INSTITUTO TECNOLGICO DE MRIDA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA ENZIMTICA Y MICROBIANA MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

Director Dr. GERARDO RIVERA MU OZ

Pre!"r"#o !or$ Si%&i" A'#re" More'o Me'#iet"

M(ri#") Y*c"t+') M(,ico. -../

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
El personal de los laboratorios est expuesto a una serie de riesgos ocupacionales por agentes fsicos, qumicos y biolgicos, los cuales pueden originar accidentes generalmente prevenibles, si se conocen y aplican las medidas de BIOSE !"I#$#% Estas medidas preventivas estn destinadas a mantener la vigilancia, para proteger la salud y seguridad del personal% En el laboratorio de Biotecnologa En&imtica y 'icrobiana del I(', se recomienda) El mane*o adecuado de material de vidrio y equipos +centrfuga, incubadoras, planc,as de calentamiento, etc-% El uso de elementos protectores +bata, guantes, tapabocas, gafas, etc-% Evitar comer y. o maquillarse en el rea de traba*o% Evitar guardar alimentos en los refrigeradores destinados para reactivos o cepas% /acer una adecuada disposicin de los desec,os biolgicos y reactivos% 'antener limpia y despe*ada el rea de traba*o% $visar en caso de cualquier emergencia%

PROTOCOLO PARA MANE0O DE MATERIAL Y DISPOSICIN DE DESEC1OS

I. LAVADO DE MATERIAL

Material que se ha utilizado para la siembra de microorganismos, preparacin de inculos o que est contaminado: #e*ar 0, en solucin de ,ipoclorito al 1%2345% #escartar esta solucin y lavar con abundante agua% Otro material #escartar los residuos de reactivos y de*ar correr abundante agua% Sumergir en detergente, en*uagar con agua corriente varias veces y lavar con agua destilada o desminerali&ada%

II.

SECADO

Secar el material de vidrio con aire, o en la estufa a (6 inferior de 7168 si se requiere% Secar el material de plstico a temperatura ambiente%

III.

ESTERILIZACION

Envolver el material para esterili&ar con papel 9raft% 8olocar el material en el autoclave% Esterili&ar 42 a 01 min% $ 40468 y 42 :b de presin%

IV.

DISPOSICIN DE DESECHOS

Envolver con papel peridico las ca*as de petri que ,an sido previamente esterili&adas antes de tirar a la basura% Envolver en papel peridico el material de vidrio roto antes de tirar a la basura% En caso de derrames de alg;n material biolgico +inculos, etc-, inactivar con ,ipoclorito de sodio unos 41 minutos antes de lavar con abundante agua%

ELABORACIN DE CURVAS ESTNDAR

I. CURVA ESTNDAR DE N-ACETILGLUCOSAMINA (NAcGlu)

REACTIVOS 4- Solucin de N3acetilglucosamina en agua a concentraciones entre 1 y 4111 g .ml 0- "eactivo de #<S PROCEDIMIENTO Se preparan 41 tubos de ensayo como se indica en las columnas y se agregan >%1 ml de reactivo #<S a cada tubo, se lleva a ebullicin en ba?o de mara por 2 minutos% Se de*a enfriar el sistema a temperatura ambiente y se completa a 01 ml con agua destilada% Se lee la densidad ptica a 221 nm% :a curva final resulta del promedio de mnimo > curvas%

Tubo 1 4 0 > = 2 @ B 7 A 41

NAGlu g !l 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111

Soluc"#$ %&oc' (!l) 1%1 1%4 1%0 1%> 1%= 1%2 1%@ 1%B 1%7 1%A 4%1

Agu( (!l) 4%2 4%= 4%> 4%0 4%4 4%1 1%A 1%7 1%B 1%@ 1%2

PREPARACIN DEL REACTIVO DNS

REACTIVOS /idrxido de sodio 4%= 5 Ccido >,23dinitrosaliclico 1%B2 5 (artrato doble de sodio y potasio 04%@5 Denol 1%2= 5 'etabisulfito de sodio 1%2A 5 PREPARACIN Se disuelven en estricto orden todos los componentes en la mitad del agua destilada, permitiendo la total disolucin de cada componente antes de a?adir el siguiente% Se lleva a volumen final

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOC) DE NAcGlu 4g E 4 x 41@ g 4 x 413> g F4111 g 4 x 413> g E 4 ml g a pesar F volumen a preparar

E*+!,loNAcGlu 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111 D.O. 1 1,11=0 1,1>4@ 1,1@7B 1,412> 1,4=>0 1,47A4 1,0>1A 1,0@>7 1,0A04 1,>>1@

CURVA ESTNDAR DE NAcGlu

1,= 1,>2 1,> D.O. (990 $!) 1,02 1,0 1,42 1,4 1,12 1 31,12 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111 4411

. / 0100023 - 010452 R6 / 015578

NAcGlu g !l

II.

