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Quim. Nova, Vol. 34, No.

5, 831-840, 2011 APLICAO DE QUITOSANA COMO SUPORTE PARA A IMOBILIZAO DE ENZIMAS DE INTERESSE INDUSTRIAL Adriano A. Mendes* Universidade Federal de So Joo Del-Rei, CP 56, 35701-970 Sete Lagoas MG, Brasil Pedro C. de Oliveira e Heizir F. de Castro Departamento de Engenharia Qumica, Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de So Paulo, CP 116, 12602-810 Lorena SP, Brasil Raquel de L. C. Giordano Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal de So Carlos, CP 676, 13560-970 So Carlos SP, Brasil Recebido em 14/6/10; aceito em 15/12/10; publicado na web em 25/3/11

APPLICATION OF CHITOSAN AS SUPPORT FOR IMMOBILIZATION OF ENZYMES OF INDUSTRIAL INTEREST. Chitosan, poly[-(1-4)-linked-2-amino-2-deoxy-D-glucose], is the N-deacetylated product of chitin which is a major component of arthropod and crustacean shells such as lobsters, crabs, shrimps, and cuttleshes. In addition, chitosan has many signicant biological and chemical properties such as biodegradability, biocompatibility and bioactivity as well as polycationic properties. Thus, it has been widely used in many industrial and biomedical applications including wastewater treatment, chromatographic support, carriers for controlled drug delivery and enzyme immobilization. This review is an insight into the exploitation of utilization of chitosan basedsupports in different geometrical congurations on the immobilization of enzymes by different protocols for further application in biotransformation reactions. Keywords: chitosan; immobilization; enzymes.

ENZIMAS COMO BIOCATALISADORES E SUAS APLICAES As limitaes existentes na obteno de produtos e intermedirios de interesse industrial esto associadas aos tipos de catalisadores qumicos empregados, que so pouco versteis e exigem altas temperaturas para atingir razovel velocidade de reao. Alm disso, estes catalisadores possuem baixa especicidade, geralmente fornecem produtos de composio qumica mista ou produtos contaminados e requerem uma etapa posterior de puricao.1,2 As enzimas atuam em condies suaves de temperatura, pH e presso, atingindo velocidades de reao bastante superiores quelas obtidas em presena de catalisadores qumicos convencionais.1-3 Este comportamento permite uma reduo no custo nal do processo e evita a formao de subprodutos indesejveis. Alm disso, devido sua elevada especicidade, maior rendimento do processo pode ser atingido, permite a obteno de produtos biodegradveis e reduz a quantidade de resduos gerados.2 Nesse contexto, o enfoque biotecnolgico vem se apresentando como uma opo promissora para sua explorao em diversos tipos de reaes.1-10 A tecnologia enzimtica despontou como rea de investigao no incio da dcada de 1960, com a imobilizao de enzimas para utilizao em processos qumicos.3 Desde ento esses biocatalisadores tm sido empregados em diversos segmentos, incluindo a sntese de compostos bioativos e de novos biopolmeros, metodologias analticas por meio de construo de biossensores, terapia enzimtica e processos em indstrias tradicionais como leos e gorduras, curtumes, papel e celulose, txtil e cosmticos.1-10 Com o avano da tecnologia enzimtica, a seleo de novas enzi*e-mail: mendes@ufsj.edu.br

mas, a produo de enzimas por tecnologia do DNA recombinante e a engenharia de protenas permitiram a modicao das propriedades cinticas e da estabilidade que contriburam para o desenvolvimento de novas solues ao nvel da tecnologia de reatores enzimticos e das tcnicas de imobilizao.11,12 De acordo com Freedonia Group,13 o mercado global de enzimas industriais foi de U$ 5,1 bilhes de dlares em 2008 e a projeo de que o crescimento anual ser de aproximadamente 6,3%, com estimativa de movimentao de U$ 7,0 bilhes de dlares para 2013. O mercado mundial das enzimas divide-se em trs segmentos: enzimas empregadas na indstria de alimentos; enzimas tcnicas e, enzimas empregadas na produo de rao animal. Destes trs grupos, destacam-se as enzimas destinadas aos setores de alimentos, que so empregadas basicamente na produo de xarope de acar invertido e de compostos aromatizantes,6 e as enzimas tcnicas, que so utilizadas na formulao de detergentes, produo de papel e celulose, manufatura de couros e produo de frmacos. Este o principal mercado consumidor de enzimas, detendo aproximadamente 50% do total das enzimas comercializadas. No setor industrial as mais utilizadas so as proteases, que ocupam 40% do mercado de enzimas, seguidas das carboidrases (amilases e celulases) e lipases.4 No entanto, o crescimento acima da mdia de algumas enzimas como as polimerases e as nucleases, juntamente com outras enzimas como tases e celulases, poder levar esse grupo de enzimas a ultrapassar o grupo das mais empregadas industrialmente nos dias de hoje, formado pelas lipases, carboidrases e proteases.13 A grande desvantagem da utilizao de enzimas na forma solvel a sua separao para posterior aplicao, assim como a contaminao do produto desejado, pois enzimas so compostos solveis em gua. Desta forma, tcnicas de imobilizao tm sido empregadas com o objetivo de reutilizar as enzimas. Esta estratgia tambm

