Articoli originali

Le carbapenemasi: un problema di antibiotico resistenza in preoccupante evoluzione

The carbapenemases: troubling trend of an antibiotic resistance problem

Roberta Migliavacca,1 Angelo Pan,2,3 Carlo Gagliotti,2 Mario Sarti4

1. Dipartimento di Scienze Morfologiche, Eidologiche e Cliniche, Universit di Pavia 2. Area Rischio Infettivo, Agenzia Sanitaria e Sociale Regionale Emilia Romagna 3. Istituti Ospitalieri di Cremona 4. Laboratorio Provinciale di Microbiologia Clinica, Azienda USL di Modena

Summary.
Carbapenems are currently regarded as essential drugs for treatment of severe infection caused by multi resistant Gram negative rods. Carbapenemases, enzymes inactivating these antibiotics, represent one of the most relevant issues related to antimicrobial resistance. Rapid alert systems of and infection control measures should be implemented to limit the diusion of carbapenemase-producing bacteria.

Key words: carbapenems, severe infection, antibiotical resistance. Riassunto.

I carbapenemi costituiscono tuttora un presidio terapeutico fondamentale per la cura delle infezioni gravi sostenute da bacilli Gram negativi multi resistenti. Le carbapenemasi, enzimi in grado di inattivare questi antibiotici, rappresentano uno dei problemi di antibiotico resistenza pi rilevanti. necessario implementare sistemi di segnalazione rapida e misure di controllo delle infezioni per limitare la diusione dei batteri produttori di carbapenemasi.

Parole chiave: carbapenemi, infezioni gravi, antibiotico resistenza. Introduzione I carbapenemi sono antibiotici -lattamici caratterizzati da tossicit relativamente bassa ed ampio spettro dazione, essendo attivi nei confronti della maggior parte dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi ad eccezione degli stafilococchi meticillino-resistenti, della maggior parte dei ceppi di Enterococcus faecium e di poche specie di bacilli Gramnegativi che presentano nei loro confronti una resistenza costitutiva (ad es. Burkholderia e Stenotrophomonas spp.). A partire dallintroduzione nella pratica clinica del capostipite imipenem, avvenuta nel 1985, si sono dimostrati di straordinaria utilit per il trattamento delle infezioni sostenute da patogeni nosocomiali Gram-negativi Multi Drug Resistant (MDR), fra cui Pseudomonas aeruginosa. I carbapenemi rappresentano tuttora gli agenti antimi-

