Universidad Veracruzana

Facultad de Biologa





Clonacin y caracterizacin de los genes de la xilosa
reductasa y xilitol deshidrogenasa de un
aislado autctono de Candida sp.



TESIS


TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

QUE PRESENTA:


MONSERRAT MACAS CARBALLO



DIRECTORA:
DRA. BEATRIZ PALMEROS SNCHEZ




Xalapa de Enrquez, Veracruz, Mxico 2009


Facultad de Biologa

i

















Este Trabajo se realiz en el Laboratorio de Toxicologa
de la Facultad de Biologa de la Universidad Veracruzana
campus Xalapa bajo la direccin y asesora de la Dra.
Beatriz Palmeros Snchez. Tambin se cont con la
asesora del comit tutorial formado por las Dras. Mara
del Socorro Fernndez y Mara del Carmen Ramrez
Bentez.
Para la parte experimental se utiliz el equipo e
infraestructura con los que cuenta el laboratorio, y los
recursos y materiales de que dispone la Dra. Palmeros
para llevar a cabo sus proyectos de investigacin.


ii























Antes pensbamos que nuestro futuro estaba en las
estrellas. Ahora sabemos que est en nuestros genes.

James Watson



iii


DEDICATORIAS


A mis padres Eduardo Macas Prez y Anita Carballo Caldern, por su apoyo en toda la carrera y
por estar siempre a mi lado y tendindome la mano en todo momento.

A mi hermano Eduardo por su cario, paciencia y optimismo.

A mis abuelos Dipna, Eduardo t, Bernardina e Inocencio, por su cario y confianza.

A mis tas (os), primos (as) y a toda mi familia.

A mis amigos Chiristian, Fabio, Monse, Paul, Luis( Chispa), Luis (Gicho), Cyntia, Misael,
Neftaly, Lorenzo, Edgar, Adriana, Karla, Isabel, por todos los malos y buenos momentos que
pasamos y seguiremos pasando juntos.

MUCHAS GRACIAS



iv


AGRADECIMIENTOS


A la Dra. Ma. del Socorro Fernndez por haberme apoyado en todo momento y abrirme las
puertas del laboratorio para realizar este trabajo y compartir muchos momentos de enseanza.

A la Dra. Ma. del Carmen Ramrez Bentez por todo lo que me enseo y apoyo a lo largo de estos
aos.

A la Dra. Beatriz Palmeros Snchez le agradezco toda la confianza depositada en mi, su paciencia
y el apoyo en todo momento, es un gusto haberla conocido y poder trabajar con usted, la
considero una persona muy especial, gracias por ensearme y ser el pilar ms fuerte en toda la
carrera.


MUCHAS GRACIAS













v

N D I C E
Pag.
ndice de abreviaturas vi
ndice de figuras vii
ndice de tablas viii
ndice de anexos ix
Resumen x
Introduccin:
Caracteristicas del xilitol
Obtencin del xilitol
1
3
5
Antecedentes
Problema de investigacin
8
11
Hiptesis
Objetivos:
12
Objetivo General 13
Objetivos Particulares 13
Metodologa: 14
Diagrama de trabajo
Cepas de levaduras
Medios de cultivo
14
15
17

Condiciones de crecimiento
Tcnicas de biologa molecular
18
18
Resultados y discusin 23
Conclusiones 34
Bibliografa 35
Anexos 38



vi

ndice de abreviaturas
A Adenina
Ap Ampicilina
DNA Acido desoxirribonucleico
BamH1 Endonucleasa de restriccin de Bacillus amyloliquefaciens cepa H
C Citosina
EcoR1 Endonucleasa de restriccin de Escherichia coli cepa R
EDTA
Na
Sal sdica de Acido Etilendiaminotetracetico
FDA Administracin Federal de Alimentos y Drogas de EU; de sus siglas en ingles
Food and Drugs Administration
G Guanina
Kb o kpb kilo base o kilo pares de base, 1000 pb
NADP Dinucletido de Nicotinamida y adenina fosfato
NADPH+H
+
Dinucletido de Nicotinamida y adenina fosfato reducida
pb Pares de bases
PCR Reaccin en cadena de la Polimerasa; de sus siglas en ingles Polymerase Chain
Reaction
PstI Endonucleasa de restriccin de Providencia stuartii
T Timina
Taq Enzima DNA-polimerasa de Thermus aquaticus o Thermophilus acuaticus
TBE Solucin amortiguadora de TRIS - Borato EDTA
UNIDA Unidad de Investigacin y Desarrollo de Alimentos del Instituto Tecnolgico de
Veracruz
X5P Xilulosa 5-fosfato
XHD Xilitol deshidrogenasa
XK Xilulosa cinasa
XR Xilosa reductasa
YEPD Medio de cultivo para crecimiento de levaduras; de sus siglas en ingles Yeast
Extract Peptone Dextrose


vii

ndice de figuras
Pag.
Figura 1. Conversin enzimtica de xilosa a xilitol por medio de la enzima Xilosa
Reductasa
2
Figura 2. Transformacin del xilitol en D-xilulosa por la enzima Xilitol
Deshidrogenasa dependiente de la coenzima NAD
+
, que se reduce a NADH+H
+
.
3
Figura 3. Estructura qumica del xilitol 4
Figura 4. Diagrama de trabajo 14
Figura 5. rbol filogentico de diferentes especies de levaduras por comparacin
del gen Xyl1
23
Figura 6. Comparacin de las secuencias del gen Xyl1, xilosa reductasa, de
diferentes cepas de C. tropicalis
24
Figura 7. Anlisis con BLAST del gen Xyl2 que codifica la xilitol deshidrogenasa
(XDH)
25
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa de los DNA genmicos de levaduras. 27
Figura 9. Separacin electrofortica de los productos de PCR obtenidos 28
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2%-TBE 1X de los fragmentos de
Xyl1 y Xyl2 purificados por corte de banda y extraccin
29
Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa de las clonas obtenidas despus del
proceso de ligacin en pUC19 y transformacin en XL1Blue
30











viii

ndice de tablas

Pag.
Tabla 1. Clasificacin cientfica de Candida tropicalis. 9
Tabla 2. Cepas utilizadas en este trabajo 16
Tabla 3. Vector utilizado en este trabajo 17
Tabla 4. Preparacin de 250 ml de medio YEPD con Xilosa al 2% 18
Tabla 5. Preparacin de buffer SET 19
Tabla 6. Oligonucletidos para Candida tropicalis 26
Tabla 7. Oligonucletidos para Saccharomyses cereviseae 26




















ix

ndice de anexos
Pag.
Anexo1. Extraccin de DNA cromosomal utilizando como solucin de lisis Buffer
SET
38
Anexo2.Recuperacin de bandas de DNA separadas por electroforesis en gel de
agarosa
39
Anexo 3.Mini screening de plsmidos por lisis-alcalina 40
Anexo 4.Preparacin de la mezcla de PCR para amplificar los fragmentos 41
Anexo 5. Precipitacin de digestiones 42
Anexo 6. Preparacin de clulas competentes 42
Anexo 7. Transformacin de E. coli con Ca 43
Anexo 8. ZR Fungal/Bacterial DNA Kit
TM
44
Anexo 9 .InsTAclone
TM
PCR Cloning Kit 45
Anexo 10. Mapa del vector de clonacin pUC 19 46
Anexo 11. Mapa del vector de clonacin pTZ57R/T 47

x


RESUMEN
El uso de tcnicas de ingeniera gentica ha permitido que en un tiempo muy corto el avance en
el conocimiento de la organizacin de los genes en los cromosomas, as como la forma en que
estos se regulan sea significativo. En la ltima dcada, se desarrollaron mtodos avanzados que
permiten obtener la secuencia de nucletidos del DNA que forma los cromosomas de cualquier
organismo vivo. De esta forma, se ha podido determinar la secuencia del genoma completo de
diferentes organismos, desde microorganismos hasta vegetales y animales incluyendo al ser
humano. El anlisis de estas secuencias permiti la aparicin de una nueva rama de la biologa
molecular, la biologa genmica, que surge del anlisis y comparacin de las secuencias de
organismos diferentes.
En el presente trabajo se clonaran y secuenciaran los genes Xyl1 y Xyl2 de Candida sp. la cual fue
aislada por producir xilitol y crecer en altas concentraciones de carbohidratos. Estos genes
codifican las enzimas xilosa reductasa (XR) y xilitol deshidrogenasa (XDH), las cuales catalizan
dos pasos importantes del metabolismo de pentosas, va catablica que produce xilitol como uno
de sus metabolitos intermedios. Ambos pasos enzimticos son determinantes de la concentracin
de xilitol, la XR convierte la xilosa en xilitol y la XDH transforma el xilitol en xilulosa. El
conocimiento generado con la caracterizacin de estos genes permitir plantear estrategias de
modificacin gentica, las cuales permitirn aumentar la produccin de xilitol, ya sea mejorando
la conversin de xilosa a xilitol y/o impidiendo la va que convierte el xilitol a xilulosa.
Trabajos de investigacin, como el presente, que permiten la caracterizacin y posibilitan la
transferencia de genes, adems de generar conocimiento bsico sobre la regulacin gentica y el
desarrollo celular entre otras cosas, tambin se est utilizando para lograr el mejoramiento de
algunas especies de inters e incluso para la produccin de protenas heterlogas y otros
productos con valor agregado como el xilitol.
La produccin de xilitol a partir de biomasa residual, en particular los desechos del proceso de
produccin de azcar, es redituable debido a que a nivel de produccin el costo de esta fuente de
carbono no es elevado. Adicionalmente, este azcar polialcohol puede ser consumido por
personas diabticas y se utiliza como ingrediente activo en productos de higiene bucal,
farmacuticos y cosmticos por sus propiedades antispticas.