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uma importante ferramenta para estabilizar e reduzir a inativao por distoro da sua estrutura nativa por inuncia da temperatura, pH e de solventes orgnicos, o que pode ser atrativo para a aplicao de enzimas no setor industrial.11,12,14-17 IMOBILIZAO DE ENZIMAS A imobilizao consiste no connamento da enzima em um suporte slido para posterior reutilizao do biocatalisador, tornando o processo menos oneroso.11 Em geral, a imobilizao oferece uma srie de vantagens e as razes para a escolha de um derivado imobilizado variam de aplicao para aplicao, incluindo: utilizao da atividade cataltica por um maior perodo de tempo; possibilidade de operao contnua do processo, com maior facilidade de controle; facilidade de separao do produto nal; em alguns casos, ocorre modicao favorvel das propriedades catalticas da enzima como, por exemplo, maior estabilidade ao pH e temperatura, entre outros; facilidade de interrupo da reao, em um nvel desejado, pela remoo da enzima, caso o processo seja batelada, ou ajuste do tempo de residncia se usado um reator contnuo.11,12,14-17 Apesar da grande diversidade de mtodos desenvolvidos e aplicados na imobilizao de enzimas, no h um mtodo aplicvel para todas as enzimas. Portanto, para cada aplicao de uma enzima imobilizada necessrio escolher o procedimento mais simples e mais barato e que resulte em um derivado com boa reteno de atividade e alta estabilidade operacional. A partir das informaes disponveis sobre as caractersticas do suporte e o efeito dos mtodos empregados, possvel fazer generalizaes que permitam uma primeira seleo do mtodo de imobilizao. Enzimas podem ser imobilizadas por diferentes protocolos, isto , podem ser encapsuladas; adsorvidas em materiais insolveis como resinas de troca inica; copolimerizadas com algum monmero ou se ligar a uma matriz insolvel por ligaes covalentes.11,12,14,16-21 Estes mtodos so bem revisados e discutidos na literatura.11,12,14,16-21 A adsoro fsica o mtodo mais simples e o mais empregado para imobilizao de enzimas. Nesse caso, o biocatalisador estabilizado por interaes fracas com o suporte como foras de van der Waals (interaes hidrofbicas), pontes de hidrognio e ligaes inicas. As principais vantagens deste processo de imobilizao so a facilidade e a simplicidade do processo e, alm disso, a estrutura conformacional da enzima pouco alterada. A grande desvantagem a dessoro da enzima devido s variaes de temperatura, pH e fora inica.12,14,16,18,19 A encapsulao consiste na reteno fsica da enzima nas cavidades internas de uma matriz slida porosa constituda geralmente por polmeros entrecruzados como poliacrilamida, gelatina, alginato, carragenana, resinas de poliuretano e silanos. As principais vantagens da encapsulao de enzimas referem-se grande rea supercial para contato do substrato e da enzima no interior de um volume relativamente pequeno, e possibilidade de imobilizao simultnea de diferentes enzimas em uma nica etapa. Como principais desvantagens, tm-se: a restrio de que os biocatalisadores podem ser aplicados somente com substratos de baixa massa molecular; a possvel inativao da enzima durante o procedimento de imobilizao; a alta concentrao de enzima necessria para garantir a encapsulao e, os possveis efeitos de difuso de substratos e/ou produtos no interior da matriz porosa.12,14,16-19 A imobilizao por ligao covalente baseia-se na ativao de suportes com a insero de grupos reativos que reagem com os grupos nucleoflicos da enzima. Esta tcnica no comum como o mtodo de adsoro fsica, mas apresenta a vantagem de evitar o fenmeno de dessoro. A seleo das condies para a imobilizao por ligao covalente mais difcil que em outros mtodos de ligao em

suportes. necessrio conhecer a densidade dos grupos ativos por unidade de rea do suporte e a sua geometria para reduzir a formao do complexo enzima-suporte inativo. Este mtodo pode tambm afetar a estrutura ativa da enzima, devido alterao do centro ativo. Suas principais vantagens so a maior resistncia do biocatalisador quanto variao de pH, temperatura e inuncia de solventes orgnicos; os derivados preparados podem ser empregados em diversas conformaes de reatores, como uxo contnuo, empacotado, tanque agitado e leito uidizado e, a carga de enzima permanece constante aps a etapa de imobilizao.12,14-21 A maior contribuio para o bom desempenho da enzima imobilizada dada pelo suporte. Se de um lado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, de outro uma escolha imprudente pode afetar adversamente no s a estabilidade trmica, mas o desempenho global do sistema. Na seleo de um suporte para uma determinada aplicao, devem ser analisadas suas propriedades fsicas e qumicas, bem como a possibilidade de regenerao do material. As principais caractersticas a serem observadas na seleo de um suporte para uma determinada aplicao so: rea supercial, permeabilidade, insolubilidade, capacidade de regenerao, morfologia e composio, natureza hidroflica ou hidrofbica, resistncia ao ataque microbiano, resistncia mecnica e custo, dentre outras. Eles podem ser classicados como orgnicos e inorgnicos, e conforme sua morfologia em materiais porosos, no porosos e de estrutura de gel.16-21 Os materiais orgnicos, notadamente os polmeros que podem ser naturais ou sintticos, so uma classe de suportes amplamente empregados na imobilizao de enzimas.12,15,17 Os sintticos exibem variedades de formas fsicas e estruturas qumicas que podem ser combinadas para formar um suporte ideal, porm os naturais apresentam algumas vantagens quando comparados aos sintticos, pois geralmente apresentam baixo custo e so facilmente degradados, no causando danos ao meio ambiente.17 Dentre os diferentes suportes orgnicos naturais empregados na imobilizao de enzimas, destaca-se a quitosana.3 A aplicao de quitosana como suporte para a imobilizao de enzimas se deve s suas diferentes conguraes geomtricas como p, escamas, hidrogeis, membranas, bras e outras, alm da presena de diferentes grupos funcionais, como hidroxila e amino, que permitem a utilizao de diferentes mtodos de imobilizao.22,23 QUITOSANA A quitosana (Figura 1a) a forma desacetilada da quitina (Figura 1b), o segundo polmero mais abundante na natureza, depois da celulose (Figura 1c).23-26 um produto natural, de baixo custo, renovvel e biodegradvel e de grande importncia econmica e ambiental. As carapaas de crustceos so resduos abundantes e rejeitados pela indstria pesqueira que, em muitos casos, as consideram poluentes. Sua utilizao reduz o impacto ambiental causado pelo acmulo nos locais onde gerado ou estocado. Este biopolmero possui uma estrutura molecular quimicamente similar da celulose, diferenciando-se somente nos grupos funcionais.3 Grupos hidroxilas (OH) esto presentes na estrutura geral desses biopolmeros, mas a principal diferena entre eles a presena de grupos amino (NH2) na estrutura da quitosana. Este biopolmero solvel em meio cido diludo, formando um polmero catinico, com a protonao do grupo amino gerando o on NH3+, que confere propriedades especiais diferenciadas em relao, por exemplo, s bras vegetais.22 A maioria das indstrias que produzem quitina e quitosana em escala comercial est localizada no Japo, onde mais de 100 bilhes de t de quitosana so manufaturadas por ano, a partir de carapaas de caranguejo e camaro.26 Nessas indstrias, a quitosana produzida

