Evaluacin del efecto de la hormona gonadotropina corinica humana (hCG) en la maduracin ovrica en Hyla eximia (Rana nacional) Barran

Salmn Alberto Eduardo, Florentino de la Cruz Natividad, Monroy Santiago Diana Araceli, Romero Santamara Arturo, Vzquez Sandoval Armando Laboratorio de Metodologa Cientfica III de la FES Iztacala, UNAM
Resumen En Mxico el 66% de las especies de anfibios se consideran en riesgo poblacional. Lo que produce un alarmante desequilibrio ecolgico debido a su papel como controladores de la poblacin de insectos y bioindicadores de la calidad del ambiente. Debido a esto es necesaria la conservacin de los anfibios. Una especie representativa de Mxico es Hyla eximia, especie perteneciente a la familia Hylidae, debido a que por su ciclo reproductivo alcanzan la madurez sexual hasta los cuatro aos y por su alta demanda como mascota, su poblacin se ha visto amenazada. Se han realizado protocolos para su reproduccin en cautiverio como la induccin de la ovulacin mediante la administracin de hormonas gonadotropicas. Sin embargo, no se han realizado estudios en la induccin de la maduracin de la gnada en ejemplares juveniles, por lo que el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la hormona gonadotropina corinica humana en la maduracin ovrica de la rana nacional (H. eximia) y determinar las caractersticas morfolgicas del ovario y de los folculos despus de la administracin de la homona a la semana; as como los cambios fsicos externos de H. eximia. Se inyectaron dos dosis de la hormona a concentraciones de 0.3 UI y 0.6 UI cada 48 h., midindose y pesndose diariamente. Las ranas se sacrificaron al quinto da para extraer la gnada y stas se procesaron mediante la tcnica histolgica y la tincin de hematoxilina-eosina. Se observaron por microscopa ptica, determinndose la presencia de folculos vitelognicos en ambas concentraciones. Mediante el estadstico de ANOVA se encontraron diferencias significativas (P>0.05), siendo la concentracin de 0.3 UI la que present los mayores dimetros en promedio; no se encontraron diferencias significativas (P<0.05) entre las variaciones de peso y talla. Se concluy que la mejor dosis para la induccin de la maduracin es a 0.3 UI. Palabras clave: Hyla eximia, gonadotropina corinica humana, maduracin gonadal

Introduccin En nuestro pas habitan ms de 290 especies de anfibios, de las cuales el 60.7% son exclusivas de Mxico y debido a la modificacin y destruccin de sus hbitats se considera que el 66% de las especies de anfibios estn en riesgo poblacional de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, NOM-059-ECOL-2001 (Suazo y Alvarado, 2004). Los anfibios son de importancia ecolgica debido a que constituyen parte de la biomasa, son controladores de poblaciones de insectos y artrpodos (Suazo y Alvarado, 2004). Entre ellos se encuentran las ranas que funcionan como indicadores altamente sensibles del estrs ambiental y por su ciclo de vida. Motivo por el cual constituyen excelentes modelos para evaluar los cambios morfo estructurales que puedan producirse (Browne and Zippel, 2007 e Izaguirre et al., 2006). Rana nacional (Hyla eximia), una especie perteneciente a la familia Hylidae, distribuida en los estados de Durango, Guerrero, Veracruz, Estado de Mxico, Distrito Federal, Morelos, Puebla y Tlaxcala, llega a medir hasta 4.5 cm de largo en el caso de la hembra; mientras que el macho llega a alcanzar aproximadamente a los 3.5 cm (Gmez-Prez et al., 2011). H. eximia es de importancia en la industria de mascotas, stas se extraen directamente de su hbitat, generando as, un descenso en su poblacin (Franco y Sarmiento, 2012). Por lo que la necesidad de conservar su poblacin silvestre es de vital importancia. Existen especies de la familia Hylidae que se encuentran amenazadas, como lo son Hyla plicata, Exedoronta melanoma entre otros; o en proteccin especial (NOM-059-SEMARNAT2010), considerndose importante lograr la cra en cautiverio; estableciendo protocolos para su reproduccin y poder as restablecer la poblacin de estos organismos. Para ello, existen tecnologas reproductivas aplicadas en los programas de cautiverio, que son valiosas herramientas frente a las dificultades en la obtencin de cras de las especies amenazadas. Estas tcnicas incluyen: fertilizacin asistida, sincronizacin hormonal y almacenamiento de gametos (Franco y Sarmiento, 2012), mediante la induccin de la ovulacin y espermiacin en ranas maduras por medio de la estimulacin de las gnadas de la rana para as obtener los gametos maduros empleando hormonas como la folculo estimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina corinica humana (hCG), (Franco y Sarmiento, 2012 y Trudeau et al., 2010). En anuros, la maduracin sexual se alcanza hasta despus de los cuatro aos, tiempo en el que el ovario madura, as como las clulas germinales lo hacen por el proceso de ovognesis y los folculos por vitelognesis (Gmez-lvarez y Martn de Serrano, 1983). Durante el proceso de ovognesis hay una secrecin de hormonas liberadoras de gonadotropinas por parte del hipotlamo, las cuales promueven a la pituitaria para la produccin de gonadotropinas como la hormona luteinizante (LH) y la hormona folculo estimulante (FSH) (Franco y Sarmiento, 2012), las cuales viajan de manera endcrina hasta llegar a su rgano blanco, las gnadas donde la FSH acta sobre stas promoviendo su maduracin y la secrecin de estrgenos y de progesterona (PrietoGmez y Velzquez-Paniagua, 2002). Durante la ovognesis de los anfibios, la accin de la FSH sobre los folculos, promueve una sntesis de estrgenos y de estradiol-17 el cual promueve la produccin de vitelogenina por parte del hgado y posteriormente este es transportado por el torrente sanguneo al ovario (Wallace y Bergink, 1974 y Gilbert, 2005) donde entran al ovocito mediante pinocitosis y es almacenado como plaquetas de vitelo habitualmente en el polo vegetal (Gilbert, 2005).