crobici di scelta per il trattamento delle infezioni gravi causate da ceppi di Enterobacteriaceae produttori di Extended-Spectrum -Lactamases (ESBL) e/o di enzimi inattivanti di tipo AmpC. Lesteso utilizzo dei carbapenemi in caso di eventi epidemici ed in aree a prevalenza endemica di ceppi ESBL e/o AmpC-produttori ha tuttavia portato ad un incremento di P. aeruginosa ed Acinetobacter spp. carbapenemico-resistenti, nonch di Klebsiella pneumoniae con fenotipo di scarsa sensibilit ai carbapenemi.1 Un microrganismo ESBL o AmpC-produttore pu diventare scarsamente sensibile o resistente ai carbapenemi per perdita di porine della membrana esterna (impermeabilit) e/o attraverso iper-espressione di pompe di efflusso.2 Ci pu anche verificarsi grazie a mutazioni geniche che si instaurano e selezionano in corso di trattamento terapeutico con carbapenemi.3,4 Il principale meccanismo di resistenza verso tali molecole, sviluppato negli ultimi anni dagli isolati MDR, rappresentato tuttavia dalla produzione di carbapenemasi, enzimi ad attivit -lattamasica in grado di inattivare, con differente rapidit, molecole quali imipenem, meropenem ed ertapenem. La frequenza di isolamento di P. aeruginosa produttori di carbapenemasi ha raggiunto da alcuni anni livelli elevati in diversi contesti assistenziali e grande preoccupazione suscita, a livello internazionale, la recente e crescente diffusione di enzimi ad attivit carbapenemasica nelle Enterobacteriaceae. La produzione di carbapenemasi, aumentando le difficolt di trattamento delle infezioni causate da patogeni MDR quali K. pneumoniae, P. aeruginosa, ed Acinetobacter spp determina elevati tassi di mortalit.5 Scopo del presente articolo fornire elementi utili alla conoscenza delle diverse tipologie di carbapenemasi sino ad ora descritte e precisarne gli aspetti epidemiologici. Leterogeneit delle carbapenemasi Gli enzimi che presentano attivit idrolitica nei confronti dei carbapenemi si distinguono in Metallo-Lattamasi (MBL, -lattamasi di classe B) e carbapenemasi a serina (alcune -lattamasi classe A e di classe D). Le carbapenemasi possono essere codificate sia da geni (bla) a localizzazione cromosomiale che da geni trasferibili. Questi ultimi possono muoversi fra microrganismi per lo pi attraverso plasmidi e meno frequentemente con il supporto di altri elementi detti trasposoni.6
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I geni che codificano per le carbapenemasi si riscontrano spesso in associazione con quelli che conferiscono multiresistenza, quali i determinanti di resistenza agli aminoglicosidi, ai fluorochinoloni, o che codificano per ESBL.7,8 Enzimi di tipo MBL sono stati riscontrati in Enterobacteriaceae, P. aeruginosa 9,10 ed A. baumannii.11 Le MBL (attualmente si conoscono varianti di tipo IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, KHM, AIM, NDM e DIM) presentano attivit idrolitica nei confronti di tutti i substrati -lattamici, ad eccezione dellaztreonam. La MBL di tipo VIM-2 (Verona Integron-encoded Metallo-Beta-Lactamase), la cui presenza risulta attualmente estesa a cinque continenti, prodotta per lo pi da ceppi di P. aeruginosa ed ha superato, in termini di diffusione, le altre varianti.12,13 Il determinante blaVIM-1 si riscontra invece pi comunemente negli Enterobatteri, in particolare in isolati provenienti da paesi limitrofi allarea Mediterranea.14,15 interessante notare come nuovi tipi di MBL vengano rilevati con una certa regolarit: lenzima NDM-1 (New Delhi Metallo-beta-lactamase), di recente emerso in India,16 con rapida diffusione secondaria a diverse altre nazioni.17 Un motivo di preoccupazione la diffusione di ceppi produttori di serina -lattamasi ad attivit carbapenemasica chiamate K. pneumoniae carbapenemases (KPC). Le -lattamasi KPC (KPC 1-7) conferiscono scarsa sensibilit o resistenza a tutti gli antibiotici -lattamici18 e, a differenza di quanto avviene per le ESBL, sono scarsamente inibite dallacido clavulanico e dal tazobactam.19 Le -lattamasi ad attivit carbapenemasica pi diffuse in A. baumannii sono le -lattamasi di classe D, per lo pi specifiche di questa specie (sebbene la variante OXA-48 sia riscontrabile nelle Enterobacteriaceae). Questi enzimi plasmideo cromosoma- mediati, appartengono ai tre gruppi non correlati di -lattamasi resistenti al clavulanato OXA-23, OXA-24 ed OXA-58. A. baumannii presenta inoltre unoxacillinasi intrinseca (varianti OXA-51/69) con attivit idrolitica verso i carbapenemi la cui variabile espressione pu giocare un ruolo molto importante nella resistenza.20 In tabella 1 riportata una schematica classificazione e distribuzione degli enzimi ad attit carbapenemasica. I test di laboratorio La produzione di carbapenemasi pu essere talvolta piuttosto scarsa in vitro e ci pu condizionare il riconoscimento del meccanismo di resistenza. Non risulta inoltre immediato distinguere fra una ridotta sensibilit ai carbapenemi conseguente ad impermeabilit o iper-espressione di pompe di efflusso, da una resistenza di tipo enzimatico. Per il rilievo fenotipico della produzione di carbapenemasi sono state proposte due tipologie di test: a. test di sinergia, dove il microrganismo potenziale produttore di carbapenemasi testato nei confronti di un carbapenemico in presenza di inibitori quali EDTA o acido dipicolinico (per MBL) ed acido boronico (per KPC) in disco-combinazione/disco-approssimazione; b. test che sfruttano la capacit delle carbapenemasi, diffondendo nellagar circostante un microrganismo pro68
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duttore, di proteggere dallazione dei carbapenemi ceppi sensibili, posti sulla medesima piastra (Hodge test). La mancanza di inibitori specifici per alcune carbapenemasi (es. OXA-58) e le difficolt nella standardizzazione/interpretazione dei risultati dei test fenotipici, rendono tuttavia evidente la necessit, soprattutto in caso di sospette condizioni epidemiche, di utilizzare test di conferma molecolari,che permettono lidentificazione dei determinanti di resistenza in gioco (AmpC, ESBL, KPC, VIM, IPM; NDM-1 ecc.)21,22,23 La diusione del fenomeno La resistenza dovuta alla produzione di carbapenemasi acquisite stata evidenziata in ceppi patogeni Gram-negativi a partire dagli inizi degli anni 90.24,25 Gli isolamenti di bacilli MDR carbapenemasi-produttori responsabili di outbreak nosocomiali26,27 ed il loro impatto clinico sono rimasti tuttavia limitati fino alla met del 2000, allorch laumento della loro prevalenza, unito alla comparsa di nuove varianti enzimatiche, hanno raggiunto livelli epidemiologici preoccupanti in tutto il mondo ed allarmanti in alcune aree endemiche.28 In figura 1 viene illustrato il numero di voci bibliografiche ottenibili in PubMed inserendo le parole chiave Outbreak -carbapenemase -carbapenem-resistance- MBL - VIM - KPC - NDM. Appare chiaro come negli ultimi 5 anni vi sia stato un aumento delle segnalazioni di eventi epidemici e come la frequenza di tali pubblicazioni abbia subito una vera e propria impennata durante lanno appena trascorso. In figura 2 riportato il risultato di unanaloga ricerca: sono state questa volta incluse tutte le pubblicazioni sullargomento distinguendo fra le specie di microrganismi carbapenemasi-produttori. Interessante notare come lattenzione si sia spostata, nellultimo periodo, sullespressione del fenomeno da parte degli Enterobatteri (in particolare K. pneumoniae ma anche E. coli, Enterobacter spp. ed altri).
Tabella 1 Classicazione e distribuzione delle carbapenemasi.

