Aplicacin de la metodologa de superficie de respuesta para estudiar la eliminacin de los estrgenos en un reactor de membrana continuo lacasa mediada

abstracto Una caja de tres niveles - diseo factorial Behnken combinado con la metodologa de superficie de respuesta ( RSM ) se aplic como una herramienta para estudio de la expulsin lacasa - catalizada de tres compuestos estrognicos: estrona ( E1 ), estradiol ( E2 ), y etinilestradiol ( EE2 ), en un reactor de membrana enzimtica continua ( EMR ). Se consideraron tres factores principales que afectan el tratamiento efi ciencia: actividad de la enzima, el tiempo de retencin hidrulica ( TRH ) y la tasa de oxigenacin . Como era de esperar, la actividad lacasa y HRT mostraron efectos grandes y , curiosamente , la relevancia de oxgeno en la mejora de la cintica de oxidacin mediante el aumento de la disuelto por encima de los niveles de saturacin de oxgeno se demostr . Al considerar las tasas de eliminacin como la respuesta , las condiciones ptimas eran : 1000 U / L de lacasa , 1 h TRH y 60 MgO 2 / ( ? L h ) de la tasa de oxigenacin , la prediccin de 2,82 a 3,24 mg eliminado / ( L h? ), ( 71 - 81 % de oxidacin) . Estas condiciones ptimas fueron validados con xito , y 75 % de la reduccin de estrogenicidad fue alcanzado . Por otro lado , slo 100 U / L se han encontrado como ptima para maximizar la efi cacia de la enzima : E1 se oxid por 0,06 mg / (L ? h ? U ) , aunque la eliminacin de estrogenicidad se redujo a 60 % . La metodologa tambin se aplica a maximizar la reduccin de la actividad estrognica : los valores ms altos se ensayaron [ 1000 U / L , la TRH 4 h y 60 MgO 2 / ( L h ? ) ] siempre 99 % desintoxicacin de cationes.

Introduccion El desarrollo de los procesos para eliminar eficazmente las sustancias estrognicas presentes en el medio ambiente ha sido un foco de investigacin en los ltimos aos debido a la no puede actividad estrognica significativa relacionada con estos compuestos (Aerni et al 2004;. Suzuki et al.2003), junto con su inefi ciente demostrado la degradacin en las plantas de tratamiento de aguas residuales convencionales (STPS) (. Esplugas et al 2007; Leusch et al 2005). y el nmero de desventajas asociadas con las tecnologas recientes como la ozonizacin (por ejemplo, los altos costos, periodos de tratamiento prolongados y subproductos con toxicidad incierta) (Auriol et al 2006;. Kim y Nicell 2006; Moriyama et al. 2004). Con el objetivo de superar ese reto, innovador tecnologas se estn estudiando, como el tratamiento sistemas basados en reacciones catalizadas por enzimas, con lacasa siendo el ligninoltico ms ampliamente aplicada enzima debido a sus requisitos catalticos simples [que utiliza oxgeno como aceptor de electrones (Wesenberg et al. 2003)], y su conocida capacidad para oxidar contaminantes recalcitrantes: por ejemplo, colorantes, pesticidas y compuestos poliaromticos hidrocarburos (Camarero et al 2007.; Yamak et al. 2009). Nuestro grupo de investigacin ha investigado la capacidad de la lacasa de Myceliophthora thermophila para eliminar naturales [estrona (E1) y estradiol (E2)] y sinttico [etinilestradiol

(EE2)] estrgenos en el modo por lotes (Lloret et al. 2010). Enzima inmovilizacin ha sido probado en y intento de la aplicacin de tratamiento enzimtico en operaciones continuas

