Instituto Tecnolgico de Costa Rica. Escuela de Biologa.

Trabajo Final de Gentica Ivonne Corts Segura $a%ana Rojas &enegas Fabiola *l+aro *lvarado 2 *ndrea ,lloa Fern-nde. 2 2 2 !"""2#. !'"((). !(!!(". !")('".

Estrategias para secuenciar genomas completos.

E/ *$0 es la +uente 1ri2aria de in+or2acin gentica 3ue est- contenida en el orden % dis1osicin de las cuatro bases 4adenina5 ti2ina5 guasina5 citocina6 a lo largo del es3ueleto de -cidos nucledos. /os es1ectaculares avances en la bio3u2ica5 la biologa 2olecular5 la ingeniera gentica % la biotecnologa abrieron el ca2ino 1ara incursionar en una nueva 7a.a8a 3ue 1odra ser la res1uesta a 2uc7as 1reguntas co2o el origen del ser 7u2ano5 ta2bin 1odra ser la cura a 2uc7os 2ales etc.9 la secuenciacin % 2a1eo del geno2a 7u2ano. /os geno2as contienen toda la in+or2acin 3ue deter2ina todos los 2ecanis2os 7o2eost-ticos de cu%o correcto +unciona2iento de1ende conservar la salud. 4:arris5 T. 2 !6

El geno2a es el contenido total de *$0 en una clula5 3ue en el caso de los eucariontes est- re1resentado 1or el geno2a nuclear % el 2itocondrial9 en las 1lantas ta2bin el de los cloro1lastos. Tan solo en los 7u2anos el geno2a nuclear est- +or2ado 1or # de 1ares de bases divididas en 2" 2olculas lineares de *$0 lla2adas cro2oso2as9 de stos5 22 son autoso2as % 2 son cro2oso2as se;uales. Sola2ente una 1e3ue8a +raccin de stos # 2il 2illones de bases5 esti2ada en tan solo el #< 4= contribu%e con la in+or2acin 1ara los ! es1ecie. 4:arris5 T. 2 !6 bases65 genes 3ue se cree 3ue 1osee nuestra

/a totalidad del geno2a5 integrado 1or un n>2ero de 2olculas de *$0 igual al n>2ero de cro2oso2as de la es1ecie 4si bien con contenido di+erente en ellas65 contiene ade2-s de las secuencias 3ue codi+ican 1ara el n>2ero total de genes 3ue caracteri.a a cada es1ecie5 un co21onente i21ortante5 constituido 1or secuencias re1etidas5 3ue no codi+ican in+or2acin gnica % de otras secuencias5 3ue 1ueden ser de +uncin

regulatoria5 o 1otencial2ente estructural5 o de +uncin a>n desconocida. 4?i2ne.5 G.5 Sobern5 G. 2 26

/a 1ro1orcin entre las secuencias codi+icantes % las no codi+icantes vara en +uncin del nivel evolutivo5 siendo en general 2-s alta la 1ro1orcin codi+icante en los gru1os in+eriores % 2enor 4en 1ro1orcin5 1ero no en valor absoluto65 en los organis2os su1eriores. 4?i2ne.5 G.5 Sobern5 G. 2 26.

