effet, le parasite responsa!le de cette maladie, le Plasmodium, se r&le moins pathogne che" les porteurs de l'allle mut. Pour toutes ces raisons, il est intressant d'utiliser l'lectrophorse pour identifier les deu' hmoglo!ines, par e'emple dans une simulation de situation relle.

Protocole

#ur le plan technique, il s'agit d'une simulation pou&ant correspondre la distri!ution des hmoglo!ines A et # dans trois gnrations au sein d'une famille. Al s'agit, partir des rsultats de l'lectrophorse des hmoglo!ines des diffrents mem!res de cette famille &irtuelle, de dterminer leurs phnot pes molculaires, d'en dduire leur gnot pe et de dresser l'ar!re gnalogique correspondant. Les chantillons utiliss pour mener l'lectrophorse sont des solutions ralises artificiellement a&ec des hmoglo!ines A et # du commerce dissoutes raison de 2,: mg<mL dans du tampon d'lectrophorse prala!lement o' gn par une agitation &igoureuse. Pour chaque Hmem!re de la familleH, on place dans un tu!e (ppendorf tiquet .00 UL de solution. Les chantillons correspondant au' indi&idus homo" gotes pour B!A sont constitus de .00 UL de la solution d'hmoglo!ine A, les chantillons correspondant au' indi&idus homo" gotes pour B!# sont constitus de .00 UL de la solution d'hmoglo!ine # et les chantillons correspondant au' indi&idus htro" gotes sont constitus d'un mlange de :0 UL de la solution d'hmoglo!ine A et de :0 UL de la solution d'hmoglo!ine #. Cn tel &olume permet de raliser 20 pistes d'lectrophorse a&ec la technique des gels supports pr%ts l'emploi. Fn se rfrera l'ar!re gnalogique du paragraphe He'ploitationH pour la correspondance entre mem!res de la famille et solutions d'hmoglo!ine. L'lectrophorse est mene ..0 > pendant :0 minutes sur un -idigel Bmoglo!ine *$AF-ADA+ selon la procdure indique la page du protocole.

9sultats

Le recours l'lectrophorse peut %tre ,lectrophorse des hmoglobines A et & )ustifi par le pro!lme sui&ant @ che" les mem!res d'une m%me famille dont un fils est atteint de drpanoc tose, on a e'trait l'hmoglo!ine des glo!ules rouges et on a soumis les chantillons l'lectrophorse sur gel d'agarose afin d'identifier les gnot pes pour construire l'ar!re gnalogique de la famille. Les sept mem!res dont l'hmoglo!ine a t anal se sont les deu' parents *pistes . et 2+, leurs quatre enfants *pistes 4 5+ et un petit

enfant *piste ?+. (n outre, deu' rfrences sont constitues par un chantillon d'hmoglo!ine # *piste 1+ et un chantillon d'hmoglo!ine A *piste E+. Le gel ci,contre montre les rsultats o!tenus.

('ploitation

Dans un premier temps, Fn peut alors construire l'ar!re gnalogique de la famille @ on identifie les !andes d'hmoglo!ine pour en dduire les gnot pes des diffrents indi&idus.

Interprtation

Arbre gnalogique N$ -es numros des individus correspondent au$ numros des pistes d'lectrophor:se

"n exemple d utilisation de l lectrophorse en immunologie

Principe Protocole 9sultats et e'ploitation 3ournisseurs Principe

La sparation et l'identification de protines par lectrophorse de liquides !iologiques est utilise en immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du s stme immunitaire, en particulier celles concernant l'immunit humorale.

Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme l'agammaglo!ulinmie, a!sence de scrtion des gammaglo!ulines et l'h pogammaglo!ulinmie, scrtion insuffisante des gammaglo!ulines, peu&ent %tre dtectes par lectrophorse des protines sriques. (n effet, de rares e'ceptions prs, les atteintes de l'immunit humorale se traduisent par une diminution de la concentration d'une ou plusieurs classes d'immunoglo!ulines dans le srum m%me si les larges &ariations de concentration o!ser&es parmi la population adulte rendent difficile la dtermination de la fourchette des &aleurs normales. 7'est pourquoi, en pratique clinique, d'autres tests sont utiliss pour complter l'information du mdecin comme, par e'emple, la mesure des isohmagglutinines et de l'anti,streptol sine F ou celle des agglutinines t phoWdiques B et F a&ant et aprs immunisation par le &accin contre la fi&re t phoWde. A l'in&erse, le profil lectrophortique du srum montre une importante augmentation de la !ande des gammaglo!ulines che" les patients et les animau' atteints de m lome *tumeur maligne des plasmoc tes+ a&ec notamment un pic dit H-H *monoclonal+ dans cette rgion dont la nature peut %tre confirme par immunolectrophorse. L'lectrophorse du srum constitue ainsi une mthode de choi' pour le sui&i des patients atteints de gammapathies monoclonales. (n outre, le composant - peut %tre dtect dans !eaucoup d'autres pathologies comme les leucmies chroniques l mphoc tes, les l mphomes a ant pour origine des l mphoc tes $ ou /, dans quelques cancers, dans di&erses atteintes dgnrati&es *cirrhoses+ et parasitaires et dans des maladies autoimmunes comme la pol arthrite rhumatoWde. #elon la pathologie, la nature du composant - est &aria!le, molcules d'anticorps intactes ou altres, fragment d'anticorps, chaRnes lourdes ou chaRnes lgres isoles. Dans le m lome, non seulement le profil lectrophortique du srum prsente un pic - dit en Hclocher d'gliseH dans la rgion des gammaglo!ulines, mais, de plus, on retrou&e sou&ent ce composant dans l'urine *protines de $ence,Iones+. Au contraire, dans les gammapathies monoclonales !nignes ou d'origine incertaine, le pic - est moins marqu et on ne retrou&e pas ces protines dans l'urine. #i d'autres e'amens sont ncessaires en clinique pour ta!lir un diagnostic sSr, l'lectrophorse de srums humains artificiels peut nanmoins %tre utilise des fins pdagogiques pour concrtiser les connaissances sur l'immunit humorale d'autant qu'elle peut aussi ser&ir comprendre les notions de rponses primaire et secondaire une infection et les mcanismes de la protection &accinale. Les srums utiliss dans ce cadre sont constitus a&ec des produits du commerce. Fn trou&e ainsi du srum dpour&u des trois classes d'immunoglo!ulines A, N et permettant de mimer un d sfonctionnement de l'immunit humorale, des AgN permettant d'enrichir un srum et<ou une urine artificielle pour mimer di&ers t pes de situations ph siologiques ou pathologiques accompagnes d'une augmentation des anticorps *&accination, rponse secondaire, m lome+ ainsi que di&ers srums animau' immuniss ou non. Fn peut ainsi poser di&ers pro!lmes qui seront rsolus par l'anal se des lectrophorses.

Protocole

Les procdures sui&re pour raliser les lectrophorses sont indiques la page du protocole gnral. Fn se limitera ici au' indications ncessaires la ralisation de di&ers chantillons destins %tre anal ss par cette mthode dans un cadre pdagogique.

>oir ci,dessous les adresses des fournisseurs pour l'appro&isionnement. Les rsultats prsents correspondent au dp;t d'chantillons d'un &olume de : UL soumis lectrophorse pendant 50 minutes .80 > . o ,chantillons @ Noter qu'il s'agit de simulations de situations relles rendues possible par l'laboration au pralable de srums artificiellement constitus. #rum normal @ srum du commerce. #rum dpour&u d'immunoglo!ulines A, N et - @ srum du commerce . B pergammaglo!ulinmie @ srum normal enrichi a&ec des AgN pures *. &olume de srum normal mlang un &olume d'AgN+. Les profils lectrophortiques sont tracs a&ec l'un des deu' outils logiciels distri!us li!rement sur le Pe!, Digispec et >esurim. Pour se procurer Digispec @ le demander par un courrier lectronique l'auteur Pour se procurer >esurim @ se connecter par Anternet sur le site #>/ de l'Acadmie d'Amiens oQ le logiciel est tlchargea!le.

9sultats et e'ploitation
o

Dtection d'anomalies immunitaires

&rum humain normal

es glo!ulines sriques ont t nommes par /iselius en E:0 d'aprs leur &itesse de migration lectrophortique ar rapport l'al!umine qui migre le plus rapidement et sente la concentration la plus le&e. Fn distingue ainsi s alpha *. et 2+, !%ta *. et 2+ et gamma glo!ulines dans ordre des &itesses de migration dcroissantes. es anticorps prsents dans le srum migrent des &itesses ffrentes selon leur nature. Les AgA migrent a&ec les actions alpha 2 ou !%ta ., les Ag- a&ec la fraction gamma pide et les AgN a&ec la fraction gamma lente. a figure ci,contre prsente le profil lectrophortique du rum humain normal et son anal se densitomtrique. Al er&ira de rfrence pour interprter les rsultats des ectrophorses des di&ers patients. &rums pathologiques et analAse densitomtrique

ans le !ut d'identifier la nature de leur pathologie, on a d'lectrophorse oumis l'lectrophorse le srum de deu' patients atteints (iste *srum humain normal+ e d sfonctionnements du s stme immunitaire. utre le srum des deu' patients *pistes 2 et 4+, on a galement soumis l'lectrophorse deu' chantillons de

rum normal *pistes . et :+ ainsi qu'un chantillon immunoglo!ulines pour ser&ir de rfrence *piste 8+. es rsultats o!tenus et les profils densitomtrique des stes sont prsents ci,dessous droite.

