Biosensores: Tecnologia e Aplicaes

Cleumar S. Moreira , Antonio M.N. Lima , H. Neff , Arlindo G. Barreto Neto , Fernanda C. C. L. Loureiro , 2,5 1,2 Carlos A. De Souza Filho e Luis H. C. Lima Junior 1 Instituto Federal de Alagoas, Coordenadoria de Eletrnica, Macei, AL, E-mail: cleumar@gmail.com 2 Universidade Federal de Campina Grande,Departamento de Engenharia Eltrica Campina Grande, PB 3 LINCS / CETENE, Recife, PE 4 Instituto Federal da Paraba, Coordenadoria de Eletrotcnica, Cajazeiras, PB 5 Universidade Federal da Paraba, Joo Pessoa, PB
1 2 2,3 2,4 2

Resumo
Biosensores so ferramentas analticas que utilizam um elemento bioativo e um transdutor para a deteco/quantificao de substncias bioqumicas nas mais variadas aplicaes. Neste trabalho so evidenciados as classificaes, caractersiticas bsicas e diferenas com mtodos analticos convencionais. Biosensores baseados no principio de ressonancia de plsmons de superficie (SPR) sero detalhados em sua operao, funcionamento, componentes e aplicaes. Exemplos de biosensores SPR sero apresentados, assim como perspectivas futuras desses dispositivos.

1. INTRODUO Mtodos analticos para identificao e determinao quantitativa e qualitativa de compostos bioqumicos so utilizados nas mais variadas aplicaes, tais como no diagnstico de doenas provocadas por vrus e bactrias, na deteco de patgenos em bebidas lcteas, na deteco de substncias qumicas para os sistemas de defesa e segurana e no monitoramento do meio ambiente. Os mtodos analticos convencionais (gravimetria, titulometria, espectroscopias de massa e Raman, interferometria, fotometria, refratometria) so bastante precisos e muito utilizados [1]. Todavia apresentam, normalmente, as seguintes desvantagens inerentes anlise bioqumica: a realizao feita em laboratrio e a anlise, desde a coleta da amostra at a divulgao do resultado, tem a durao de dias; o processo completo da anlise geralmente muito oneroso, requerendo profissionais experientes e qualificados para a operao, manuteno e anlise dos resultados. Os mtodos baseados nos imunoensaios so mtodos normalmente utilizados para a deteco / quantificao de patgenos em alimentos, doenas provocadas por vrus e bactrias e poluentes na gua destinada ao consumo. O imunoensaio um mtodo de diagnstico que utiliza a capacidade de um anticorpo ligar-se qumica e especificamente a uma nica molcula ou um grupo muito limitado de molculas, que denominada de antgeno. Num imunoensaio, a ligao antgeno-anticorpo, altamente especfica e sensvel, utilizada para a deteco de protenas, vrus, bactrias entre outras substncias que esto presentes em uma amostra fludica, que pode ser sangue, saliva, soluo aquosa, entre outras. Neste sentido, o anticorpo ou antgeno do vrus, bactria, etc., imobilizado e o antgeno ou o anticorpo a ser detectado imerso ou entra em contato e uma ligao no-covalente ocorre. Para identificao e quantificao da substncia em anlise (analito), normalmente associado um marcador fosforescente, luminescente, radioativo, enzimtico, molecular e nanoparticular, que se liga a um substrato e geralmente uma mudana fsico-qumica observada, como a alterao da cor. Utilizando esse procedimento, a presena ou no do analito e a quantidade (massa ou concentrao) da mesma pode ser medida [2,3]. A principal etapa na realizao de um imunoensaio corresponde funcionalizao da superfcie, na qual sobre uma superfcie plstica ou vtrea, os anticorpos de deteco ou captura so imobilizados. Tal imobilizao envolve, normalmente, etapas anteriores de limpeza da superfcie, imobilizao dos anticorpos, e retirada de excesso de material de captura. Isso se realiza usando

