Estructura y Funcin de Biomolculas

Clase 3

Tcnicas para el estudio estructural de protenas 2 Fluorescencia 1

JJC

Qu nos interesa saber de una protena?

TERCIARIA Baja resolucin (~nm) microscopa electrnica (EM) microscopa fuerza atmica (AFM) difraccin de rayos X RMN Dicrosmo circular (CD) Infrarojo (IR) Dispersin de luz (LS)

Estructura

Alta resolucin (~) SECUNDARIA CUATERNARIA

Dinmica (flexibilidad)

(rayos X, B factors) RMN tcnicas pticas (CD, fluorescencia, etc)

Estabilidad

CD Fluorescencia Termodinmica: Kb Cintica: kon, koff

Interaccin con ligandos

Cmo interacciona la radiacin electromagntica con la materia? En nuestro caso una protena.
Dispersin h.ex
SLS (esttica) DSL (dinmica) Difraccin de Rayos X Dispersin Raman

Radiacin incidente h.ex

Absorcin h.ex

Absorbancia UV-VIS-IR Actividad ptica (CD, ORD) RMN EPR Turbidimetra

Luminiscencia Fluorescencia Fosforescencia h.em

LUMINISCENCIA: CUALQUIER FENMENO DE EMISIN DE LUZ a nosotros nos interesan los procesos originados por absorcin de luz: FLUORESCENCIA FOSFORESCENCIA Conceptualmente es el mismo fenmeno, la diferencia es el estado de partida del electrn.
Tambin podemos tener quimioluminiscencia, termoluminiscencia, radioluminiscencia, triboluminiscencia, sonoluminiscencia, electroluminiscencia.

QUE LE OCURRE A UNA MOLECULA CUANDO ABSORBE UN FOTON ? TRANSICIONES ENTRE ESTADOS ELECTRONICOS (quienes a su vez poseen subestados vibracionales y rotacionales) :

S2

S1 hA S0

Y DESPUES QUE PASA CON LA MOLECULA EXCITADA ? SE DESEXCITA (como todo el la vida), BASICAMENTE SIGUENDO DOS CAMINOS POSIBLES:

No radiativamente (el caso ms general) Radiativamente: fluorescencia o fosforescencia

DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)

relajacin vibracional

S2

conversin interna IC relajacin vibracional cruce intersistemas ISC

S1 hA S0

T1
kNR IC

hF
fluorescencia

kNR ISC

hP

fosforescencia

LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS: ABSORCION: ~ 10-15 seg CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transicin prohibida por simetra) RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg Los pasos propiamente dichos de absorcin y de emisin son extremadamente rpidos, tanto que los ncleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon). La absorcin slo da informacin del entorno inmediato a la molcula que absorbe. La relajacin vibracional por lo general es mucho ms rpida que la fluorescencia, entonces la molcula se relaja completamente y (en general) slo vemos la emisin desde el estado S1. La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee informacin de un entorno ms amplio que el de absorcin.

DESEXCITACION

S1

relajacin del solvente (10-12 seg)

RET

kF hF
kNR

Quenching

kT= (1/0)(R0/r)6 A1

hA S0

kQ [Q] Q*

A0

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA: Q = # fotones emitidos / # fotones absorbidos 0 < Q < 1 en trminos de las constantes cinticas de cada proceso: Q = kF / (kF + kNR) donde kNR son todos los procesos de decaimiento no radiativos TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluorforo pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier va) = 1 / (kF + kNR) TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si slo volviera por fluorescencia n = 1 / kF se puede calcular a partir de y Q: n = / Q

Ley de Vavilov: Q no depende de

If = Iabs . Q = I0 ( 1 - 10- c l ) Q
Entonces, al aumentar la intensidad de la lampara I0 Q o aumenta la fluorescencia.
(pizarron)

En general, cuanto mayor sea n tanto menor ser Q. Esto se debe a que al pasar ms tiempo en el estado excitado hay ms chance de volver por un proceso no radiativo. Por ejemplo en fosforescencia no es raro ver Q de 10-6 La transicin T1 S0 involucra un cambio de spin (S 0) y est prohibida por simetra. Prohibida no significa que nunca va a ocurrir, sino que la probabilidad de que ocurra es muy baja. Como pasa mucho tiempo en el T1, la mayor parte se quenchea en el estado T1 y se desexcita noradiativamente.