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Aplicao de quitosana como suporte para a imobilizao de enzimas de interesse industrial

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Figura 1. Estrutura dos biopolmeros quitosana (a), quitina (b) e celulose (c)

a partir da quitina por hidrlise alcalina via processo termoqumico, que promove a desacetilao da quitina, normalmente com NaOH (40-50% m/m) a 110-115 C. Os principais fatores que afetam o grau de desacetilao e, consequentemente, as caractersticas da quitosana obtida so temperatura e tempo de reao, concentrao da soluo do lcali, razo quitina/lcali, tamanho das partculas da quitina e presena de agentes que evitam a despolimerizao.27 Para produzir 1 kg de quitosana 70% desacetilada a partir de carapaas de caranguejo, so necessrios 6,3 kg de HCl, 1,8 kg de NaOH, 0,5 t de gua para o processo e 0,9 t de gua de resfriamento.23 Diferentes conguraes de quitosana podem ser obtidas no processo de desacetilao da quitina e estas conguraes podem ser empregadas no processo de imobilizao de enzimas.3 Entretanto, as formas de hidrogeis e membranas so as mais empregadas devido s alteraes fsicas obtidas, como o aumento do dimetro de poros do suporte, ideal para o processo de imobilizao de enzimas.22 Hidrogeis e polieletrlitos de quitosana Hidrogeis so estruturas polimricas tridimensionais capazes de adsorverem grandes quantidades de gua ou uidos biolgicos. Estas matrizes so insolveis em gua devido presena de pontos de reticulao qumica ou fsica.22 Este fato se deve aos grupos ionizveis presentes na estrutura dos biopolmeros como os grupos amino, carboxilatos, sulfatos e hidroxilas que possuem anidade com a molcula de gua. De acordo com a literatura, a quitosana um dos principais compostos empregados na sntese de hidrogeis, juntamente com outros polmeros como alginato, carragenana, lcool polivinlico, gelatina e outros.28,29 Os complexos polieletrlitos de quitosana so formados com o objetivo de obter hidrogeis mais versteis, com diferentes estruturas qumica e fsica, o que pode melhorar sua atuao em uma determinada aplicao, como na imobilizao de enzimas para diversas aplicaes, principalmente no desenvolvimento de biossensores.30,31 Sua estrutura mantida por interaes inicas ou ligaes covalentes. As ligaes inicas so fortemente inuenciadas pelo pH do meio reacional, inuenciando tambm na capacidade de reteno de gua no hidrogel.22 Se o pH do meio decresce, ocorre a protonao dos grupos amino da quitosana, resultando na repulso eletrosttica e enfraquecimento da resistncia mecnica e qumica do hidrogel, alm de favorecer consideravelmente o grau de inchamento. Com a elevao do pH, a protonao da quitosana decresce, o que reduz o grau de inchamento dos hidrogeis. Entretanto, nestes meios tambm ocorre desprotonao de grupos reativos como os grupos aninicos de biopolmeros como sulfatos e carboxilatos, o que reduz tambm a interao inica entre os biopolmeros. Em pH prximo da neutralidade, h equilbrio entre as cargas do hidrogel que promove mxima interao entre os grupos ionizveis, proporcionando maior estabilidade ao gel. Os eletrlitos mais empregados, juntamente com a quitosana, para a formao de hidrogeis de complexos polieletrolticos so alginato, carragenana e gelatina.32-34 Alginato um polissacardeo extrado de algas marrons, com estrutura qumica constituda por um polmero linear formado por

unidades de cidos L-gulurnico e D-manurnico.32,33 Carragenana outro polissacardeo extrado de algas vermelhas e possui em sua estrutura grupos sulfato. Dentre as formas de carragenana existentes, a -carragenana a mais abundante e possui um grupo sulfato para cada duas unidades de galactose. Este grupo sulfato responsvel pela elevada capacidade de reteno de gua, empregada na indstria de alimentos como emulsicante e na proteo de alimentos contra o processo de desidratao.33 A gelatina um produto obtido da hidrlise parcial do colgeno, extrado geralmente da pele e dos ossos de certos animais. A gelatina formada por trs molculas polipeptdicas, arranjadas em forma de hlice. Possui uma grande habilidade de ligao com gua e suas cadeias de congurao helicoidal so importantes para a formao do gel.34 Estes eletrlitos tm sido empregados como veculos para a liberao de frmacos e protenas, juntamente com a quitosana, sob a forma de complexos polieletrolticos.22,32-34 Tais complexos so formados por interaes inicas entre os grupos aninicos dos referidos polieletrlitos e os grupos amino da quitosana.34 Suportes hbridos de quitosana preparados pela tcnica sol-gel Os materiais orgnicos-inorgnicos obtidos pela tcnica solgel tm recebido especial ateno dos pesquisadores por conta da possibilidade de incorporao de polmeros orgnicos em matrizes inorgnicas, com formao de materiais compsitos que preservam as propriedades de cada componente.35-45 A qumica do processo solgel baseia-se em reaes de polimerizao inorgnica por meio de uma reao que envolve duas etapas.35 Na primeira, a hidrlise do precursor alcxido de um metal ou de um semimetal leva formao de um produto hidroxilado e o lcool correspondente: Me(OR)4+nH2O Me(OR)4-n(OH)n + n(ROH) (reao 1)

Em seguida, ocorre uma condensao entre um grupamento no hidrolisado do alcxido e uma hidroxila (reao 2) ou entre duas hidroxilas (reao 3) com formao de uma mistura coloidal chamada de sol: -MeOR + HOMe- -MeOMe- + ROH -MeOH + HOMe- -MeOMe- + H2O (reao 2) (reao 3)

