Informe de Laboratorio No.

3 _______________________________________________________________________

Estudio de la actividad estersica presentada por extractos animales

lvarez, David; Caicedo, Michelle;Chamorro, Andrea; Marn, Freddy; Merizalde, Wendy; Orcs Este ania!
Estudiantes de la asignatura IBT411 ! Bio"u#mica 1$ %arrera de Ingenier#a en Biotecnolog#a$ &niversidad de las 'm(ricas$ )uito Ecuador *E+&,EN En esta prctica se cuantific- la actividad estersica de tres extractos$ cada uno pertenecientes a las v#sceras de una animal diferente .pollo$ res o cerdo/. 0ara cuantificar esta actividad en1imtica se necesit- construir diagramas de dispersi-n .adsorci-n vs tiempo/ para cada uno de los extractos a evaluar con la a2uda del espectrofot-metro. Los valores de las pendientes obtenidas fueron 3.3333 en v#sceras de pollo$ 3.3314 en v#sceras de res 2 3.3311 en v#sceras de cerdo. Los valores de actividad en1imtica se obtuvieron con la f-rmula 'E 2 dieron 3.3454 6L en v#sceras de pollo$ 3.3!34 6L en v#sceras de res 2 3.314! en v#sceras de cerdo. 0or tanto como la pendiente en v#sceras de pollo fue ma2or en la actividad en1imtica tambi(n ser ma2or en comparaci-n a los extractos obtenidos de las otras v#sceras. 'dems se reali1- un balance de masas del procedimiento reali1ado 2 se dedu7o "ue a medida "ue el proceso avan1a se purifica gradualmente la concentraci-n en1imtica de los extractos obtenidos$ gracias a la centrifugaci-n de los extractos.

0alabras clave8 'ctividad estersica$ Extracto$ Balance de masas$ %entrifugaci-n. 'B+T*'%T In t9is practice :as "uantified t9e esterase activit2 of t9ree extracts$ eac9 one belonging to a different animal vicera .c9ic;en$ beef or por;/. To "uantif2 t9is en12matic activit2 is needed to build scatter diagrams .adsorption vs time/ for eac9 one of t9e extracts t9at :ere evaluated$ :it9 t9e 9elp of t9e spectrop9otometer. T9e values of t9e slopes obtained :ere 3.3333 in c9ic;en viscera$ 3.3314 in beef vicera and 3.3311 in por; vicera. <alues of en12matic activit2 :ere obtained :it9 t9e formula 'E and gave 3.3454 6L in c9ic;en vicera$ 3.3!34 6L in beef vicera and 3.314! in por; vicera. T9erefore as t9e slope in c9ic;en viscera :as 9ig9er in t9e en12matic activit2$ also :ill be greater in comparison to t9e extracts obtained from t9e ot9er vicera. =urt9ermore$ a mass balance of t9e procedure performed :as reali1ed and :it9 t9at :as deducted t9at mean:9ile t9e process moves t9e purit2 of en12mes concentration increses$ t9is 9appensa$ t9an;s to t9e centrifugation of t9e extracts. >e2:ord8 Esterase activit2$ Extract$ ,ass balance$ %entrifugation.

1. INT*?@&%%IAN "as enzimas son #iomolc$las %ertenecientes al &r$%o de las %rotenas, c$ya $nci'n es catalizar reacciones #iol'&icas! A %esar ($e se desconoce el %or($ de s$ e)celente es%eci icidad, las

mismas son a&entes catalticos m$cho me*ores ($e los a&entes catalticos ($micos! +"ehnin&er, ,elson, - Co), .//0, %!1203 "a actividad ester4sica mide los niveles de actividad de enzimas ($e est4n li&adas a %rocesos hidrolticos, de#ido a ($e son estas

