INTRODUO PRTICA (01) OBJETIVOS: Produo da enzima invertase de Saccharomyces cerevisiae utilizando diferente fonte de carbono.

MATERIAL - Microrganismo Saccharomyces cerevisiae - Meios de cultura Caldo Nutritivo modificado - E ui!amentos" Es!ectrofot#metro Mesa agitadora $alana semi-anal%tica - &iversos" Cubetas do es!ectrofot#metro 'ubos de ensaio est(reis ) Erlenmeyers* +,,,ml Pi!etas* +ml e +,ml MTODOS 1) Produo da i !"r#a$" +. Pre!arar +*- litros de caldo Nutritivo* distribuir -,,ml em ) Erlenmeyers de +,,,ml de ca!acidade. .dicionar no !rimeiro +,g de glicose* no segundo +,g de sacarose e no terceiro +,g de frutose* homogeneizar e esterilizar a +/+ o C !or +- minutos. &ei0ar esfriar1 /. Colocar os Erlenmeyers na balana semi-anal%tica e inocular esterilmente cerca de +*, 2 -*,g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae 3fermento liofilizado ) e incubar a tem!eratura ambiente sob agitao1 ). Centrifugar o caldo fermentado a +,,,, r!m !or +, min. 4. 5emover o sobrenandante* caldo fermentado contendo a enzima invertase* !ara um Erlenmeyers est(ril e conserv6-lo sob refrigerao.

PRTICA % 7$8E'9:7 &eterminar a atividade da invertase variando a 'em!eratura e !;

MATERIAL - Enzima 9nvertase obtida das fermenta<es anteriores - E ui!amentos" Es!ectrofot#metro Mesa agitadora $alana semi-anal%tica - &iversos" Cubetas do es!ectrofot#metro 'ubos de ensaio est(reis Erlenmeyers Pi!etas* +ml e +,ml MTODOS %& A#i!idad" " 'i()#i*a 1 No reator adicionar =*, m> da soluo de sacarose a ,*,? M* dilu%da em tam!o fosfato de s@dio ,*,- M a !; -*/* e +*, m> da amostra convenientemente 3mosto filtrado obtido no item anteriorA. .s rea<es sero realizadas a -, oC. E a amostra retirada a!@s um tem!o de +, minutos de reao. Com o au0%lio de uma curva de calibrao !reviamente determinada !elo m(todo de &NS 3ane0o +A !ode-se determinar a atividade enzim6tica. %&1& E+"i#o do ,- a a#i!idad" da i !"r#a$" . reao ser6 realizada em diferentes tubos de ensaio contendo a soluo de sacarose a ,*,? M* dilu%da em tam!o fosfato de s@dio ,*,- M 34*-mlA variando o !; 3-*/ e +,A. 9nicialmente a soluo deve ser inserida no tubo* submetida ao banho* uando a tem!eratura atingir a ' da reao 3-, oCA* adiciona-se a invertase 3,*-mlA. 7 tem!o da reao ser6 de +, min. 'abela %&%& E+"i#o da T"(,"ra#ura a a#i!idad" da i !"r#a$" . reao ser6 realizada em diferentes tubos de ensaio contendo a soluo de sacarose a ,*,? M* dilu%da em tam!o fosfato de s@dio ,*,- M 34*-mlA variando a 'em!eratura de acordo com a tabela. 9nicialmente a soluo deve ser inserida no tubo* submetida ao banho* uando a tem!eratura atingir a ' deseBada* adiciona-se a invertase 3,*-mlA. 7 tem!o da reao ser6 de +, min. 'em!eratura de ensaio ser6 de , oC* +,, oC e -,oC

A ".o1
C6lculo " &eterminao da atividade enzim6tica" .EC D E 0 +, ? F +,,,.PM t .E C .tividade enzim6tica t C tem!o de reao +,,,C fator de consero de > ml PMC !eso molecular"+G,g 3glicoseA1 )4/g 3 sacaroseA +, ? C fator de converso de mol em Hmol D E C concentrao de glicose em gF> M(todo de determinao da atividade enzim6tica !or inclinao da reta" .EC 3 FIA 0 /J*JJJ 0 d dC diluio da invertase C coeficiente angular da amostra 3absobancia 0 tem!o de reaoA IC coeficiente angular de !adro de glicose na sacarose 3absobancia do !adro 0 concentrao de aucarA
+

.bsorbKncia

.bsorbKncia

Conc de aLcar

t 3minA

A ".o % D"#"r(i ao d" A/*ar"$ R"du#or"$ ,"0o M1#odo do DNS I #roduo2 7s aLcares redutores das amostras !odem ser determinados !elo m(todo do &NS. Este m(todo consiste na reduo* em meio alcalino* do 6cido )*- 2 dinitrossalic%lico em 6cido )- amino---nitrossal%cilico !or ao dos aLcares redutores* dando origem a um com!osto acastanhado ue obedece a lei de >ambert-$eer* ou seBa* a transmitKncia ( !ro!orcional M concentrao da substKncia dissolvida* neste caso* os aLcares redutores.

