Extraccin y caracterizacin de principios activos de estructura fenlica con propiedades antioxidantes y antibacterianas, a partir de residuos del procesamiento de alcachofas.

J. Dueas, B. Naranjo & P. Araujo

Departamento de Ciencias de la vida, Escuela Politcnica del Ejrcito, Sangolqu, Ecuador.

RESUMEN: En esta investigacin se determin la presencia y actividad de compuestos fenlicos como el cido cafeico (sin dato) y cido clorognico (40.06 - 82.86 mg/L) en brcteas de alcachofa mediante la aplicacin de tcnicas de extraccin slido-lquido, fenoles totales de Folin-Ciocalteu, actividad antioxidante con el reactivo DPPH, actividad antibacteriana, cromatografa en capa fina (TLC) y HPLC. Los resultados demostraron que el extracto con mayor concentracin de fenoles totales en equivalentes de quercetina fue el extracto hidroalcohlico (0.160 mg EQT/100g brcteas frescas), seguido del extracto alcohlico (0.153 mg EQT/100g brcteas frescas), del hidrolizado sin calor (0.142 mg EQT/100 g brcteas frescas) y, del hidrolizado con calor (0.001 mg EQT/100g brcteas frescas). Durante la prueba de actividad antioxidante se observ que los extractos, alcohlico e hidroalcohlico, fueron capaces de reducir al reactivo DPPH en 91.46% y 91.28% respectivamente. La prueba de actividad antibacteriana de estos dos extractos en cultivos de Staphylococcus aureus y Salmonella spp. demostr que tienen propiedades antibacterianas. Basado en los resultados, es posible afirmar que las brcteas de alcachofa son un valioso recurso para obtener principios activos tiles como antioxidantes y antibacterianos. ABSTRACT: In this investigation it was possible to determine the presence and activity of phenolic compounds such as caffeic (no data) and chlorogenic acid (40.06 - 82.86 mg/L) in artichoke bracts by applying solid-liquid extraction methods, Folin-Ciocalteu total phenolics, DPPH antioxidant activity test, antibacterial activity test and chromatography (TLC and HPLC) techniques. Four extracts were elaborated and the extract with the highest concentration, expressed in Quercetin equivalents (QTE), was the hydro-alcoholic extract (0.160mgQTE/100g fresh bracts), followed by the alcoholic extract (0.153mgQTE/100g fresh bracts), non-heat hydrolyzed (0.142mgQTE/100g fresh bracts), and heat hydrolyzed (0.001mgQTE/100g fresh bracts). Antioxidant activity tests demonstrates that alcoholic and hydro-alcoholic extracts were capable to reduce the concentration of DPPH 91.46% and 91.28% respectively. Antibacterial activity of the same extracts was also evaluated using Staphylococcus aureus y Salmonella spp. cultures. Antibacterial activity test determined that both extracts are antagonists of those bacteria. Based on the results, artichoke bracts are valuable resources of active principles with antioxidant and antibacterial activity.

1. INTRODUCCIN Las plantas son una fuente de innumerables recursos tiles para el desarrollo de la ciencia, entre los ms importantes estn los conocidos principios activos o metabolitos secundarios [2]. Los compuestos fenlicos son un grupo muy comn de metabolitos secundarios presentes en las plantas, estos incluyen a los fenoles simples, polifenoles, flavonoides, taninos, entre otros. Los flavonoides son el mayor grupo de fenoles vegetales y los ms estudiados [9].

Existen dos compuestos fenlicos de gran importancia debido a su amplia y variada actividad biolgica, estos compuestos son el cido cafeico y el cido clorognico. Las propiedades ms representativas de estos compuestos son antioxidantes, antibacterianas, antivirales, antifngicas, anticarcinognicas, antitumorales, antimutagnicas, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, antihipercolesterolmicas e inmunoestimulantes [11]. En [10], los autores determinaron que los compuestos fenlicos ms representativos en la alcachofa (Cynara scolymus L.) son el cido Cafeico (cido 3.4-dihidroxicinmico), el cido Clorognico (cido 3-Cafeilquinico), la cinarina, el cinarsido, la isorhoifolina, y la narirutina, todos estos con propiedades antioxidantes. Muchas fuentes de informacin mencionan que los principios activos de la alcachofa se encuentran nicamente en sus hojas y no en otra parte como sus brcteas o el corazn, pero estudios como el de [7] y [8], demostraron que las brcteas de alcachofa de algunas variedades poseen concentraciones importantes de compuestos fenlicos con actividad antioxidante, es decir que contienen lo mismo que las hojas solo que con ciertas diferencias cuantitativas de concentracin. Segn [7], las brcteas de alcachofa son una importante fuente de compuestos fenlicos con propiedades beneficiosas para el organismo y, pueden llegar a ser un recurso alternativo para las aplicaciones farmacuticas tradicionales que solo utilizaban extractos de las hojas. Esto resalta la importancia de utilizar los subproductos o mal llamados desechos que constituyen las brcteas de alcachofa como material para obtener este tipo de sustancias. Los principales compuestos fenlicos encontrados en las brcteas fueron el cido 1.5-Odicafeilqunico (cinarina), seguido del cido clorognico y la 7-O-glucuronida.