usando reactores de lecho fijo o fluidizado (Lloretet al. 2011, 2012b, c).
Sin embargo, un nmero de desventajas relacionado con las limitaciones de difusin o los difi cultad para mantener un nivel constante de enzima la actividad en el biorreactor son evidentes cuando se utilizan enzimas inmovilizadas (Diano et al. 2007). Con el fin de evitar estas limitaciones, as como para disear un enzimtica reactor de membrana (EMR) basado en el uso de una membrana semipermeable para asegurar la retencin de la enzima en el sistema y por lo tanto su reciclaje. Eso biorreactor se aplic con xito para la eliminacin de los estrgenos naturales, E1 y E2, y el efectos del tiempo de residencia hidrulica (TRH) y Se evalu el aporte de oxgeno (Lloret et al. 2012a). Con el fin de evitar estas limitaciones, as como para disear un enzimtica reactor de membrana (EMR) basado en el uso de una membrana semipermeable para asegurar la retencin de la enzima en el sistema y por lo tanto su reciclaje. Eso biorreactor se aplic con xito para la eliminacin de los estrgenos naturales, E1 y E2, y el efectos del tiempo de residencia hidrulica (TRH) y Se evalu el aporte de oxgeno (Lloret et al. 2012a). No obstante, la optimizacin convencional mtodo seguido, el "un factor a la vez", enfoque, no es el ms adecuado para la optimizacin de procesos ya que es muy lento, laborioso, y incompleta, con la metodologa de superficie de respuesta (RSM) ser una alternativa adecuada. Esta herramienta es utilizado ampliamente en la biotecnologa para el diseo de experimentos, la construccin de modelos y la evaluacin de la signifi cacin de diversas variables, adems de la determinacin condiciones ptimas, adems, permite una reduccin de la el nmero de experimentos a realizar (Claus et al. 2002; Ferreira et al. 2007; Roriz et al. 2009). RSM basada en un diseo de Box - Behnken ha sido exitosa aplicado para evaluar diferentes multivariable sistemas, como los tratamientos de aguas residuales (Fern ndez et al. 2011) y la eliminacin enzimtica de diversos contaminantes (Bhattacharya y Banerjee 2008; Khouni et al. 2010; Tavares y col. 2009). Sin embargo, para nuestra conocimiento, ningn estudio para la optimizacin de la parmetros en la operacin continua de un catalizada lacasa sistema para el propsito de biorremediacin tiene ha llevado a cabo previamente. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar por RSM la eliminacin de E1, E2 y EE2 por lacasa libre en un EMR continua e investigar los efectos individuales y relacionados entre s de los parmetros estudiados (actividad enzimtica, HRT, y la tasa de oxigenacin) en las diferentes respuestas evalu: tasas de extraccin, remocin las tasas por unidad de enzima requerida, y la reduccin de la actividad estrognica.

Materiales y mtodos Materiales

Los compuestos estrognicos seleccionados, E1, E2 y EE2, se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE.UU.). 2,2 '-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS,? 99%) fue suministrado por Fluka (EE.UU.). Todos los disolventes fueron de calidad HPLC (Sigma-Aldrich, Alemania). Los levadura Saccharomyces recombinantes cerevisiae fue proporcionado amablemente por el Laboratorio de Ecologa Microbiana y Tecnologa (Labmet, Gante Universidad, Blgica). Comercial lacasa (Novozym 51003) de Myceliophthora thermophila fue suministrado por Novozymes (Dinamarca). Esta enzima (56 kDa) fue producido por fermentacin sumergida de organismos genticamente modifi cada Aspergillus sp. RSM y el diseo factorial

Un total de 15 experimentos se llevaron a cabo con el fin de estudiar la infl uencia que tres factores principales, actividad enzimtica, la TRH, y la tasa de oxigenacin, pueden tener en la eliminacin de los estrgenos (E1, E2, y EE2) en un reactor enzimtico continuo . Los factores y niveles codificados y el diseo experimental se muestran en la Tabla I. Los niveles evaluados fueron seleccionados de acuerdo a los valores anteriores examinados y preliminar resultados obtenidos para E1 y E2 eliminacin continua (Lloret et al. 2012a). Los resultados experimentales se analizaron mediante el uso de el software Statgraphics Centurion XVI (Statsoft Inc.) con el fin de vincular la respuesta a la seleccionada variables. La caja experimental - diseo Behnken y el anlisis de la varianza (ANOVA) se llevaron a cabo por el mismo programa. La calidad de los modelos era expresada por los coeficientes de correlacin (R 2 y LDA 2), y la signifi cacin estadstica se verific el F-test. Por ltimo, las superficies de respuesta tridimensionales se representaron con el software Matlab R2012a (MathWorks Inc.). La respuesta evaluada fue relacionada con la seleccionada variables por un modelo cuadrtico de la siguiente manera:

donde Y es la respuesta predicha; x 1, x 2, y x 3 sonlos niveles de codificacin de los factores; 0 es el intercepto plazo, 1, 2, 3 y los coeficientes de los efectos lineales; 12 , 13, 23 y son los coeficientes a travs del coeficiente, y 11, 22, 33 y son los coeficientes de segundo grado. La eleccin de esta respuesta es justificacin ed por el hecho de que relativamente pocas combinaciones experimentales de las variables son necesaria para estimar el potencial compleja respuesta funcin.