Una vez alcanzada la maduracin sexual de la gnada, comienza el periodo reproductivo, en el caso de H. eximia se presenta entre el mes de mayo y agosto, comenzando los primeros das de junio y terminando los primeros das de julio; en las hembras el proceso de ovognesis se realiza antes del inicio de la temporada de reproduccin, ya que se encuentran ovocitos maduros predominantemente (Aguilar y Casas, 1999). Trabajos anteriores han demostrado que la aplicacin de hCG tiene efectos en el desarrollo gnadal. Aguilar-Miguel y colaboradores en 2009 encontraron que la respuesta a la estimulacin hormonal con dosis de 750 y 900 UI de hCG, sin combinacin con otra hormona en Ambystoma granulosum y A. lermaense, fue positiva en los dos sexos, ya que hubo respuesta en la ovulacin en las hembras y la produccin de espermatozoides en los machos, correspondiendo a la activacin del ciclo hormonal. En la rana Osteopillus septentrionalis, se logra la induccin de la ovulacin aplicando tres dosis, la primera dosis de 0.007 mg de FSH/g y 24 horas despus dos dosis de 400 y 800 UI (Trujillo et al., 2008). Estudios en la rana Montezumae bajo un tratamiento hormonal de hCG en hembras se obtuvo una produccin de los gametos (vila et al., 2009). A pesar de esto los antecedentes son trabajos con especies ajenas y encaminadas a la ovulacin y espermiacin en ranas ya maduras; Tohru y Hisaaki (1989) encontraron que a los 90 minutos de inyectar la hormona HCG en juveniles de Rana nigromaculata macho presentaron un desarrollo del lumen en los tbulos seminferos. Al no existir antecedentes suficientes acerca de la maduracin ovrica de la especie H. eximia en estado juvenil mediante la hCG, este estudio busca la induccin de la maduracin gonadal en hembras, adems se espera realizar un aporte al conocimiento bsico de la induccin hormonal en la familia Hylidae. Si la hCG promueve la maduracin de la gnada a una concentracin de 0.3 UI, entonces una concentracin al doble promover un mayor grado de maduracin. Objetivo general Evaluar el efecto de la hCG en la maduracin del ovario de H. eximia. Objetivos particulares Determinar las caractersticas morfolgicas del ovario y de los folculos de H. eximia despus de dos dosis de hCG a 0.3 y 0.6 UI. Metodologa Obtencin del modelo experimental Se compraron 12 ranas de la especie H. eximia en etapa juvenil de un tamao de 1-2 cm y de un peso aproximado de 1 g, en el Mercado de Mixuca, D.F. Se mantuvieron en 3 peceras subdivididas en 4 espacios de 15 cm de largo x 15 cm de ancho x 15 cm de alto cada una con 1cm de profundidad de agua potable, las que contenan una rana por espacio. Se agregaron rocas de canto rodado pequeas, se rosearon las paredes y se