2. MATERIALES Y MTODOS 2.1. Obtencin y preparacin de la muestra Las muestras de brcteas de alcachofa fueron obtenidas de la empresa INAEXPO, perteneciente a PRONACA, en Puembo, Pichincha-Ecuador. La preparacin de las muestras consisti en secarlas a una temperatura menor a 40C para evitar la alteracin de los principios activos y, finalmente fueron pulverizadas. 2.2. Extraccin de principios activos Los extractos de brcteas de alcachofa se obtuvieron aplicando tcnicas de extraccin slidolquido recomendadas por [12]. La primera tcnica aplicada fue la maceracin del pulverizado en etanol durante 30 das, utilizando 10 mL de etanol al 99.6% por cada 10g de brcteas pulverizadas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, uno alcohlico y otro hidroalcohlico mediante la adicin de agua durante la maceracin. La segunda tcnica aplicada para la extraccin de principios activos fue la hidrlisis cida con cido clorhdrico (HCl) 6N, utilizando 200 mL de HCl por cada 15g de brcteas pulverizadas durante tres das, luego de la maceracin en cido clorhdrico (HCl) se dej el extracto en reflujo durante 12 horas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, un hidrolizado con calor y otro a temperatura ambiente. Finalmente todos los extractos fueron concentrados en rotavapor con vaco y a una temperatura menor de 40C.

2.3. Caracterizacin de los extractos 2.3.1. Reaccin con Cloruro Frrico (FeCl3) La presencia de compuestos fenlicos en los extractos se determin con el reactivo de cloruro frrico (FeCl3) siguiendo el protocolo de [4], el cual indica que se debe aadir 0.5mL de solucin de cloruro frrico al 5% por cada mL de extracto diluido en etanol. 2.3.2. Cromatografa en Capa Fina La cromatografa en capa fina del extracto de brcteas de alcachofa se realiz segn el procedimiento indicado por [12]. La fase mvil fue preparada con: butanol-cido actico glacial -agua destilada (4:1:5), se usaron como estndares cido cafeico, cido clorognico, quercetina y los extractos de brcteas de alcachofa sobre cromatoplacas de slica gel. La identificacin de las bandas se realiz con luz UV a una de longitud de onda 365m. 2.3.3. Cuantificacin de Fenoles Totales La cuantificacin de fenoles totales en las brcteas de alcachofa se realiz utilizando el procedimiento de [6] con el reactivo de Folin-Ciocalteu. Se realiz una curva de calibracin previa con concentraciones conocidas del quercetina a 760 m de absorbancia en espectrofotmetro para comparar con los valores de absorbancia de los extractos. 2.3.4. Tamizaje fitoqumico y Cromatografa HPLC El tamizaje fitoqumico del pulverizado y la cromatografa HPLC de los extractos alcohlico e hidroalcohlico se realizaron en el laboratorio de Productos Naturales de la Universidad Politcnica Salesiana por el profesor Wilson Tapia MSc. Para la cromatografa HPLC se utilizaron como estndares cido cafeico, cido clorognico y quercetina. 2.4. Pruebas de actividad 2.4.1. Actividad antioxidante Se utiliz el procedimiento de [6] para la determinacin de la actividad antioxidante de los extractos de brcteas de alcachofa utilizando una curva de calibracin con concentraciones conocidas del radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) a 517m de absorbancia en el espectrofotmetro para comparar con los valores de absorbancia de los extractos. 2.4.2. Actividad antibacteriana La actividad Antibacteriana de los extractos de brcteas de alcachofa se realiz mediante el mtodo de difusin en agar por discos [5], a travs de este se determin la presencia de un halo de inhibicin en el cultivo bacteriano demostrando que el extracto es un agente antibacteriano. Las bacterias utilizadas para el ensayo fueron Staphylococcus aureus y Salmonella spp., obtenidas del laboratorio de microbiologa de la Universidad San Francisco de Quito. 2.5. Anlisis de Datos El anlisis de resultados se realiz mediante clculos estadsticos bsicos como promedios, desviaciones estndar y error de muestreo. Para los resultados de concentracin de fenoles totales, actividad antioxidante y antibacteriana se realizaron anlisis de varianza (ANOVA) de un factor, pruebas de Tukey y determinacin de correlacin mediante el anlisis de Pearson.

