INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCENA USANDO CROMATOGRAFA POR ADSORCIN

INTRODUCCIN Cromatografa de adsorcin

La fase estacionaria es un slido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase mvil puede ser un lquido (cromatografa lquido-slido) o un gas (cromatografa gasslido); los componentes se distribuyen entre dos fases a travs de la combinacin de los procesos de adsorcin y desercin. Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad. La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina queden retenidas en la columna. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Sin embargo,no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad , y esta es precisamente la clave de la cromatografa. Algunos compuestos se ven ms fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarn ms despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarn a mayor velocidad. En general se dice que la separacin en la cromatografa se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase mvil o la fase estacionara

RESULTADOS
Volumen de elucion (mL) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 A493 0.033 0.023 1.975 0.95 0.089 0.032 0.017 0.047 0.013 0.02 0.011 0.061 0.023 0.022 0.024 0.032 0.033 0.042 0.038 0.026 0.018 0.016 A668 0.07 0.02 0.033 0.011 0.01 0.033 0.358 0.061 0.034 0.028 0.067 0.044 0.02 0.045 0.128 0.141 0.385 0.78 0.82 0.579 0.336 0.21

72 75 78

0.007 0.119 0.005 0.057 0.001 0.029

2.5

2 1.5 1 0.5 0

A493 y = -0.007x + 0.4276

R = 0.1495

A668

y = 0.0042x + 0.0054 R = 0.1732

-0.5

20

40

60

80

100

Volumen (mL)

Tabla 1.Valores de absorbancia obtenidos para la separacin de fluorescena y azul de metileno

3.- ELEMENTOS CROMATOGRFICOS Fase estacionaria: Es el compuesto que acta como adsorbente dentro de la columna. Fase mvil: Es o son los compuestos qumicos que pasan a travs de la columna, estas sustancias son los solventes que dependiendo de la polaridad de cada soluto hacen que eluya el ms afin a l. Soporte: Es donde se lleva a cabo la separacin de la mezcla de compuestos, esta solo sirve para mantener la elucin es inerte a las reacciones que se llevan a cabo, en nuestro caso es la columna. Mezcla o solutos a separar: Son los compuestos qumicos que estn unidos en una dilucin. 4.- ADSORCIN La adsorcin es el proceso mediante el cual un slido poroso (a nivel microscpico) es capaz de retener partculas de otra sustancia en su superficie tras entrar en contacto con ste. Es un fenmeno de superficie donde las molculas de una determinada sustancia (adsorbato) interactan con las molculas de otro compuesto (adsorbente), que tiene sus cargas desestabilizadas en la superficie debido a las fuerzas intermoleculares de determinado adsorbente. Es una operacin en la que una determinada sustancia (adsorbato) se transfiere desde un fluido hasta la superficie de un slido (adsorbente), cuyas paredes estn en contacto con dicho fluido. Remocin de iones y molculas de una solucin que presentan afinidad a un medio slido adecuado, de forma tal que son separadas de la solucin. Fuerzas intermoleculares que participan : Fuerzas dipolo- dipolo

Fuerzas de van der waals Puentes de hidrogeno

5.- podemos cambiar el orden de los disolventes para que haya un orden invertido, ya que el azul de metileno es muy soluble en el etanol, que tiene cargas sobre todo negativas, la fluorescena por tanto se queda adsorbida en las molculas de la almina y luego al poner agua saldr con esta por que es ms fuerte su solubilidad con el agua que su adherencia a la almina. Para poder invertir el orden de elucin, se puede adicionar primero el eluyente que provoque que el azul de metileno eluya primero, esto es, el etanol cido. Una vez que el primer colorante ha eluido, se sustituye el alcohol por agua para provocar que eluya la fluorescena. Este orden puede ser alterado debido a que la fluorescena eluye con facilidad en agua, pero no as en etanol. En el caso del azul de metileno, este es muy afn al etanol, por lo que eluye muy fcilmente.

CONCLUSIONES La cromatografa en columna es un mtodo para la separacin de mezclas mediante la retencin selectiva de cada soluto. La afinidad de un soluto a una de las fases mviles es debida a las estructuras moleculares, en las cuales interfieren interacciones moleculares como los puentes de hidrogeno, fuerzas de Van der Waals y fuerzas electrostticas. La fluorescena disdica absorbe al mximo a una longitud de onda de 493 nm en el espectro de la regin visible donde el color que se absorbe es azul. El azul de metileno absorbe lo mximo a una longitud de onda de 668 nm.