Metallo-Carbapenemasi lattamasi a serina (Classe B) (Classe A) (Classe D) IMP VIM NDM... KPC - GES OXA Acinetobacter baumanni Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Proteus mirabilis Providencia spp. Klebsiella oxytoca Serratia marcescens Enterobacter s pp. Citrobacter freundii Salmonella enterica + ++ + + ++ + + + + + + + + ++ + ++ + + + +

+ + + + +

+ associazioni specie/enzima riportate solo sporadicamente ++ associazioni specie/enzima prevalentemente riportata adattata e modicata da Miriagou et al. (2010 CMI)

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La recente e rapida diffusione in K. pneumoniae delle carbapenemasi di classe A (KPC) segnalate inizialmente nel 2001 in North Carolina29 e poi nel 2003 durante un outbreak a New York City, ha effettivamente provocato un cambiamento nella percezione del rischio di estensione del problema. Microrganismi KPC-produttori sono stati segnalati in 27 stati USA, in Cina, in America Latina ed in alcuni paesi europei includendo Grecia,30 Inghilterra,31 Polonia,32 Norvegia e Svezia,33 ed Italia.34 Veri e propri eventi epidemici sono stati descritti soprattutto in Grecia ed in Israele.35 I dati dellEuropean Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) evidenziano come la prevalenza delle resistenze ai carbapenemi in P. aeruginosa risulti maggiore nei paesi delle aree europee meridionale ed orientale mentre nel caso di K. pneumoniae sono interessate soprattutto la Grecia e lisola di Cipro (figure 3 e 4). Per quanto riguarda P. aeruginosa, il problema dellantibiotico-resistenza appare aver raggiunto livelli preoccupanti gi da diversi anni.36,37,38 In base ai dati raccolti in Emilia Romagna dal Sistema di Sorveglianza Regionale dellAntibiotico-resistenza dellArea Rischio Infettivo, la prevalenza locale della resistenza di P. aeruginosa ai carbapenemi negli isolati provenienti da tutti i gruppi di campioni clinici considerati (sangue, materiali respiratori profondi, urine) si dimostrata in costante incremento dal 2005 al 2008. Nel 2009 tale prevalenza ha subito una leggera flessione (figure 5,6 e 7). Per K. pneumoniae i dati di prevalenza EARSS relativi al periodo 2005-2009 appaiono non esprimere adeguatamente, tranne che nel caso della Grecia, la tendenza allincremento del fenomeno. Nella regione ellenica la diffusione di multiresistenza. avvenuta con estrema rapidit: si verificato un increFigura 1 Riferimenti bibliograci in PubMed per outbreak

mento nellisolamento di ceppi di K. pneumoniae imipenemresistenti dall1% al 20-50% (reparti ospedalieri/terapie intensive) nel periodo 2001-2006.39 Molti degli isolati di K. pneumoniae KPC-produttori appartenevano al medesimo complesso clonale CC11 e per lo pi al Sequence Type ST258, che ospita differenti varianti del gene blaKPC. La disseminazione di microrganismi KPC produttori stata inoltre sicuramente favorita dal supporto dellelemento genetico mobile Tn 4401.40 In Italia la prima segnalazione di isolati di K. pneumonie KPC- produttori (variante KPC-3) risale al 2009,34 mentre la presenza di KPC-2 stata riportata nel 2010.41 Nellepidemiologia delle resistenze causate da carbapenemasi possono essere riconosciuti tre momenti fondamentali: lintroduzione di ceppi produttori in contesti dove non erano mai stati osservati (a), lespansione clonale di tali ceppi (b), la trasmissione orizzontale dei geni che conferiscono questo tipo di resistenza (c). Lintroduzione di ceppi produttori di KPC in un paese dove questo tipo di resistenza non era stato rilevato in precedenza avviene per mezzo di soggetti infetti o colonizzati
Figura 3 Prevalenza di P. aeruginosa I/R ai carbapenemi in Europa

(dati EARSS).
2005 Norvegia Gran Bretagna Polonia Germania Francia 2007 2009

di infezioni da microrganismi carbapenemasi-produttori.