11

INTRODUCCIN:

La generacin de grandes cantidades de desechos vegetales y agroindustriales
producto de la actividad humana, constituye uno de los mayores problemas de
contaminacin ambiental. A pesar de su composicin orgnica, su perodo de vida media
degradativa y los volmenes en los cuales se producen son tan grandes, que su acumulacin
en el ecosistema se ha vuelto inevitable. Como un intento para reducir o solucionar este
problema, se han desarrollado tcnicas tendientes a la utilizacin de desechos con alto
contenido orgnico como fuentes alternativas de carbono para la produccin de energa, de
metabolitos de inters comercial e industrial, e incluso para ser sometidos a pre-
tratamientos con el fin de incorporarlos en procesos de composteo (Venegas et al., 2004a).
As, el aprovechamiento de los residuos agroindustriales como sustratos en procesos
biotecnolgicos para la produccin de productos de alto valor agregado es una alternativa
atractiva ya que estos materiales son abundantes, renovables y de bajo costo (Vials Verde
et al., 2006).

El bagazo de la caa de azcar es un residuo lignoceluloso de la industria azucarera, con
alto contenido en xilano, el cual puede ser convertido en xilosa que a su vez puede
utilizarse en diferentes procesos fermentativos, entre lo que se encuentra el proceso para
convertirla en xilitol (Vials Verde et al., 2006). Este residuo est constituido
aproximadamente por 50% de celulosa, 25% de hemicelulosa y 25% de lignina; a pesar de
que es utilizado como combustible en las industrias azucarera, alimenticia, de papel,
alcohol y qumica, grandes cantidades son acumuladas en la naturaleza (Martnez et al.,
2002). Lo que se hace con el bagazo de la caa de azcar, de forma similar se puede
realizar con otros residuos agrcolas como el rastrojo de maz, arroz, madera de abedul,
eucalipto, paja de trigo, semilla de algodn, etc.

Actualmente, las pentosas, particularmente la xilosa, se estn utilizando como fuente de
carbono en varios procesos de produccin comercial, debido a que estas azcares son muy
abundantes en las plantas ya que son la unidad estructural mayoritaria de la hemicelulosa

12

(Vials Verde et al., 2006). A partir de esta se pueden obtener grandes cantidades de xilosa
por diferentes procesos.

La conversin metablica de la xilosa en xilitol se lleva a cabo por una reaccin de oxido-
reduccin catalizada por la enzima Xilosa Reductasa (XR) en presencia de uno de los
cofactores NADPH y/o NADH
+
(Figura 1).








D-Xilosa D-Xilitol
Figura 1. Conversin enzimtica de xilosa a xilitol por medio de la enzima Xilosa Reductasa. Esta
enzima reduce la D-Xilosa, una aldosa, a un poli-alcohol, D-Xilitol


El xilitol es el producto intermediario para la formacin de xilulosa, esto es, el xilitol es
oxidado a xilulosa por la xilitol deshidrogenasa (XDH) dependiente de NAD
+
. Esta enzima
elimina el hidrogeno beta, cercano al primer carbono con el grupo hidroxilo de este alcohol,
transformando el polialcohol en una cetosa, como se muestra en la reaccin de la figura 2
(Karhumaa et al., 2007)

NAD(P)H+H

NAD(P)+
Xilosa
Reductasa

13





Figura 2. Transformacin del xilitol en D-xilulosa por la enzima Xilitol Deshidrogenasa
dependiente de la coenzima NAD
+
, que se reduce a NADH+H
+
.

As, el metabolismo de la xilosa se lleva a cabo por la actividad de las enzimas XR y XDH,
las cuales estn codificadas por los genes Xyl1 y Xyl2, respectivamente (Ko et al., 2006).

La xilulosa al ser fosforilada por la xilulosa cinasa (XK) se transforma en xilulosa 5-fosfato
(X5P) e ingresa a la va de las pentosas-fosfato. En esta ruta metablica, la fase oxidativa
produce poder reductor en forma de NADPH+H
+
, el cual es un metabolito necesario para
los pasos de biosntesis reductora, y ribosa-5-fosfato necesaria para la biosntesis de
nucletidos y cidos nucleicos; en la fase no oxidativa, donde la X5P se incorpora a la va
de las pentosas fosfato, se forma fructosa 6-Fosfato (F6F) y gliceraldehido 3-fosfato (G3P)
que ingresan a la ruta de la glucolisis para al final regenerar ATP (Mathews et al., 2002).



Caractersticas del Xilitol

El xilitol (C
5
H
12
O
5
) es un azcar alcohol de cinco tomos de carbonos (Figura 3), usado
como edulcorante natural en productos alimenticios y puede ser usado como sustituto de
azcar (Saracoglu y Cavusoglu, 1999). Es de apariencia y dulzura similares a la sacarosa,
pero aporta un 40% menos de caloras (2,4 kcal/g); por esta razn, es utilizado como
NADH+H
+

NAD
+
Xilitol
Deshidrogenasa
a
D-Xilitol D-Xilulosa

14

sustituto del azcar en una relacin 1:1 peso a peso, con la consecuente disminucin
calrica (Venegas et al., 2004b).

A B






Figura 3. Estructura qumica del xilitol. A Estructura del xilitol donde se observan los cinco grupos
hidroxilo que lo definen como un polialcohol. B Representacin 3D donde se aprecian los tomos
que conforman la molcula de xilitol: cinco tomos de carbono (negro), cinco tomos de oxigeno
(rojo) y doce tomos de hidrogeno (gris claro).

El xilitol se usa en la industria de alimentos, farmacutica y en productos de salud oral.
Posee sabor agradable, no deja gusto residual amargo, presenta dilucin rpida en agua, no
sufre pardeamiento de Maillard y sus soluciones son altamente estables. Sin embargo, su
importancia radica en sus numerosas aplicaciones en el rea de la salud, debido
principalmente al hecho de poder ser consumido de forma segura por diabticos y aquellas
personas deficientes en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, con desrdenes en el
metabolismo de lpidos, lesiones renales y parenterales, infecciones pulmonares, etc.
(Martnez et al., 2002).

Igualmente, no produce caries y su consumo frecuente contribuye a la prevencin de la
otitis media aguda y de la osteoporosis (Venegas et al., 2004a). Presenta propiedades
anticariognicas por el hecho de no ser utilizado por los microorganismos de la flora bucal,
en particular por la bacteria Streptococcus mutans, lo que evita la formacin de cidos que
atacan el esmalte dental. Por otra parte, induce la remineralizacin del esmalte de los
dientes revertiendo lesiones recin formadas, por el aumento de la concentracin de los
iones calcio (Ca2
+
) y fosfato (PO
4
-3
). La anticariogenicidad del xilitol es una caracterstica
de gran importancia principalmente para los pases del tercer mundo, donde la incidencia de
caries es extremadamente alta (Martnez et al., 2002).

15


El uso de este compuesto como aditivo en los alimentos fue aprobado por la FDA (Food
and Drug Administration from U.S.A) en 1963, inicialmente se aplic en dietas para
diabticos, y posteriormente fue utilizado en alimentos libres de azcar (Sreenias et al.,
2004).



Obtencin del xilitol

El xilitol se encuentra de manera natural en numerosas frutas y algunas legumbres como
ciruelas amarillas, fresas, coliflor, frambuesas, lechuga, espinaca, zanahoria, banano y
cebolla, aunque en muy bajas concentraciones, lo que hace que la extraccin a partir de
dichas fuentes no sea prctica ni econmica (Venegas et al., 2004b).

En la actualidad, la produccin de xilitol a gran escala se realiza por hidrogenacin
cataltica de la xilosa a presiones y temperaturas altas. Adems de que en este proceso los
costos de produccin son altos, se generan impurezas que dificultan la purificacin y
cristalizacin del producto final. Otra forma de obtencin es a travs de procesos
biotecnolgicos, los cuales son una alternativa de produccin limpia, porque no generan
subproductos txicos debido a su naturaleza especifica (Venegas et al., 2004b). La
biotransformacin se realiza utilizando bacterias y algunos hongos capaces de asimilar y
fermentar la xilosa a xilitol, etanol y otros compuestos. Dentro de todas las especies
microbianas las levaduras son reconocidas como las mejores productoras de xilitol
(Saracoglu y Cavusoglu, 1999).

La posibilidad de utilizar desechos vegetales con contenido alto de hemicelulosa para la
produccin de xilitol y otros compuestos con valor agregado, se encuentra limitada por el
paso de degradacin de este polisacrido en sus componentes. Como se mencion lneas
arriba, este proceso se puede hacer de dos formas:


16

1. Por medio de procedimientos qumicos que a nivel de escala industrial son muy
costosos. La hidrogenacin de la xilosa presente en los hidrolizados hemicelulsicos
requiere el uso de presiones controladas, 31-40 atm, y temperaturas elevadas, 100-
130C, adems de extensas etapas de purificacin de la solucin de xilosa, lo que
consecuentemente encarece el producto final, el costo de produccin del xilitol es
cerca de 10 veces superior al de la sacarosa o del sorbitol (Branco y Santos, 2006).