La eliminacin continua de estrgenos en un enzimtica reactor de membrana Un EMR descrito anteriormente (Lloret et al. 2012a) se utiliz para la eliminacin lacasa-catalizada continuo de E1, E2, y EE2. Forma concisa, el biorreactor consisti de un reactor de tanque agitado de 250 ml operado en un continuo modo acoplado a una la ultrafiltracin polietersulfona membrana (Prep / Escala-TFF Millipore) con un corte de peso molecular nominal de 10 kDa, lo que permite el reciclaje de la enzima de nuevo a la reactor. El volumen adicional en poder del ltracin ultrafi y la unidad de tubera de interconexin de 120 ml. La temperatura se control a 26 C por circulado agua y la velocidad de agitacin fue de 250 rpm. Un esquema representacin del reactor se muestra en la Figura 1.
Una solucin madre que contiene E1, E2, y EE2 (4 mg / l de cada uno) en 100 mM de tampn de fosfato de sodio (pH 7,0) se aliment continuamente en el reactor por una bomba peristltica (Cole-Parmer). La adicin de la alimentacin tasa se selecciona de acuerdo con la TRH considerado en cada experimento (Tabla I). Lacasa se aadi en un solo pulso inicial y se recicl en una reciclaje: alimentacin fl ujo relacin de 12:1. Una electrovlvula situado en el extremo de un tubo de membrana fl exible controlado se utiliz por un temporizador cclico para inyectar oxgeno con un fl ujo pulsante (35 - 38 mg / L de oxgeno disuelto Se han alcanzado por cada impulso) a diferentes frecuencias para funcionar a velocidades de adicin de oxgeno en el rango entre 15 y 60 MgO 2 / (L? h).
Metodologa de superficie de respuesta para estudiar la eliminacin de los estrgenos Tabla I. Box - Behnken diseo factorial, la comparacin de los valores obtenidos experimentalmente y tericamente predicho para E1, E2 y EE2 continuo tasas de remocin [Y1, mg / L (? h)] y los porcentajes de reduccin de la actividad estrognica alcanzado.

Se tomaron muestras en diferentes perodos del recipiente de reaccin con el fin de medir la lacasa actividad, as como de la uentes effl para determinar tanto las concentraciones de estrgenos y el estrognicos actividad. Concentraciones residuales de estrgeno se monitorizaron ms de 10 - 14 h de operacin con el objetivo de verificar que se alcanzaron las condiciones de estado estacionario. Controles que carecen lacasa demostr que la eliminacin de la compuestos era debido a la accin de la enzima slo. Adems, se demostr que no haba fsica adsorcin de los estrgenos sobre la membrana.
Los mtodos de anlisis

Determinacin de la actividad lacasa. Actividad de la lacasa se determin mediante el control de la oxidacin de 5 mM ABTS a sus catin radical ABTS (??) A 436 nm en MM de tampn de acetato de sodio 100 (pH 5) y 30 C [? 29300 1 / (M? Cm)] en un Shimadzu UV-1603 espectrofotmetro. Una unidad (U) de actividad fue defi nida como la cantidad de enzima que forma 1 mol de ABTS?? por min. Los anlisis de cromatografa lquida de alto rendimiento. Determinacin de las concentraciones de estrgenos era llevada a cabo por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en un sistema HP-1090 equipado con un detector de matriz de diodos a 210 nm. Cromatogrfico separacin se realiz en una Lichrocart 250-4 columna rellena con Licrosphere 100 RP-18 5 m (Merck) y se utiliz 100 l de volumen de inyeccin. La fase mvil consisti en una mezcla binaria de disolventes A (acetonitrilo) y B (fosfato 50 mM tampn, pH 4,5) a una velocidad de flujo de 0,8 fl ml / min. La mtodo del gradiente y tiempos de funcionamiento se programan de la siguiente manera: las condiciones iniciales fueron 40% A durante 1 min, a continuacin, una lineal aumentar hasta un 80% en 20 min, que se mantuvo durante 4 min, seguido por una lineal programa al 40% durante 5 min y se mantuvo durante 1 min. Evaluacin de la actividad estrognica. La actividad estrognica se midi por el ensayo de LYES (estrgeno levadura pantalla-ensayo asistido por digestin enzimtica con liticasa), descrito previamente por Schultis y Metzger (2004) y detallado en otro lugar (Lloret et al. 2012c), utilizando precultivos levaduras de Saccharomyces cerevisiae. Resultados y discusin Basado en la caja - Behnken y el enfoque RSM, el metodologa consta de tres pasos principales: (i) el rendimiento de experimentos diseados estadsticamente, la estimacin de (ii) de los coeficientes de un modelo matemtico con el correspondiente anlisis de la varianza (ANOVA), y (iii) la prediccin de la respuesta y la validacin de los el modelo (Caja y Behnken 1960). Una aplicacin completa de RSM despus de la pasos mencionados anteriormente se llev a cabo teniendo en cuenta la tasa de eliminacin (expresado en mg eliminado por volumen del biorreactor y hora [mg / (L? h)] como respuesta variables (Y1). Posteriormente, la metodologa fue tambin aplicada por las siguientes respuestas: Y 2 [mg / (? L h U)], las tasas de extraccin por unidades utilizadas de la enzima, y Y 3 (%), la reduccin de la actividad estrognica.