3. RESULTADOS 3.1. Tamizaje o screening fitoqumico El pulverizado de brcteas de alcachofa contiene compuestos fenlicos tales como flavonoides, cumarinas y taninos catquicos, junto con otros compuestos como azcares reductores, saponinas, esteroles y, carotenoides. Alcaloides, antocianidinas, lactonas y muclagos no fueron hallados en el screening. 3.2. Reaccin con cloruro frrico (FeCl3) El extracto alcohlico, hidroalcohlico y el hidrolizado sin calor reaccionaron con el cloruro frrico evidenciando la presencia de compuestos fenlicos en su composicin. 3.3. Cromatografa en capa fina En el cromatograma tograma del extracto alcohlico se evidenci la presencia de cido clorognico. Tambin encontraron otros compuestos de los cuales no se pudieron identificar. En el cromatograma del extracto hidroalcohlico (Figura 3.1) 3. se encontr cido clorognico, la que se presenta mucho ms clara y definida que en el extracto alcohlico. Existiendo t tambin la presencia de otros componentes no identificados. identificados

Figura 3.1 Cromatograma del extracto hidroalcohlico. [3] (a: cido clorognico; b: cido cafeico)

El cromatograma del hidrolizado sin calor present 3 bandas una de las cuales corresponde al cido cafeico El cromatograma del hidrolizado con calor no present bandas identificables. . El tratamiento de las brcteas con cido clorhdrico (HCl) ( 6N y temperatura mayor a 40C no permiti obtener un extracto que contenga compuestos fenlicos. La tabla 3.1 resume los resultados de la cromatografa. 3.4. Cromatografa HPLC El resultado del anlisis realizado al extracto alcohlico (Figura 3.2) e hidroalcohlico mediante HPLC revela que las concentraciones concentraci de cido clorognico son 82.8560 y 40. 0.0613 mg/L, respectivamente. Estos extractos no contienen cido cafeico y quercetina segn los cromatogramas.

Tabla 3.1 Rf de los compuestos identificados en los cromatogramas. [3] Extractos Rf c. Cafeico Rf c. clorognico Alcohlico 0.96 0.54* Hidroalcohlico 0.95 0.54* Hidrolizado sin calor 0.95* 0.53 0.90* 0.76 0.42

0.84 0.82 Rf Muestra 0.71 0.65 0.59* 0.52* * Indica que el Rf de la muestra corresponde al del estndar.

Figura 3.2 Cromatograma HPLC del extracto alcohlico. [3]

3.5. Fenoles totales La tabla 3.2 indica los valores obtenidos de la concentracin de fenoles totales en equivalentes de quercetina (EQT) como mg EQT/100g de brcteas frescas.
Tabla 3.2 Concentracin de fenoles totales de los extractos de brcteas de alcachofa. [3] Extractos Alcohlico Hidroalcohlico Hidrlisis con calor Hidrlisis sin calor mg EQT/100g brcteas frescas 0.153 (0.004) 0.160 (0.004) 0.001 (0.001) 0.142 (0.004)

3.6. Actividad antioxidante hidroalcohlico redujeron la concentracin de radical DPPH en Los dos extractos, alcohlico e hidroalcohlico, 91.46% y 91.28%, 28%, respectivamente, esto indica la capacidad que tienen de capturar radicales libres del medio en el que se apliquen. Por otro lado, el hidrolizado sin calor, , aunque presenta

una concentracin importante de e fenoles totales no tiene la capacidad de capturar radicales libres en un porcentaje representativo. representativo. Esto hace suponer que el tratamiento con cido clorhdrico (HCl) no es el adecuado para elaborar un extracto con propiedades antioxidantes y, que esta actividad no est completa ni directamente relacionada con el contenido de compuestos fenlicos. Del el anlisis estadstico se determin determin que existe correlacin media entre la concentracin de fenoles totales y la capacidad de reducir la concentracin del radical libre DPPH, esto significa que el anlisis solo puede explicar el 50% de correlacin entre las variables. La interaccin con otras s molculas y las condiciones del medio tambin influyen en la capacidad capturar radicales libres. El valor del coeficiente de correlacin de Pearson negativo indica que mientras mayor sea la concentracin de fenoles totales menor ser la concentracin final final del radical libre DPPH.