alimentaron a base de grillos y moscas de fruta (4 grillos y 10 moscas de fruta para cada rana) diario durante una semana para su aclimatacin. Obtencin de la hormona La hormona corinica humana (hCG) se consigui en la farmacia San Pablo a una concentracin de 5000 UI en una ampolleta con un mililitro de solucin fisiolgica. Aplicacin de los tratamientos La manipulacin se realiz con guantes y se midieron de hocico-cloaca con la ayuda de una hoja milimtrica colocndolas en una caja Petri para su mejor manipulacin y se pesaron mediante una balanza digital durante cinco das. Para la aplicacin de (hCG) se usaron jeringas para insulina de 0.5 mL. A las cuatros repeticiones por tratamiento se les inyect subcutneamente en el saco dorsal linftico cada 48 horas durante 5 das 0.3 UI/g, 0.6 UI/g y a un grupo control se les inyect solucin fisiolgica al 0.9% (Tohru y Hisaaki, 1989). Obtencin de los ovarios y procesamiento Se sacrificaron a los animales en un frasco aadiendo unas gotas de cloroformo (Hospital General Universitario de Valencia, 1990), y se realiz una diseccin para la obtencin de la gnada y se proces mediante la tcnica histolgica y la tincin de hematoxilina y eosina (Palomar et al., 2005) para su observacin al microscopio ptico y la determinacin de la maduracin de folculos previtelognicos y vitelognicos. Se realiz un anlisis estadstico de ANOVA con un valor de riesgo de error de 0.05 para determinar la presencia de diferencias significativas entre las variaciones de peso, talla y dimetro de folculo de los tratamientos. Resultados En la variacin del peso durante la aplicacin de hCG (Fig. 1) se observ en el tratamiento control y en el tratamiento 0.3 que la variacin del peso en cada da no fue muy alta, aunque en el tratamiento 0.6 se observ una mayor variabilidad de peso; sin embargo, en el estadstico de ANOVA no se determinaron diferencias significativas entre los tres tratamientos. En la figura 2, se observa como la concentracin 0.3 y 0.6, mostraron una reduccin en el peso, siendo el tratamiento 0.6 el que present una mayor disminucin de peso; por el contrario, el grupo control fue el nico caso en el que se registr un aumento de peso. Se determin mediante un anlisis de ANOVA que la prdida de peso no es significativo.

Variacin de peso
1.2 1 Peso (g) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 Das 4 5 6 7 Control [0.3] [0.6]

Fig. 1: Variantes en el peso durante la aplicacin de hCG.

Cambio de peso
0.45 0.4 0.35 0.3 Peso (g) 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Tratamientos control [0.3] [0.6]

Fig. 2: Cambio en el peso durante la aplicacin de los tratamientos. Nota: los valores de los tratamientos 0.3 y 0.6 indican disminucin en el peso y se consideraron sus valores absolutos para la grfica. En la variacin de talla (Fig. 3) durante la aplicacin de hCG no se observ una variacin importante entre el tratamiento 0.3 y el control, los cuales presentaron una tendencia similar; sin embargo, el tratamiento 0.6 muestra un ligero aumento en la talla en comparacin a los otros dos tratamientos. En la figura 4 se observa una marcada diferencia entre el aumento de la talla del grupo control y del tratamiento 0.6; sin embargo de acuerdo con el estadstico de ANOVA

(P>0.05) no se encontraron diferencias estadsticamente significativas entre los tratamientos.

Variacin de talla
3.5 3 2.5 Talla (cm) 2 Control 1.5 1 0.5 0 0 1 2 3 Da 4 5 6 7 [0.3] [0.6]

Fig. 3: Variacin de la talla entre los tratamientos.

Cambio en el tamao
0.18 0.16 0.14 Largo (cm) 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 Tratamientos Control [0.3] [0.6]

Fig. 4: Aumento de tamao promedio de las ranas. Posteriormente del sacrificio de las ranas por medio de clorofomo, se les eviscer y se observ la presencia del ovario, ubicndolas por encima del rin. Se caracteriz por presentar un color blanco y lobulado al observarse por el microscopio (Fig. 5, 6, 7, 8). El ovario del grupo control (fig. 5) visualmente se observ de un tamao ms reducido en comparacin con los dems tratamientos.

Fig. 5. Ovario de grupo control

Fig.9 . Control. Vista 40x. Ovocitos de H. eximia: Se observan folculos previtelognicos con ncleo (n), nuclolos (nu), citoplasmas (C ), membrana vitelina (flechas bidireccionales) y clulas foliculares (Cf). H-E.

Fig. 6. Ovario de tratamiento 0.3

Fig. 10. [0.3]. Vista 40x. Ovocitos de H. eximia: Se observan folculos vitelogenicos y un previtelognico (recuadro) con ncleo (n), nuclolo (un), citoplasmas y vitelo (C y V ), membrana vitelina (flechas bidireccionales) y clulas foliculares (Cf). H-E.

Fig. 7. Ovario de tratamiento 0.6

Fig. 11. [0.6]. Vista 40x. Ovocitos de H. eximia: Se observan folculos vitelogenicos con ncle (n), nuclolo (un), citoplasmas y vitelo (C y V ), membrana vitelina (flechas bidireccionales) y clulas foliculares (Cf). H-E.