Anlisis de la velocidad de eliminacin

Montaje del modelo y anlisis de varianza. Conforme el diseo de Box - Behnken, 15 experimentos diferentes correspondiente a la operacin continua del reactor enzimtica se llevaron a cabo. Los niveles de los factores, junto con los resultados experimentales son presentado en la Tabla I. En un estudio anterior, 500 U / L de lacasa, HRTs de 2 y 4 h y pulsos de oxgeno cada 30 min y 1 h [tasas de oxigenacin 60 y 30 MgO 2 / (L? H), respectivamente] se ensayaron, obteniendo los rendimientos de eliminacin de entre 59% y 100% (Lloret et al. 2012a). Los niveles estudiados en el presente trabajo fueron seleccionados de acuerdo a los resultados preliminares: 100 y 1000 U / L tambin se ensayaron para reducir al mnimo la el consumo de enzima o para mejorar la eliminacin cuando funciona a baja oxigenacin y HRT, un TRH de 1 h tambin se consider para maximizar la tasas de eliminacin, y de suministro de oxgeno de 15 MGO 2 / (L h?) se incluy en el estudio para investigar su efecto sobre una gama ms amplia. El oxgeno puro se utiliz ya que era demostrado anteriormente que el suministro de aire en fl ujo continuo no ejerci ningn efecto signifi cativo en la cintica de E1 y E2 oxidacin continua (Lloret et al. 2012a). Un modelo polinomial de segundo orden se ajust a los datos experimentales de las tasas de eliminacin de E1, E2, y EE2 y los siguientes modelos empricos fueron obtenido:

donde Y 1 corresponde a la tasa de eliminacin [mg / (L? H)] de cada uno de los estrgenos en el estado estacionario, y x 1, x 2 y x 3 son los valores codificados de las variables estudiadas: actividad lacasa, HRT, y la oxigenacin tarifa. Los valores positivos indican sinergismo negativo, mientras que valores indican antagonismo. El error estndar asociado para cada parmetro proporcionado por el software fue menor que 5%. De los resultados obtenidos, diagramas de Pareto se trazada para analizar el efecto estandarizado de cada factores y su interdependencia en la eliminacin de los estrgenos (Figura 2). Por otra parte, la estadstica signifi cacin de los modelos propuestos se investig por ANOVA (Tabla II). Se supuso que el coefi cientes de regresin y la correlacin entre cada factor puede considerarse estadsticamente signifi cativa para valores de p por debajo de 0,05. Todos los trminos de la expresin resultaron ser signifi cativa, excepto los crossinteractions x 1? x 3 y 2 x? x 3 para los tres compuestos analizado, as como el efecto cuadrtico 3 x 2 en el caso de E1.

Por lo tanto, los modelos polinomiales pueden ser ed simplificaciones a las expresiones con siete o seis ajustable coeficientes. Adems, se observ que la terapia de reemplazo hormonal de la compuestos en el reactor era la variable con el ms signifi efecto no puede, y como era de esperar para una variable respuesta defi nida por unidad de tiempo [mg / (L? h)], que efecto fue negativo. En contraste, la terapia de reemplazo hormonal tendra un efecto positivo si la respuesta era el porcentaje de oxidacin. Por ejemplo, cuando el aumento de la TRH a partir 1 a 4 h, la velocidad de eliminacin de E1 disminuy de 2,11 a 0,76 mg / (L? h) (carreras 1 y 3, Tabla I), mientras que el porcentajes de remocin mejor de 53% a 76% (datos no mostrados). El efecto cuadrtico de la terapia de reemplazo hormonal fue el segundo parmetro no puede ms signifi seguido por el efecto lineal de la actividad enzimtica. Oxigenacin tasa tambin tuvo un efecto importante en la eliminacin tasa de E1. Las tasas de eliminacin de los compuestos diana calculadas por los modelos se muestran en la Tabla I, su correlacin con los valores experimentales era muy cerca, lo que indica la bondad del racor. De hecho, alto coeficiente de correlacin coeficientes R 2 y LDA 2 entre Se obtuvieron 0,997 y 0,999, lo que corrobora la adecuacin de los modelos. Anlisis de superficie de respuesta. El efecto de las variables probado y sus interacciones en la eliminacin de la compuestos diana se analizaron por medio de RSM y las representaciones grficas de superficie obtenidos para la eliminacin de E1 se muestra en la Figura 3. E1 fue seleccionado como el modelo ya que se observaron pequeas diferencias entre los tres compuestos ensayados.