Os precursores mais comumente empregados so os alcxidos metlicos, entre os quais, o mais estudado o tetraetilortossilicato (TEOS).21,36-44 Sua compatibilidade com diferentes biopolmeros como celulose,41 lcool polivinlico,21,37-39 carragenana42 e quitosana36,40,43,44 amplamente reportada na literatura. TEOS/quitosana tem se destacado como um material hbrido de promissora aplicao.36,40,43,44 Esses compsitos, sintetizados pela tcnica sol-gel, apresentam excelentes propriedades trmicas, mecnicas, ticas e de adsoro.40-44 As hidroxilas e as aminas presentes na quitosana so as responsveis pela sua facilidade em formar ligaes com os grupos silanois (-Si-OH) dos precursores. Na estrutura do hbrido TEOS/quitosana so encontradas pontes de hidrognio entre os grupos silanois da rede tridimensional do TEOS e os oxi-grupos e os aminos da estrutura da quitosana, interaes inicas entre os grupamentos amino da quitosana e os grupos silanois do TEOS, bem como ligaes covalentes como resultado da estericao das hidroxilas da quitosana e os grupos silanois da rede do TEOS.43,44 Na Figura 2 (adaptada da literatura)43,44 est ilustrado um esquema hipottico para o mecanismo de preparao da matriz hbrida SiO2quitosana empregando TEOS (tetraetilortossilicato) como precursor silano.

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Figura 3. Estrutura qumica de quitosana reticulada com glutaraldedo (a), genipina (b) e epicloridrina (c)

Figura 2. Esquema hipottico de formao da matriz hbrida SiO2-quitosana empregando TEOS como precursor. Adaptado das refs. 43 e 44

Modicao qumica da estrutura da quitosana No intuito de aumentar a estabilidade qumica e fsica da quitosana e seus derivados (complexos polieletrolticos e matrizes hbridas), tm sido empregadas alternativas como a modicao qumica, tambm denominada de reticulao, empregando diferentes agentes de ativao.25,29,46-50 No caso especco da quitosana, a modicao de sua estrutura qumica necessria para a obteno de um suporte quimicamente mais resistente ao meio cido e reduo da sua capacidade de reteno de gua. As reaes envolvidas na reticulao por agentes bifuncionais ocorrem entre os grupos amino e hidroxilas da quitosana. Estas reaes podem ser realizadas de maneira homognea pela adio do agente bifuncional soluo de quitosana, ou de maneira heterognea com a adio do agente quitosana nas formas de membranas e esferas.22,25,28,29,47,48 Esta modicao pode ser realizada com diferentes agentes qumicos como glicidol,29 epicloridrina,28,29,46,48,49 glutaraldedo,24,46,48 glioxal,48 formaldedo25 e genipina,50 formando estruturas complexas, amplamente reportadas na literatura especializada. A Figura 3 mostra uma representao esquemtica da quitosana reticulada com glutaraldedo (a), genipina (b) e epicloridrina (c). Na reao da quitosana com glutaraldedo, ocorre ataque nucleoflico dos grupos amino da quitosana aos grupos carbonilas do glutaraldedo, tambm observado quando se utiliza glioxal e formaldedo. A ligao covalente entre os grupos amino do biopolmero e aldedo terminal do glutaraldedo irreversvel e resiste a valores extremos de pH e temperatura. Diferentes mecanismos so propostos para explicar a reao de glutaraldedo com quitosana. Monteiro e

Airoldi47 propuseram o mecanismo como sendo uma interao dos grupos amino livres da quitosana com o grupo aldedo do glutaraldedo formando uma base de Schiff (ligao imina). Para interpretar este comportamento, trs hipteses so consideradas: (i) formao de uma base de Schiff entre o grupo aldedo com o grupo amino da quitosana. O outro grupo aldedo livre seria utilizado para a uma determinada reao de interesse; (ii) a reticulao formada entre uma molcula de glutaraldedo e duas unidades de grupo amino, resultando na formao de duas bases de Schiff (Figura 3a) e (iii) a reticulao formada tambm por mais de uma molcula de glutaraldedo, devido sua polimerizao em determinadas condies, por exemplo, em altos valores de pH. Aps a polimerizao, ocorre a reticulao dos grupos amino da quitosana. Genipina outro agente bifuncional extrado do jenipapo, bastante empregado na medicina chinesa e tambm como corante de alimentos. Na reticulao de quitosana com genipina, bases de Schiff no so formadas.50 Conforme mostrado na Figura 3b, ocorre ataque nucleoflico de um grupo amino da quitosana carbonila da genipina com a formao de uma ligao amida estvel e um tomo de oxignio da estrutura cclica da genipina substitudo por um tomo de nitrognio da quitosana. O mecanismo de reao da epicloridrina com quitosana bastante similar ao do glutaraldedo, no entanto, este agente de reticulao reage preferencialmente com os grupos hidroxilas da quitosana (Figura3c). Estas reaes podem ser efetuadas entre grupos hidroxilas de duas molculas de quitosana (reticulao intermolecular) ou reagir somente com um grupo hidroxila. importante caracterizar as condies de reticulao, pois sua ecincia diretamente proporcional concentrao e tipo de agente de reticulao, tempo de contato, temperatura, pH, massa molecular e grau de desacetilao da quitosana.22 O tempo de contato e a concentrao de agente de reticulao so importantes para a determinao da natureza da estrutura produzida, porque o aumento do tempo de reao e o uso de altas concentraes geram extensas reticulaes. O grau de desacetilao e a massa molecular da quitosana so importantes parmetros, porque o aumento da massa molecular e do grau de desacetilao tambm resulta em um maior rendimento de reticulao. Este efeito tambm pode prejudicar a difuso de macromolculas como as protenas nos interstcios do hidrogel, devido formao de poros de pequenos dimetros.24 O processo de reticulao reduz a ocorrncia de reaes paralelas na estrutura da quitosana como, por exemplo, a reao de ruptura do anel glicosdico por ao de agentes oxidantes como o on periodato, conforme mostrada na Figura 4.51 O on periodato reage com os grupos diois vicinais clivando a ligao carbono-carbono por oxidao na formao de um dialdedo, com a liberao de uma molcula de on amnio. Esta tcnica empregada para aumentar a exibilidade da quitosana e reduo da sua extensa cadeia para aumentar a sua solubilidade, ou seja, permite

