ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS, TECNOLOGA E INGENIERA INGENIERA DE ALIMENTOS Asignatura: Biotecnologa alimentaria. (301105). Segunda evaluacin (Jueves 8 de mayo.

) Temti a: Tecnologa en im!tica. "#traccin$ caracteri acin$ %uri&icacin y cin'tica. Tut!r: (lae)ter *)on +lore (u m!n.

N!m"re: ________________________________________ C#$ig!: ____________ 1. 2. Describa una metodologa para determinar el nmero de subunidades de un enzima alostrica purificada. Determine el peso molecular en KDa, de la enzima mostrada en la figura 1.

Inu(in )ru t!trans)erasa

%igura &' E(e tr!)!resis !rres*!n$iente a (a *uri)i a i#n $e (a en+ima inu(in )ru t!trans)erasa, $e Arthrobacter ureafaciens' Los marcadores de peso molecular estn dados en kilo daltons (Kda). M: marcadores de pesos moleculares, 1: muestra patron, 2: muestra de precipitacin con sulfato de amonio. Tomado de: Kelle t !. L. 1"#$. Journal ,& Bacteriology, %pr. &. 2$"'2() 1$$, *o. 1

3.

n un laboratorio de in!estigaci"n se obtiene un e#tracto enzim$tico pro!eniente del sobrenadante de la fermentaci"n de %acillus subtilis& se re'uiere purificar una proteasa (enzima 'ue hidroliza otras protenas) presente en dicha muestra& se conocen de antemano algunas propiedades de ella como* su peso molecular es de 3+ KD, posee una carga negati!a , , , , a p- .,/, su purificaci"n parcial o total es re'uerida para estudios cinticos 0 moleculares. Describa la metodologa de su purificaci"n con la siguiente informaci"n.

Ta"(a &' +aracter,sticas del e-tracto en.imtico de la fermentacin de Bacillus su-tilis. ,re i*ita i#n ,'M' Carga a *1 A ti4i$a$ !n su()at! $e ,r!te-na ,'I' ./$0 2'3 .U0a am!ni! a( 567 % / 20 11111 2.02 *o 3 /.) 2/ 1111 0.0) 4i + ( 2/ 11' ' ' ' 0.00 *o 5 #." 2( ''''' 1.0$ *o 6 #./ 2/ '''' 2.01 4i 7 ( 100 1 $."# 4i 8 ".# 1$0 11111 2.(0 *o 9 /.2 $0 '' 10.1 *o : ( )/ ' 0.00 *o a) acti;idad proteol,tica e-presada como micro<ramos de triptfano =ml por minuto a una temperatura de )2>+, p9: #,/, 1m<=ml de prote,na (34%) una concentracin de en.ima de 0,2 micro<ramos por ml. 4e cuenta con las si<uientes t?cnicas: a. 4ulfato de amonio una solucin al )0@ de saturacin. A. MemArana de dilisis de un tamaBo de poro de 12000 5a. c. 5os cartucCos de ultrafiltracin con un tamaBo de poro de 20 K5 uno de 20 K5. d. +olumna de e-clusin por tamaBo (sepCade- 8'100) Due separa prote,nas entre /0 1/0 K5. e. +olumna de intercamAio catinico (amAerlita, la cual retiene cationes (') a p9 (.#). 3.1. 1i la acti!idad proteoltica de la enzima se disminu0e a cero cual seria el procedimiento para su purificaci"n. 2. 3omplete la tabla 2. correspondiente a la purificaci"n enzim$tica de una le!anasa producida por %acillus subtilis 0 clonada en . coli. ,uri)i ati!n

Ta"(a 8' &urification of 3. suptilis le;anase produced in ". coli. Ste* ,r!tein T!ta( a ti4it9 :ie($ .mg0 .U0 .70 +rude e-tract 1,") ),10 %mmonium sulfate 1,1( 2,($ precipitation 56%6E4epCarose +L'$3 &eak : 12,1 0,#2 &eak :: 12,( 1,1) 4'4epCaroseA &eak : ),$ 0,2$ &eak :: 2,) 0,2 MonoF 1,2 0,12

Tomada de: Eri ; <an=er, Ant!n 1u"er, an$ 1e(mut S ;>a": &urification and cCaracteri.ation of tCe Bacillus su-tilis Le;anase &roduced in "sc)eric)ia coli. %pplied %nd 6n;ironmental MicroAiolo< , Ma 1""/, Gol. $1, *o. / p. 1"/2E1"/#

+.