ESPECTROFLUOROMETRO:es una especie de espectrofotmetro cheto SLIT de excitacin

LAMPARA

CELDA F

Monocromador de excitacin

POLARIZADOR POLARIZADOR

Qu diferencias notan respecto a un espectrofotmetro? Por qu el detector est a 90 de la lmpara?

SLIT de emisin Monocromador de emisin

FOTOTUBO

Al tener dos monocromadores se pueden hacer dos tipo de espectro: ESPECTRO DE EXCITACION: se fija el monocromador de emisin (emconstante) y se barre el de excitacin (exvariable). ESPECTRO DE EMISION: se fija el monocromador de excitacin (exconstante) y se barre el de emisin (emvariable).

ex em
FLUORESCENCIA o ABSORBANCIA

OBSERVACIONES INTERESANTES: el espectro de excitacin en general tiene la misma forma que el espectro de absorbancia (probabilidad de transicin). Esto se cumple para la regin de altas ex, donde se da la transicin S0 S1. la forma del espectro de emisin (por lo comn) es independiente de ex, lo que cambia es la intensidad (por conversin interna se ve slo la emisin desde S1)

FLUORESCENCIA

ex

ex

MAS OBSERVACIONES: MIRROR RULE el espectro de emisin es la imagen especular del espectro de excitacin, porque los estados vibracionales de S0 y el S1 son similares y por ende la probabilidad de ida y de vuelta tambin. Dicha probabilidad esta dada por el grado de superposicion de las funciones de onda de los estados de partida y llegada del electrn y se la calcula con el momento dipolar de transicin: mn = *n m d = -erj es el momento dipolar de la molcula

S2

S1
00 00

S0

Y SIGUEN LAS OBSERVACIONES: CORRIMIENTO DE STOKES la transicin 0-0 en la emisin aparece corrida hacia el rojo debido al relajamiento de los ncleos en el estado excitado Al aumentar la polaridad se desnaturalizacin de protenas. mueve al rojo. Por ejemplo en la

Este efecto es mayor cuanto mayor sea el momento dipolar de fluorforo. Se debe a que el estado excitado tiene un momento dipolar mayor que el estado basal, y al aumentar la polaridad del solvente se estabiliza ms (lo vamos a ver en otra clase).

CH3CN / etilenglicol / EtOH 30% / H2O

Algunos espectros de fluorescencia no siguen la regla de la imagen especular: por cambios de geometra:

p-terfenilo en ciclohexano: indica un ordenamiento distinto de los nucleos en S1 respecto de S0. En este caso los anillos se hacen ms coplanares y el espectro de emisin presenta una mayor estructura vibracional que el espectro de absorcin

 por reaccin del estado excitado:

imagen especular de la absorcin antraceno

exciplejo antraceno* - dietilanilina

Se forma un complejo de transferencia de carga entre el estado excitado del antraceno y la dietilanilina (exciplejo). El complejo emite a una longitud de onda diferente. Es un efecto comn entre hidrocarburos aromtico polinucleares y aminas.

por formacin de complejos consigo mismo (excmero): pireno en EtOH

2 mM pireno, purgado con Ar 2 mM pireno 0.5 mM pireno, purgado con Ar 0.5 mM pireno

Por qu el espectro del excmero es ms sensible al quencheo por O2? el del excmero es mayor que el del monmero y por lo tanto la fluorescencia es ms sensible a la presencia de un quencher (O2)

por cambios del estado de protonacin del estado excitado: acridina: S0: pKa = 5.45 S1: pka = 10.7 entonces dependiendo del pH puede unir un protn en el estado excitado, y cambia el espectro de emisin

algo similar para para la TYR: S0: pKa = 11 S1: pKa = 4 el estado excitado puede desprotonarse y se ve la emisin del tirosinato (similar al TRP)