2. Utilizando microorganismos con la capacidad de hidrolizar estos compuestos, como
por ejemplo la produccin de xilitol con Candida sp. En este tipo de procedimientos
se requieren controlar y mantener los niveles de diferentes parmetros fsico
qumicos como: Temperatura, pH, agitacin, oxgeno disuelto, tamao de las
partculas del sustrato, volumen de la fermentacin, as como parmetros biolgicos
y nutricionales como: volumen del inoculo, concentracin alcohlica, concentracin
de xilosa en el medio y extracto de levadura, etc. Sin embargo, la temperatura y la
agitacin son de gran impacto a este proceso. Seguido de ello est la concentracin
de xilosa en el medio y la concentracin alcohlica, que sirven solo para la
conversin de Xilosa a Xilitol (Sreenias et al., 2004).

En los organismos eucariotas el catabolismo de la xilosa se realiza en dos reacciones redox
consecutivas catalizadas por las enzimas xilosa reductasa (XR) NADPH-dependiente y
xilitol deshidrogenada (XDH) NADH-dependiente con formacin de xilitol como paso
intermedi (Vials Verde et al., 2006).

La biotransformacin se realiza utilizando bacterias y algunos hongos capaces de asimilar y
fermentar la xilosa a xilitol, etanol y otros compuestos. Dentro de todas las especies
microbianas, las levaduras son reconocidas como las mejores productoras de xilitol,
especialmente los generos Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Pachysolen, Debaryomyces,
Schizosaccharomyces, Saccharomyces y Candida, considerada en el campo de la
investigacin como patrn de referencia (Venegas et al., 2004b).



17


Ktter y Ciriacy (1993) desarrollaron una cepa recombinante de S. cerevisiae, en la cual
transformaron los genes clonados de P. stipitis que codifican las enzimas XR y XDH, pero
la recombinante fermentaba xilosa extremadamente lento, produciendo muy poco etanol y
mucho xilitol (Ktter y Ciriacy, 1993).


18


ANTECEDENTES:

Biotecnolgicamente hablando, las levaduras son organismos eucariotas sencillos que se
han utilizado durante milenios en la produccin de alimentos fermentados, como vino, pan
y cerveza, lo que los convierte en los organismos unicelulares ms manejados y utilizados
en procesos para la produccin y obtencin de productos con diferentes aplicaciones.
Adems de la utilizacin de las levaduras en los procesos de fermentacin tradicionales,
actualmente su uso se ha incrementado debido a que pueden metabolizar fuentes de
carbono no convencionales.

Las levaduras catabolizan la xilosa, obteniendo xilitol como paso intermedio para la
formacin de xilulosa, la cual al ser fosforilada ingresa al ciclo de las pentosas-fosfato para
la obtencin de NADPH+H
+
para los pasos de biosntesis reductora y proporcionar ribosa-
5-fosfato para la biosntesis de nucletidos y cidos nucleicos (Mathews et al., 2002). El
catabolismo de la xilosa en los organismos eucariotas se realiza en dos reacciones redox
consecutivas catalizadas por la xilosa reductasa NADPH-dependiente (XR) y la xilitol
deshidrogenada NADH-dependiente (XDH) con formacin de xilitol como paso intermedi
(Sondereger y Saur, 2003). Una excepcin es el hongo anaerobio Piromyces sp. cepa E2
que a travs de la actividad de una D-xilosa isomerasa convierte la D-xilosa a D-xilulosa
directamente (Berghll et al., 2007). En las levaduras, incluyendo Candida tropicalis, la
asimilacin de xilosa est dada por la actividad de las enzimas XR y XDH (Ko et al.,
2006). En otras levaduras como Pichia stipitis que tambin utilizan estos sustratos, las
enzimas estn codificadas por los genes Xyl1 y Xyl2 respectivamente, el gen Xyl2 ha sido
clonado de esta levadura y otros hongos como Saccharomices cerevisiae, Hypocrea
jecorina y Arxula adenonivorans. Por otra parte el xilitol es producido de manera natural
por la asimilacin de xilosa por levaduras y hongos, tales como: Pachysolen tannophylus,
Candida guilliermondii, Candida parpsilosis y Candida tropicalis (Jin et al., 2004).

Dentro del grupo de las levaduras, Candida tropicalis representa una alternativa favorable
para utilizarse en procesos fermentativos que utilizan desechos agroindustriales como

19

fuente de carbono econmica. Este microorganismo pertenece al reino mycota y se
encuentra clasificado dentro de la familia Saccharomycetaceae (tabla 1).

Tabla 1. Clasificacin cientfica de Candida tropicalis

Taxa:
Reino Mycota
Phylum Ascomycota
Subphylum Saccharomycotina
Clase Saccharomycetes
Orden Saccharomycetales
Familia Saccharomycetaceae
Genero Candida
Especie C. tropicalis

Candida tropicalis es importante industrialmente, debido a su alta capacidad de produccin
de xilitol (Granstrm et al, 2002) y la capacidad de utilizar n-alcanos y cidos grasos como
fuentes de carbono. Esta especie se ha explotado para la produccin de acido ,-
dicarboxlico, material til para la preparacin de perfumes, polmeros y adhesivos, y
tambin por ingeniera metablica de las enzimas peroxisomales llevan a cabo -oxidacin
para la produccin de antibiticos macrlidos (Sam et al., 2006).

Por otra parte, la D-glucosa es un sustrato comn en la industria alimentaria y, en
comparacin con D-xilosa, es barato y fcilmente disponible. Por lo tanto, sera atractivo si
el xilitol pudiera producirse a partir de D-glucosa. Sin embargo, se conocen pocos o ningn
microorganismo que produzca xilitol a partir de D-glucosa. No obstante lo antes
mencionado, la existencia de especies de Bacillus, Zygosaccharomyces, Aureobasidium,
Torula, y Candida que convierten la D-glucosa en otros azcares y alcoholes como la D-
ribosa, D-arabitol, y el eritritol (Toivari et al., 2007) abre la posibilidad de obtener
microorganismos genticamente modificados que permitan obtener de manera eficiente
estos compuestos.


20

Lo anterior est condicionado a la obtencin y caracterizacin de cepas que realicen alguno
de estos pasos enzimticos de forma eficiente, a partir de las cuales se pueden obtener los
genes que codifican las enzimas involucradas. La clonacin satisfactoria de un gen requiere
varios elementos; en primer lugar es necesario disponer del fragmento de DNA que
contenga el gen de inters en cantidad adecuada para poder manipularlo in vitro.
Anteriormente el fragmento de DNA se obtena como un fragmento de restriccin despus
de un proceso largo y tedioso. Actualmente se cuenta con la metodologa de la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual adems de permitir obtener el fragmento del
genoma que contiene el gen de inters, permite copiarlo muchas veces, en el orden de 10
9

copias, en un tiempo corto, entre 2.5 a 3.5 hrs (Mullis and Faloona, 1989; Eeles y Stamps,
2000).

Estudios relacionados con el tratamiento de los hidrolizados hemicelulsicos de bagazo de
caa, de eucalipto, de paja de arroz y de paja de trigo estn dirigidos hacia el
aprovechamiento de estos residuos lignocelulsicos para que por va microbiolgica sean
una alternativa tecnolgica en la obtencin de xilitol (Martnez et al., 2002).

En este trabajo se utiliz la cepa IEC5-ITV, la cual fue obtenida por el grupo de la Dra. Ma.
Guadalupe Aguilar Uscanga, Unidad de Investigacin y Desarrollo de Alimentos del
Instituto Tecnolgico de Veracruz (UNIDA). Este grupo realiz un muestreo de sustratos
lignocelulosos donde se pre-asumi la presencia de microorganismos con la capacidad de
utilizar la celulosa y/o hemicelulosa como fuente de carbono produciendo xilitol y alcohol
por fermentacin de los residuos lignocelulsicos. A partir de las muestras obtenidas, se
llev a cabo el proceso de aislamiento de cepas nativas que presentaran las caractersticas
necesarias para considerarlas con potencial para utilizarse en procesos biotecnolgicos,
para obtener los productos con valor agregado de inters.

La cepa IEC5-ITV fue aislada a partir de bagazo de caa de azcar, el cual fue obtenido del
Ingenio Azucarero La Gloria (Rangel, 2006). Esta levadura ha sido identificada
bioqumicamente y las pruebas preliminares indican que se puede tratar de una cepa de
Candida tropicalis, aunque esto no se ha confirmado totalmente.

21

PROBLEMA DE INVESTIGACIN

En solo 25 aos, el desarrollo de la biotecnologa ha permitido el nacimiento de tecnologas
novedosas para la obtencin de productos biolgicos, el anlisis gentico de organismos
completos, el desarrollo de tcnicas de diagnostico gentico pre- y posnatal, el desarrollo de
organismos que degradan contaminantes y regeneran el ambiente, alimentos con
caractersticas mejoradas, productos de consumo y uso industrial, sistemas de anlisis
bioqumicos de sistemas celulares complejos, etc. Todo este desarrollo vertiginoso,
finalmente permiti el planteamiento de llevar a cabo la estrategia que permiti llegar a la
meta nada sencilla de analizar y conocer completamente las secuencias de diferentes
genomas, incluyendo al humano, no solamente a nivel de secuencia nucleotdica, sino
tambin de funciones especificas (Balbs, 2002).