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Figura 4. Mecanismo de oxidao por periodato dos grupos amino da quitosana

controlar a sua massa molecular, bem como a obteno de novos grupos reativos, aumentando a possibilidade para novas aplicaes.29,51 De acordo com Vold e Christensen,51 diversas macromolculas podem ser funcionalizadas por esta tcnica como amido, alginato e a prpria quitosana. Um dos principais parmetros de controle de reao de oxidao da quitosana o grau de desacetilao. De acordo com a Figura 4, os grupos amino acetilados ou reticulados impedem a reao de clivagem do biopolmero, reduzindo a sua solubilidade. Imobilizao de enzimas em diferentes conformaes de quitosana Diferentes protocolos podem ser empregados na imobilizao de enzimas em quitosana, tais como adsoro, encapsulao e ligao covalente.28,29,36,48,52-85 Na Tabela 1, alguns exemplos da aplicao de quitosana na imobilizao de enzimas de interesse industrial so listados, dando nfase metodologia de imobilizao empregada, tipo de agente de reticulao, ativao e aplicao. Como enzimas, so citadas as hidrolases, com maior aplicao industrial como lipases, peptidases (papana, bromelina, subtilisina Carlsberg, tripsina, quimotripsina, tiol protease), urease, -amilase, pululanase, -galactosidase, -xilosidase, xilanase, -glicosidase, celulase, catalase, penicilina G acilase, dentre outras. Outras classes, incluem as oxidorredutases (cloroperoxidase, colesterol oxidase, lacase, peroxidase, oxalato oxidase, glutamato desidrogenase e lcool desidrogenase), liases (aliinase) e isomerases (L-arabinose isomerase). Dentre os diferentes mtodos, a imobilizao covalente em quitosana ativada por glutaraldedo o mtodo mais empregado em funo dos grupos amino existentes na estrutura da quitosana que reagem com este agente em condies brandas, prximas neutralidade. Utilizando essa metodologia, Guerfali et al.84 imobilizaram -xilosidase de Talaromyces thermophilus em quitosana ativada com glutaraldedo para posterior aplicao na sntese de xarope de xilose e xilo-oligossacardeos. Em comparao aos outros protocolos testados como adsoro inica e encapsulao, o mtodo de ligao covalente ao suporte previamente ativado por glutaraldedo foi selecionado por fornecer um derivado com elevado rendimento de imobilizao e atividade recuperada. Alm disso, o derivado imobilizado apresentou uma elevada estabilidade operacional retendo 94% de sua atividade inicial aps 25 reutilizaes na reao de hidrlise. A mxima atividade hidroltica foi vericada em pH 8,0 e 53 C e em pH 7,0 e 50 C,

respectivamente, para a enzima imobilizada e livre. A enzima imobilizada foi eciente na sntese de xilo-oligossacardeos na presena de elevada concentrao de xilose. O efeito sinrgico de xilanase e -xilosidase foi ainda avaliado por meio da coimobilizao das enzimas em gel de quitosana. O biocatalisador preparado foi testado na hidrlise contnua de xilana de aveia a 50 C e a hidrlise da xilose foi favorecida empregando a enzima coimobilizada. Quitosana foi gratizada eletroquimicamente com polianilina e o hidrogel preparado foi testado na imobilizao de creatina amidino-hidrolase para a construo de biossensor na quanticao de creatinina.31 A enzima foi covalentemente imobilizada no suporte gratizado ativado com glutaraldedo, avaliando a inuncia de diversos parmetros tais como pH, temperatura e tempo de imobilizao. Partculas de hidrogel N-succinil-quitosana foram preparadas pela modicao qumica da quitosana com anidrido succnico, seguido de ativao via glutaraldedo e empregadas como suporte para a imobilizao de aliinase.53 Em condies otimizadas, o rendimento de imobilizao da enzima foi de 75,6%. A atividade mxima do biocatalisador imobilizado foi alcanada a 40 C, pH 7, enquanto a enzima livre exibiu atividade mxima a 30 C e pH 6. O derivado reteve 85% de sua atividade inicial aps 5 ciclos de hidrlise da aliina. -galactosidase de Kluyveromyces fragilis foi imobilizada em suportes orgnicos por diferentes protocolos.62 O derivado com maior atividade cataltica foi preparado pela imobilizao da enzima em hidrogel de quitosana coagulado com KOH e ativado com glutaraldedo. O carregamento mximo de protena imobilizada neste suporte foi da ordem de 247 mg por grama de suporte. A imobilizao no alterou os valores de pH e temperatura. A estabilidade operacional da enzima imobilizada foi superior enzima solvel, pois aps quatro ciclos de hidrlise de lactose a 40 C e pH 7 a enzima imobilizada manteve 83% de sua atividade inicial. Zhang et al.60 imobilizaram covalentemente cloroperoxidase (CPO) de Caldariomyces fumago em membranas de quitosana ativadas com 0,8 mol/L de glutaraldedo em pH 3,5 e o mximo carregamento de protena imobilizada foi de 3,18 mg g-1 de suporte. Na converso de mono-organoclorado em diorganoclorados a 50 C por 40 min, o derivado reteve 40% da atividade inicial enquanto a enzima livre reteve apenas 0,02%. Aps 20 h, a atividade residual do derivado imobilizado foi superior ao da CPO livre, 99 e 58%, respectivamente. Pululanase foi covalentemente imobilizada em esferas magnetizadas de quitosana preparadas via polimerizao fotoqumica com magnetita (Fe3O4) em suspenso aquosa, seguida de ativao com glutaraldedo.76 O suporte preparado imobilizou 180 g de pululanase por grama de gel, quando foi oferecido um carregamento de 1,0 mg da enzima. O processo de imobilizao deslocou o pH timo da enzima livre em 0,5 unidades para a regio mais cida (pH 5,0). A estabilidade trmica e operacional do derivado de pululanase foi superior enzima livre. Outros dialdedos tm sido empregados na ativao de quitosana para a imobilizao covalente de enzimas. Dialdedo de amido (amido funcionalizado) foi empregado como agente de ativao de partculas de hidrogeis de quitosana na imobilizao de xilanase de Aspergillus niger A-25, visando a sntese de xilo-oligossacardeos.82 Comparado com quitosana ativada via glutaraldedo e esferas no ativadas, o derivado preparado por ativao com dialdedo de amido apresentou maior atividade cataltica. As condies que maximizaram a atividade xilanoltica do biocatalisador foram 6,7% m/v de dialdedo de amido e tempo de reticulao de 16 h. A temperatura tima de atuao dos derivados preparados por ativao com dialdedos (de amido e glutaraldedo) foi 5 C mais elevada que a enzima livre (50C). Xilanase imobilizada em suporte ativado com dialdedo de amido tambm apresentou maior estabilidade trmica e de armazenamento