Si bien dentro de cada gru1o evolutivo e;iste un i21ortante grado de dis1ersin en el ta2a8o del geno2a5 4siendo los gru1os 2as lla2ativos en este sentido5 las 1lantas con +lor % los an+ibios5 3ue 1resentando es1ecies 2u% 1arecidas 2or+olgica2ente 1ueden tener geno2as 3ue di+ieran en uno o dos rdenes de 2agnitud65 el ta2a8o del geno2a5 re+erido al geno2a 2enor de cada gru1o au2enta en ta2a8o en 1ro1orcin a su co21lejidad % 1osicin en la escala evolutiva. @or 2-s in+or2acin vea las gr-+icas en el enlaceA *s 1or eje21lo la bacteria Esc7eric7ia coli tiene "52 2illones de 1ares de bases5 la levadura co2>n 4Sacc7aro2%ces cerevisiae6 tiene un geno2a de )# 2illones de 1ares de bases5 un insecto co2o la 2osca del vinagre 4$roso17ila 2elanogaster6 )" 2illones de 1ares de bases % la es1ecie 7u2ana #.# )==B6 Esa 2is2a correlacin 1ositiva se da5 desde luego5 1ara el n>2ero de genes de cada es1ecie. En el caso de la es1ecie 7u2ana5 en base a la in+or2acin del 1ro%ecto 2ultinacional Geno2a :u2ano5 se esti2a 3ue conta2os con a1ro;i2ada2ente # . genes5 #2 2illones de 1ares de bases. El conoci2iento del geno2a 7u2ano re1resenta un 7ito en la 7istoria de la 7u2anidad solo 1or la envergadura cient+ica % tecnolgica 3ue eso conlleva sino 1or el gran i21acto 3ue este conoci2iento tiene en la vida cotidiana de la 1oblacin. Conocer las variaciones del geno2a 3ue con+ieren individualidad a las 1ersonas es de gran utilidad en el ca21o 2edico al 1oder 1revenir5 diagnosticar % tratar en+er2edades co2unes. Todo esto 7a contribuido al desarrollo de nuevas tecnologas 1ara la secuenciacin e inter1retacin del geno2a 7u2ano. 4/a8e.5 E. )==B6 /a estrategia 7abitual 1ara secuenciar geno2as es la siguienteA 4Rodrgue.5 G. 2 6 2illones de 1ares de bases. 4/a8e.5 E.

). El *$0 gen2ico se corta aleatoria2ente en +rag2entos5 3ue se se1aran en distintas clases de ta2a8os5 % se insertan en distintos ti1os de vectores5 cada uno

con una ca1acidad 2edia di+erente 41or eje21lo5 los C*Cs 1ortan insertos entre ) %2 Db5 los cs2idos unas " Db6. 2. Se 1re1aran 2a1as +sicos de baja resolucin a base de clones sola1ados de insertos de C*Cs. #. Se 1re1aran 2a1as +sicos de alta resolucin5 1re1arados 1ara la secuenciacin5 1or 2edio de la subclonacin en cs2idos de +rag2entos aleatorios de insertos de C*Cs. ". Final2ente5 se escoge un conjunto de clones de cs2idos con sola1a2ientos 2ni2os5 sus insertos se ro21en aleatoria2ente % se subclonan en vectores 1ara la secuenciacin 4derivados del +ago E)#5 1l-s2idos de la serie 1,C5 etc.6. @or cada cs2ido 7a% 3ue secuenciar unos ! 2edio de inserto de " clones de +ago E)#5 con un ta2a8o

1b5 % la secuencia de " Db del inserto del cs2ido original se

ensa2bla co21utacional2ente. Este en+o3ue de secuenciacin aleatoria 4 shotgun6 obliga a secuenciar 2uc7as veces 4unas ! o ) 6 el 2is2o seg2ento de secuencia5 lo 3ue tiene la ventaja de 3ue asegura una 2a%or +iabilidad de los datos obtenidos. Sin e2bargo5 co2o %a diji2os5 1resenta varios inconvenientesA 7a% 3ue dis1oner 1revia2ente de buenos 2a1as9 los C*Cs son inestables % 2uc7os de ellos son 3ui2eras5 arte+actos de clonacin 3ue no re+lejan el orden gen2ico 4identi+icarlos % descartarlos es una tarea 3ue lleva tie21o % es+uer.o69 cabe destacar 3ue esta 2etodologa no se 1uede auto2ati.ar total2ente. 4/a8e.5 E. )==B6 Etodos cl-sicosA /os dos 1rotocolos cl-sicos 1ara secuenciar geno2as tienen dos eta1as en co2>n. 4/a8e.5 E. )==B6 FEarcadoA Es necesario 2arcar las 2olculas a secuenciar radiactiva o +luorescente2ente. F Se1aracinA Cada 1rotocolo genera una serie de cadenas sencillas de *$0 2arcadas cu%os ta2a8os se di+erencian en una >nica base. Estas cadenas de distintas longitudes 1ueden se1ararse 1or electro+oresis en geles desnaturali.antes de acrila2idaFbisacrila2idaFurea5 donde a1arecen co2o una escalera de bandas cu%a longitud vara en un >nico nucletido