E E E Com!onentes e uantidades Ocido )*--dinitrossalic%lico Soluo /N de Na7; Sal de 5ochellle Ogua destilada at( 3ver nota .A +*, g /,*, m> ),*,g +,,*, m>

1& 5 .N N'

M7&7 &E P5EP.57 &issolver M tem!eratura ambiente 3ver nota $A +*, g de 6cido )*-dinitrossalic%lico em -, m> de 6gua destilada 3ocorre dissoluo !arcial do 6cidoA. .os !oucos* adicionar os /, m> da soluo /N de Na7;* agitando sem!re* at( a dissoluo com!leta do 6cido. .dicionar ),g de sal de 5ochelle1 dissolver e com!letar o volume at( +,, m>. 3ver nota CA.

Notas

." 7 sal de 5ochelle ( o tartarato de !ot6ssio e s@dio tetrahidratado. Sua funo ( !roteger o reagente e* conse uentemente* o aLcar da amostra* da ao do o0igPnio dissolvido. $" Essa dissoluo ( demorada* necessitando de agitao constante. Para favorecer o !rocesso* ela !ode ser feita a uma tem!eratura !r@0ima a ), , C. C" Proteger o reagente da ao do C7/1 hidr@0ido de s@dio na soluo. Cur!a d" Ca0i3rao do DNS +. Em um co!o de $( uer de -,ml !esar* em balana semi-anal%tica* /,g de glicose* anotando o valor e0ato. &iluir em um !ouco de 6gua e transferir* analiticamente* !ara um balo de +,,,ml. Com!letar o volume e homogeneizar1 . !artir da concentrao da sus!enso !adro escolher os valores !ara as concentra<es* de forma a cobrir uma determinada fai0a de concentra<es1 5ealizar uma s(rie de dilui<es com um conBunto de !i!etas e bal<es volum(tricos ade uados. Qtilizar como sugesto os valores da tabela abai0o. Su$," $o Co *& da 8a#or d" Modo d" /("ro di0uio4 di0uio ,r",aro 5 (670) ((0 da $u$,& ,adro) + ,*/ +,,0 - at( -,, / ,*4 -,0 + at( -,, ) ,*? ))*)0 +- at( -,, 4 ,*G /-0 / at( -, +*, /,0 /*- at( -, ? +*/ +?*?J0 )*, at( -, J +*+)*))0 += at( /-, G +*? +/*-0 /, at( /-, ;omogeneizar cada sus!enso e transferir !ara um tubo de es!ectrofot#metro !reviamente aBustado ao com!rimento de onda de -4, nm. 5ealizar* !elo menos* duas leituras do valor da absorbKncia !ara cada concentrao. 7 es!ectrofot#metro ( calibrado antes de cada leitura* com um RbrancoS de 6gua destilada. Construir um gr6fico* colocando no ei0o das ordenadas os valores da concentrao de glicose T 3gFlA e no ei0o das abscissas os valores da absorbKncia 3&.7A.

/.

).

4.

-.

?.

J. G.

Uazer uma regresso linear com o au0%lio de um !rograma de com!utador ou utilizando o m(todo dos m%nimos uadrados. Calcular o coeficiente de correlao* r* e determinar o intervalo de concentra<es* T + V T / * no ual a e0!resso ( v6lida.
0,7

Cur a !e ca"ibrao #"icose

0,6 0,5

$% &0,063'6(0,2003') r%0,**554

Abosrbncia DO

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Concentrao g/L

Pro*"di(" #o ".,"ri(" #a0 ,ara a a(o$#ra 1&1&

Pr",arao da$ a(o$#ra$ *o #" do $a*aro$"

'ransferir +m> da amostra !ara um tubo de ensaio1 .dicionar +m> de ;Cl concentrado1 . uecer em banho-maria a ?GWC !or +-min1 Neutralizar com Na7; utilizando fenolftale%na como indicador1 .ferir o volume M diluio deseBada.

1&%& T"$#" *o( DNS

'ransferir ,*-m> da amostra !ara o tubo de Uolin Xu e adicionar +m> de &NS. ;omogeneizar1 >evar o tubo de Uolin Xu a banho-maria !or -min a +,,WC1 .ferir o volume !ara +/*-m> com 6gua destilada1 ;omogeneizar a amostra e realizar a leitura da 'ransmitKncia no es!ectrofot#metro devidamente calibrado utilizando com!rimento de onda YC -4,nm.

1&9& Pr",arao do :ra *o 5e!ete-se o mesmo !rocedimento !ara a !re!arao da amostra* entretanto a al% uota retirada deve ser 6gua. Em seguida* realizam-se os !rocedimentos !ara o teste com &NS.