Rev. Fac. Ing. Univ. Antioquia N. 43.pp. 33-41.

Marzo, 2008 Implementacin de un bus articulado con motor dedicado a gas natural ...

Determinacin de la velocidad especfica de consumo de oxgeno en microorganismos incluyendo el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno Determination of the specific oxygen uptake rate in microorganisms including electrode time response
Ana Mara Torres Lpez a*, Juan Carlos Quintero Daz b, Luca Atehorta Garcs c Programa de Bioingeniera. Calle 67 N 53108, Universidad de Antioquia, A.A. 1226, Medelln, Colombia
a

Grupo de Bioprocesos, Departamento de Ingeniera Qumica. Calle 67 N 53108 Universidad de Antioquia, A.A. 1226, Medelln, Colombia
b

Grupo de Biotecnologa Vegetal. Instituto de Biologa. Calle 67 N 53108 Universidad de Antioquia, A.A. 1226, Medelln, Colombia
c

(Recibido el 6 de agosto de 2007. Aceptado el 9 de noviembre de 2007)

Resumen La transferencia de oxgeno es un parmetro importante en los procesos de fermentacin aerobios. Conocer el consumo de oxgeno real del organismo de inters, permite determinar los requerimientos energticos y de proceso en aireacin y agitacin. En este trabajo se presenta un tratamiento matemtico y metodolgico para la determinacin de la velocidad especca de consumo de oxgeno (QO2) considerando el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno. Dicha metodologa se aplic en la determinacin del QO2 del hongo medicinal Ganoderma lucidum, durante su cultivo en un reactor de tanque agitado a escala de laboratorio. Se obtuvo un valor promedio de QO2 de 0,345 mmol O2 (g biomasa.h)-1 0,0171 sin incluir el tiempo de respuesta del electrodo y de 0,383 mmol O2(g biomasa.h)-1 0,025 al incluir dicho parmetro. A mayor tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno, mayor ser la diferencia entre los valores de QO2.

* Autor de correspondencia: telfono: + 57 + 4 + 219 55 08, fax: + 57 + 4 + 211 90 28, correo electrnico: atorres@udea.edu.co (A. Torres)

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---------- Palabras clave: demanda especfica de consumo de oxgeno, electrodo de oxgeno disuelto, tiempo de respuesta, Ganoderma lucidum.

Abstract The oxygen transfer rate is an important parameter for the aerobic fermentative process. By establishing the real oxygen uptake rate of the target organism we can determine the energetic and process requirements for aeration and agitation. We report in this paper the mathematical and methodological procedure for the determination of the specic oxygen uptake rate (QO2), taking the oxygen electrode response into account. This methodology was applied to the QO2 determination for the Ganoderma lucidum medicinal mushroom while it was being cultured in a stirred reactor in the laboratory. The average value for QO2 was 0.345 mmol O2 (g biomass.h)-1 0.0171 without taking the electrode time response into account and 0.383 mmol O2 (g biomass.h)-1 0.025 taking the electrode time response into account. Higher response times of the oxygen electrode resulted in a greater differences between the two QO2 values obtained. ---------- Keywords: specific oxygen transfer rate, oxygen electrode, time response, Ganoderma lucidum.

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Determinacin de la velocidad especfica de consumo de oxgeno