CURVA ESTNDAR DE TIROSINA

REACTIVOS Tubo 1 4 0 > = 2 @ B 7 A 41 T":o%;$( <g !l 1 41 01 >1 =1 21 @1 B1 71 A1 411 Soluc"#$ %&oc' (!l) 1%1 1%1K 1%4 1%> 1%0 1%@ 1%> 1%A 1%= 4%0 1%2 4%2 1%@ 4%7 1%B 0%4 1%7 0%= 1%A 0%B 4%1 >%1 Agu( (!l) 4%1 >%1 1%A 0%B 1%7 0%= 1%B 0%4 1%@ 4%7 1%2 4%2 1%= 4%0 1%> 1%A 1%0 1%@ 1%4 1%> 1%1 1%1

4% Solucin de tirosina de 411 Gg.ml% 0% "eactivos de :oHry) R+(c&"=o A- Sulfato de 8u penta,idratado al 45 en agua% R+(c&"=o >- (artrato de <a y I al 05% R+(c&"=o C- 8arbonato de <a al 05 en <aO/ 1%4'% R+(c&"=o D- 4 vol $ J 4 vol de B% R+(c&"=o E- 4 vol de # J 21 vol de 8% R+(c&"=o ?+ @ol"$-C"oc(l&+u diluido 4)4 con agua%

PROCEDIMIENTO $ cada tubo preparado se a?aden 2 ml de reactivo E y se agita% Se de*a reposar durante 41 minutos, se agregan 1%2 ml de reactivo Dolin 4)4 en agua y se agita% Se de*a reposar durante >1 minutos y se lee la absorbancia a 2A1 nm% :a curva final resulta del promedio de mnimo tres curvas% K Lol;menes utili&ados para la curva estndar a 071 nm%

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOC) DE TIROSINA 4g E 4 x 41@ g 4 x 413= g F411 g E*+!,loT":o%"$( 1 41 01 >1 =1 21 @1 B1 71 A1 411 D.O. 1,10=@ 1,44>2 1,0444 1,0AB1 1,>701 1,=701 1,2721 1,@B71 1,BB11 1,77@1 1,A2A1 D.O. D.O. M+?"( 1,1>42 1,1074 1,44>2 1,44>2 1,04=B 1,040A 1,>141 1,0AA1 1,>A71 1,>A11 1,=701 1,=701 1,2721 1,2721 1,@@71 1,@B>1 1,BB11 1,BB11 1,77@1 1,77@1 1,A2A1 1,A2A1 D.O. D"A 1,1111 1,1722 1,47=A 1,0B41 1,>@01 1,=2=1 1,22B1 1,@=21 1,B=01 1,7271 1,A>41

4 x 413= g E 4 ml g a pesar F volumen a preparar

CURVA ESTNDAR DE TIROSINA

4,4211

. / 0100523 - 01008B
1,A211 D.O. 950 $! 1,B211 1,2211 1,>211 1,4211 31,1211 1 41 01 >1 =1 21 @1 B1 71 A1 411 441

R / 015552

T":o%"$( g !L

P:o&+;$( 1 41 01 >1 =1 21 @1 B1 71 A1 411

D.O.(680 $!) 1,114A 1,17=1 1,4277 1,0=00 1,>4A7 1,>AB> 1,=BB7 1,22B0 1,@>=7 1,B4>1 1,B772

D.O. D.O. M+?"( 1,1144 1,1142 1,1B7@ 1,174> 1,427= 1,427@ 1,0>B@ 1,0>AA 1,>427 1,>4B7 1,>A00 1,>A=7 1,=B20 1,=B@2 1,22B7 1,22B2 1,@>04 1,@>>2 1,B4B= 1,B420 1,BA>= 1,BA41

D.O. D"A 1,1111 1,1BA7 1,42B4 1,0>7= 1,>4@> 1,>A>> 1,=B21 1,22@1 1,@>01 1,B4>B 1,B7A2

Cu:=( E%&C$?(: ?+ T":o%"$( ( 680 $!