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

enzimas las ($e estos %rocesos se lleven a ca#o de orma r4%ida y se&$ra! Esta medida se o#tiene de orma e)%erimental y #a*o condiciones ($e son im%ortantes de esta#lecer! Adem4s la actividad ester4sica e)%resa c$4nto s$strato se convierte en %rod$cto %or $nidad de tiem%o! +5inche, .//0, %!163 7ara %oder medir la actividad enzim4tica es m$y im%ortante tomar en c$enta las condiciones con las c$ales se est4 tra#a*ando %or($e las enzimas al ser %rotenas tam#in %$eden desnat$ralizarse y %or ende inactivarse con lo c$al ya no sera %osi#le medir s$ actividad! Es %or esto ($e la tem%erat$ra a la ($e de#e ser sometida dentro del la#oratorio no de#e e)ceder de los 6/ 8C. Adems es importante tomar en cuenta el pH al momento medir la actividad estersica, debido a que las enzimas son muy sensibles a los cambios del pH se debe colocar una solucin tampn en la muestra donde se encuentren las mismas para que no se vean afectadas. +9onzalez, .//:3 7ara %oder medir la actividad ester4sica es im%ortante tener en c$enta la ec$aci'n de Michaelis;Menten, donde se relaciona la VO (velocidad inicial) con Vm (velocidad m ima) y con !"#O (concentracin inicial del sustrato) a trav$s de %& (constante de &ic'aelis). Al tener esta ecuacin, la misma debe ser (raficada razn de una 'ip$rbola rectan(ular ((rfico ms preciso) o a razn de una l)nea recta para de esta manera obtener una ecuacin y sacar su pendiente para el futuro clculo de la actividad estersica. +"ehnin&er, ,elson, - Co), .//0, %!1023 "a actividad ester4sica se mide con la ay$da del espectrofotmetro, pues la adsorbancia que posea la muestra antes traba*ada corresponder al a actividad estersica en una muestra. +ara esto se deben tomar en cuenta parmetros como a (pendiente de la curva obtenida de la adsorbancia en relacin al tiempo) Vc (volumen de la mezcla de reaccin en <"3, =e +vol$men del e)tracto %resente en la mezcla de reacci'n en <"3, " +lon&it$d del %aso de l$z en la celda en cm3 y > ?1?/ M;1 cm;1 +coe iciente de e)tinci'n del %;nitro enol a @:2nm3! Es as ($e la 'rm$la $tilizada %ara determinar la actividad ester4sica es la si&$iente +5inche, .//0, %! :63A AE > a B 1/// B =c B " B =e !. ?BBETI<?+

!.1 ?b7etivo general

C$anti icar la actividad ester4sica %resente en e)tracto de vsceras de %ollo, vsceras de res y vsceras de cerdo!

!.! ?b7etivos espec#ficos ; ; Esta#lecer condiciones adec$adas de tem%erat$ra y %C %ara los e)tractos! Constr$ir el &r4 ico de dis%ersi'n de la adsor#ancia en relaci'n al tiem%o %ara cada $no de los e)tractos tra#a*ados! Ela#orar el res%ectivo #alance de masas ($e se realiz' en los e)tractos de la %r4ctica! Calc$lar la actividad ester4sica de cada $no de los e)tractos con la ay$da de la %endiente o#tenida en la ec$aci'n del dia&rama de dis%ersi'n de la adsor#ancia con res%ecto al tiem%o! Com%arar la actividad ester4sica entre los e)tractos de vsceras de %ollo, res y cerdo!

3. ,'TE*I'LE+ C ,DT?@?+

@!1 Materiales y reactivos 9radilla! D$#os de ensayo! +1.3 =aso de %reci%itaci'n 9"A55CO +.3 Ealanza!

.?/

ml!

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

7lancha de calentamiento a&itador! A&itador ma&ntico! 9otero C$chillo "ic$adora Derm'metro Es%ectro ot'metro Centri $&adora Micro %i%etas +@3 =sceras de res +./&3 =sceras de %ollo +./&3 =sceras de cerdo +./&3 Dam%'n os ato +1./ml3 E)tracto +0/ <"3 Etanol a#sol$to +0/ml3 A&$a con A contin$aci'n, en la i&$ra . se e)%ondr4 el #alance de masas ($e se o#t$vo del %rocedimiento e)%erimental de la %r4ctica!