* +inales de los a8os B

+ueron 1ublicados dos 2todos r-1idos % e+icientes de Estos 2todos 1er2iten de 2anera si21le % r-1ida5

secuenciacin de *$0A el de degradacin 3u2ica de Ea;a2 % Gilbert % el de ter2inacin de cadena ideado 1or Sanger. determinar la secuencia de nucletidos de cualquier fragmento de ADN . Estos 1ri2eros intentos de secuenciar -cidos nucledos siguieron los 1asos e21leados en la secuenciacin de 1rotenasA ro21er las 2olculas en 1e3ue8os +rag2entos5 deter2inar su co21osicin de bases % deducir la secuencia a 1artir de +rag2entos sola1antes. Este 2todo resulta relativa2ente sencillo 1ara 1rotenas donde estas resultan de la co2binacin de 7asta 2 a2ino-cidos distintos5 1ero constitu%e un 1roble2a en el caso de los -cidos nucledos donde la secuencia resulta de la co2binacin de >nica2ente cuatro nucletidos di+erentes. 4/a8e.5 E. )==B6

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert. Griginal2ente descrito 1or *. Ea;a2 % H. Gilbert en )=BB. Consiste en ro21er cadenas de *$0 de cadena sencilla 2arcadas radiactiva2ente con reacciones 3u2icas es1ec+icas 1ara cada una de las cuatro bases. /os 1roductos de estas cuatro reacciones se resuelven5 1or electro+oresis5 en +uncin de su ta2a8o en geles de 1oliacrila2ida donde la secuencia 1uede leerse en base al 1atrn de bandas radiactivas obtenidas 4Corvalan5 2 26

$escri1cin del 1rocesoA Se to2a un +rag2ento de *$0 % se 2arca radiactiva2ente5 general2ente se 7ace en los e;tre2os de la cadena % se 1uede reali.ar con ga22a#2@ o ga22a #2Sd*T@ esto 1or accin de la 3uinasa. Se to2an cuatro alcuotas de la 2is2a 2uestra % se tratan bajo condiciones distintas. *s 2ediante reacciones 3u2icas es1ec+icas 1ara cada base se ro21en estas 2olculas 2arcadas. Seguida2ente el trata2iento con 1i1eridina ro21e las el *$0 a nivel de la base 2odi+icada. El 1roducto de las cuatro reacciones electro+oresis 4Corval-n5 2 se dis1one en geles de 1oliacrila2ida % se se1aran 2ediante bases de secuencia. donde la secuencia 1uede leerse con base en el 1atrn de bandas 26.

radiactivas obtenidas. Esta tcnica 1er2ite la lectura de unas )

Fig.) Es3ue2a del 2todo de Ea;a2 % Gilbert. FuenteA 7tt1AIIJJJ.iib.ua2.es Mtodo enzimtico de anger $ise8ado 1or Sanger5 0icKlen % Coulson ta2bin en )=BB % se conoce co2o 2todo de los ter2inadores de cadena o dideo;i. @ara utili.ar este 2todo se re3uiere un *$0 de cadena si21le co2o 2olde % cebador co21le2entario a una regin del *$0 2olde donde dar- lugar la iniciacin de la secuencia. El cebador +unciona co2o sustrato de la *$0 1oli2erasa 3ue va a sinteti.ar la secuencia de bases de la cadena co21le2entaria a la cadena 2olde de *$0. 4Corval-n5 2 26.

$escri1cin del 1rocesoA Se agrega un 1ri2er a la secuencia 3ue se 3uiere anali.ar5 1ara 3ue la 1oli2erasa se una a la cadena % e21iece a sinteti.ar la cadena co21le2entaria. Seguida2ente se lleva a cabo la secuenciacin 2ediante cuatro reacciones de sntesis