Fig. 8. Ovario de rana de tratamiento 0.6

Fig. 12. [0.6]. Vista 40x. Ovocitos de H. eximia: Se observan folculos vitelogenicos y un previtelognico (recuadro) con ncle (n), nuclolo (un), citoplasmas y vitelo (C y V ), membrana vitelina (flechas bidireccionales) y clulas foliculares (Cf). H-E.

En el grupo control se observ un mayor nmero de folculos previtelognicos (Fig. 9); mientras que en el tratamiento 0.3 y 0.6 (Fig. 10-12) se presentaron un mayor nmero de folculos vitelognicos. Los folculos del tratamiento 0.3 (Fig. 10) presentan colores mucho ms claros en el vitelo que los folculos del tratamiento 0.6 (Fig. 11 y 12), sugiriendo que hay una mayor presencia de vitelo en los folculos del ovario tratado con 0.3 UI. En la figura 13 se observa que el dimetro promedio de los folculos tratados con la hCG a una concentracin de 0.3 UI es mayor que los promedios de los tratamientos 0.6 y el control. De acuerdo con el estadstico de ANOVA se encontraron diferencias significativas (P<0.05) entre los tratamientos. Al realizar la prueba de LSD se observaron diferencias significativas entre la concentracin de 0.3 con respecto al control.

Desarrollo Folicular
160 140 Dimetro (mm) 120 100 Control 80 60 40 20 0 Tratamientos 0.3 0.6

Fig. 13: Dimetro folicular al trmino de la dosis. Anlisis y discusin Las hormonas foliculoestimulante (FSH) y luteinizante (LH) son glicoprotenas producidas y liberadas por la hipfisis anterior, de donde se vierten al torrente sanguneo para as alcanzar sus rganos blanco, las gnadas. Ambas hormonas, favorecen la maduracin gonadal y la esteroidognesis, capacitando al organismo para que se pueda reproducir. La FSH, en la hembra, acta sobre los folculos en los que se encuentran los vulos en desarrollo, produciendo su crecimiento adems de iniciar la secrecin de la hormona sexual femenina, el estrgeno, que al alcanzar determinados niveles, inhibe la secrecin hipofisiaria de la FSH (Prieto-Gmez y Velzquez-Paniagua, 2002). En el presente estudio se observaron folculos vitelognicos no totalmente desarrollados, indicando una induccin en la maduracin gonadal; lo que se puede atribuir a que las hormonas, como la hCG, son anlogas entre las especies (Browne et al., 2007); por lo que cumplen una funcin similar, que en este caso, la hormona es de origen humano y esta acta mediante la imitacin de LH pasando por alto el eje hipotlamo-hipfisis, ejerciendo un efecto directo sobre las gnadas (Franco y Sarmiento, 2012).

Sin embargo la administracin de los tratamientos gener una prdida de peso directamente proporcional a la concentracin de hCG. Los anfibios gastan una proporcin (hasta la mitad) de su balance energtico total en la produccin de gametos y la reproduccin. La produccin de esperma es relativamente poco costosa para los machos de todas las especies, pero la formacin de vulos puede llegar a ser un desgaste energtico demasiado alto (Eckert, 2002). Adems, esta prdida de peso puede explicarse debido a que la hormona corinica humana induce al ovario para la produccin de estrgenos (Franco y Sarmiento, 2012), los cuales actan sobre el hgado para iniciar la sntesis de vitelo (Wallace y Bergink, 1974) a partir de las reservas de H. eximia, la cual posteriormente es secretada a la circulacin y transportada al ovario en donde es incorporada dentro de los ovocitos por un proceso de micropinocitosis mediado por receptores ; as se dara un aumento de tamao de los folculos. El crecimiento folicular en el grupo control present un bajo desarrollo de los folculos siendo previtelognicos en su mayora; mientras que en los grupos tratados con la hormona fueron vitelognicos, lo cual concuerda con Billeter y Jorgernsen (1976) donde en ovarios tratados con la hormona corinica humana a una dosis de 3 y 6 UI/10g se desarrollaron folculos vitelognicos en un rango de 0.5 a 150 mm, rango en el cual entran los folculos observados; en cambio, Franco y Sarmiento (2012) observaron que la hCG no tiene efecto en la induccin de la ovulacin de Dendrobates truncatus. El tratamiento a una concentracin de 0.3 UI mostr mayor efecto en el desarrollo folicular con respecto al tratamiento de 0.6 UI, se sabe que el metabolismo es variado entre las especies de rana de tal manera que sugiere que una alta concentracin de hormona (0.6 UI) pudo haber saturado los receptores de las hormonas (Begoa, 1994). Conclusiones La hormona corinica humana tuvo un efecto en la maduracin gnadal de H. eximia. La relacin concentracin de hormona-peso es inversamente proporcional. La hormona no influy en la talla de H. eximia A una concentracin de 0.3 UI se observ un mayor desarrollo de los folculos en su dimetro y cantidad de vitelo.

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