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Quim. Nova

Tabela 1. Aplicao de quitosana como suporte de imobilizao de diferentes enzimas Enzima (classe) Acetilcolinesterase (hidrolase) lcool desidrogenase (oxidorredutase) Aliinase (liase) -Amilase (hidrolase) Fonte Peixe poraqu Saccharomyces cerevisiae Alho Suporte Membrana modicada com poliacrilonitrila Nanobiocompsito de quitosana e nanotubos de carbono Hidrogel modicado com anidrido succnico Ativao GLU Mtodos de imobilizao Aplicao Ligao covalente Quanticao de acetilcolina Encapsulao Deteco amperomtrica de etanol Ligao covalente Produo de alicina (composto com atividade antimicrobiana e antiviral) Hidrlise do amido Ref. 30 52

GLU

53

Flocos modicados com cidos L-glutmico e 4-aminobutrico L-Arabinose isomer- Bacillus licheniformis Partculas de hidrogel ase (isomerase) Bromelina Abacaxi Nanopartculas de hidrogel (hidrolase) de carboximetil-quitosana modicado com cido linoleico Catalase Fgado de boi Hidrogel reticulado com (hidrolase) GLU contendo ons Cu2+ (resina de anidade por ligaes coordenadas entre a cauda de histidina da enzima e ons Cu2+) Clulas ntegras Hidrogeis de quitosana e Bacillus pumilus contendo anidrase alginato e hidrogeis hbridos carbnica e enzima de quitosana-PVA, alginato, puricada (hidrolase) argila e alumina Celulase Polieletrlito de quitosanaTrichoderma reesei (hidrolase) alginato Cloroperoxidase Membrana Caldariomyces (oxidorredutase) fumago Colesterol oxidase Hidrogel hbrido com cido (oxidorredutase) algnico Bacillus subtilis Creatina amidinohidrolase (hidrolase) -Galactosidase (hidrolase) Actinobacillus sp. Partculas hbridas de quitosana-slica e nanotubos de carbono Hidrogel Membrana de quitosana-carragenana Hidrogel hbrido com argilas ativadas

GLU

Ligao covalente

54

Encapsulao Adsoro

Produo semicontnua de L-ribulose Hidrlise de casena

55 56

GLU

Adsoro inica e ligao Hidrlise de perxido de covalente hidrognio

57

GLU GLU/ GLI GLU -

Adsoro Ligao covalente Ligao covalente Ligao covalente Encapsulao

Converso de CO2 presente em combustveis em bicarbonato Produo de etanol Clorao de organoclorados Diagnsticos de doenas cardacas e trombose cerebral Quanticao de creatinina (biossensores) Hidrlise da lactose

58

59 60 61

GLU

Ligao covalente

31

Kluyveromyces fragilis Aspergillus oryzae

GLU GLU GLU

Ligao covalente Ligao covalente Ligao covalente

62 63

-Glicosidase (hidrolase) D-Hidantoinase e D-Carbamoilase (hidrolases) Glutamato desidrogenase (oxidorredutase) Lacase (oxidorredutase)

Agrobacterium radio- Polieletrlito de quitosanaalginato bacter Filme de quitosana

Encapsulao

Produo de glicose a partir de materiais lignocelulsicos Sntese de D-p-hidrxifenilglicina Quanticao de ons amnio em gua (biossensor ptico) Remoo do corante azo-cido Black 10 BX de euentes Remoo de 2,4-diclorofenol em euentes

64

65

Encapsulao via spincoating Adsoro

66

Cogumelo shimejipreto Coriolus versicolor

Membranas

67

Hidrogel

GLU

Ligao covalente

68

em comparao ao derivado ativado via glutaraldedo e a enzima livre. Este derivado produziu xilo-oligossacardeos de alta qualidade a partir da xilana de vidoeiro, rvore nativa na China. A utilizao de polieletrlitos de quitosana reticulados como suporte de imobilizao de lipases uma alternativa que tem sido aplicada com sucesso para utilizao dos derivados imobilizados na

biotransformao de leos e gorduras.29,69,71 Lipase de Thermomyces lanuginosus foi imobilizada em polieletrlitos de quitosana ativados com diferentes agentes, como glicidol, epicloridrina e glutaraldedo.29 Neste estudo, foram avaliadas as inuncias do tipo de polieletrlito e da modicao qumica dos polieletrlitos com cido 2,4,6 trinitrobenzenossulfnico (TNBS) na atividade cataltica e estabilidade

Vol. 34, No. 5 Tabela 1. continuao Enzima (classe) Lipase (hidrolase)

Aplicao de quitosana como suporte para a imobilizao de enzimas de interesse industrial

837

Fonte Candida antarctica

Suporte Hidrogel

Ativao GLU EPI GLU EPI GLU

Mtodos de imobilizao Aplicao Ligao covalente Hidrlise de steres

Ref. 48

Candida rugosa

Matriz hbrida quitosanaSiO2 Quitosana em p funcionalizada com HEMDA Partculas de hidrogel reticulado com TPP

Ligao covalente Ligao covalente

Hidrlise do azeite de oliva Hidrlise do azeite de oliva e sntese de steres aromatizantes Hidrlise de steres Sntese de biodiesel