processos de lavagem com solues aquosas adequadas para a determinada aplicao. Nessa etapa tambm pode ser realizada a captura do antgeno na soluo analtica. Vrios mtodos e tcnicas de diagnstico so baseadas nos procedimentos dos imunoensaios. Entre eles, o teste ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), ou simplesmente ELISA, o mtodo tradicional de diagnstico e o mais preciso e sensvel [4]. A simplicidade, a especificidade e a sensibilidade associadas ao processo de ligar uma enzima a um anticorpo de deteco e produzir uma reao colorida na soluo, tem levado, ao longo dos anos, o ELISA a ser amplamente explorado para as mais variadas aplicaes [4]. Apesar dessas vantagens, algumas restries so associadas ao ELISA: O tempo de diagnstico alto (em torno de dias, desde a coleta da amostra), requerendo mltiplas etapas de lavagem e incubao; A superfcie do poliestireno no homognea e as protenas podem ter ligaes diferentes em poos do mesmo prato; A presena de materiais contaminantes na amostra pode levar a erros no sistema de deteco; H a necessidade de se ter um equipamento (espectrmetro, fluormetro, entre outros) para quantificar o patgeno detectado limita sua utilizao para aplicaes portteis e online, alm de ter um custo relativamente alto; Os marcadores modificam a medida precisa das constantes cinticas, como o equilbrio qumico e interferem nas ligaes ou outras interaes moleculares. Podem, inclusive, ser txicas para as clulas (clulas tronco ou primrias, por exemplo), alm de promover reaes cruzadas de anticorpos; Para medidas repetitivas, como as necessrias para a deteco de certos patgenos, os poos podem ser deteriorados ou mesmo as substncias em anlise podem sofrer alteraes. Neste caso, faz-se recorrncia a utilizao de vrios kits para uma mesma medio, o que encarece o custo final. Mtodos sem marcadores, como os biosensores, vem sendo pesquisados e utilizados para aplicaes de deteco rpida. Os prximos itens apresentaro os fundamentos tericos dos biosensores e, especialmente, aqueles baseados no principio de ressonancia de plsmons de superficie ou SPR (Surface Plasmon Resonance). Alm disso, sero apresentados os biosensores SPR utilizados no Laboratrio de Biosensores da Universidade Federal de Campina Grande. 2. BIOSENSORES Os biosensores so dispositivos analticos, sem marcadores, que integram uma biocamada, um transdutor eltrico, elementos de condicionamento e processamento do sinal eltrico. O objetivo de um biosensor produzir um sinal eltrico que proporcional em magnitude ou frequncia concentrao do analito.

Figura 1 Diagrama de blocos de um biosensor O diagrama de blocos de um biosensor ilustrado na Figura 1. A biocamada, que inclui o elemento bioreceptor, imobilizada no substrato do biosensor. Os bioreceptores podem ser: enzimas, micrbios, organelas, clulas de animais ou plantas, tecidos de plantas ou animais, anticorpos, receptores, cidos nuclicos, DNA, entre outras substncias [5,6]. O analito, contido na amostra fludica (gs ou lquido) ou slida (filme fino, por exemplo), ao entrar em contato com o bioreceptor, imobilizado na superfcie do biosensor, produz uma mudana fsico-qumica (variao de calor, ndice de refrao, resistncia, capacitncia, etc.) que pode ser identificada por um transdutor eltrico. O sinal eltrico resultante ento adquirido e processado. O sistema de aquisio, processamento e visualizao dos dados informa ao usurio se o analito foi ou no detectado e tambm informa a quantidade de analito na amostra. Vrios estudos e aplicaes foram realizados desde o primeiro biosensor proposto em 1962. No ano de 2007, foram investidos 10,7 bilhes de dlares na pesquisa e desenvolvimento de biosensores para vrias aplicaes (biodefesa, pesquisa mdica e biofarmacutica, monitoramento ambiental e alimentos e bebidas) [5,6]. Um crescimento anual no mercado de biosensores estimado para 10,4%. Tal popularidade deve-se s caractersticas vantajosas desses dispositivos analticos, ou seja: menor tempo de processamento e anlise da amostra (de minutos a horas) e um nus menor, alm da possibilidade de integrao em um nico encapsulamento e de anlise em tempo real e no local de medio [6]. 2.1. Tipos de Biosensores