Introduccin
En los procesos de fermentacin aerbicos es necesario un suministro adecuado de oxgeno que satisfaga los requerimientos metablicos de los organismos empleados. La oxidacin de la fuente de carbono y su transformacin en clulas, productos y CO2 establece una demanda de oxgeno que es esencial satisfacer a travs de la aireacin y mezclado del cultivo, el oxgeno es el receptor nal de los electrones producidos en las reacciones de oxidacin, fenmeno conocido como respiracin aerobia [1, 2]. Comnmente el oxgeno se introduce en el caldo de cultivo por la inyeccin de aire, las molculas de oxgeno deben superar una serie de resistencias al transporte antes de que sean utilizadas por las clulas. En la gura 1 se muestran de forma esquemtica las resistencias involucradas en el transporte de oxgeno desde el interior de las burbujas de gas hasta el lugar de reaccin en el interior de las clulas [3]. La velocidad a la que las clulas consumen oxgeno en los biorreactores determina la velocidad a la que se requiere transferir. Muchos factores inuyen en la demanda de oxgeno, siendo los ms importantes la especie celular utilizada, la fase de crecimiento del cultivo y la naturaleza de la fuente de carbono en el medio. En cultivos discontinuos, la velocidad de consumo de oxgeno vara con el tiempo, debido a que la concentracin de clulas aumenta durante el cultivo y a los cambios siolgicos en las diferentes fases de crecimiento. De otro lado, cuando la concentracin de oxgeno disuelto en el lquido (CL), se site por debajo de un cierto nivel crtico (Ccrt.), la velocidad especca de consumo de oxgeno depender tambin de CL. Para eliminar las limitaciones en el crecimiento por falta de oxgeno, CL en cada punto del biorreactor debe ser superior a Ccrt.. La CL en biorreactores se mide generalmente empleando un electrodo de oxgeno disuelto. Existen dos tipos de electrodos que son de uso comn: los electrodos galvnicos y los polarogrcos. Los

electrodos estn constituidos por una carcasa metlica que contiene un ctodo de Pt y un nodo de Ag, inmersos en una solucin electroltica. Esta celda est separada del medio por una membrana permeable al oxgeno. Las reacciones que tienen lugar en el electrodo son: Reaccin nodo: 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4eReaccin Ctodo: O2 + 2 H2O + 4 e- 4 OH-

Figura 1 Representacin de las resistencias a la transferencia de oxgeno desde las burbujas de aire hasta el interior de la clula en clulas libres y agregados celulares. (i) Difusin desde la fase gaseosa de la burbuja hasta la interfase, (ii) Disolucin del oxgeno a travs de la interfase gas-lquido, (iii) Difusin a travs de una pelcula lquida estancada que rodea la burbuja, (iv) Transporte convectivo del oxgeno a travs del seno del fluido, (v) Difusin a travs de una pelcula lquida estancada que rodea la clula o los agregados, (vi) Difusin libre a travs de la interfase lquido-clula o lquido-agregado, (vii) Difusin a travs del agregado hasta cada clula individual y (viii) Difusin libre a travs del citoplasma al interior de la clula

Estas reacciones qumicas producen una corriente elctrica que es proporcional a CL. Puesto que no existe movimiento del uido en la solucin electroltica y escaso movimiento en la pelcula lquida que rodea la membrana, se considera que el oxgeno se transere desde el medio hacia el

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electrodo por difusin molecular y como consecuencia, existe un retraso en la respuesta del electrodo con respecto al valor real en el medio. El tiempo de respuesta se dene como el tiempo que tarda el electrodo en alcanzar el 63% del valor nal de la medida, cuando se lo expone a un cambio de concentracin [3]. En caso de que no se tuviera en cuenta la correccin por el retraso en la respuesta del electrodo de oxgeno, sobre los valores de OD suministrados, se podra sub-

valorar el valor del QO2 y en consecuencia operar el biorreactor bajo unas condiciones de aireacin y/o agitacin no adecuadas para el crecimiento del microorganismo. En la tabla 1 se presentan datos de QO2 reportados en la literatura. En algunos de estos reportes bibliogrcos no se especica si los datos de concentracin de oxgeno, necesarios para la determinacin de dicho parmetro, fueron corregidos considerando el tiempo de respuesta del electrodo.

Tabla 1 Velocidad especfica de consumo de oxgeno (QO2) para diferentes microorganismos QO2 (mmol O2 . g clulas-1.h-1) 5,13 (sin corregir) 0,79 (corregido) 1,06 18,00 (sin corregir) 0,81

Organismo

Ref.