36 69

GLU EPI GLU EPI GLU GLU GLU GLU GLI EPI GLU

Encapsulao Ligao covalente

70 29

Thermomyces lanuginosus Rhizopus oryzae

Polieletrlitos de quitosana reticulados por TNBS

Membranas de quitosana e alginato Oxalato oxidase Polieletrlito de quitosana(oxidorredutase) mucina Papana Mamo Membranas de anidade (hidrolase) contendo ligantes azo Penicilina G acilase Bacillus megatherium Partculas de quitosana(hidrolase) poliestireno Peroxidase Rabanete Hidrogel depositado em (oxidorredutase) nanotubos de carbono Pululanase Partculas magnticas de Klebsiella pneu(hidrolase) quitosana-Fe3O4 moniae Quimotripsina Pncreas bovino Polieletrlitos hbridos de (hidrolase) quitosana-alginato, gelatina e carragenana empregando agente porognico S. cerevisiae Subtilisina Carlsberg Hidrogeis, bras e lmes (hidrolase) -Transglicosidade Aspergillus niger Polieletrlito hbrido de (hidrolase) quitosana-alginato reticulado com fosfato de clcio Tripsina Pncreas bovino Hidrogel (hidrolase) Tiol protease Feijo mungo Hidrogel (hidrolase) Urease Soja Hidrogel (hidrolase) Xilanase Hidrogel Aspergillus niger (hidrolase) A-25 Bacillus halodurans C-125 Hidrogel Quitosana em p e hidrogel

Ligao covalente Ligao covalente Adsoro (anidade) Ligao covalente Encapsulao Ligao covalente Ligao covalente

Sntese de emulsicantes Quanticao de oxalato (biossensor) Puricao da papana do extrato do mamo Produo de antibiticos semissintticos Deteco de xido ntrico (biossensor) Hidrlise de pululana Sntese de peptdeos

71 72 73 74 75 76 28

GLU TPP -

Encapsulao e ligao covalente Encapsulao

Sntese de peptdeos em meio orgnico Converso de maltose em isomalto-oligossacardeos Hidrlise de protenas Hidrlise de protenas Quanticao de ureia no sangue Produo de xilo-oligossacardeos Hidrlise de xilana Produo de xarope de xilose em biorrenarias

77 78

GLI GLU GLU GLU GLU DAA GLI GLU

Ligao covalente Ligao covalente Ligao covalente Ligao covalente

79 80 81 82

-xilosidase (hidrolase)

Ligao covalente Ligao covalente

83 84

Quitosana em p e hidrogel GLU Ligao covalente Produo de xilo-oligos85 Talaromyces thersacardeos e xilose mophilus GLU: glutaraldedo; GLI: glicidol; EPI: epicloridrina; DAA: dialdedo de amido; TPP: tripolifosfato de sdio; PVA: lcool polivinlico; HEMDA: hexametilenodiamina; TNBS: cido 2,4,6 trinitrobenzenossulfnico.

trmica dos derivados imobilizados. A reticulao dos polieletrlitos com TNBS teve como objetivo aumentar a hidrofobicidade destes suportes. TNBS reage com os grupos amino da quitosana, reduzindo o carter hidroflico das matrizes e, consequentemente, aumentando a hidrofobicidade dos suportes. A modicao qumica dos polieletrlitos com TNBS aumen-

tou a atividade cataltica e a estabilizao trmica da lipase de Thermomyces lanuginosus imobilizada, decorrente da formao de microambiente que favoreceu a interao da enzima com o suporte. Na estabilizao de enzimas por imobilizao, necessrio um alinhamento entre os grupos reativos do suporte com os grupos da enzima para que ocorram multi-interaes e na hidrofobizao das matrizes

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Mendes et al.

Quim. Nova

hbridas ocorreu uma maior proximidade entre os biopolmeros que constituam estas matrizes, o que resultou na formao de um suporte com boa congruncia geomtrica, favorendo as multi-interaes entre enzima e os grupos reativos do suporte. Para as lipases, a hidrofobicidade da matriz um parmetro muito importante para que o acesso do substrato (leo) aos interstcios da matriz seja favorecido. Dentre os polieletrlitos testados, quitosana-alginato modicado quimicamente com TNBS forneceu derivados com maior atividade cataltica e estabilizao trmica.29 Lipase de Candida rugosa foi imobilizada por ligao covalente em matriz hbrida SiO2-quitosana obtida pela tcnica sol-gel e ativada com epicloridrina.36 A atividade do derivado foi avaliada em meio aquoso na hidrlise do azeite de oliva emulsicado com goma arbica. Um estudo comparativo entre a lipase livre e imobilizada foi realizado em termos de pH, temperatura, parmetros cinticos e estabilidade trmica. A atividade cataltica mxima da lipase solvel foi em pH 7,0 e 45 C e do derivado imobilizado foi em pH 7,5 e na faixa de temperatura de 40-50 C. O derivado imobilizado resultante foi 9 vezes mais estvel que a lipase solvel a 50 C. Outros procedimentos so empregados no processo de imobilizao de enzimas em quitosana, como adsoro e encapsulao em membranas e hidrogeis sem o uso de agentes de reticulao. Estes mtodos de imobilizao so mais simples que a imobilizao por ligao covalente porque no requerem a ativao do suporte.16-19 Alguns destes estudos empregam agentes de reticulao de carter inico, como tripolifosfato de sdio (TPP) e fosfato de clcio, para melhorar o aprisionamento de enzimas encapsuladas em geis de quitosana e polieletrlitos.70,78,86 Isomalto-oligossacardeos (IMO) so empregados como alimentos funcionais devido s suas baixas calorias, no cariogenicidade e segurana para diabticos.78 Para converter maltose em IMO, -transglicosidase foi encapsulada em polieletrlito quitosanaalginato reticulado ionicamente com fosfato de clcio. Devido presena de uma superfcie externa inorgnica, o polieletrlito reticulado ionicamente reteve maior atividade cataltica se comparado com o polieletrlito no reticulado. As condies de mxima atividade cataltica para a enzima imobilizada foram similares s da enzima livre (pH 6,0 e 60 C). -transglicosidase encapsulada em suporte reticulado foi mais estvel que a enzima livre em uma ampla faixa de temperatura e pH. Tripolifosfato de sdio (TPP) um composto polianinico no txico empregado na sntese de hidrogeis de quitosana reticulados por interaes inicas, como alternativa s reticulaes covalentes realizadas por agentes bifuncionais como glutaraldedo.70,86,87 Este agente de reticulao empregado na preparao de esferas de quitosana devido sua rpida capacidade de gelicao.86,87 Estudos descritos na literatura mostram a aplicao deste agente na reticulao inica de quitosana para a obteno de geis para a imobilizao de enzimas por encapsulao.70 A utilizao de TPP reduz os tamanhos dos poros do gel, aprisionando ecientemente a enzima nos interstcios do suporte. Este mtodo de reticulao promissor, pois os biocatalisadores preparados no so txicos e, portanto, ideais para aplicao na liberao de frmacos e em alimentos. Alsarra et al.70 avaliaram as inuncias do pH, concentrao de TPP e fora inica do meio de gelicao na preparao de biocatalisadores de lipase de Candida rugosa encapsulada em partculas de quitosana. O biocatalisador foi preparado pela adio da enzima em soluo de quitosana em cido actico. A encapsulao foi realizada pela adio da soluo lipase-quitosana em soluo de TPP. Neste estudo, foi testada a capacidade de aprisionamento da enzima nos interstcios do suporte por incubao do biocatalisador preparado em tampo Tris-HCl pH 7,2 por 36 h e a enzima liberada foi quanticada em termos de protena presente no tampo. Foi empregado delinea-