1,A111 1,7111 1,B111 680$! D.O. 1,@111 1,2111 1,=111 1,>111 1,0111 1,4111 1,1111 1 41 01 >1 =1 21 @1 B1 71 A1 411 441

. / 0100753 D 4E-09 R /B
6

T":o%"$( g !L

@UNDAMENTO TERICO DEL METODO DE LOFRG

Este mMtodo consta de dos etapas) en la primera, los iones 8u 0J, en medio alcalino, se unen a las protenas formando comple*os con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos% Estos comple*os 8u0J3protena tienen un color a&ul claro% $dems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponiMndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin% El 8u0J se mantiene en solucin alcalina en forma de su comple*o con tartrato% En la segunda etapa, el cobre act;a como catali&ador de la reduccin, tambiMn en medio bsico, del reactivo de Dolin38iocalteau, por parte de los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas% El principal constituyente del reactivo de Dolin38iocalteau es el cido fosfomolibdot;ngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los fenoles da lugar a un comple*o de color a&ul intenso directamente proporcional a la concentracin de las protenas%

III.

CURVA ESTNDAR DE CIDO >UTHRICO

PREPARACIN DE LA EMULSIN DE TRI>UTIRINA.

REACTIVOS Ccido succnico /idrxido de sodio $lco,ol polivinlico NL$ (ributirina

PREPARACIN Se disuelven 0%1 g de NL$ en 21 ml de buffer de succinatos 1%10' de p/ @%1 y se afora a 411 ml con el mismo buffer% Nara facilitar que el NL$ se disuelva se debe calentar el agua% Nara preparar la emulsin se me&clan 0%= ml de tributirina con 411 ml de la solucin de NL$ y se emulsifica en licuadora de alta velocidad%

REACTIVOS 4- Buffer de succinatos 1%10' de p/

@%1 0- $cido butrico

PROCEDIMIENTO Se titulan 40%2 ml del amortiguador de succinatos 1%10 ', p/ @%1 adicionando alcuotas de 21 l de una solucin al 2 5 v.v de cido butrico +equivalente a una concentracin de 2=%> moles de cido butrico por cada 411 l- ,asta completar 2=>%1 moles adicionadas al sistema%

E*+!,lo-

TITULACIN DE 690 !L DE >U@@ER 0.06 M ,H I.0 CON CIDO >UTHRICO ,H ?+l >uAA+: L ?+ c"?o >u&;:"co J M ?+ c"?o >u&;:"coK @,1> 1 1,11 2,A> 21 0B,42 2,7= 411 2=,>1 2,B@ 421 74,21 2,B1 011 417,@1 2,@= 021 4>2,71 2,27 >11 4@0,A1 2,2> >21 4A1,41 2,=B =11 04B,01 2,=0 =21 0==,=1 2,>B 211 0B4,21 2,>0 221 0A7,B1 2,07 @11 >02,71 2,0= @21 >20,A1 2,01 B11 >71,41 2,4B B21 =1B,>1 2,4= 711 =>=,=1 2,44 721 =@4,@1 2,17 A11 =77,B1 2,1@ A21 242,72 2,14 4111 2=>,11

CURVA ESTNDAR DE CIDO >UTHRICO

B11,11 @11,11 c"?o bu&;:"co MJ !LK 211,11 =11,11 >11,11 011,11 411,11 1,11 =,21

y O >=@,=0x 3 =>20,4x J 4>@22 0 " O 1,AA7A

=,B1

=,A1

2,41

2,>1 ,H

2,21

2,B1

2,A1

@,41

@,>1

IV.

CURVA ESTNDAR DE GLUCOSA

REACTIVOS Tubo 1 4 0 > = 2 @ B 7 A 41 Gluco%( g !l 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111 Soluc"#$ %&oc' (!l) 1%1 1%4 1%0 1%> 1%= 1%2 1%@ 1%B 1%7 1%A 4%1 Agu( (!l) 4%2 4%= 4%> 4%0 4%4 4%1 1%A 1%7 1%B 1%@ 1%2

4- Solucin de glucosa en agua a concentraciones entre 1 y 4111 g .ml 0- "eactivo de #<S PROCEDIMIENTO Se preparan 41 tubos de ensayo como se indica en las columnas y se agregan >%1 ml de reactivo #<S a cada tubo, se lleva a ebullicin en ba?o de mara por 2 minutos% Se de*a enfriar el sistema a temperatura ambiente y se completa a 01 ml con agua destilada% Se lee la densidad ptica a 221 nm% :a curva final resulta del promedio de mnimo > curvas%

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOC) DE GLUCOSA 4g E 4 x 41@ g 4 x 413> g F4111 g E*+!,loGluco%( 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111 D.O. 1 1,101 1,12B 1,1A= 1,402 1,4@@ 1,4A0 1,0>2 1,0B1 1,>1> 1,>>2 D.O. 1 1,14A 1,122 1,1A1 1,407 1,4@= 1,4A0 1,0>2 1,0@@ 1,07A 1,>=> D.O. M+?"( 1 1,101 1,12@ 1,1A0 1,40B 1,4@2 1,4A0 1,0>2 1,0@7 1,0A@ 1,>>A

4 x 413> g E 4 ml g a pesar F volumen a preparar

CURVA ESTNDAR DE GLUCOSA

1,= 1,>2 1,> D.O. 990 $! 1,02 1,0 1,42 1,4 1,12 1 31,12 1 411 011 >11 =11 211 @11 B11 711 A11 4111 4411

. / 0100043 - 01005I R6 / 015584

Gluco%( g !L

V.