CUAL ES EL LIMITE DE DETECCION DE FLUORESCENCIA? dependiendo de las caractersticas del fluorforo (, , Q) se puede medir de M hasta nM o menos. para aumentar la sensibilidad se puede: -aumentar la ganancia del fototubo (hasta un lmite dado por el ruido) -agrandar los slit de emisin y de excitacin (para que llegue ms luz a la muestra y colectar ms luz emitida). Hay que tener cuidado con la fotlisis! (sobre todo en experimentos de cintica, aparece un componente lineal) la fluorescencia es varios rdenes ms sensible que la absorbancia debido a que se mide sobre un fondo que (idealmente) es cero (ojo, depende mucho de los monocromadores!) Por ejemplo: un fluorforo 1 nM con =1000 dara ABS = 0.000001, o sea que habra que distinguir una diferencia de 0.0001 % de luz IMPOSIBLE!

Puedo subir la concentracin del fluorforo indefinidamente? Hasta donde es lineal la respuesta del equipo?

Se ve algo as:

Efecto de filtro interno:

[F]

cuando la densidad ptica de la muestra en EX o EM supera 0.05-0.1 comenzamos a tener problemas. En estos casos hay que medir la OD en ambas y corregir la F medida por: Fcorr = Fmed antilog((ODEM+ODEX)/2) (imprescindible cuando se quiere ver quenching, sino puede ser un falso positivo) Alternativamente se emplea iluminacin frontal, y se ve la emisin de las primeras capas:

LAS CUATRO TECNICAS FUNDAMENTALES: 1) ESPECTRO DE EMISIN:cambios en el entorno del fluorforo 2) QUENCHING: accesibilidad del fluorforo 3) RET (O FRET): cercana entre dos molculas 4) ANISOTROPIA: difusin rotacional pueden ser en estado estacionario o resueltas en el tiempo (TR). Por lejos es ms simple el primer caso, para TR hace falta un equipo 5-10 veces ms caro y la dificultad terica es proporcional al costo del equipo.

Aplicando estas tcnicas con la sonda adecuada se puede: seguir cambios conformacionales de una protena (1,2,3,4) medir interacciones (prot-prot, prot-DNA, ligando-protena, etc) (1,2,3,4) determinar viscosidad de membranas (4, 1 (por FRAP), 3) medir constantes de difusion rotacional (4) estudiar difusin a travs de membranas (1,2,3,4) etc, etc

TODO CON EL MISMO APARATO La clave est en el fluorforo !

QUENCHING: retorno no radiativo al estado basal por contacto con una segunda molcula (metales pesados, acrilamida, I-, Cl-, O2, etc). Depende de la accesibilidad del fluorforo al quencher.

Q h

S1 kF hA S0
kQ [Q] Q

hF
Q*

se mide el espectro de fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula: F0/F (F0: fluorescencia en ausencia de quencher)

Grfico de Stern-Volmer F0/F = 1 + kQ . [Q] F0/F

1 kQ kQ depende de: tipo de fluorforo y quencher accesibilidad del fluorforo (viscosidad) (temperatura)

[Q]

cambio conformacional de una protena

Q

Q*

F0/F
Q

1
Q*

[Q]

difusin a travs de una membrana

Q tiempo

RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET):

EX D EM D A EX

EM A

EX D

*
EM A

La eficiencia de la transferencia depende de: la distancia entre D y A el grado de solapamiento entre el espectro de emisin de D y el de absorcin de A la orientacin relativa entre D y A el tiempo de vida de D* La constante de velocidad del proceso es:

kT (r) = (1 / D) (R0 / r)6

R0: distancia de Fster (depende del par D-A) r: distancia D-A

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Para que sirve?

para medir distancia inter o intramoleculares. Con esa informacion se puede: -estudiar cambios conformacionales -medir asociaciones - colocalizar in vivo etc,etc se puede ver la disminucin de la fluorescencia de D o el aumento de la emisin de A. En general se usa la primera forma.
EX D EM A

ANISOTROPIA
Qu ocurre cuando se excita con luz linearmente polarizada? Se excitan preferencialmente aquellas molculas cuyo momento de transicin es paralelo al plano de polarizacin

y la emisin a su vez sale polarizada

Entonces, si ponemos un polarizador a la salida, a medida que lo giremos F va a cambiar:

I I
Si el fluorforo no rota la I va a ser (en una primera aproximacin) cero y la I va a tener algn valor. Si calculamos: anisotropa: r = (I - I) / (I + 2 I) el valor va a depender de cuanto haya rotado el fluorforo entre la absorcin y la emisin

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r = (I - I) / (I + 2 I)
Para un fluorforo fijo: I=0 => r =1 (en realidad el mximo posible es 0.4)

Para un fluorforo muy mvil: I = I => r = 0

Para qu sirve medir r?

medir microviscosidades (por ejemplo de una membrana) determinar bindings (ligando-protena, protena- protena, etc) seguir cambios conformacionales

En las prximas clases vemos a ver en detalle cada una de estas tcnicas.

Ahora vamos a ver algunas cosas del espetrofluormetro y los espectros:

MUCHAS VECES EL ESPECTRO APARECE DEFORMADO:

ej: TRP
FLUORESCENCIA (UA)

terico Medido (tcnico)

300 340 380

(nm) POR QUE?

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PORQUE LA EFICIENCIA DE LOS COMPONENTES DEPENDE DE LA LONGITUD DE ONDA: - la respuesta del fototubo - la emisin de la lmpara - la transmisin de las redes de difraccin o prismas

RESPUESTA ESPECTRAL DE UNA LAMPARA DE Xe DE ALTA PRESION

TRANSMITANCIA DE LA VENTANA DE UN PMT

Respuesta espectral de los fotoctodos

Eficiencia de un red de difraccin: depende de y de la polarizacin de la luz!

Por qu no se ven estos efectos en la absorbancia? Si los componentes son prcticamente los mismos?

UN ESPECTROFLUORIMETRO IDEAL:
LAMPARA
INTENSIDAD EFICIENCIA DE LUZ

MONOCROMADOR
EFICIENCIA

PTM

- la fuente de luz debe dar una salida constante de fotones en todas las - los monocromadores debe transmitir fotones a todas las con igual eficiencia, independiente del grado de polarizacin de la luz - el detector debe detectar fotones a todas las con igual eficiencia

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COMO ESTO NO OCURRE SE DEBE CORREGIR LOS ESPECTROS. PARA ELLO ES NECESARIO CALIBRAR EL APARATO PARA OBTENER LOS FACTORES DE CORRECCION. Correccin de la lmpara: -se usa un quantum counter: soluciones fluorescentes con Q=1 dentro de un rango muy amplio de longitudes de onda. Se usan concentradas, de forma de absorber toda la luz (deteccin frontal) Correccin del espectro de emisin: - se usan sustancias de espectros conocidos como estandar. -o se puede usar una lmpara calibrada (siguen la emisin de un cuerpo negro)

CUANDO SE USAN SOLUCIONES DILUIDAS MUY COMUNMENTE SE OBSERVA:

POR QUE?

UNA IMPUREZA?
BUFFER

Scattering inelastico del solvente (RAMAN), para agua ocurre 3600 cm-1 hacia el rojo. La diferencia de energa es constante, no en . Por ejemplo si excito a 280 nm el pico Raman se ve a 311 nm. la diferencia de energa depende del solvente

...y ms general, se puede ver: fluorescencia de una protena

311 nm 280 nm 330 nm

POR QUE? EX : 280 nm

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CUANDO SE HACEN BARRIDOS MUY ALEJADOS DE EX SE PUEDE VER ALGO ASI: EX = 280 nm
560 nm

F POR QUE?

la red de difraccin presenta transmisin de segundo orden:

300 nm 1er orden 600 nm 1er orden 300 nm 2er orden

CENTRO DE MASA DE UN ESPECTRO: muchas veces cuando se est siguiendo un cambio espectral (por ejemplo en una desnaturalizacin de protena) es vez de seguir el cambio a una fija conviene ver como el espectro se corre como un todo. Esto baja mucho el ruido.

Para ello se calcula el centro de masa del espectro: CM () = F() / F() = (1/ ) F() / F( )

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