mento experimental para avaliar a inuncia do pH e da concentrao de TPP no aprisionamento da enzima. De acordo com os resultados apresentados, a concentrao de TPP e o pH de encapsulao foram parmetros signicativos para a obteno de derivados com elevada atividade cataltica. Tan et al.56 prepararam nanopartculas de hidrogel de carboximetil-quitosana modicada por sonicao com cido linoleico. Estas partculas foram empregadas na imobilizao por adsoro de bromelina de abacaxi (Ananas comosus). Os derivados preparados foram mais estveis termicamente que a enzima livre. Esses resultados indicam que o processo de imobilizao promoveu a estabilidade da enzima e aumentou a anidade da enzima pela casena, substrato empregado neste estudo. Biossensor ptico foi preparado por encapsulao de glutamato desidrogenase em lme de quitosana para a quanticao de ons amnio em gua.66 A soluo enzima/quitosana foi depositada em lminas de vidro e o lme contendo a enzima encapsulada foi obtido pela tcnica spin-coating que consiste na evaporao de solventes de uma soluo por movimento de rotao do aparato na qual a soluo foi gotejada. O biossensor preparado apresentou atividade tima em pH 8,0. As concentraes timas de quitosana e carregamento da enzima foram de 2% (m/v) e 0,08 mg, respectivamente. A resposta linear do biossensor foi obtida no intervalo de concentrao de ons amnio de 0,005 a 0,5 mmol/L com um limite de deteco de 0,005 mmol/L. O biossensor mostrou ser estvel por um perodo de 1 ms, quando armazenado seco a 4 C. Quitosana tambm tem sido empregada como suporte de anidade para a puricao de enzimas de grande interesse industrial. Este interesse crescente pelos processos de puricao de biomolculas se deve ao desenvolvimento da biotecnologia e demanda das indstrias farmacutica e qumica por produtos com alto grau de pureza. Diferentes estratgias tm sido empregadas em processos de puricao de biomolculas e a imobilizao de enzimas por anidade com ligantes inseridos em um suporte uma tcnica amplamente relatada na literatura.57,73,88-92 Nessa tcnica, os ligantes (grupos de anidade) inseridos em uma matriz se ligam molcula de interesse por interaes seletivas e reversveis como adsoro inica e foras de van der Waals, com elevado grau de seletividade.57,73,88-92 Em seguida, a enzima adsorvida aos ligantes inseridos no suporte pode ser eluda empregando solues ou tampes apropriados. Chen et al.73 prepararam membranas de anidade de quitosananylon para a puricao de papana presente no extrato em p de mamo com a insero de grupos de anidade ou ligantes oriundos de corantes antraquinnicos Reactive Red 120 e Reactive Brown 10. Papana, uma protease presente no ltex do mamo, amplamente empregada na indstria do couro, cosmticos, txtil, detergentes, alimentos e farmacutica. A capacidade de adsoro da enzima nas membranas contendo ligantes oriundos dos corantes Reactive Red 120 e Brown 10 foi de 143,6 e 107,3 mg/g de membrana, respectivamente. A adsoro da protena foi demonstrada pelas isotermas de Freundlich. A enzima foi eluda das membranas empregando soluo de NaCl 1 mol/L a pH 6,0 e o rendimento de puricao foi superior a 80% para a membrana quitosana-nylon-Reactive Red 120 e de apenas 50% para a membrana quitosana-nylon-Reactive Brown 10. Neste estudo, membrana quitosana-nylon-Reactive Red 120 foi selecionada para o processo de puricao da papana presente no extrato em p do ltex de mamo. CONCLUSO Nos ltimos anos, o grande desao da tecnologia enzimtica tem sido o desenvolvimento de produtos e processos menos agressivos em termos ambientais. A imobilizao de enzimas em suportes slidos

Vol. 34, No. 5

Aplicao de quitosana como suporte para a imobilizao de enzimas de interesse industrial

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uma ferramenta importante para a estabilizao da enzima, permite a reutilizao e reduz a inativao por inuncia da temperatura e solventes, o que pode ser atrativo para o setor industrial. Diferentes suportes comerciais tm sido estudados para a imobilizao de enzimas. No entanto, muitos destes suportes possuem custo elevado, o que permite a substituio por outros de baixo custo e que possam estabilizar as enzimas, como a quitosana. Os biocatalisadores preparados por imobilizao em quitosana tm sido empregados na biotransformao de protenas, modicao de leos e gorduras e materiais lignocelulsicos, remoo de contaminantes em guas residurias, sntese de compostos de alto valor agregado empregados nas indstrias farmacutica e alimentcia e gerao de energia, puricao de enzimas, preparao de sosticados biossensores para medies in situ em guas residurias e quanticao de metablitos produzidos pelo organismo humano no controle de enfermidades. Os exemplos descritos nesta reviso mostram que a imobilizao de enzimas em quitosana bastante promissora na preparao de biocatalisadores ativos e de grande interesse industrial. AGRADECIMENTOS FAPESP (Processo 04/14593-4), CAPES e ao CNPq pelo suporte nanceiro. REFERNCIAS
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