@!. 7rocedimiento e)%erimental En la i&$ra 1 ($e se e)%one a contin$aci'n se e)%one el %rocedimiento e)%erimental a manera de $n dia&rama de l$*o, esto %or($e en res$ltados se $tilizar4 este dia&rama de l$*os %ara la o#tenci'n del #alance de masas!

=igura !8 Balance de masas de los diferentes extractos obtenidos en la prctica

"a actividad ester4sica se mide mediante la adsor#ancia de l$z ($e %resenta la m$estra en el es%ectro ot'metro, &racias a esto se e)%ondr4 en la ta#la 1 y i&$ra @ la adsor#ancia de l$z con res%ecto al tiem%o del e)tracto . de vsceras de %ollo, de esta manera con la %endiente o#tenida del dia&rama de dis%ersi'n se calc$le la actividad ester4sica del e)tracto! "o mismo se realizar4 %ara el e)tracto . de las vsceras de res y cerdo; solo ($e el de las vsceras de res ser4 e)%resado en la ta#la . y i&$ra : mientras ($e el de cerdo ser4 e)%resado en la ta#la @ y i&$ra ?!

=igura 18 0rocedimiento experimental reali1ado en la prctica mediante un diagrama de flu7o 4. *E+&LT'@?+

7ara los c4lc$los de la actividad enzim4tica los valores de =c y =e son los si&$ientesA

=c > ..?/ <" +vol$men m$estra inicial3 F @/ <" +e)tracto3

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________ AE =

=c > ..2/ <"

a*

1000 * Vc * L * Ve

=e > @/ <" +e)tracto3

AE =

0,0033

1000 * 2280 L 5150 M-1 cm-1 * 1 cm* 30L

AE =
Tabla 18 'dsorbancia del extracto ! de v#sceras de pollo en relaci-n al tiempo utili1ando un espectrofot-metro a 353nm. Diem%o +s3 / 1? @/ :? 6/ G? 0/ 1/? 1./ 1@? 1?/ 16? 12/ Adsor#ancia +@:2nm3 1,/1 1,/G: 1,1@1 1,12G 1,..G 1,.G2 1,@@1 1,@G2 1,:.? 1,:G6 1,?.1 1,?G? 1,6.1

0,0487 u/L

Tabla !8 'dsorbancia del extracto ! de v#sceras de res en relaci-n al tiempo utili1ando un espectrofot-metro a 353nm.

Tiempo (s 0 15 30 45 %0 75 &0 105 120 135 150 1%5 180

A!so"#a$cia (348$m 0,815 0,848 0,8%& 0,8&% 0,&1& 0,&42 0,&%7 0,&&3 1,015 1,03& 1,0%1 1,084 1,108

=igura 38 @iagrama de dispersi-n lineali1ado de la adsorbancia vs tiempo del extracto ! de v#sceras de pollo

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

=igura 48 @iagrama de dispersi-n lineali1ado de la adsorbancia vs tiempo del extracto ! de v#sceras de res =igura E8 @iagrama de dispersi-n lineali1ado de la adsorbancia vs tiempo del extracto ! de v#sceras de cerdo

AE =

a*

1000 * Vc * L * Ve

AE =

a*

1000 * Vc * L * Ve

AE =

0,001 %

1000 * 2280 L 5150 M-1 cm-1 * 1cm * 30L

AE =

0,0011

1000 * 2280 L 5150 M-1 cm-1 * 1cm * 30L

AE =

AE 0,023% u/L =

0,01%2 u/L

Tabla 38 'dsorbancia del extracto ! de v#sceras de cerdo en relaci-n al tiempo utili1ando un espectrofot-metro a 353nm.