Bacillus thuringiensis Cephalosporium acremonium Pseudomonas putida Candida lipolytica

[4] [5] [6] [7]

La informacin respecto a la metodologa para la determinacin del QO2 teniendo en cuenta el tiempo de respuesta del electrodo es escasa [2, 8]. Por tanto, el objetivo principal de este trabajo es presentar en forma detallada el procedimiento matemtico para la determinacin de la velocidad especca de consumo de oxgeno QO2 considerando el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno; adicionalmente se presenta la aplicacin de dicho procedimiento en la determinacin del QO2 para el hongo medicinal Ganoderma lucidum cultivado en un biorreactor de tanque agitado.

Donde

(1)

KLa: coeciente volumtrico de transferencia de oxgeno (h-1) C*: solubilidad del oxgeno en el medio (gL-1) CL: concentracin de oxgeno disuelto en el medio (gL-1) QO2: velocidad especca de consumo de oxgeno (mmol O2 .g clulas secas-1. h-1) X: concentracin de clulas secas en el medio (g.L-1)

Modelo matemtico
A continuacin se presenta el modelo para el clculo del QO2 considerando el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno. La ecuacin (1) describe el balance de oxgeno durante la transferencia desde una burbuja de aire hacia el medio de cultivo y el consumo por la clula:

Al dividir ambos lados de la ecuacin (1) por C*, se tiene: (2)

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Determinacin de la velocidad especfica de consumo de oxgeno

Donde R =

Q O 2X C*

Durante la medicin del QO2 se suspende la aireacin, por tanto la ecuacin (4) se simplica as: (3)

De la ecuacin (4), si se dene que E ' (t ) = L C*, entonces: ,y

E ' (t T ) = U + V (t T )

(6)

Multiplicando la ecuacin (5) y (6) por k e igualando ambas ecuaciones, resulta: (7)

La ecuacin (3) puede integrarse con la condicin inicial CL(0)=Cb. Donde Cb es la concentracin de oxgeno disuelto en condicin de estado estable, al iniciarse la medicin de QO2 (gura 2). Considerando que el valor de QO2 es constante, dado que el tiempo en el que se hace la medicin es corto, Donde (4)

La ecuacin (7) es una ecuacin diferencial lineal de primer orden y su solucin es de la forma: , t T (8) Dado que E(T)=E(0)=U, entonces (9)

V = R
Por consiguiente, durante la etapa de medicin del QO2, el descenso en la concentracin de oxgeno disuelto es lineal con respecto al tiempo (gura 2). Para incluir el efecto de la respuesta del electrodo en las mediciones experimentales, Yang et al. [9] presentaron una expresin (ver ecuacin 5) que muestra la relacin entre la seal con retraso del electrodo E(t) y la seal sin retraso E(t-T), que incluye el tiempo muerto del electrodo (T), por la introduccin de una funcin de transferencia.

Figura 2 Variacin de la concentracin de oxgeno disuelto para medidas de QO2

t T
Donde: T : tiempo muerto del electrodo k: inverso del tiempo de respuesta, k =

(5)

Por consiguiente, la respuesta dinmica del electrodo de oxgeno durante el tiempo de medicin del QO2 es: (10)

Para elementos de medicin sin tiempo muerto (T=0), esta ecuacin se simplica a: (11)

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Como el electrodo empleado no presenta tiempo muerto, se emple la ecuacin (11) en la determinacin de la velocidad especca de consumo de oxgeno (QO2), considerando el tiempo de respuesta del electrodo. Luego, a partir de la grca de E(t) vs. se encontr el valor

Determinacin de la concentracin de oxgeno disuelto La concentracin de oxgeno disuelto se determin a partir de la lectura del porcentaje de oxgeno disuelto obtenida con un electrodo polarogrco Ingold. Para convertir la respuesta del electrodo dada en % de OD a su correspondiente valor en gL-1, se emple el valor de la solubilidad del oxgeno en el medio de cultivo, la cual se midi experimentalmente, calibrando el sensor de oxgeno con agua destilada y realizando la lectura de porcentaje de OD para el medio de cultivo saturado con aire. El porcentaje de saturacin de oxgeno en el medio fue de 93,8%. Como la solubilidad del aire en agua a 30C y 1 atm de presin es de 8,05x10-3gL-1 [3], entonces la concentracin de O2 en el medio se calcul a partir de la siguiente ecuacin:

de V, del cual se deriv el valor del QO2.