Determine la !elocidad m$#ima 0 el Km de las dos enzimas reportadas en la tabla 3. stablezca cual de ellas tiene ma0or afinidad por el sustrato, 0 determine 'ue tipo de inhibici"n presenta la enzima 2 en presencia de calcio. Ta"(a 5' Gariacin de la acti;idad en.imtica con respecto a la concentracin de sustrato de dos en.imas in;ertasas.

En+ima & Sustrat! A ti4i$a$ .M0a .U0 0 0 0,11 1,/ 0,22 1," 0,22 2,2 0,)) 2,/ 0,// 2,# 0,$$ 2 0,(( 2 0,## 2,2 1,1 2,2 1,22 2,2

En+ima 8 Sustrat! A ti4i$a$ .M0a .U0 0 0 0,11 1 0,22 1,/ 0,22 2 0,)) 2,2 0,// 2,/ 0,$$ 2,# 0,(( 2,# 0,## 2," 1,1 2,# 1,22 2,#

En+ima 8 ? CaC(8 .6'5M0 Sustrat! A ti4i$a$ .M0a .U0 0 0 0,11 0,/ 0,22 1 0,22 1,/ 0,)) 2 0,// 2,/ 0,$$ 2,# 0,(( 2,# 0,## 2," 1,1 2,# 1,22 2,#

a) Concentracin molar de sacarosa en buffer fosfatos 50 mM a pH: 5.5.

4.

1egn la lectura de enzimas alostricas de duardo 3ardenas, e#pli'ue* a. n 'ue consiste el modelo concertado o simetra (563) 0 el modelo secuencial generalizado (K78) 0 cual es su principal diferencia. b. #pli'ue el comportamiento de la enzima Alostrica mostrada en la figura 3. con la hip"tesis K78. c. #pli'ue en 'ue consiste la coperati!idad positi!a 0 negati!a.

6stado ! G

6stado T

(4)
%igura 8' !elacin ;elocidad alost?rica. concentracin de sustrato de dos en.imas. ''' micCeliana '''

..

#pli'ue los siguientes mtodos de inmo!ilizaci"n*

a. Atrapamiento. b. ntrecruzamiento. c. 9eticulado. /. ;. Describa mnimo cuatro metodologas utilizadas para la e#tracci"n de una enzima intracelular, de una cepa de :euconostoc mesenteroides. < l =m 0 el Km de una enzima glucosiltransferasa son* +,2 >, 0 ?,2 5 respecti!amente. 1i se realiza los mismos ensa0os, pero cambiando los siguientes tems <@u ocurrira, 0 como afectara el !alor de Km 0 =mA a. Duplicando la cantidad de enzima inicial. b. Aumentando la cantidad de enzima en forma e#ponencial. c. Disminu0endo a una cincuenta!a parte la concentraci"n de sustrato.

1?. 1e re'uiere cuantificar la acti!idad enzim$tica de una enzima in!ertasa comercial& para esto realiz" una reacci"n enzim$tica utilizando 2ml de enzima 0 + ml de sustrato. 1e cuantific" producci"n de glucosa a tra!s del tiempo Babla 2. Determine la acti!idad enzim$tica >Cml total de la enzima comercial. .a unidad de actividad se e#%resa como/ cantidad de en ima necesaria %ara %roducir 1 m0 de glucosa %or minuto a 1023$ %4 1$5 y una concentracin de sustrato del 506%7v. Ta"(a @' 5atos de los anlisis de las al,cuotas del paso anterior. Tiem*! C!n entra i#n $e g(u !sa .min0 .mgAm(0 0 0 / 1,/ 10 1," 1/ 2,2 20 2,/ 20 2,# )0 2 /0 2 $0 2,2 (0 2,2 "0 2,2