CURVA ESTNDAR >OVINA

REACTIVOS

DE

AL>LMINA
Soluc"#$ %&oc' (!l) 1%1 1%1K 1%4 1%> 1%0 1%@ 1%> 1%A 1%= 4%0 1%2 4%2 1%@ 4%7 1%B 0%4 1%7 0%= 1%A 0%B 4%1 >%1

SERICA
Agu( (!l) 4%1 >%1 1%A 0%B 1%7 0%= 1%B 0%4 1%@ 4%7 1%2 4%2 1%= 4%0 1%> 1%A 1%0 1%@ 1%4 1%> 1%1 1%1

Tubo

4% Solucin de $SB de 211 Gg.ml% 0% "eactivos de :oHry) R+(c&"=o ASulfato de 8u penta,idratado al 45 en agua% R+(c&"=o >- (artrato de <a y I al 05% R+(c&"=o C- 8arbonato de <a al 05 en <aO/ 1%4'% R+(c&"=o D- 4 vol de $ J 4 vol B% R+(c&"=o E- 4 vol de # J 21 vol de 8% R+(c&"=o ?+ @ol"$-C"oc(l&+u diluido 4)4 con agua%

1 4 0 > = 2 @ B 7 A 41

P:o&+;$( <g !l 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211

PROCEDIMIENTO $ cada tubo preparado se a?aden 2 ml de reactivo E y se agita% Se de*a reposar durante 41 minutos, se agregan 1%2 ml de reactivo Dolin 4)4 en agua y se agita% Se de*a reposar durante >1 minutos y se lee la absorbancia a 2A1 nm% :a curva final resulta del promedio de mnimo tres curvas% K Lol;menes utili&ados para la curva estndar a 071 nm%

PREPARACIN DE LA SOLUCIN STOC) DE AS> G CASEHNA 4g E 4 x 41@ g 2 x 413= g F211 g E*+!,loP:o&+;$( 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211 D.O. 1,142 1,4=7 1,0@7 1,>@2 1,=B@ 1,2@0 1,@=4 1,B=@ 1,70> 1,A41 1,AA4 D.O. D.O. M+?"( 1,147 1,14B 1,4>@ 1,4=0 1,0@0 1,0@2 1,>B@ 1,>B4 1,=B@ 1,=B@ 1,2@4 1,2@0 1,@B2 1,@27 1,B=B 1,B=B 1,702 1,70= 1,A>4 1,A04 1,AB= 1,A7> D.O. D"A 1,111 1,40@ 1,0=A 1,>2= 1,=@1 1,2=2 1,@=0 1,B>1 1,717 1,A1= 1,A@@

2 x 413= g E 4 ml g a pesar F volumen a preparar

CURVA ESTNDAR DE AS>

4,011 4,111 D.O. 950 $! 1,711 1,@11 1,=11 1,011 1,111 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211 221 P:o&+;$( g !L . / 0100B53 D 010298 R6 / 015548

P:o&+;$( 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211

D.O. 680 $! 1,1111 1,10B0 1,1220 1,17>> 1,444= 1,4>A> 1,4@A1 1,4AA1 1,00AA 1,0@0> 1,0A17

D.O. (6) 1,1111 1,1020 1,12@1 1,170A 1,4441 1,4>7= 1,4@A> 1,4A7@ 1,007= 1,0@44 1,0A42

D.O. (4) PROMEDIO 1,1111 1,1111 1,102@ 1,10@1 1,12BB 1,12@> 1,170A 1,17>1 1,441A 1,4444 1,4>A@ 1,4>A4 1,4B4B 1,4B11 1,4A71 1,4A72 1,00@B 1,007> 1,0@41 1,0@4= 1,0A42 1,0A4>

Cu:=( E%&C$?(: ?+ A.S.> ( 680 $!