Experimentacin
Microorganismo y cultivos de activacin La cepa de Ganoderma lucidum se conserv a 4C en cajas Petri conteniendo agar enriquecido con cereales. El preinculo de 100 mL, se prepar en erlenmeyers de 250 mL, a partir del micelio de un cultivo semilla proveniente de caja Petri. La composicin del medio fue: 30 gL-1 de glucosa, 8,95 gL-1 de peptona, 1 gL-1 de KH2PO4, 0,5 gL-1 de MgSO4.7H2O y 0,05 gL-1 de tiamina. El tiempo de incubacin fue de 10 das. El cultivo se homogeniz en un blender durante 15 s. El inculo se prepar transriendo alcuotas de 5 mL del preinculo a un erlenmeyer de 250 mL que contena 45 mL del medio de un medio de cultivo compuesto de 38,95 gL-1 de harina de cereal y 4,77 gL-1 de extracto de levadura. Los cultivos del inculo se incubaron durante 7 das. Tanto el preinculo como el inculo tuvieron un pH inicial de 5,6 y se incubaron a 30C y 120 rpm. Cultivos en Reactor Los cultivos en reactor tuvieron como objetivo determinar el coeciente volumtrico de transferencia de oxgeno del hongo Ganoderma lucidum. Se emple un reactor de tanque agitado Biostat B. Braun de 2 L de capacidad total, que dispone de un agitador mecnico de paletas planas inclinadas. Los cultivos se llevaron a cabo empleando el mismo medio de cultivo del inculo, a una temperatura de 30 C, 300 rpm. y una aireacin de 1,6 vvm.

Determinacin del tiempo de respuesta del electrodo El electrodo de oxgeno calibrado, se sumergi en agua exenta de oxgeno (a 30C y 1 atm, previo burbujeo de gas nitrgeno) para obtener un valor de 0% en la lectura. Posteriormente, se transri a un recipiente con agua destilada saturada (previo burbujeo de aire). Cada 10 segundos, se registr el valor del porcentaje de OD hasta que dicho valor se mantuvo relativamente constante en varias lecturas sucesivas. A partir de la grca de OD (%) vs. tiempo (s), se determin el tiempo de respuesta del electrodo como el necesario para obtener un 63% del cambio total en la medida [3]. Determinacin de la velocidad especfica de consumo de oxgeno (QO2) Para la determinacin del QO2 del hongo Ganoderma lucidum en el reactor de tanque agitado (ver gura 3), se increment la agitacin y la aireacin del cultivo con el propsito de aumentar el nivel de oxgeno disuelto (OD) en el medio, hasta alcanzar un 80% de saturacin. Posterior-

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mente, se suspendi la aireacin y se registr el descenso en la concentracin de OD en el tiempo. En esta etapa la velocidad de descenso en la concentracin de OD es igual a la velocidad de consumo de oxgeno por las clulas del hongo, de modo que la ecuacin (1) se simplic a: (12)

cin de OD vs. tiempo se ajustaron a una lnea recta y la pendiente obtenida es el valor del QO2X sin corregir. Para determinar el QO2 teniendo en cuenta el tiempo de respuesta del electrodo, las concentraciones de OD medidas se corrigieron empleando la ecuacin (11). A partir de la grca de E(t) vs. se encontr el parme-

Los ensayos y la medicin de la biomasa se realizaron por triplicado. Los valores de concentra-

tro V que corresponde a la pendiente de la lnea y a partir de la cual se calcul el valor de QO2.