Os biosensores podem ser classificados de acordo com a biocamada e o transdutor utilizado. No tocante biocamada, os biosensores podem ser classificados em [5,6]: Biosensores enzimticos: usam enzimas como elementos bioreceptores, como o caso da oxidase de glicose utilizada na medio de glicose no sangue. Alm do uso de oxidase de glicose, vrias outras enzimas so utilizadas na construo de biosensores, tais como a urase, a penicilinase e a dehidrogenase de lcool;
3

Imunobiosensores: so biosensores que monitoram as interaes do par anticorpo-antgeno, nas quais o anticorpo ou o antgeno so imobilizados na superficie. Os imunobiosensores podem facilitar a regenerao do componente imobilizado, maximizando, assim, o uso do reagente, que no caso dos dispositivos convencionais pode ser utilizado apenas uma nica vez. A sensibilidade de um imunobiossensor depende da afinidade e da especificidade da ligao e do rudo do sistema transdutor. Entre os analitos que podem ser investigados pelos imunobiosensores esto os hormonios (esteroides e hormonios pituitarios), drogas, vrus, bacterias e poluentes ambientais (pesticidas, por exemplo); Biosensores celulares: Estes biosensores utilizam microorganismos, especialmente, para o monitoramento ambiental de poluentes. As clulas so incorporadas superfcie de um eletrodo, sendo o principio de operao muito semelhante aos biosensores enzimticos, contudo apresentam custo reduzido, maior atividade cataltica e estabilidade. J conforme o transdutor, os biosensores podem ser classificados em [5,6]: Biosensores eletroqumicos: Os biosensores eletroqumicos consistem de dois componentes - um elemento biolgico que reconhece o analito alvo e o transdutor (eletrodo) que "traduz" o evento de bio-reconhecimento em um sinal eltrico til. Os biosensores eletroqumicos podem ser de trs tipos: potenciomtrico, amperomtrico e condutomtrico; Biosensores pticos: so biosensores que se baseiam em mudanas nas propriedades pticas das substncias, com o fito de monitorar a concentrao do analito. Entre as propriedades pticas que podem ser utilizadas esto: absoro, ndice de refrao, fluorescencia, fosforescencia, refletividade e comprimento de onda. Entre as vantagens desses biosensores esto o seu tamanho reduzido, a velocidade de resposta, a facilidade de integrao, imunidade a rudo eletromagntico, boa biocompatibilidade e no-necessidade de elementos ativos na biocamada; Biosensores acsticos: so baseados na propriedade da piezo-eletricidade que os cristais anisotrpicos (quartzo, por exemplo) possuem. Quando aplicada uma tenso alternada a este biossensor, o cristal oscila com uma determinada frequencia, sendo tal frequencia associada massa e s constantes elsticas do cristal. O mais antigo e conhecido biosensor acstico a Microbalana de Cristal de Quartzo (QCM - Quartz-Crystal Microbalance), que utilizada em vrias aplicaes e tambm facilmente integrvel; Biosensores calorimtricos: usam o calor gerado por reaes catalisadoras de enzimas exotrmicas para medir a concentrao do analito. As mudanas de temperatura so geralmente determinadas por termistores de alta sensibilidade; Entre os biosensores existentes, h os biosensores pticos baseados no principio de ressonncia de plsmons de superfcie ou, simplesmente, SPR (Surface Plasmon Resonance). Eles destacam-se na investigao de interaes biomoleculares devido, alm das caractersticas supracitadas para os biosensores, alta seletividade e sensibilidade e tempo de resposta de anlise da amostra em poucos minutos.

3. BIOSENSORES SPR Um diagrama bsico de um biosensor SPR apresentado na Figura 2. A integrao do elemento de acoplamento (substrato ptico) e o filme fino metlico formam o biochip. Adicionado a estes, h os elementos de gerao e deteco da fonte luminosa p-polarizada, componentes pticos e sistema de aquisio, processamento e visualizao.