Con el desarrollo rpido de la economa mundial, la magnitud del consumo de combustible
se ha incrementado muy rpidamente, dando como resultado la contaminacin ambiental y
la escasez de recursos naturales. Por lo tanto, la explotacin y utilizacin de energa limpia
y renovable se ha convertido en una necesidad a nivel mundial. En la actualidad, la energa
renovable ms abundante en todo el mundo se almacena en las plantas en forma de
lignocelulosa (Tian et al., 2008)

Dentro del territorio Mexicano, el estado de Veracruz es uno de los mayores productores de
caa. De acuerdo al reporte de Perfil de caa de azcar de la Comisin Veracruzana de
Comercializacin Agropecuaria, hasta el ao 2003 Veracruz generaba el 38.41% de la
produccin nacional caera, con un valor de 5,469,350 (miles de pesos) y 252,280
hectreas cosechadas (Reporte de la Comisin Veracruzana de Comercializacin
Agropecuaria, 2003). De lo anterior, se infiere que durante el proceso industrial para la
obtencin de azcar de caa se genera una gran cantidad de bagazo de caa, desecho
lignocelulsico que puede ser utilizado para obtener diferentes compuestos, como por
ejemplo xilitol.

22


Debido a las cantidades reportadas y mencionadas anteriormente, nace el inters por utilizar
la materia orgnica, como el bagazo de caa de azcar, para producir xilitol y etanol a
travs de procesos de fermentacin con microorganismo. Por este motivo se plante este
trabajo de investigacin que por medio de tcnicas de biologa molecular busca contribuir
con conocimiento bsico que sustente estos procesos.

La caracterizacin molecular de los genes Xyl1 y Xyl2 responsables del metabolismo de
xilosa en la cepa de levadura IEC5-ITV, adems de apoyar la estrategia para la
manipulacin gentica de este microorganismo aprovechando sus caractersticas
metablicas que le permiten producir xilitol, sustentar el planteamiento de una propuesta
para utilizarla en la produccin de xilitol a partir de hidrolizados de caa.




HIPTESIS

Los genes Xyl1 y Xyl2 de la cepa IEC5-ITV presentan diferencias significativas con los
genes que codifican la xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa reportados para otras cepas
de Candida sp., lo cual potencia su aplicacin biotecnolgica.


23




OBJETIVO GENERAL:

Obtener, clonar y secuenciar los genes de la cepa IEC5-ITV de Candida sp. que codifican
las enzimas xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa (Xyl1 y Xyl2).




OBJETIVOS PARTICULARES:

Realizar un anlisis de secuencia de los genes Xyl1 y Xyl2 de diferentes
cepas de Candida sp. depositados en Gene Bank para determinar que
secuencias estn conservadas hacia afuera de estos genes.
Disear oligonucletidos forward y reverso para cada uno de los genes
de inters.
Obtener por medio de PCR los fragmentos de DNA que contengan los genes
Xyl1 y Xyl2 a partir del DNA genmico de la cepa IEC5-ITV.
Clonar los genes Xyl1 y Xyl2 en un vector plasmdico (vector de expresin).
Analizar por medio de secuenciacin los dos genes obtenidos.
Proponer estrategias para la manipulacin de estos genes con la finalidad de
aumentar la produccin de xilitol en la cepa IEC5-ITV o para utilizarlos
como genes heterlogos en S. cereviciae.


24

DIAGRAMA DE TRABAJO:


25


METODOLOGA:

Para realizar este trabajo experimental se utilizaron tcnicas bsicas de microbiologa para
mantener viable y pura la cepa de estudio IEC5-ITV as como la cepa de S. cerevisiae
utilizada como control. Para cumplir con los objetivos planteados la purificacin,
amplificacin por PCR y manipulacin in vitro del DNA genmico y de plsmido se
siguieron las metodologas de biologa molecular establecidas para cada uno de los
procedimientos. La determinacin de la secuencia de nucletidos en los fragmentos
clonados se realiz de forma automatizada.


MATERIALES Y MTODOS

Cepa de Levadura IEC5-ITV.
La cepa IEC5-ITV fue proporcionada por la Dra. Ma. Guadalupe Aguilar Uscanga del
Instituto Tecnolgico de Veracruz (ITV). Se mantuvo por resiembra en medio YEPD
(Yeast Extract, Nutrient Broth slido: 20 g/litro de peptona, 10 g/litro de extracto de
levadura, 20 g/litro de fuente de carbono; Sambrook and Russell, 2001), que es un medio de
cultivo adecuado para el crecimiento rutinario de levaduras. La cepa se mantuvo y
resembr mensualmente en cajas Petri con este medio. Para reaislar y mantener pura la
cepa, peridicamente sta se inocul en medio YEPD con una concentracin alta de xilosa,
15%; para la conservacin y enriquecimiento de la cepa de estudio y cepa control, la
primera se inocularon en medio con xilosa glucosa al 2% y la segunda solo en glucosa al
2% ya que no crece en xilosa.
La temperatura de incubacin para el crecimiento de las cepas de levadura y Escherichia
coli utilizadas en este trabajo se crecieron a 37
o
C tanto en medio de cultivo slido como
lquido; los cultivos en medio lquido se agitaron a 300 rpm.

26

El genotipo y fenotipo de las cepas utilizadas en este trabajo y los plsmidos empleados en
los procesos de clonacin se detallan en la tabla 2 y 3.

Tabla 2. Cepas utilizadas en este trabajo
Cepa: Genotipo y/o fenotipo: Fuente
E. coli XLI-
blue
E. coli, subE44, hsdR17, recA1, gyrA46 (Nal
R
), thi,
relA1, lacF [traD36 proAB
+
lacI
q
lacZ MI5]. Tn10
(Tc
R
). Hospedero para transformar a altas eficiencias
plsmidos, fago filamentoso M13 y el fagmido pT7-
BLUE. Cepa deficiente en recombinacin que soporta el
crecimiento de vectores con mutaciones mbar, pero no
la mutacin sam100 (e.g. ZAP). Modifica pero no
restringe el DNA transformado. El F de esta cepa
permite la seleccin de colonias blancas/azules en X-gal
e IPTG y permiten la superinfeccin con bacterifago
M13.
Sambrook et
al., 1989
Cepario del
laboratorio
Candida sp
IEC5-ITV
Aislado autctono obtenido de muestras de bagazo de
caa de azcar obtenido del Ingenio Azucarero La
Gloria
Rangel, 2006
S. cerevisiae Cepa recuperada del producto farmacutico Levadura
BIOCLON ampolleta ingerible (500 millones de
clulas viables)
Este trabajo







27

Tabla 3. Vector utilizado en este trabajo
Vector Caractersticas Fuente
pUC19 Plsmido de alto nmero de copias que tiene origen de
replicacin derivado de pBR322 que le permite replicarse en
E. coli. El sitio de clonacin mltiple est en fase con el
fragmento a del gen lacZ por lo que permite la seleccin
directa de clonas recombinantes por cambio en el fenotipo
de azul a blanco en presencia del sustrato gratuito X-Gal.
Adicionalmente porta el gen de resistencia a ampicilina
(Ap
R
).
Vieira and
Messing,
1982
pTZ57R/T Origen de replicacin (rep) del plsmido pMB1, gen de
resistencia bla (Ap
R
), complementacin del pptido- de
LacZ, mltiples sitios de clonacin, origen de replicacin del
fago f1, promotor del fago T7, compatible con los primers
forward -20 y -26 de M13/pUC y el primer para
secuenciacin de T7
Fermentas
Inc


Medios de cultivo.
Medios de cultivo YEPD lquido y slido enriquecido con xilosa al 2%, y medio de cultivo
selectivo con xilosa al 15%, el resto de componentes del medio de cultivo son: extracto de
levadura, peptona y agar para solidificar el medio cuando se requiera (Tabla 4). La
preparacin del medio requiere que la solucin de xilosa se haga por separado y se agregue
al medio despus de esterilizarlos por separado (ver Tabla 4) debido a que la xilosa u otro
componente del medio se oxida (n) durante la esterilizacin y este queda oscuro.
E. coli se creci en medio Luria-Bertani (LB) adicionado con el antibitico adecuado, por
lo general Amp
100
.



28

Tabla 4. Preparacin de 250 ml de medio YEPD con Xilosa al 2%
Ingredientes Cantidad
Xilosa al 40% estril 12.5 ml (concentracin final 2%)
Extracto de levadura 2.5 gr
Peptona de casena 5.0 gr
Agar bacteriolgico (*) 3.5 gr
Agua 237.5ml
(*) Solo se agrega si se quiere preparar medio slido.

Condiciones de crecimiento.
Ambas cepas de levadura se crecieron en medio para levaduras adicionado con un
carbohidrato al 2% final, medio YEPD + 20 g/litro de glucosa o xilosa. Se crecieron en
medio slido utilizando una estufa microbiolgica a 37C. Cuando los crecimientos se
hicieron en lquido se utiliz un agitador orbital con una velocidad de 300 350 rpm.


TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
Extraccin de DNA cromosomal de la cepa IEC5-ITV y S. cereviseae.
Para la obtencin del DNA cromosomal de las levaduras se utiliz una variacin del
mtodo reportado por Sambrook et al. utilizando como buffer de lisis solucin SET
(Sambrook et al., 2001; Rodrguez and Tait, 1983), cuya formulacin se muestra en la
Tabla 5.