1,>211 1,>111 680 $! D.O. 1,0211 1,0111 1,4211 1,4111 1,1211 1,1111 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211 221

. / 01000I3 - 010042 R6 / 015552

P:o&+;$( !g !L

E*+!,lo cu:=( +%&C$?(: ?+ c(%+;$( ( 950 $!C(%+;$( 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211 D.O 1 1,1B40 1,4>>1 1,4A20 1,0=21 1,0A>B 1,>=7B 1,>7A2 1,==A2 1,=B0A 1,20B@ D.O 1 1,1B10 1,4=1B 1,4A41 1,0==> 1,0A>0 1,>2B4 1,=@>7 1,=7=B 1,2=1B 1,22>B D.O 1 1,1B=4 1,4=4A 1,01B0 1,0B11 1,0AA7 1,>B10 1,=4B4 1,=@B7 1,2>4@ 1,2=BA D.O M+?"( 1 1,1B47 1,4>72 1,4AB7 1,02>4 1,0A2@ 1,>27B 1,=0>2 1,=@B> 1,2424 1,2=>4

CURVA ESTNDAR DE CASEHNA

1,@ 1,2 D.O. (950 $!) 1,= 1,> 1,0 1,4 1 1 21 411 421 011 021 >11 >21 =11 =21 211 221 P:o&+;$( g ! l

. / 0100BB3 D 01066I R6 / 01552B

DETERMINACIN DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS Y PROTENA E2TRACELULAR

I.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD MUITINOLHTICA

:a actividad quitinoltica se determina por el mMtodo reportado en 4A@A por 'onreal y "eese% En un tubo de 47 x 4B2 mm se colocan 1%2 ml del sobrenadante libre de cMlulas +diludo cuando es necesario- y 4 ml de suspensin de quitina coloidal al 1%25 en buffer fosfatos de potasio 1%1= ' a p/ @%@ y se incuba por una ,ora a @168% (ranscurrida la ,ora se determina por el mMtodo de 'iller +4A2A-, la concentracin de a&;cares reductores) a los tubos muestra se les adiciona > ml de reactivo #<S +cido >,2 dinitrosaliclico-, para detener la reaccin en&imtica y luego se llevan todos los tubos a ebullicin en ba?o mara durante 2 min% Se de*a enfriar el sistema a temperatura ambiente y se completa el volumen a 01 ml con agua destilada% Se centrifuga 2 minutos a 0,111 rpm y se lee la densidad ptica del sobrenadante a 221 nm contra blanco de agua destilada% 8on el fin de diferenciar la cantidad de <$c lu presente en el sistema de ensayo de aquella producida por la accin de las quitinasas, para cada tubo muestra se prepara un &ubo &+%&"go de la siguiente manera) 4 ml de suspensin de quitina coloidal al 1%25 en buffer fosfatos de potasio 1%1= ' a p/ @%@, > ml del reactivo #<S y 1%2 ml del sobrenadante libre de cMlulas, luego se incuba 4 ,ora a @168 y se contin;a con el mMtodo de 'iller%

El bl($co ?+l +Nu",o consiste en el mismo sistema de ensayo pero reempla&ando los 1%2 ml de sobrenadante libre de cMlulas con 1%2 ml de agua destilada% Se procesa igual que el resto de los tubos y se resta el valor obtenido a los dems tubos% :as densidades pticas resultantes se convierten a concentraciones de N3 acetilglucosamina Pg.mlQ utili&ando la curva estndar de <$c lu% Nosteriormente las concentraciones de los tubos testigo se restan a las de los tubos muestra% !na U$"?(? ?+ Ac&"="?(? E$O"!C&"c( se define como la cantidad de en&ima requerida para producir 1%2 moles de N3acetilglucosamina.ml por minuto ba*o las condiciones de ensayo% No&(- 8ondiciones establecidas para la determinacin de actividad quitinoltica de la bacteria (E:3II3>B%

II.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD PROTEOLHTICA

:a actividad proteoltica se determina por el mMtodo modificado de Iunit& +4A=B-% Se colocan en un tubo de 4@ x 421 mm, 4 ml de sobrenadante diluido libre de cMlulas y 0 ml de solucin de casena al 0 5 en buffer de fosfatos 1%0 ' a p/ 7%1% Se incuba a =168 por >1 minutos y se detiene la reaccin mediante la adicin de = ml de cido tricloroacMtico al 41 5% Se centrifuga a 40,111 rpm, durante B minutos a =68 con el propsito de separar la protena no ,idroli&ada% En el sobrenadante se mide la cantidad de tirosina liberada por accin en&imtica, utili&ando el mMtodo de :oHry et al%, 4A24 o directamente midiendo la densidad ptica del sobrenadante a 071 nm% Nara diferenciar la cantidad de tirosina presente en el sistema de ensayo de aquella producida por la accin de las proteasas, para cada tubo muestra se prepara un &ubo &+%&"go de la siguiente manera) 4 ml de sobrenadante diluido libre de cMlulas, = ml de cido tricloroacMtico al 41 5, 0 ml de solucin de casena al 0 5 en buffer de fosfatos 1%0 ' a p/ 7, luego se incuba a =168 por >1 minutos y se contin;a con el mMtodo igual que para los tubos muestra% :os valores de densidad ptica resultantes se convierten a concentraciones de tirosina Pg.mlQ utili&ando la curva estndar de tirosina% :as concentraciones de los tubos testigo se restan a las de los tubos muestra% !na U$"?(? ?+ Ac&"="?(? E$O"!C&"c( se define como la cantidad de en&ima requerida para producir 4 mol de (irosina.ml por minuto ba*o las condiciones de ensayo%