Figura 3 Variacin de la concentracin de OD en un cultivo de Ganoderma lucidum durante la determinacin del QO2

Resultados y Discusin
Tiempo de respuesta del electrodo La gura 4 muestra la respuesta del electrodo de OD al transferirse desde una solucin exenta de oxgeno a una saturada. El tiempo de respuesta se determin como el tiempo necesario para alcanzar el 63% del valor nal de la medida [3], que correspondi a 18,8 0,03 s. Este valor servir para realizar la correccin de los valores de QO2 por retraso en la respuesta del electrodo determinado de acuerdo con la ecuacin (11).
Figura 4 Curva de tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno cuando es sumergido en agua destilada saturada con aire a 30 C

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Velocidad especfica de consumo de oxgeno (QO2) En la gura 5 se presentan los valores de OD en funcin del tiempo obtenidos para uno de los tres ensayos realizados en la determinacin del QO2 en el reactor de tanque agitado. Tambin se mues-

tran los valores corregidos por tiempo de respuesta del electrodo. La siguiente es una muestra del clculo del QO2, a partir de la pendiente de las lneas de la gura 3, sin considerar el tiempo de respuesta del electrodo e incluyendo dicho parmetro.

QO2 sin considerar el tiempo de respuesta del electrodo

QO2 considerando el tiempo de respuesta del electrodo ,entonces

El promedio de los 3 valores de QO2 obtenidos sin considerar el tiempo de respuesta del electrodo y considerando este parmetro fue de 0,345 mmol O2(g biomasa.h)-1 0,0171 y 0,383 mmol O2(g biomasa.h)-1 0,025 respectivamente. Estos resultados muestran una diferencia de un 9,9% entre los valores de QO2. Al realizar la prueba tstudent tomando como hiptesis de partida que no hay diferencia entre medias para una probabilidad del 95%, se obtuvo un valor de P=0,5501 (P>0,05), que indica que la hiptesis es vlida. Por tanto, no hay diferencia estadstica signicativa entre el valor de QO2 determinado considerando tiempo de respuesta del electrodo de oxgeFigura 5 Variacin de la concentracin de OD Figura 5 Variacin de la concentracin de OD en un cultivo de cuando se no y G. el lucidum obtenido sin considerar dicho parmetro. en un cultivo de Ganoderma lucidum cuando se Asumiendo un tiempo de respuesta del electrodo suspende el suministro de oxgeno. (n) Valores suspende el suministro de oxgeno. () Valores de OD experimentales, ) Valores de superior al (valor determinado experimentalmende OD experimentales, () Valores de OD te, se encontr que para un tiempo de respuesta 1 corregidos por tiempo de respuesta del electrodo kt OD corregidos por tiempo -kt de respuesta del electrodo donde . La s existir una diferent = t (1( ) 112,8 del electrodo )e de donde t = t - 1/k (1 - e ). La concentracin de k cia signicativa entre los valores de QO2 con un biomasa seca en el momento de la medicin fue valor de P=0,0396 (P<0,05), esto quiere decir que concentracin biomasa seca en el momento de la medicin fue de 8,93 g.L-1 0,57. de 8,93 g.L-1de 0,57. para electrodos con un elevado, se requerir considerarlo en la determinacin del QO2.

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Conclusiones
La metodologa derivada para la determinacin del QO2 considerando el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno se aplic a la determinacin del QO2 para el cultivo del hongo Ganoderma lucidum. Los valores de QO2 obtenidos al incluir el tiempo de respuesta del electrodo de oxgeno no fueron estadsticamente diferentes, debido al bajo tiempo de respuesta del electrodo. Por tanto, para el caso ilustrado empleando un electrodo con un de 18,8 s, no se requiere incluir este parmetro en la determinacin del QO2. Se encontr que si el electrodo de OD tuviera un seis veces superior al real, se requerira incluirlo en la determinacin del QO2.

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