Tiempo (s 0 15 30 45 %0 75 &0 105 120 135 150 1%5 180

A!so"#a$cia (348$m 1,057 1,074 1,078 1,0&4 1,111 1,131 1,154 1,1%4 1,181 1,201 1,215 1,227 1,243

E. @I+%&+IAN

Es im%ortante in ormar ($e tanto la i&$ra 1 ($e contiene el %rocedimiento e)%erimental con la i&$ra . ($e contiene el #alance de masas se enc$entran $#icadas tam#in en la %arte de ane)os %ara ($e se %$edan vis$alizar estas i&$ras de manera m4s clara ($e en %rocedimiento e)%erimental y res$ltados! Comenzando con la disc$si'n del #alance de masas se %$ede o#servar en la i&$ra . ($e a medida ($e el %rocedimiento avanza la m$estra se %$ri ica la concentraci'n enzim4tica &rad$almente! Esto se de#e a los %rocedimientos de centri $&aci'n ($e se realizaron %or($e cada vez ($e se o#tena $n e)tracto el %reci%itado o el so#renadante eran des%reciados %ara el %aso si&$iente! ,o se %$ede disc$tir la di erencia de cada e)tracto o#tenido en el #alance de masas con la actividad ester4sica de los mismos %or($e solo se c$anti ic' esta actividad en el e)tracto . de cada $na de las vsceras +%ollo, res y cerdo3! "as condiciones de tem%erat$ra y %C $eron adec$adas en los tres e)tractos con los ($e se c$anti ic' la actividad ester4sica %$es a$n($e %e($eHos, los tres %resentaron actividad enzim4tica! Esto ($iere decir ($e

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

las %rotenas no se desnat$ralizaron con orme avanz' el %rocedimiento! En el caso de la actividad ester4sica del e)tracto . de las vsceras de %ollo se o#serva en la i&$ra @ ($e s$ %endiente es de /!//@@ relativamente %e($eHa y %or tanto s$ actividad ester4sica tam#in ser4 %e($eHa, /!/:2G $I<"! 5in em#ar&o si se com%ara este res$ltado con los res$ltados de la actividad enzim4tica del e)tracto . de las vsceras de res +/!/.@6 $I<"3 y cerdo +/!/16. $I<"3, se determina ($e la me*or actividad ester4sica se %resent' en el %ollo %or($e tanto la i&$ra : como la i&$ra ? %resentaron %endientes m4s %e($eHas ($e en la i&$ra @ y como se e)%$so en la introd$cci'n la actividad ester4sica ser4 mayor a medida ($e el valor de la %endiente de s$ dia&rama de dis%ersi'n adsor#ancia vs tiem%o incremente! "a se&$nda me*or actividad enzim4tica la %resenta las vsceras de res con $n valor de /!/.@6 $I<", esto se de#e a ($e el valor de s$ %endiente $e de /!//16; no como la %endiente o#tenida en la i&$ra ? %erteneciente al dia&rama de dis%ersi'n de adsor#ancia vs tiem%o de las vsceras de cerdo ($e %resenta $n valor de /!//11 ($e da $na activada ester4sica de a%enas /!/16. $I<", siendo este Jltimo e)tracto el ($e %resent' menor actividad ester4sica! "a disc$si'n so#re ($e vscera %resent' me*or actividad enzim4tica redactado en el %4rra o anterior %$ede de#erse al ori&en de cada $no de los animales de los c$ales se e)tra*eron las vsceras; sin em#ar&o como las vsceras de los mismos $eron ad($iridas en el mercado no se %osi#le conocer las varia#les am#ientales y alimenticias de cada animal! Otra %osi#le raz'n %$ede ser ($e las vsceras de %ollo $eron me*or lavadas ($e las vsceras de res y cerdo o la concentraci'n de tam%'n os ato, condiciones de tem%erat$ra y %C $eron m4s adec$adas en las vsceras de %ollo ($e en las vsceras de res y cerdo, a$n($e se intent' dar las mismas condiciones a todas las m$estras de vsceras! A %esar de ($e se han #$scado razones es%ec icas %ara e)%licar esta di erencia en la actividad ester4sica de las vsceras de %ollo, res y cerdo con $na e)%licaci'n a nivel de cada animal, ha sido m$y com%licada encontrarla; es %or esta raz'n ($e en #ase a disc$siones con com%aHeros de otros &r$%os de tra#a*o y el %ro esor de la materia se han intentado dar %osi#les e)%licaciones de estas di erencias! A %esar de ($e e)iste error en el c4lc$lo de la actividad ester4sica +de#ido a la h$medad es%ont4nea ($e a#sor#en las m$estras del am#iente antes de in&resar al es%ectro ot'metro3 de vsceras %ertenecientes a los di erentes animales, el mismo es des%reciado %or($e el error se a%licara a los tres c4lc$los y adem4s re%erc$te en la c$arta ci ra si&ni icativa del res$ltado! 5in em#ar&o si en $t$ras %r4cticas se ($iere c$anti icar el valor e)acto de este error se de#e realizar $n #lanco %ara o#tenerlo! 4. %?N%L&+I?NE+ ; "as condiciones de tem%erat$ra y %C ($e se $tilizaron %ara los e)tractos $eron adec$ados, %$es todas las m$estras viscerales %resentaron actividad enzim4tica, es decir no e)isti' desnat$ralizaci'n de las enzimas! 5in em#ar&o in l$yeron de manera m4s adec$ada en la m$estra de vsceras de %ollo %$es %resent' m4s actividad enzim4tica Al constr$ir los &r4 icos de dis%ersi'n de adsor#ancia vs tiem%o del e)tracto de cada animal se o#t$vo ($e la %endiente m4s alta la t$vieron las vsceras de %ollo con $n valor de /!//@@, les si&$ieron las vsceras de res con $n valor de /!//16 y %or Jltimo las vsceras de %ollo con $n valor de /!//11 en s$ %endiente! Estos res$ltados ay$daron a c$anti icar la actividad ester4sica en cada e)tracto! En el #alance de masa se determin' ($e a medida ($e se desarrolla el %roceso se %$ri ica la concentraci'n enzim4tica de la m$estra en los di erentes e)tractos! 5in em#ar&o no