III.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD LIPOLHTICA

:a actividad lipoltica se mide de acuerdo a la tMcnica de /offelman +4A72- modificada% Esta tMcnica consiste en medir el cambio de p/ generado en un sistema que contiene 40%7 ml de una emulsin de tributirina al 0%>=5 en buffer de succinatos 1%10' de p/ @%1 con NL$ al 0%1 5 +equivalente a B=%B7 m' de tributirina- y 4%1 ml de extracto en&imtico crudo% El sistema de ensayo debe ser incubado en un ba?o maria a >B8, durante 42 minutos y se toma la lectura de p/ inicial y p/ final% :a diferencia de los valores de p/ obtenidos es referida a la curva estndar de p/ contra concentracin de cido butrico% :os resultados se reportan como moles de cido butrico liberados por mililitro de extracto en&imtico crudo%

IV.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD CELULOLHTICA

En un tubo de 47 x 4B2 mm se coloca una tira de papel filtro R,atman <o%4 de 4 x @ cm +que equivale 21 mg de celulosa- se a?ade 4 ml de buffer citratos 1%1B2 ' de p/ =%7 y 1%2 ml del sobrenadante libre de cMlulas% Este sistema se incuba en ba?o mara a 216 8 durante @1 minutos% #espuMs de transcurrir este tiempo se adicionan >%1 ml de cido >32 dinitrosalicilico +#<S- y se llevara a ebullicin en ba?o mara por 2 minutos para desarrollar color entre el #<S y los a&;cares reductores liberados por la accin de la en&ima sobre el papel filtro% Nosteriormente se enfra el sistema a temperatura ambiente y se afora a 01 ml con agua destilada, la densidad ptica se lee a 221 nm% :os valores obtenidos se convierten a concentracin de glucosa utili&ando la curva estndar de glucosa%

V.

DETERMINACIN DE PROTEHNA EPTRACELULAR

Se colocan en un tubo de 4@ x 421 mm, 4 ml de sobrenadante diluido libre de cMlulas al que se le determina la protena extracelular mediante el mMtodo de :oHry et al, 4A24 o directamente midiendo la densidad ptica del sobrenadante a 071 nm, utili&ando la curva estndar de $lb;mina SMrica Bovina% :os valores de densidad ptica resultantes se convierten a concentraciones de protena Pg.mlQ utili&ando la curva estndar% 8on las concentraciones obtenidas de protena extracelular se calculan las actividades quitinoltica y proteoltica especficas seg;n la siguiente frmula) $ctividad especfica Pg.mlQ O +$ctividad volumMtrica. Nrotena extracelular- x 411%

PREPARACIN DE SUSTRATOS
I. PREPARACIN DE MUITINA SEGLN EL METODO DE No et al1 B585

Se recolectan los residuos slidos de camarn en la &ona de :erma, 8ampec,e% El posterior tratamiento de estos residuos incluye) secado al sol durante 2 das, reduccin del tama?o de partcula utili&ando un molino industrial y tami&ado +en tmden de tamices (ayler- para obtener la fraccin retenida en malla <o% 01, la cual se somete a los procesos de desminerali&acin, desproteini&acin, extraccin de pigmentos y decoloracin, seg;n el mMtodo reportado por <o et al, 4A7A%