29

Tabla 5. Preparacin de buffer SET
Componente: Cantidad (100 ml) Concentracin final
Sacarosa 20 gr 20%
EDTA 10 ml 50mM
Tris HCl pH 7.6 5 ml 50mM

Procedimientos genticos y tcnicas de DNA recombinante.
Todas las enzimas de restriccin, T4 DNA polimerasa y marcadores de tamao de los
fragmentos de DNA fueron obtenidos de Fermentas o Invitrogen, y se utilizaron de acuerdo
a las recomendaciones de los fabricantes.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Las reacciones de sntesis de DNA in vitro para la amplificacin de los fragmentos de DNA
que contienen los genes de inters se hicieron por medio de PCR utilizando Taq DNA-
polimerasa (Fermentas internacional Inc., Ontario, Canad). Las mezclas de reaccin para
amplificar los fragmentos de DNA se prepararon mezclando los siguientes reactivos en un
volumen final de 20l: 20 ng de DNA templado, 50 pmol de cada oligonucletido
iniciador, 0.25 mM de mezcla de dNTPs, 1.6 mM de MgCl
2
y 1-2 unidades de DNA-
polimerasa. Para el proceso de amplificacin las mezclas se incubaron en un termociclador
T-Gradient (Biometra, USA) siguiendo el siguiente mtodo de amplificacin:
1 etapa. Un ciclo de pre-desnaturalizacin a 95C durante 3 min.
2 etapa. 37 ciclos de amplificacin, cada uno con un paso desnaturalizacin, alineamiento
y polimerizacin, cuyos parmetros de temperatura y duracin fueron determinados para
cada caso.
3 etapa. Un ciclo de extensin final de 30 minutos a la temperatura ptima de la
polimerasa, 68 72C (Mullis, 1989).

30

4 etapa. Cuando fue necesario, el termociclador se program para mantener las muestras a
4C por tiempo indefinido.

Oligonucletidos (primers):
Para el diseo de los oligonucletidos se hizo una bsqueda de todas las secuencias
publicadas de los genes Xyl1 y Xyl2 de cepas de levaduras, especficamente de Cndida
tropicalis. La bsqueda se realiz en la base de datos del Centro Nacional para la
Informacin Biotecnolgica (NCBI por sus siglas en Ingles, National Center for
Biotechnology Information). Las secuencias encontradas se alinearon con el algoritmo
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que encuentra regiones con similitud
presentes entre diferentes secuencias. Los oligonucletidos se disearon teniendo en cuenta
las regiones de similitud encontradas con este algoritmo.

Electroforesis:
Para verificar la integridad y concentracin del DNA cromosomal as como el tamao y
concentracin de los productos de PCR obtenidos, estos se analizaron por electroforesis en
geles de agarosa al 1.2% en buffer TBE 1X. Para visualizar el DNA los geles se tieron con
una solucin diluida de Bromuro de Etidio (10 mg/ml) y se enjuagaron con agua destilada
antes de observarlos en el transiluminador de luz UV de onda corta. Para determinar el
tamao de los fragmentos de PCR se utiliz como marcador de peso molecular el estndar
1kb DNA ladder (SM0311, Fermentas internacional Inc., Ontario, Canad).

Recuperacin de bandas de DNA separadas por electroforesis en gel.
El procedimiento que se sigui para recuperar las bandas de DNA obtenidas como
productos de PCR y separadas por electroforesis en gel de agarosa al 1.2%, se llev a cabo
por el mtodo de destruccin-congelacin del fragmento de agarosa que contiene la(s)
banda(s) de inters. Despus de congelar el fragmento de agarosa, el DNA se extrajo con
fenol y cloroformo (ver anexo).

31


Restricciones.
Las reacciones para digerir el DNA con las enzimas de restriccin utilizadas se llevaron a
cabo de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La cantidad de DNA que se puso a
restringir, 175-225 ng, se determin a partir de las bandas observadas en los geles despus
de su separacin por electroforesis. Por lo general las reacciones de restriccin se incubaron
a la temperatura adecuada, 37
o
C, durante toda la noche.

Reacciones de ligacin.
Las reacciones de ligacin para clonar los genes del metabolismo de xilosa se hicieron con
DNA ligasa del fago T4 (Fermentas internacional Inc., Ontario, Canad), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. La cantidad de inserto y vector se determinador a partir del
gel. Antes de poner las ligaciones se realiza precipitacin para quitar enzimas y no tenga
interferencia con la ligacin (ver anexo).

Transformacin con DNA.
La cepa utilizada como hospedero para transformar las mezclas de ligacin y obtener las
clonas deseadas fue E. coli XL1-blue. Las clulas competentes se prepararon por el mtodo
de cloruro de calcio (CaCl
2
) glicerol (ver anexo) y se almacenaron a -80C en el
ultracongelador. El procedimiento de transformacin y recuperacin fue el recomendado
por Sambrook y Russell (2001).

Anlisis de clonas.
Las clulas transformantes se recuperaron por crecimiento de las clonas recombinantes en
el medio de seleccin adecuado. Las transformantes obtenidas por crecimiento en el medio
de seleccin, se analizaron por el fenotipo de coloracin blancas/azules en X-Gal e IPTG. ,
de las colonias blancas resultantes se extrajo el DNA de plsmido por el mtodo de lisis-
alcalina descrito por (Rodrguez y Tait, 1983). Y posteriormente se realizaron pruebas para

32

verificar las posibles clonas haciendo digestiones para checar que suelten el inserto y PCR
para que nos de el fragmento con el tamao esperado.

Anlisis de Secuencia de DNA. Una vez corroboradas las clonas, se mandaron a
secuenciar a la Unidad de Secuenciacin del Instituto de Biotecnologa de la UNAM.


33


RESULTADOS Y DISCUSIN.
Busqueda y comparacin de la secuencia de los genes Xyl1 y Xyl2 de diferentes cepas
de Candida sp. depositadas en Gene Bank.
La bsqueda de las secuencias de genes que codifican la XR y XDH en las bases de datos
disponibles a travs del servidor del NCBI, y su comparacin por medio de BLAST
permiti determinar la similitud que se presenta entre la secuencia de estos genes (figuras 5
a 7). Para el gen Xyl1 se tomo como referencia la secuencia reportada para este gene en la
cepa ct1799 de Candida tropicalis. Se encontr que la similitud de este gen entre diferentes
especies de Candida (0.99) las agrupa y relaciona muy cercanamente con Debaryomyces sp
y Pichia sp. (figura 5). Tomando el alineamiento del grupo de Candidas se disearon los
oligonucletidoss para amplificar este gen (figura 6).














Figura 5. rbol filogentico de diferentes especies de levaduras por comparacin del gen Xyl1.

34












Figura 6. Comparacin de las secuencias del gen Xyl1, xilosa reductasa, de
diferentes cepas de C. tropicalis.


El anlisis por BLAST del gen Xyl2 que codifica la xilitol deshidrogenasa, mostro resultados
similares a los encontrados para el gen de la XR. La similitud entre las diferentes cepas de C
tropicalis (0.99) es alta (figura 7), por lo que los oligonucletidos para amplificar este gen se
disearon a partir de estas secuencias.








35












Figura 7. Anlisis con BLAST del gen Xyl2 que codifica la xilitol deshidrogenasa (XDH)


Diseo de los oligonucletidos forward y reverso para amplificar cada uno de los
genes de inters de C. tropicalis y S. cereviseae.
A partir del anlisis de las secuencias de diferentes cepas de Candida sp. y S. cereviseae se
disearon los siguientes oligonucletidos para amplificar por medio de PCR los genes Xyl1
y Xyl2 de ambas especies, cepa de estudio y control respectivamente.
Para el diseo de los oligonucletidos se tomaron en cuenta los criterios establecidas por
Sambrook y Russell (2001), as como las recomendaciones del personal de la Unidad de
Sntesis del Instituto de Biotecnologa de la UNAM, lugar donde los iniciadores fueron
sintetizados.




36


Tabla 6. Oligonucletidos para Candida tropicalis
Oligonucletido
para xyl1
Secuencia
Endonucleasa
de restriccin
Tm
Longitud
(bases)
X1CT5E GGA ATT CSA TGT CTA CTA CTC EcoRI 44C 21
X1CT3K
GGG GTA CCG CCT TAA ACA
AAG
KpnI 44 C 21

Oligonucletidos
para xyl2
Secuencia
Endonucleasa
de restriccin
Tm
Longitud
(bases)
X2CT5E GGA ATT CAT GAC TGC AAA CCC EcoRI 46 C 21
X2CT3X GCT CTA GAT CTA TTC TGG ACC GAC XbaI 48 C 24


Tabla 7. Oligonucletidos para Saccharomyses cereviseae
Oligonucletidos
para xyl1
Secuencia
Endonucleasa
de restriccin
Tm
Longitud
(bases)
5EXERIX1
GGA ATT CGT AGA CGC AG EcoRI 48C 17
3EXBHIX1
GGG ATC CAA CAT TTT ATT TAA AGC
BamHI 48C 24

Oligonucletidos
para xyl2
Secuencia
Endonucleasa
de restriccin
Tm
Longitud
(bases)
5EXERIX2
GGA ATT CCA TGA GAG TGG AAG Eco RI 54C 21
3EXBHIX2
CGG ATC CCC ACA ATA ATG C BamHI 52C 22


37

Nota: El color del texto en la secuencia de bases de los oligonucletidos resalta los sitios
de restriccin que se crearon en el diseo de los oligonucletidos para utilizarlos
durante la clonacin de los fragmentos.
GAATTC = EcoRI
GGTACC = KpnI
TCTAGA = XbaI
GGATCC = BamHI

Obtencin por medio de PCR de los fragmentos de DNA que contienen los genes Xyl1
y Xyl2 a partir del DNA genmico de la cepa IEC5-ITV y S. cereviseae.
Para obtener los fragmentos de DNA con los genes Xyl1 y Xyl2 de ambas cepas, estas se
crecieron en medio lquido YEPD con glucosa al 2% para purificar su DNA genmico. En
este trabajo se utiliz la metodologa descrita en el apartado de material y mtodos, y
adicionalmente se utiliz el Kit ZR Fungal/Bacterial DNA Kit
TM
(ver anexo).
La calidad y concentracin del DNA purificado de ambas cepas se analiz por medio de
electroforesis en gel de agarosa al 1.2% en TBE 1X (figura 8).








Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa de los DNA genmicos de levaduras.
Carril 1 y 2 IEC5-ITV; carril 3 marcador; carril 4 S. cerevisiae

1 2 3 4 5

38

Como se puede observan en la figura 8, los DNAs genmicos purificados quedaron limpios
por lo que se procedi a realizar las reacciones de amplificacin in vitro para obtener los
fragmentos de ambos genes de ambas cepas.
Las mezclas de reaccin se prepararon como se especifica en materiales y mtodos. Las
temperaturas y tiempos para cada uno de los pasos de la PCR fueron los mencionados en el
mismo apartado. Los productos de amplificacin obtenidos se muestran en la figura 9.

pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13









Figura 9. Separacin electrofortica de los productos de PCR obtenidos. Carril 1 marcador;
carriles 2-6 PCR de Xyl1 de S. cereviceae; carriles 7-12 PCR de Xyl2 de S. cereviceae;
carril 13 Xyl2 de Candida sp

El anlisis por electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR confirm que se
obtuvieron los fragmentos con el tamao esperado (figura 9). Sin embargo, aunque se
observa una banda mayoritaria con el tamao correcto, para clonarlos se corri un gel
preparativo para cortar solo las bandas correctas. De los fragmentos de agarosa se extrajo el
DNA y se corri un gel analtico para calcular las cantidades de inserto y vector que se
utilizaron en el proceso de clonacin (figura 10).



39












Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2%-TBE 1X de los fragmentos de Xyl1 y
Xyl2 purificados por corte de banda y extraccin. Carril 1 marcador; carril 2 Xyl1 de S.
cereviseae; carriles 3 y 4 Xyl2 de S. cereviseae; carriles 5 y 6 Xyl2 de Candida sp.

Clonacin de productos de PCR en el plsmido pUC 19
Para clonar y mandar a secuenciar los genes Xyl1 y Xyl2 obtenidos por amplificacin por
PCR, tanto los fragmentos como el vectores, pUC19 se digirieron toda la anoche a 37C
con la enzima correspondiente. El DNA tanto de los vectores como de los insertos se limpio
de la mezcla de digestin por extraccin y precipitacin. Las mezclas de ligacin se
hicieron de acuerdo a la metodologa y recomendaciones reportadas por Sambrook y
Russell (2001)
Despus del proceso de transformacin en presencia de CaCl
2
las clulas transformantes se
recuperaron en medio LB slido ms Ap (100 g/mL). Las colonias que crecieron en
presencia del antibitico (Ap
R
) fueron las clulas transformantes que portan el vector de
clonacin. Para confirmar la presencia de inserto, las clonas obtenidas se replicaron en
medio LB adicionado con X-Gal + IPTG para confirmar la presencia de insertos; la
seleccin por el cambio de fenotipo azul por blanco, es indicativo de la presencia de DNA
clonado en el sitio de clonacin mltiple de ambos vectores, ya que se inactiva (interrumpe)
el pptido de la -galactosidasa, enzima que hidroliza el X-Gal volvindolo de incoloro a
pb 1 2 3 4 5 6

40

color azul. Las colonias con fenotipo blanco y Ap
R
se seleccionaron como posibles
recombinantes.

Caracterizacin de clonas con los fragmentos de Xyl1 y Xyl2.
Para confirmar la presencia de los fragmentos clonados cada una de las clonas se creci en
medio lquido toda la noche. Se purificaron plsmidos por el mtodo de lisis alcalina
(anexo), se pusieron en digerir con la enzima de restriccin correspondiente y se analizaron
por electroforesis en gel de agarosa (figura 11). Los plsmidos purificados se nombraron
como pMP ms el nmero que les corresponde.













Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa de las clonas obtenidas despus del proceso de
ligacin en pUC19 y transformacin en XL1Blue. Carril 1 marcador; carriles 2 y 3 clonas
de Xyl1 de S. cereviceae; carriles 4-11 clonas de Xyl2 de S. cereviceae; carriles 12 y 13
Xyl2 de Candida sp.

De las clonas analizadas, no todas tenan inserto (carriles 2-8 en la figura 11). Se
seleccionaron las clonas correctas y se enviaron a secuenciar. Las clonas seleccionadas se
describen a continuacin:
3000 pb
2000
1500
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

41

pMP21 con fragmento de aproximadamente 1,900 pb que corresponde al fragmento
esperado para Xyl2 de S. cerevisiae. Despus de la PCR, este fragmento se purifico y
fue digerido con EcoRI y BamHI y se clono en el vector pUC19 digerido con las
mismas enzimas. Adems de confirmar la presencia de inserto por digestin con
enzimas de restriccin se realiz PCR confirmativa. El plsmido se envi a secuenciar
utilizando los oligonucletidos universales (Forward y Reverso). La secuencia con el
iniciador forward dio un marco de lectura de 870 nucletidos; al analizarlo en el
programa BLAST da 3 alineamientos significativos y el de mayor identidad, 94%
equivalente a 611 pb con tan solo 26 gaps, es con un fragmento del gen de 3866 pb que
codifica la protena RGR1 de S. cereviseae. Esta protena interviene en el mecanismo
de represin por glucosa. La secuencia con el iniciador reverso dan un marco de
lectura de 870 nucletidos que genera 117 alineamientos significativos, siendo el de
mayor identidad de 86% con una regin del cromosoma XII de S. cerevisiae ORF
YLR070c, de 1462 pb con identidad con nuestra secuencia de 310 pb y 27 gaps.

pMP22 con inserto de aproximadamente 1300 pb correspondiente a la PCR de Xyl2 de
S. cereviceae. Fragmento digerido con EcoRI y PstI y ligado en pUC19 digerido con
las mismas enzimas. La presencia de inserto se confirm por patrn de restriccin y
amplificacin mediante PCR. El plsmido se purific con DNA Extraction Kit de
Fermentas y se envi a secuenciacin utilizando oligonucletidos universales
(Forward y Reverso). La secuencia con el iniciador forward dio un marco de lectura
de 490 nucletidos y al analizarlo con BLAST arroja 29 alineamientos significativos;
el de mayor identidad es de 98% con un segmento del genoma completo de
Escherichia coli str. K12 substr. DH10B. La identidad entre la secuencia del inserto y
el genoma de E. coli es de 482 pb y solo 1 gaps. Los resultados con el iniciador
reverso arrojan resultados similares.
pMP22-2 con un inserto de aproximadamente de 1300 pb correspondiente a Xyl2 de S.
cereviseae. Fragmento digerido con EcoRI y PstI y clonado en pUC19 digerido con las
mismas enzimas. La presencia de inserto se confirmo por patrn de restriccin contra
el vector sin inserto, y por medio de PCR. El plsmido se purific con DNA
Extraction Kit de Fermentas, y se envi a secuenciacin con los oligonucletidos

42

universales (Forward y Reverso). Los resultados con ambos iniciadores fueron muy
similares a los obtenidos con el plsmido pMP22.

pMP23 clona con inserto de aproximadamente 1600 pb correspondiente a Xyl2 de
Candida sp. El producto de PCR fue digerido con las enzimas EcoRI y PstI y clonado
en el vector pUC19 digerido con las mismas enzimas. La presencia del inserto se
confirm por digestin con enzimas de restriccin y por PCR. Confirmada la presencia
de inserto, el plsmido se purifico con DNA Extraction Kit de Fermentas y se envi
a secuenciacin con oligonucletidos universales (Forward y Reverso). Los resultados
con iniciador forward dio un marco de lectura de 870 nucletidos; el anlisis con
BLAST dio como resultado 57 alineamientos significativos, siendo el de mayor
identidad (98%) con un segmento del genoma completo de E. coli str. K12 substr.
DH10B. Con el iniciador reverso la secuencia obtenida alinea al 100% con el grupo
de genes para la biosntesis del antgeno O55:H7 de la cepa TB182A de E. coli.

pMP24 con inserto de aproximadamente 1900 pb correspondiente a Xyl2 de S.
cereviseae. Producto de PCR digerido con EcoRI y BamHI para clonarlo en pUC19
digerido con las mismas enzimas. La presencia del inserto se confirm por medio de
patrn de restriccin contra pUC19, y se realiz una segunda confirmacin mediante
PCR. El DNA de plsmido se purific con DNA Extraction Kit de Fermentas y se
envi a secuenciacin con oligonucletidos universales (Forward y Reverso). Los
resultados de secuencia con ambos iniciadores y el anlisis con el programa BLAST
muestran homologa significativa (98%) con el genoma completo de E. coli str. K12
substr. DH10B pero no con los genes de inters.
pMP25 tiene insertado un fragmento de aproximadamente 1600 pb correspondiente a
Xyl2 de Candida sp. El fragmento fue direrido y clonado en pUC19 utilizando las
enzimas de restriccin EcoRI y PstI. La presencia de inserto se confirm por lisis
alcalina y mediante PCR. Para enviar a secuenciacin el plsmido se purific con
DNA Extraction Kit de Fermentas. Las secuencias con los oligoncletidos
universales (Forward y Reverso). Los resultados de la secuencia con ambos iniciadores

43

fueron un marco de lectura de 870 nucletidos, solo que el anlisis con el programa
BLAST determin homologa con el genoma completo de E. coli IAI1 y con la
secuencia completa del vector de clonacin pPAC7, pero no con los genes que se
estudiaron en este trabajo.

pMP26 tiene insertado un fragmento de aproximadamente 1600 pb correspondiente a
Xyl2 de Candida sp. El producto de PCR se digiri y clono en pUC19 con EcoRI y
PstI. La presencia del inserto se confirmo por fenotipo blanco en presencia de X-Gal e
IPTG, por patrn de restriccin y por PCR. El plsmido se purific con DNA
Extraction Kit de Fermentas y se secuenci con oligonucletidos forward y reverso.
Los resultados de la secuenciacin y anlisis con el programa BLAST no dieron
resultados de alineamiento significativos, no se encontr similitud con alguna otra
secuencia.