Figura 3.5 Curvas de reduccin de la Abs517m de la solucin 0.1mM DPPH. [3]

3.7. Actividad antibacteriana Los resultados de esta prueba indican que el extracto alcohlico como el hidroalcohlico poseen actividad antibacteriana frente a S. aureus. y Salmonella spp., siempre que estn presentes en una concentracin igual o mayor al 50%.

Figura 3. 6 Halos de inhibicin formados por el extracto alcohlico en un cultivo de S. aureus. [3]

4. DISCUSIN La caracterizacin determin la presencia de compuestos fenlicos en los extractos realizados a partir de brcteas de alcachofa, confirmando que estos metabolitos no estn presentes solamente en las hojas. La cromatografa en capa fina y HPLC confirm la presencia del cido clorognico y cido cafeico en la composicin de los extractos alcohlico e hidroalcohlico de brcteas de alcachofa. Todo esto concuerda con los resultados de los estudios de [7] y [8]. Los extractos alcohlico e hidroalcohlico presentaron actividad antioxidante al capturar radicales libres del DPPH en medio lquido, confirmando la actividad antioxidante estudiada por [7] y [8]. La evaluacin de actividad antibacteriana confirma que los compuestos fenlicos presentes en los extractos alcohlico e hidroalcohlico tienen efecto sobre Salmonella spp. y Staphylococcus aureus, bacterias pertenecientes al grupo de microorganismos afectados por estos compuestos segn la descripcin de los autores de [1]. 5. CONCLUSIONES Las brcteas de alcachofa contienen compuestos fenlicos como fenilpropanoides, taninos catquicos, flavonoides y cumarinas adems saponinas, carotenoides, azcares reductores y esteroles. Las caracterizaciones cualitativa (cloruro frrico y cromatografa en capa fina) y cuantitativa (Folin-Ciocalteu y HPLC) demostraron que los extractos alcohlico e hidroalcohlico y el hidrolizado sin calor contienen compuestos fenlicos en su composicin. El mayor contenido de fenoles totales (mgEQT/100g brcteas frescas) lo contiene el extracto hidroalcohlico 0.160(0.004), seguido del alcohlico 0.153(0.004), del hidrolizado sin calor 0.142(0.004) y, el hidrolizado con calor 0.001(0.001). El extracto hidroalcohlico contiene mayor concentracin de fenoles totales porque al ser acuoso posee mayor capacidad de extraccin de compuestos polares como son los compuestos fenlicos. La cromatografa en capa fina de los extractos, hidroalcohlico y alcohlico revel que estos contienen cido clorognico y, en el caso del hidrolizado sin calor, cido cafeico. La cromatografa HPLC determin que los extractos alcohlico e hidroalcohlico contienen cido clorognico en 82.8560 y 40.0613 mg/L respectivamente, mas no cido cafeico o quercetina. El hidrolizado sin calor no fue analizado mediante HPLC porque no present actividad antioxidante. Los extractos alcohlico e hidroalcohlico presentaron actividad captora de radicales libres frente al DPPH, reducindolo 91.46% y 91.28% respectivamente. La correlacin media entre la concentracin de fenoles totales y la capacidad de reducir la concentracin del radical libre indica que mientras mayor sea la concentracin de fenoles, menor ser la concentracin final del radical libre en el medio. Esta actividad tambin depende de la interaccin de los compuestos fenlicos con otras molculas y de las condiciones del medio. El tratamiento de las brcteas de alcachofa con cido clorhdrico no es adecuado para elaborar extractos de compuestos fenlicos con actividad antioxidante porque es un cido muy fuerte que junto con el calor destruye a los compuestos fenlicos completamente y no solo el enlace con los azcares que forman las agliconas flavonoides. Por esta razn el hidrolizado sin calor pudo extraer solamente cido cafeico.

Los extractos alcohlico e hidroalcohlico poseen actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus y Salmonella spp. Basado en los resultados, es posible afirmar que las brcteas de alcachofa son un valioso recurso para obtener principios activos tiles como antioxidantes y antibacterianos. REFERENCIAS
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