RECOLECCI N DE RECOLECCI RECOLECCIN DE LOS LOS DESECHOS DESECHOS Secado al sol Secado al sol por por 2 2 das das "educcin "educcin del del tama?o tama?o de de partcula% partcula% HARINA HARINA DE DE CAMARON CAMARON Nartcula Nartcula retenida retenida en en malla malla <o% <o% 01 01 DESMINERALIZACION DESMINERALIZACION CON CON HCl HCl B.0 B.0 N N ( 6 ambiente, 4)42 p.v, >1S ( 6 ambiente, 4)42 p.v, >1S Diltracin Diltracin en en tela tela de de algodn algodn y y lavado lavado ,asta ,asta neutrali&acin neutrali&acin con con agua agua desminerali&ada% desminerali&ada% Secado Secado a a B16 B16 8 8 0= 0= ,% ,% DESPROTEINIZACION DESPROTEINIZACION CON CON N(OH N(OH 4.9 4.9 Q Q @26 @26 8, 8, 4)41 4)41 p.v, p.v, 0 0, , Diltracin Diltracin en en tela tela de de algodn algodn y y lavado lavado ,asta ,asta neutrali&acin neutrali&acin con con agua agua desminerali&ada% desminerali&ada% Secado Secado a a B16 B16 8 8 0= 0= ,% ,%

MUITINA MUITINA

@ILTRADO @ILTRADO G G SECADO SECADO B1 B1 6 6 8, 8, 0=,% 0=,% Eliminacin Eliminacin de de cloro cloro residual residual mediante mediante lavados lavados y y filtrados filtrados sucesivos% sucesivos%

>LANMUEADO >LANMUEADO CON CON N(OCL N(OCL 0.4B9 0.4B9 Q Q ( (6 6 ambiente, ambiente, 4)41 4)41 p.v, p.v, 2S% 2S%

Secado Secado a a( (6 6 ambiente ambiente 0 0 ,% ,%

EPTRACCI N DE EPTRACCI EPTRACCIN DE PIGMENTOS PIGMENTOS CON CON ACETONA ACETONA +Equipo +Equipo sox,let,sox,let,-

II.

PREPARACIN DE MUITINA COLOIDAL SEGLN EL METODO DE Mo$:+(l ($? R++%+1 B5I5.

AGITACIN PO 2 AL AGITACIN DE DE MUITINA MUITINA EN EN H H4 AL 89Q 89Q 4PO2 41 41 g g en en 411 411 m: m: ,asta ,asta formacin formacin de de gel% gel% "efrigeracin =7 , "efrigeracin =7 , PRECIPITACIN PRECIPITACIN EN EN EPCESO EPCESO DE DE AGUA. AGUA. Diltracin Diltracin en en tela tela de de algodn% algodn% NEUTRALIZACIN NEUTRALIZACIN :avado :avado ,asta ,asta neutrali&acin neutrali&acin con con agua agua desminerali&ada% desminerali&ada% Eliminacin Eliminacin del del exceso exceso de de agua agua por prensado manual% "efrigeracin a =6 8% por prensado manual% "efrigeracin a =6 8%

MUITINA MUITINA COLOIDAL COLOIDAL DETERMINACIN DETERMINACIN DE DE HUMEDAD HUMEDAD 4g 4g a a B1 B1 68, 68, 0=, 0=,

OBTENCIN DE INCULOS
:os inculos se obtienen sembrando por estra la bacteria motivo de estudio en ca*as de petri con el medio de propagacin correspondiente% :as ca*as se incuban a la temperatura de aislamiento por 2 das o ,asta la aparicin del ,alo de ,idrlisis, al cabo de los cuales se cosec,an las cMlulas con asa y se suspenden en solucin salina estMril con la salinidad del microorganismo ,asta obtener una densidad ptica total de 1%2 unidades a >@1 nm% E*emplo con la bacteria (E:3II3>B)

Ag(: 6Q Mu"&"$( Colo"?(l BQ E3&:(c&o ?+ L+=(?u:( 0.9Q N(Cl 4.I62Q ,H 8.0

TEL II-47 +$ !+?"o ?+ ,:o,(g(c"#$ ?+ CARROAD

Co$%+:=(: ( 2RC

I$cub(: ( 20RC1 9 ?;(%

Su%,+$?+: +$ Soluc"#$ S(l"$( +%&S:"l 4.I62Q D.O. 4I0/ 0.9 U

CINTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS

:a fermentacin se lleva a cabo en matraces Erlenmeyer de 211 ml, cada uno con 011 ml del medio de fermentacin correspondiente para cada cepa y =ml del inculo% Se incuban 401 ,oras a la temperatura y agitacin +rpm- correspondientes% En un principio el muestreo se reali&a cada 0 ,oras ,asta cumplir 40 ,oras, luego cada @ ,oras ,asta cumplir 0= ,oras y finalmente cada 40 ,oras ,asta cumplir las 401 ,oras% En cada caso se toman dos muestras de 2ml de cada Erlenmeyer, a cada una de las cuales se mide el p/, luego se diluye con 2 ml se solucin salina al porcenta*e correspondiente para cada cepa, se agita y se filtra para eliminar el sustrato remanente usando equipo 'illipore y papel R,atman <o% 4% El crecimiento bacteriano se determina por medicin de la turbide& del filtrado obtenido y se reporta como la absorbancia del filtrado a >@1 nm% Se ,ace una curva de crecimiento a partir de la cual se calculan los valores de +Lelocidad especfica de crecimiento- y (d +(iempo de duplicacin-% Nosteriormente, el filtrado se centrifuga al tiempo, rpm y temperatura correspondiente para cada cepa% $l sobrenadante libre de cMlulas obtenido se le determina las actividades de interMs y protena extracelular%