se1aradas en las cuales a cada una se le agregan 1e3ue8as cantidades de los dideo;inucletidos 4dd0T@A ddGT@9 dd*T@5 ddCT@5 ddTT@6 3ue carecen de e;tre2o #L G: libre % 3ue al incor1orarse en la cadena de *$0 3ue se esta sinteti.ando acaban con la elongacin de la 2is2a. Con la incor1oracin de estos dideo;inucletidos los d0T@ corres1ondientes co21iten 1or unirse a sus bases co21le2entarias lo 3ue da a la +or2acin de una 2e.cla de cadenas de di+erentes longitudes5 todas ellas e21e.ando en el e;tre2o 'L % acabando en todas las di+erentes 1osiciones 1osibles donde un dd0T@ 1uede incor1orarse en lugar de un d0T@. /a sustitucin de uno de los d0T@s 1or el 2is2o nucletido 2arcado radiactiva2ente 1er2ite la visuali.acin de las bandas de distinta longitud en un gel de 1oliacrila2ida donde cada una de las reacciones se carga en un carril. En el gel la se1aracin de las distintas bandas se 1roduce en +uncin de su ta2a8o % la secuencia 1uede deter2inarse le%endo las bandas de los cuatro carriles. En este ti1o de geles 1ueden leerse 7asta # 1uede llegar a ser de 7asta ' bases. En carreras 2-s largas la lectura 26. bases. 4Corval-n5 2

Fig2. Es3ue2a del 2todo de Sanger. FuenteA 7tt1AIIJJJ.iib.ua2.es

*2bos 2todos di+ieren en 3ue uno 1er2ite leer el cdigo gentico ro21iendo la 2olcula de *$0 en nucletidos es1ec+icos % el otro5 incor1orando nucletidos 3ue blo3uean la e;tensin de la sntesis de *$0 4Ea;a2 % Gilbert6 Este ltimo mtodo es el
ms utilizado actualmente, en particular, en los mtodos de secuenciacin automtica

4Corval-n5 2

26.

/a secuencia en s no desci+ra toda la in+or2acin contenida en el geno2a5 sola2ente es el 1ri2er 1aso. @osterior2ente se deben integrar todos los +rag2entos %a secuenciados 1ara conocer su estructura +sica9 este gran ro21ecabe.as no solo est- +or2ado 1or 1ie.as >nicas5 a lo largo de todo geno2a se 1resentan re1eticiones de secuencias de diversos ti1os 4satlites5 2icrosatlites5 2inisatlites6. /a +uncin de estas secuencias re1etidas 7asta a7ora es 2u% 1oco conocida o total2ente un 2isterio. Si bien su 1osible +uncin constitu%e una interrogante cient+ica 2u% relevante5 su 2era e;istencia 1lantea un 1roble2a tcnico +or2idable. *l 2o2ento de 3uerer integrar una secuencia trasla1ante no sie21re es seguro 3ue sta se ubi3ue en el lugar e;acto 1or lo 3ue el ar2ado se reali.a solo des1us de co21arar la secuencia con otras 3ue se encuentren cercanas al lugar 7i1ottico % 1robarlo con todas las 1osiciones 1osibles5 este 1roceso se lleva a cabo asistido 1or co21utadora dado el ta2a8o de la in+or2acin a 1rocesar5 sin e2bargo la intervencin 7u2ana es indis1ensable 1ues no 7a% 2-3uina ca1a. de igualar el raciocinio 7u2ano. 4Corval-n5 2 26.

*de2-s de estos 2todos se 7an creado nuevas tcnicas 1ara secuenciar geno2as 1or eje21loA o ecuenciacin !or sntesis" ce1as de *$0 1ara la 1b 3ue se

Est- tcnica 1er2ite secuenciar si2ult-nea2ente 2-s de 2! .

lectura de unas 2' bases % es a1licable a 2olculas individuales de *$0. Consiste en la secuenciacin si2ult-nea de 1e3ue8os +rag2entos de *$05 2-;i2o de # 1uede llegar a introducir errores. 4:arris5 2 !6 encajan des1us5 este 1roceso re3uiere @CR 1revia5 lo 3ue la 7ace una tcnica costosa %

Fig.". Es3ue2a del 2todo de Secuenciacin 1or sntesis. Fuente 7tt1AIIJJJ.science2ag.org

ecuenciacin !or nano!oros"