N riferimenti di outbreak in PubMed 25 20 15 10 5 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Anno

Spagna Italia Grecia <1% 1-5% 5-10% 10-25% 25-50%

Figura 4 Prevalenza di K. pneumoniae

I/R ai carbapenemi in

Europa (dati EARSS).

2005 2007 2009

Figura 2 Riferimenti bibliograci in PubMed per microrganismi

Norvegia Gran Bretagna

carbapenemasi-produttori.
120 100 80 60 40 20 0 2000 2005 P. aeruginosa A. Baumannii 2010 Enterobatteri Spagna Italia Grecia <1% 1-5% 5-10% 10-25% 25-50% Polonia Germania Francia

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Figura 5 Prevalenza di P. aeruginosa resistente ai carbapenemi in

Emilia Romagna: isolati da sangue.

25 Prevalenza I/R 20 15 10 5 0 2005 (n. 290) 2006 (n. 370) 2007 (n. 392) Anno (isolati) 2008 (n. 438) 2009 (n. 449)

Figura 6 Prevalenza di P. aeruginosa resistente ai carbapenemi in

Emilia Romagna: isolati da campioni respiratori profondi.

35 30 25 20 15 10 5 0

Prevalenza I/R

Le possibilit di controllo Appare evidente come lambito delle carbapenemasi sia divenuto progressivamente pi complicato, non solo dal punto di vista delle varianti enzimatiche ma anche per quanto riguarda il pattern epidemiologico. di particolare importanza riconoscere, tracciando lepidemiologia molecolare dei ceppi antibiotico-resistenti, i cosiddetti high-risk multidrug-resistant clones, vale a dire quei cloni che hanno dimostrato una spiccata propensione allespansione clonale.28 Proprio nei confronti di questo fenomeno infatti si sono dimostrate pi efficaci le azioni di infection control. Limportanza della rapidit nelle misure di controllo per il contenimento delle epidemie sostenute da batteri produttori di carbapenemasi stata ben documentata45 cos come stata ribadita quella di un sistema di segnalazioni tempestive.46

2005 (n. 976)

2006 (n. 1228)

2007 2008 (n. 1350) (n. 1465) Anno (isolati)

2009 (n. 1459)

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Figura 7 Prevalenza di P. aeruginosa resistente ai carbapenemi in

Emilia Romagna: isolati da urine.

19 18 18 17 17 16 16 15 15 14 14

Prevalenza I/R

2005 (n. 2709)

2006 (n.2777)

2007 2008 (n. 3025) (n. 2991) Anno (isolati)

2009 (n. 2916)

che provengono da aree endemiche o epidemiche. Ne sono esempi sia lisolamento di un microrganismo KPC-produttore in Francia da un paziente gi sottoposto a trattamento terapeutico in un ospedale di New York, che il rilievo di batteri KPC-positivi in Norvegia e Svezia da pazienti precedentemente ospedalizzati in Grecia ed Israele.42 In assenza di un controllo efficace della diffusione locale questi ceppi possono determinare fenomeni epidemici e, successivamente, diventare endemici nel nuovo contesto. In Gran Bretagna stata recentemente accertata, successivamente allimportazione da India e Pakistan di ceppi con determinanti NDM1 localizzati su plasmidi trasferibili, la presenza di cloni differenti di K. pneumoniae NDM-1-produttori.7 Lassociazione di enzimi di tipo KPC (ed occasionalmente VIM) con un clone di K. pneumoniae a diffusione internazionale (ST258), indica con forza che gli eventi epidemici ospedalieri sostenuti da microrganismi KPC-produttori non rappresentano altro che espansioni clonali, in ambito locale, successive a lunghe catene di trasmissione.43 Il supporto di elementi genetici mobili come i plasmidi o i trasposoni pu invece consentire il trasferimento intraspecie o inter-specie di tali meccanismi di resistenza. stata ad esempio documentata la trasmissione mediata da plasmidi di geni blaKPC da K. pneumoniae a E. coli.44 70
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