E*emplo con la bacteria (E:3II3>B)

Co?.
2 !L

@"l&:(c"#$ co$ +Nu",o M"ll",o:+ . ,(,+l FT(&!($ No. B.

600 !L

I$#culo D.O. 4I0/ 0.9 U

I$cub(: ( 20RC1 B60 T1 600 :,!

D+&+:!"$(c"#$ ?+l c:+c"!"+$&o b(c&+:"($o (!+?"c"#$ ?+ D.O. ( 4I0 $!). S+ T(c+ cu:=( ?+ c:+c"!"+$&o . %+ c(lcul($ lo% =(lo:+% ?+ (V+loc"?(? +%,+c;A"c( ?+ c:+c"!"+$&o) . T? (T"+!,o ?+ ?u,l"c(c"#$).

C+$&:"Aug(c"#$ (7U1 B6000 :,!)

D+&+:!"$(c"#$ ?+Ac&"="?(? Nu"&"$ol;&"c( Ac&"="?(? P:o&+ol;&"c( P:o&+;$( E3&:(c+lul(:

Sob:+$(?($&+ l"b:+ ?+ cSlul(%

M+?"o Co?. Mo?"A"c(?o1 6007 Tuitina 8oloidal en base seca Extracto de :evadura <a8l lucosa +</=-0SO= p/ (emperatura

gl 41 1%2 >@%0= 4 4 7%1 =168

Q 4 1%12 >%@0= 1%4 1%4

RE@ERENCIAS
8arroad, N and (om, "$% +4AB7-% Bioconversion of S,elfis, 8,itin Rastes) Nrocess 8onception and Selection of 'icroorganisms% Uournal of Dood Science% =>) 44273 44@4% 8ody, "'% +4AA1-% Screening microorganisms for c,itin ,ydrolysis and production of etanol from amino sugars% Biomass% 04) 07230A2% ranados3Bae&a, 'U% +4AAA-% $islamiento y seleccin de microorganismos ,alfilos quitinolticos% (esis profesional% Instituto (ecnolgico de 'Mrida% 'Mrida, Vucatn, 'Mxico% /offelman, '%W U% /artman, $% Xinn and N%Sc,erier +4A72- Isolation, purification and c,aracteri&ation of lipase isoen&ymes from tec,nical $spergillus niger en&yme% U% of Dood Sciences, 21) 4B0434B02 Iunit&, ' +4A=B- 8rystalline soybean trypsin in,ibitor% U% en% N,ysiol%, >1, 0A43>41%

:oHry, O% /%, "osenbroug,, <%U%, Darr, $%:% and "andall, "%U% +4A24- Nrotein measurement Hit, t,e Dolin p,enol reagent% U% Biol% 8,em%, 4A>, 0@230B2% 'andels, '%, $ndreoti, "% $nd "oc,e, 8,% +4AB@- 'easurement of sac,a rifying cellulase% Biotec,nol% Bioeng% Symp% <o% @, 0430>% 'arque&3#a&, N$% +011=-% Evaluacin de la capacidad de la cepa ,alfila moderada (E:3II3>B para producir quitinasas% (esis profesional% Instituto (ecnolgico de 'Mrida% 'Mrida, Vucatn, 'Mxico% 'iller, %:% +4A2A- !se of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar% $nalytical 8,emistry, >4 +>-, =0@3=07% 'onreal, U% $nd "eese, E%(% +4A@A- (,e c,itinase of Serratia 'arcescens% 8anadian Uournal of 'icrobiology, 42, @7A3@A@%

'oreno3'endieta, S%$% +011B-% Nroduccin y caracteri&acin cinMtica de las quitinasas de la bacteria ,alfila moderada (E:3II3>B% (esis de 'aestra% Instituto (ecnolgico de 'Mrida% "ivera3'u?o&, y Orti&3'iln, S +0111-% 8aracteri&acin de las $ctividades en&imticas asociadas a la degradacin de materia orgnica durante el proceso de produccin de sal por evaporacin solar% 'anual de (Mcnicas% $poyado por el Sistema de Investigacin "egional Uusto Sierra con la clave 02 AA144>>%