ARBEZ EVANGELISTA CRISTIAN ULISES ELECTROFORESIS DE AMINOACIDOS OBJETIVO:

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Llevar a cabo la determinacin cualitativa de aminocidos conocidos y desconocidos. INTRODUCCIN: Las protenas son molculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina) y del grado de ionizacin de stos al pH considerado. En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migracin, ya que el tamao de las protenas es muy pequeo en comparacin con el tamao de poro del soporte), la separacin depende de la densidad de carga de las molculas y, as, cuanto mayor sea la densidad, mayor ser la velocidad de migracin en un campo elctrico hacia el polo que determine su carga neta. La primera etapa del proceso es la aplicacin de la muestra. En papel o acetato de celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el anlisis de varias muestras simultneamente en pequeas cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de una sola muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en el tampn de electroforesis, del que est impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta, y se deposita en una pequea zona, lo ms estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cul va a ser la direccin de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la direccin del campo elctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que all el campo elctrico no es homogneo y se distorsionan las bandas segn avanzan. El volumen que se aplica suele ser inferior a 10 L y si se necesitan mayores volmenes porque la muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la misma zona, dejando secar entre aplicacin y aplicacin. Es necesario humedecer el soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el soporte de tampn de electroforesis por ambos extremos y de forma simultnea para que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicacin de la muestra. En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de dimetro adecuado y se elimina esa porcin por succin. La perforacin puede ser cilndrica o rectangular, dependiendo del nmero y cantidad de muestra a analizar y la muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el tampn est embebido en el soporte (agarosa). En todos los casos, la zona de aplicacin debe ser lo ms estrecha posible, para aumentar la resolucin y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas.

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La electroforesis termina cuando se haya producido la mxima separacin de los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los lmites del soporte. Para evitar que se sobrepasen estos lmites, se utilizan los marcadores electroforticos que son molculas coloreadas con una movilidad electrofortica superior a cualquier componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tamao). Entre los marcadores ms utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol. Una vez acabada la electroforesis, se procede a la etapa de tincin. El soporte se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disolucin de un colorante que se une de manera especfica a los componentes de la muestra y que precipita a los componentes separados en la posicin en la que se encuentren. Las disoluciones ms utilizadas en el caso de protenas son el Negro Amido al 1% (p/v) en cido actico y el Azul de Coomasie al 0.1% (p/v) en metanol/agua/cido actico (9:9:2 v/v/v). Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, ha de utilizarse un papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la electroforesis analtica (85-100 gr/cm2; 0.15mm de espesor), lo que permite la aplicacin de una mayor cantidad de muestra (50-100L)

Reactivos Lisina Isoleucina Glicina Muestra problema 1 Muestra problema 2 Equipo Pipetas Papel filtro estufa o parrila Procedimiento Debido a que no se contaba con el equipo de electroforesis se procedio una identificacin a la flama:

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Colocando las muestras a corres como en un cromatografa con piridina se seca y se corre con el revelador la ninhidrina y se calienta en la estufa y parrilla y se identifica comparando con los controles que son aminocidos conocidos. OBSERVACIONES:

colocacin de aminocidos

corrimiento de la muestra con piridina

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revelacin con ninhidrina

Revelado

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Muestra 1:___________________________________________________________________________________ Muestra 2:__________________________________________________________________________________