Est- tcnica es desarrollada5 1or un gru1o de cient+icos coordinados 1or el $octor $avid Stoddar 1erteneciente al $e1arta2ento de Mu2ica5 de la ,niversidad de G;+ord5 en Inglaterra. Consiste en una versin alterada de una 1rotena bacteriana lla2ada 1resente en E. coli 3ue de1ende de calcio 7e2olisinaFal+a 4:l% *6 es una citoto;ina

e;tracelular 1ara su activacin5 % 3ue ataca la 2e2brana de la clula blanco5 insert-ndose en la 2is2a % +or2ando 1oros 7idro+licos (Garca, 2000). @or estos 1oros 1asan +rag2entos de *$05 lo 3ue incre2enta la di+usin de corrientes 3ue se 1roducen 2ientras di+erentes bases de *$0 ocu1an el 1oro. /a tcnica 1er2ite distinguir entre grandes cadenas de bases * % C % 1er2ite 1recisar la identi+icacin de las cuatro bases en una deter2inada secuencia 4$obson5 2 =6.

Este 2todo 7a 1er2itido a la co2unidad investigadora secuenciar geno2as de +or2a 2-s r-1ida % 2enos costosa en co21aracin con los 2todos de secuenciacin dis1onibles. /os nano1oros 1rotenicos 7an 1er2itido a la co2unidad investigadora secuenciar geno2as de +or2a 2-s r-1ida % 2enos costosa en co21aracin con los 2todos de secuenciacin dis1onibles. /os autores del an-lisis5 3ue se 1ublica 7o% en @0*S5 e;1lican 3ue los nano1oros son 1rotenas naturales 3ue 1er2iten la entrada de 1e3ue8as 2olculas a travs de una 2e2brana. 4$obson5 2 =6.

Fig. #. Es3ue2a de la secuenciacin 1or nano1oros. Fuente 7tt1AIIJJJ. bioinformatica.uab.es o o o Eicrosco1as de e+ecto t>nel 4STE6 % de +uer.a at2ica 4*FE6 Secuenciacin 1or 7ibridacinA c7i1 de 7ibridacin Secuenciacin 1or 7ibridacin en c7i1s con oligonucletidosA Se basa en sinteti.ar distintas sondas de oligonucletidos5 % unirlas en dis1osiciones ordenadas 4arrays6 a una +ina 1astilla de n%lon o vidrio. Este c7i1 se 1rueba +rente a un *$0 2arcado +luorescente2ente5 de 2odo 3ue el 1atrn % cantidad de +luorescencia su2inistra in+or2acin sobre la secuencia del *$0 en cuestin.

Ta2a8os de algunos geno2as secuenciados % n>2ero de genes 3ue contienen 4Rodrgue.5 G. 2 Es1ecies Mycoplasma genitalium Rickettsia prowazekii Haemophilus influenzae Methanococcus jannaschi Bacilus subtilis Escherichia coli Myxococcus xanthus Sacharomyces cere isiae !rosophila melanogaster "aebnorhab#itis elegans Homo sapiens $rabi#opsis thaliana %ryza sati a "(( )#5' )(' =B #.# )2' ''. (. #" )2. )=. == #'. 2'. )5!# )5(( "52 "5( ).B#! ".) ).! !. 6. Geno2a 4Eb6 5'! )5)) "B !#" ).B"# Genes

*1licaciones de la secuenciacin de *$0A 4Ra2os5 *. et al. 2 o Deteccin de mutacionesA

(.6

Esta tcnica nos 1er2ite locali.ar 2utaciones 1revia2ente descritas. Se e21lea as la secuenciacin de *$0 co2o un 2todo de diagnsticoA una ve. 3ue se 7a caracteri.ado la relacin con una en+er2edad de una deter2inada 2utacin 1untual 42utaciones en el gen de la galactosa )@ uridiltrans+erasa en