inq pistes d'lectrophorse (ro"ils densitomtriques correspondants

e'amen &isuel des profils lectrophortiques complt par l'anal se densitomtrique permet d'identifier certaines anomalies @ indi&idu 2 prsente un srum particulirement concentr en immunoglo!ulines mais les autres protines sriques prsentent un oncentration infrieure la normale. &ersement, le srum de l'indi&idu 4 est dpour&u de gamma glo!ulines tandis que les autres !andes sont normales. ans le premier cas, il s'agit d'une h pergammaglo!ulinmie tandis que dans le second, il s'agit d'une agammaglo!ulinmie

lectrophorse des hmoglo!ines sur !ande d actate de cellulose

et

Protocole 9sultats #olutions 3ournisseurs

Le principe de la simulation utilise est le m%me que celui dcrit pour l'lectrophorse des hmoglo!ines sur gel d'agarose support correspondant la distri!ution des

hmoglo!ines A et # dans trois gnrations au sein d'une famille. Al est indiqu la page HAdentification des phnot pes molculaires et des gnot pes par lectrophorse de l'hmoglo!ineH et ne sera donc pas repris ici oQ l'on se limitera au' particularits lies l'utilisation de !andes d'actate de cellulose comme support d'lectrophorse. Les chantillons utiliss pour mener l'lectrophorse sont des solutions ralises artificiellement a&ec des hmoglo!ines A et # du commerce dissoutes raison de 2,: mg<mL dans du tampon d'lectrophorse prala!lement o' gn par une agitation &igoureuse. Pour chaque Hmem!re de la familleH, on place dans un tu!e (ppendorf tiquet .00 UL de solution. Les chantillons correspondant au' indi&idus homo" gotes pour B!A sont constitus de .00 UL de la solution d'hmoglo!ine A, les chantillons correspondant au' indi&idus homo" gotes pour B!# sont constitus de .00 UL de la solution d'hmoglo!ine # et les chantillons correspondant au' indi&idus htro" gotes sont constitus d'un mlange de :0 UL de la solution d'hmoglo!ine A et de :0 UL de la solution d'hmoglo!ine #. Cn tel &olume permet de raliser une &ingtaine de pistes d'lectrophorse.

Protocole

.. -ettre tremper les !andes d'actate de cellulose dans le tampon d'lectrophorse *tampon tris,&ronal+ pendant .0 20 minutes.

Trempage

2. (ssorer l'e'cs de tampon en plaMant les !andes entre deu' feuilles de papier a!sor!ant *essuie,tout+.

,ssorage 4. Placer la !ande sur le portoir en &eillant disposer la face a!sor!ante &ers le haut. La !ande doit %tre tendue et ses e'trmits doi&ent dpasser suffisamment pour tremper dans le tampon une fois le support plac dans la cu&e. N$ -e dispositif de Mise en place de la bande sur le support fi$ation de la bande sur le support varie selon les fabricants.

8. 9emplir les deu' compartiments de la cu&e a&ec un m%me &olume de tampon d'lectrophorse. :. -ettre en place le*s+ support*s+ dans la cu&e. 5. Prle&er un chantillon et le dposer sur la !ande, d) en place sur son support, au tiers de l'e'trmit, c;t cathode *!orne noire+ 7andes en place dans la cuve en prenant garde que la !ande soit !ien hori"ontale et que l'chantillon ne coule pas. !n peut prlever et dposer les chantillons soit avec une micropipette, soit avec un capillaire, soit avec un applicateur comme celui prsent ci*dessous ralis avec un bouchon et deu$ trombonnes pour permettre un dp3t linaire.

Dp+ts e""ectus sur une bande

Applicateur

?. 9ecommencer pour chaque chantillon en laissant un espace suffisant pour ne pas risquer la fusion des chantillons qui diffusent lgrement lors du dp;t. 4tiliser un applicateur diffrent pour chaque chantillon ou sinon, bien nettoyer l'applicateur entre chaque dp3t. 1. 3ermer la cu&e et mettre sous tension *en&iron . h de migration .:0 >+.

uve et gnrateur pendant la migration

E. Aprs migration, placer les !andes dans la solution de rouge ponceau pendant .0 minutes.

oloration

.0. Dcolorer le fond dans des !ains successifs dacide actique : V. Agiter le cas chant pour acclrer la dcoloration.

7ains de dcoloration

9sultats

L'hmoglo!ine # moins charge que l'hmoglo!ine A en raison de la su!stitution d'un acide glutamique par une &aline en position 5 de la chaRne de la !%ta glo!ine migre moins loin et peut ainsi %tre distingue sur la !ande ,lectrophorse des hmoglobines A et & d'actate de cellulose. Fn se rfrera au paragraphe He'ploitationH de la page consacre l'lectrophorse sur gel des hmoglo!ines A et # pour l'utilisation pdagogique des rsultats.

#olutions
&olution de coloration 9ouge ponceau Acide trichloractique (au distille @ &olution de Acide actique : V 5 ponceau @ 2g @ 40g . L dcoloration rouge

Tampon trisCvronal /ris *h dro' mth l+ aminomthane @ ?,2 g Acide dith l!ar!iturique @ .,12 g

Dith l!ar!iturate de sodium @ .0,2 g (au distille @ . L