Considerando que la caracterizacin de los plsmidos recombinantes indica que estn bien,
se decidi seguir dos estrategias: verificar nuevamente las caractersticas de los plsmidos
recombinantes para purificarlos y enviarlos a secuenciar nuevamente utilizando los
oligonucletidos especficos para los genes en estudio.
Adicionalmente, y debido a que los resultados de secuenciacin no fueron positivos en
todas las clonas analizadas se decidi realizar una segunda estrategia de clonacin
utilizando el Kit InsTAclone
TM
PCR Cloning Kit (ver anexo), el cual permite clonar
directamente los productos de PCR sin necesidad de purificarlos. De esta forma se busc
manipular al mnimo los productos de PCR para disminuir las posibilidades de
contaminacin. Se obtuvieron clonas en el medio de seleccin (LB + Ap y LB + IPTG + X-
Gal) con el fenotipo esperado, las cuales se caracterizaran por medio de patrn de
restriccin y PCR para enviarlas a secuenciar.


44

CONCLUSIONES.
Debido a que las caractersticas fermentativas de la cepa IEC5-ITV son muy
prometedoras, los niveles de produccin de xilitol que alcanza son altos en
comparacin de otros aislados (datos no mostrados en este trabajo), es relevante
concluir con la caracterizacin de los genes que codifican las enzimas involucradas en
esta va metablica.
En este trabajo, durante los cultivos rutinarios para mantener la cepa y obtener clulas
para purificar el DNA, se observo que la levadura IEC5-ITV, microorganismo
fermentador de xilosa y productor de xilitol, no se comporta como la cepa control de S.
cerevisiae (levadura Bioclon). Esta ltima cepa a diferencia del gnero Candida sp.,
grupo al que pertenece la cepa IEC5-ITV, es incapaz de metabolizar xilosa como nica
fuente de carbono.
Partiendo de las secuencias reportada en Genbank para Candida sp. los oligos
diseados dan los productos de amplificacin esperados para los genes Xyl1 y Xyl2
tanto con la cepa IEC5-ITV como la cepa control.
El fragmento clonado en el plsmido pMP21 mostr homologa con el cromosoma XII
de S. cereviceae, en el cual se localiza el gen Xyl2 que codifica la XDH y con la
protena RGR1 reguladora del metabolismo de carbohidratos, lo cual es muy
significativo dadas las caractersticas fermentativas de la cepa.
Es necesario repetir la secuenciacin de los otros plsmidos utilizando tanto los
oligonucletidos universales (Forward y Reverso) como los especficos para los
fragmentos amplificados por PCR. Existe la posibilidad de que haya habido confusin
en el manejo de las muestras enviadas a secuenciar.
Es importante mencionar que el gnero Candida est conformado por numerosas
especies, por lo que es necesario llevar a cabo la caracterizacin de la cepa IEC5-ITV
para poder determinar a qu especie pertenece. Para esto se propone hacer secuencia de
los genes del RNA ribosomal para lo cual se van a disear los oligonucletidos
adecuados.
Se est realizando la revisin bibliogrfica para disear la estrategia de identificacin
de la cepa.

45

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48

Anexos

Anexo1. Extraccin de DNA cromosomal utilizando como solucin de lisis Buffer SET

1. Inocular la cepa en medio nutritivo. Incubar con agitacin a 350 rpm durante 10
hrs.
2. Homogenizar el contenido del tubo de cultivo y pasar a un tubo Falcon de 15ml.
3. Centrifugar 5 min a 4000 rpm.
4. Eliminar el sobrenadante y la pastilla de clulas resuspenderla en 2 ml de TE 50/20.
Transferir a tubo eppendorf limpio de 1.5 ml.
5. Centrifugar a 13 krpm por 2 min y desechar el sobrenadante.
6. Resuspender la pastilla en 500 l de buffer SET e incubar 2 horas a 55C.
7. Pasadas las 2 hrs. Adicionar 50 l de SDS 10%, 50l de proteinasa K y 50 l de
lisozima e incubar 15 min a 37C.
8. Adicionar 200 l de NaCl 5M, 300 l de fenol y 300l de cloroformo, dar vortex
por 3 min.
9. Centrifugar a 13 krpm por 5 min. Recuperar sobrenadante y poner en eppendorf
limpio.
10. Adicionar al sobrenadante un volumen de isopropanol, mezclar bien y centrifugar a
13 krpm por 5 min.
11. Tirar el sobrenadante y lavar la pastilla 2 veces con etanol al 80% (1 ml). Decantar
el etanol y poner a secar la pastilla.
12. Una ves seca la pastilla agregar 50 l de TE10/1 y resuspender.
13. Verificar integridad y concentracin por medio de electroforesis.
Si la preparacin de DNA presenta RNA, tratarlo con RNasa:
1. A cada tubo se le pone 5 l de RNasa, se mezcla (Vortex) e incubar 1 hora a 37C
2. Agregar 400 l de cloroformo y mezclar con vortex. Centrifugar a 13 krpm por 3
minutos.
3. Recuperar el sobrenadante y precipitar con el mtodo sal/alcohol: 1/10 de volumen
de NaCl 5 M y un volumen de isopropanol, mezclar bien y centrifugar a 13 krpm
por 10 minutos.

49

4. Tirar el sobrenadante y lavar 2 veces con etanol al 80% (1ml).
5. Poner a secar la pastilla y resuspenderla en 100 l de TE 10/1, realizar electroforesis
para confirmar la extraccin de DNA cromosomal.



Anexo2.Recuperacin de bandas de DNA separadas por electroforesis en gel de
agarosa

1. Despus de separar las bandas de DNA por electroforesis en gel de agarosa a la
concentracin requerida, cortar la(s) banda(s) de inters y pasarla a travs de una
jeringa para triturarla lo ms posible, agregar a la jeringa 200 l de TE 10/1.
2. Depositar los fragmentos en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
3. Congelar en hielo seco o colocarlos en el ultracongelador el tiempo necesario.
4. Sacar los tubos del congelador y adicionar 250 l de fenol y 250 l de cloroformo.
5. Dar vortex bien y congelar a -80C por 30 min.
6. Descongelar y dar vortex nuevamente.
7. Centrifugar a 13 krpm por 10 min.
8. Separar el sobrenadante en un tubo limpio.
9. Adicionar 100 l de buffer TE 10/1 al tubo que tiene la agarosa y dar vortex.
10. Adicionar 250 l de fenol y vortex bien . centrifugar a 13 krpm por 15 min.
11. Pasar el sobrenadante al tubo donde se puso el primer sobrenadante. Centrifugar a
13 krpm por 8 min.
12. Separar el sobrenadante a un tubo limpio y agregar 500 l de cloroformo.
Centrifugar a 13 krpm por 4 min y pasar el sobrenadante a un tubo limpio.
13. Agregar 1/10 de acetato de amonio o de sodio, 1 l de glicgeno y segn el
volumen total por .54 , se agrega de isopropanol.
14. Mezclar por inmersin 1 min y dejar reposar 3 min. Centrifugar a 13 krpm por 15
min.
15. Decantar sobrenadante sin tirar pastilla y lavar con etanol al 80% (1 ml). Decantar
sobrenadante.

50

16. Incubar la pastilla 1 hora a 37C y resuspender en 35 l de TE 10/1 y dar vortex.
17. Checar DNA en gel de agarosa.


Anexo 3.Mini screening de plsmidos por lisis-alcalina

1. Inocular 5 ml de medio con una sola colonia bacteriana. Agregar el antibitico
adecuado e incubar toda la noche a 30 o 37C y con agitacin vigorosa (300 rpm).
El cultivo debe llegar a fase estacionaria.
2. Centrifugar el cultivo de toda la noche en un tubo eppendorf de 1.5 ml durante 45
seg.
3. Lavar la pastilla resuspendiendola en 1.3 ml de Buffer SET; resuspender con vortex
y agitar durante 1 min mas.
4. Centrifugar durante 1 min.
5. Remover el medio por aspiracin para dejar la pastilla de clulas lo ms seca
posible y resuspender 150 l de buffer SET helado.
6. Adicionar 5 l de RNasa y volver a mezclar con vortex.
RNasa: Ribonucleasa pancretica.10mg/ml
Acetato de sodio100mM
EDTA..0.3mM

7. Activar calentando a 80C durante 10 min.
8. Agregar 350 l de solucin de lisis recin preparada y a temperatura ambiente.
Cerrar el tubo y mezclar por inversin repetida. No dar vortex.
Solucin ltica: SDS..1.0%
NaOH. 0.2N
9. Incubar 10 minutos en hielo.
10. Agregar 250l de solucin de acetato de sodio 3M pH 4.8. cerrar el tubo y mezclar
perfectamente por inversin repetida hasta que desaparezca la viscosidad.