la galactose2ia5 2utaciones en cFRas % c-ncer5 etc.6 o de una 1e3ue8a delecin 4delecin de # bases en el gen CFTR en la +ibrosis 3ustica65 1uede desarrollarse un 2todo de deteccin rutinario. /a secuenciacin auto2-tica 1uede e21learse co2o 2todo de screenig en la locali.acin de nuevas 2utaciones. o ecuenciacin de ADNs fsilesA El uso del @CR 7a abierto la 1osibilidad de aislar secuencias de *$0 a 1artir de unas 1ocas co1ias intactas 1resentes en es1ec2enes de 2useo % descubri2ientos ar3ueolgicos en los cuales la 2a%ora de las 2olculas est-n da8adas o degradadas5 1ara 1roceder 1osterior2ente a su estudio 2ediante secuenciacin. o Diagnstico !renatal # Diagnstico !reim!lantacin" $iagnstico de en+er2edades 7ereditarias o deter2inacin del se;o del +eto 1revia2ente a su i21lantacin en 1rocesos de +ecundacin in vitro. ,na o dos clulas del 1reFe2brin se retiran en el estado de ! a )( clulas5 1revio a la i21lantacin. Estas 1ueden utili.arse 1ara a21li+icar un gen o genes es1ec+icos % as estudiar la en+er2edad gentica o el se;o 4utili.ando genes es1ec+icos del cro2oso2a C6. o $dentificacin de es!ecies y control de cruces entre animales /as tcnicas 1ara identi+icar es1ecies 1ueden ser 2u% i21ortantes 1ara descubrir +raudes co2erciales5 tales co2o vender carne de una es1ecie 2-s barata a los 1recios de otra 2-s cara5 o el co2ercio ilegal de es1ecies en 1eligro. Estos estudios 1ueden reali.arse utili.ando el *$0 2itocondrial5 el cual 1resenta secuencias alta2ente variables entre es1ecies distintas5 aun3ue sean cercanas entre s5 % bastante conservadas dentro de la 2is2a es1ecie. /os controles de relaciones 1arentales en ani2ales tiene i21ortancia +orense 1ara el control de co2ercio ilegal de es1ecies 1rotegidas. Individuos jvenes de es1ecies en 1eligro son sacados de sus lugares de naci2iento %

Ndis+ra.adosN 1or certi+icados veterinarios +alsos. En estos casos5 el estudio +a2iliar es el >nico 2edio de descubrir el origen ilegal de los individuos.

%royecto Genoma &umanoA El @ro%ecto Geno2a :u2ano es un 1ro%ecto internacional cu%o objetivo +inal es obtener una descri1cin co21leta del geno2a 7u2ano a travs de la secuenciacin del *$0. El geno2a 3ue se investiga es el geno2a nuclear. $esde su inicio5 el 1ro%ecto 7a sido justi+icado es1ecial2ente 1or los bene+icios 2dicos 3ue se es1era obtener del conoci2iento de la estructura de cada gen 7u2ano. Esta in+or2acin 1ro1orcionar- una ca1acidad de diagnstico en individuos con riesgo de ser 1ortadores del gen de alguna en+er2edad. Ta2bin se es1era 3ue a1orte un 2arco de trabajo 1ara el desarrollo de nuevas tera1ias5 ade2-s de nuevas estrategias 1ara la tera1ia gnica.

o Eedicina 2olecular o Gen2ica 2icrobiana o &aloraciones de riesgo

o

Bioar3ueologa5 antro1ologa5 evolucin % estudio de 2igraciones 7u2anas5 1aleogentica 1rinci1al2ente a 1artir del *$0 +sil

o Identi+icacin *$0 o *gricultura % bio1rocesa2iento

'ibliografa Corval-n5 *. 42 26. Biologa 2olecular en In+ectologa @arte IA $esarrollo % 2etodologas.

Revista Scielo 5 vol.)= 11. )"F2".

$obson5 E. 42) de " de 2

=6. &os nanoporos mejoran las t'cnicas #e secuenciaci(n. =5 de

Recu1erado el )! de ' de 2 secuenciacion. Garca5 ?. 42

7tt1AIIJJJ.d2edicina.co2Ien+er2edadesIactualidadInano1orosF2ejoranFtecnicasF

6. $eteccin del e+ecto citot;ico de la al+a 7e2olisina de E. coli 4:l% *6 en

leucocitos 1oli2or+onucleares neutr+ilos 2ediante cito2etra de +lujo . Re ista "ostarricense #e "iencias M'#icas 5 vol 2). @1. )2BF)#=. :arris5 T. 42 !6. SingleFEolecule $0* Se3uencing o+ a &iral Geno2e. Revista Science.

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