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

se %$eden hacer com%araciones entre la %$ri icaci'n de concentraci'n enzim4tica de los e)tractos con la actividad ester4sica de los mismos %or($e solo se o#t$vo la actividad enzim4tica del e)tracto . de cada m$estra de vsceras! "a actividad ester4sica ($e se o#t$vo en el caso de las vsceras de %ollo $e /!/:2G $I<"; /!/.@6 en el caso de las vsceras de res y /!/16. en el caso de las vsceras de %ollo! "as vsceras de %ollo t$vieron mayor actividad ester4sica de#ido a ($e la %endiente o#tenida en s$ dia&rama de dis%ersi'n t$vo $n mayor valor, esto %$do de#erse a las condiciones de concentraci'n de tam%'n os ato, a las condiciones de tem%erat$ra y %C a las ($e $e sometida la m$estra reaccionaron de me*or manera en este caso %artic$lar o incl$so al com%ortamiento individ$al de las enzimas en cada $no de los animales de los ($e se e)tra*eron las vsceras! +rincipios de bioqu)mica +%4&! 1203! Es%aHaA Ediciones Ome&a! 5inche, M! +K$nio de .//03! bibdi(ital.epn.edu.ec! Lec$%erado el /. de Diciem#re de ./1@, de htt%AII#i#di&ital!e%n!ed$!ecI#itstreamI 1?///I1661I1ICD;..12!%d

F. *E%?,EN@'%I?NE+

5e recomienda realizar el #lanco %ara %oder o#tener la actividad ester4sica %recisa de cada $na de las m$estras! 5e recomienda mani%$lar con m4s c$idado materiales ($e no sean m$y amiliares como las micro %i%etas %ara no daHarlas!

BIBLI?G*'=H' 9onzalez, K! +.//:3! ,ema --. /nzimas! Lec$%erado el . de Diciem#re de ./1@, de De%artamento de Eio($mica y Eiolo&a Molec$lar de la Mniversidad del %as =ascoA htt%AIINNN!eh$!esI#iomolec$lasIenzi masItema11!htm "ehnin&er, A!, ,elson, D!, - Co), M! +.//03! EnzimasA cintica e nhi#ici'n! En A! "ehnin&er, D! ,elson, - M! Co),

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

'NEI?+

=igura 18 0rocedimiento experimental reali1ado en la prctica mediante un diagrama de flu7o.

Informe de Laboratorio No. 3 _______________________________________________________________________

=igura !8 Balance de masas de los diferentes extractos obtenidos en la prctica