51

Acetato de sodio: Acetato de sodio anhidro24.63gr
Ac. actico cbp pH4.8.30 ml aprox.
H
2
O cbp .100ml
11. Incubar 30 min en hielo
12. Centrifugar 5 min a 4C y el sobrenadante, aproximadamente 700 l pasarlo a un
tubo eppendorf limpio.
13. Adicionar un volumen de isopropanol y mezclar invirtiendo el tubo varias veces.
NOTA: opcionalmente se puede dar una extraccin con cloroformo al DNA antes de
precipitarlo. Esto, elimina exopolisacridos mejorando la calidad del DNA.
14. Centrifugar 15 min a temperatura ambiente, remover el sobrenadante e invertir el
tubo abierto sobre una toalla de papel para secarlo lo mejor posible.
15. Lavar 2 veces con 1 ml de etanol al 80% a temperatura ambiente y vortex breve.
16. Centrifugar 5 min a temperatura ambiente remover el sobrenadante y secar la
pastilla a temperatura ambiente durante 10 min en el Savant.
17. Resuspender en 50 l de TE 10/1 pH 8.0. usar 5 l para cada reaccin de
restriccin.


Anexo 4.Preparacin de la mezcla de PCR para amplificar los fragmentos

Xyl1 Xyl2
dNTPs 2.0 l 2.0 l
Oligonucletido 1.0 l 1.0 l
Oligonucletido 2.0 l 1.0 l
MgCl
2
25mM 2.0 l 2.0 l
Buffer 10X 2.0 l 2.0 l
Taq Polimerasa 0.3 l 0.3 l
DNA templado 1.0 l 1.0 l
Agua 9.7 l 10.7 l
Volumen Final 20.0 l 20.0 l

52

Anexo 5. Precipitacin de digestiones

1. Llevar a 200l con TE 10/1
2. Agregar 400l de cloroformo y centrifugar 4 min a 13000 rpm
3. Pasar sobrenadante a un tubo limpio y agregar 1/10 de acetato de sodio
4. Agregar 2l de glicgeno y mezclar
5. Agregar 0.6 volumen de isopropanol
6. Mezclar por inmersin 1 min y dejar reposar 3 min.
7. Centrifugar 15 min a 13000 rpm
8. Decantar sobrenadante sin tirar pastilla
9. Lavar con etanol al 80%, decantar el sobrenadante y dejar secar el etanol
10. Resuspender pastilla en 25l de TE 10/1


Anexo 6. Preparacin de clulas competentes

JM101, DH5, XLI-Blue, CMK, MM294 RecA-
Da 1
1. Inocular 25ml de LB con la cepa de E. coli a transformar. Incubar toda la noche a
37C y 300 rpm.
2. Inocular 1,000 ml de medio Luria con el cultivo de toda la noche y crecer a 37C y
300 rpm hasta una densidad de 0.6 DO a 560 nm (fase exponencial).
Aproximadamente en 2.5 horas (1.5 a 2 horas para la cepa MM294).
Da 2
3. Obtener las clulas centrifugando en el rotor JAI4 durante 5 min a 5krpm y 4C.
Para esto, dividir el volumen en 4 botellas de 250 ml fras y estriles.
4. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla de clulas con 400 ml de CaCl
2
0.1 M
fro (100ml/botella). Resuspender rpido con vortex y agitacin.
5. Incubar en hielo durante 4 horas.

53

6. Centrifugar 5 min a 3.5 krpm y resuspender la pastilla celular en 40ml de buffer de
transformacin fro (10ml/botella), agitando suavemente.
Buffer de transformacin: CaCl
2
..100mM
Glicerol...15%
7. Incubar en hielo y refrigerar toda la noche.
Da 3
8. Alicuotar 200l de clulas en tubos eppendorf de 0.6ml estriles y fros. Congelar
en hielo seco y guardar a -70C hasta su uso. Estas clulas son viables hasta por 6
meses. Cuando se descongelan, deben usarse de inmediato y nunca volver a
congelarlas para reusarse.
NOTA: Trabajar siempre en hielo.




Anexo 7. Transformacin de E. coli con Ca

1. Si las clulas competentes estaban a -70C, descongelarlas lentamente en hielo.
2. Alicuotar 50 l de clulas en un tubo eppendorf de 1.5ml limpio y estril.
Adicionarles de 1-10 l del DNA con el que se van a transformar. Como control,
adicionar a las clulas competentes el mismo volumen que se utiliz de DNA pero
en este caso usar solo el buffer en el que esta el DNA.
NOTA: Cuando se transforma con plsmido superenrrollado utilizar 1l de los 50 l que
se obtienen de un miniprep segn el protocolo dado por Rodrguez.
3. Incubar la mezcla 30 min en hielo y dar un choque de calor a 42C durante 2 min.
4. Pasar inmediatamente a hielo e incubar durante 5 min ms.
5. Adicionar a la mezcla de transformacin 0.5 ml de LB(SOC) e incubar durante 1
hora a 37C. Para seleccionar por resistencia a Tc incubar 2 horas.

54

6. Platear de 0.1 a 0.2 ml por caja (50l cuando se transforme plsmido
superenrrollado). Utilizar el marcador de resistencia para seleccionar las clulas
transformadas.
7. El control, clulas transformadas solo con buffer, diluirlas y platearlas en medio sin
antibitico.

NOTA: Para la cepa MM294
Heat Shock a 42 C por 1 minuto mximo. Recuperar de 2 a 3 horas a 20-30C, incubar
las placas a 29-30C, se ven colonias despus de 36 a 48 horas.



Anexo 8. ZR Fungal/Bacterial DNA Kit
TM

1. Aadir 50-100 mg (peso hmedo) de hongos o bacterias que se han resuspendido en
200l de agua o buffer isotnico (ej. PBS) o hasta 200 mg de tejido a un tubo de
lisis ZR Bashing Bead.
NOTA: Los cultivos de C. tropicalis y S. cerevisiae se resuspendieron en 200 l de NaCl
0.85%.
2. Al tubo de lisis se le agrega 750 l de solucin de lisis antes de agregar las pastillas
resuspendidas.
3. Dar vortex por 5 min
4. Centrifugar el tubo de lisis ZR Bashing Bead en una microcentrifuga a 10,000 xg
por 1 min.
5. Transferir 400 l del sobrenadante a Zymo-Spin IV spin Filter (tapa naranja) con
tubo de colecta y centrifugar a 7,000 rpm por 1 min.
NOTA: Quitar el tapn del tubo naranja antes de su uso.
6. Aadir 1200 l de Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer para el filtrado en el tubo
de colecta del paso 5.

55

7. Transferir 800 l de la mezcla del paso 6 a una columna Zymo Spin IIC con tubo
de colecta y centrifugar a 10,000 xg por 1 min
8. Decantar lo contenido en el tubo de colecta y repetir el paso 7
9. Aadir 200l de Buffer DNA Pre-Wash a la columna Zymo-Spin IIC en un nuevo
tubo de colecta y centrifugar a 10,000 xg por 1 min
10. Aadir 500l de Buffer Fungal/Bacterial DNA Wash a el Zymo Spin IIC y
centrifugar a 10,000 xg por 1 min.
11. Transferir la columna Zymo Spin-IIC a un tubo limpio de 1.5 ml y adicionar 100l
de Buffer DNA elution directamente a la columna, centrifugar a 10,000 xg por 50
seg. para eluir el DNA.
12. Checar muestra por electroforesis en gel de agarosa.


Anexo 9 .InsTAclone
TM
PCR Cloning Kit

Ligaciones
Componente Volumen
Vector pTZ57R/T 3l
Buffer de ligacin 6l
PCR Xyl1 S.
cerevisiae
3l
T4 DNA ligasa 1l
H
2
O cbp 30l 17l

Nota: se ponen los mismos reactivos para Xyl2 C. tropicalis
Se dejan incubando toda la noche a 4C
Transformacin
Da 1
1. Un da previo a la transformacin se deja en agitacin a 350 rpm un tubo con 3ml
de medio LB inoculado con XLI-Blue.

56

Da 2
2. Preparar solucin T: en un tubo eppendorf de 1.5 ml mezclar 430l de sol
T(A)+430 l de sol T(B), se deja en hielo hasta su uso.
3. En un tubo falcn de 15ml adicionar 1.5ml de C-Medium e inocularlo con 150l
del cultivo de XLI-Blue de toda la noche. Incubar 20 min a 37C en agitacin.
4. Pasados los 20 minutos centrifugar por 1 min y descartar el sobrenadante.
5. Resuspender la pastilla en 300l de solucin T e incubar 5 min en hielo.
6. Centrifugar por 1 min en una Microcentrifuga y descartar el sobrenadante.
7. Resuspender la pastilla en 120l de solucin T e incubar 5 min en hielo.
8. En un tubo eppendorf de 1.5 ml adicionar 2.5l de la ligacin, previamente
calentada a 65C por 10 min.
9. Adicionar 50l de las clulas preparadas anteriormente, incubar 5 min en hielo.
10. Platear inmediatamente en cajas de LB con ampicilina, incubar toda la noche a 37C


Anexo 10. Mapa del vector de clonacin pUC 19
















57

Anexo 11. Mapa del vector de clonacin pTZ57R/T