Figura 2 - Diagrama de blocos de um biosensor SPR, onde o biochip formado pelo substrato ptico e o filme fino metlico O conhecimento do principio SPR surgiu com os experimentos de R. W. Wood em 1902 [7]. Ele observou numa gratcula de difrao que, ao incidir luz branca, para certos ngulos de incidncia, algumas bandas ou faixas escuras eram detectadas, e a magnitude da refletncia correspondente era reduzida. Wood denominou o fenmeno como ``anomalias''. Apenas em 1968 foi demonstrado que a reduo da refletncia, para uma interface metal-dieltrico, era devida interao entre os ftons incidentes e as oscilaes longitudinais existentes na superfcie do metal, que foram denominadas de plsmons de superfcie [7]. O fenmeno decorrente da interao entre os ftons incidentes e os plsmons de superfcie foi denominado de ressonncia de plsmons de superfcie ou SPR. A estrutura proposta por Otto [8] consistia de trs camadas assim organizadas: um prisma ptico para acoplamento da luz; um dieltrico (ar); e o filme metlico. No mesmo ano da descoberta de Otto, Kretschmann e Raether apresentaram uma configurao modificada, em que as camadas do dieltrico e do metal foram invertidas, ou seja, sem a presena do ``gap'' de ar entre o prisma e o metal. Essa nova estrutura foi denominada de estrutura de reflexo total atenuada ou ATR (Attenuated Total Reflection) e a mais utilizada at hoje para aplicaes usando o fenmeno SPR [8]. Ambas as proposies de Otto e Kretschmann-Raether utilizam um prisma ptico para acoplar os feixes luminosos de entrada interface metaldieltrico.

3.1.

Fundamentos do fenmeno SPR

Um feixe luminoso incide no substrato ptico com um ngulo (Figura 2), que deve ser maior que o ngulo crtico. Essa condio propicia a ocorrncia do fenmeno de reflexo interna total. Numa situao ideal, a energia luminosa incidente deveria ser totalmente refletida. Todavia, conforme foi comprovado por Kretschmann-Raether e Otto, parte ou toda a energia luminosa absorvida pela interface metal-dieltrico. Nessa situao, o campo eltrico evanescente, Eev, surge e a energia luminosa transmitida interage com as ondas de plsmons de superfcie [7]. Essa situao corresponde ao fenmeno SPR e a refletividade (parmetro que indica a quantidade de luz que refletida) do feixe luminoso de entrada reduzida. Em outras palavras, um mnimo (dip) de refletividade pode ser observado no detector ptico. Nesta condio ocorre a ressonncia dos plsmons de superfcie. Na ocorrncia do fenmeno SPR, os feixes luminosos de entrada devem ser p-polarizados. Neste caso, a polarizao ocorre paralela ao plano de incidncia e h componentes horizontal e vertical [7,8]. Alm disso, a espessura do filme fino de ouro deve ser muito menor que o comprimento de onda da luz incidente. No possvel excitar os plsmons de superfcie incidindo os feixes luminosos diretamente na superfcie do filme metlico, devido no coincidncia entre os vetores de onda dos ftons e dos plsmons de superfcie [8]. Portanto, um substrato ptico inserido para aumentar a magnitude do vetor de onda e assim propiciar a igualdade dos vetores de onda de ambas as partculas. Fibra ptica, guia de onda, prisma ptico e gratcula de difrao so as alternativas mais utilizadas na literatura como substrato ptico [7,9]; Um biosensor SPR pode ser operado com fontes de luz de entrada monocromticas ou policromticas. H dois modos de interrogao que so mais utilizados nas aplicaes [7]: Modo de interrogao angular ou AIM (Angular Interrogation Mode): neste caso, a fonte luminosa monocromtica (diodo laser, normalmente) e um elemento foto-detector ou uma cmera CCD detectam o sinal refletido na sada do dispositivo. Aqui, o comprimento de onda do feixe de luz de entrada mantido constante e o ngulo de incidncia variado. Geralmente, gonimetros e estruturas mecnicas rotativas so utilizadas para variar o ngulo de incidncia; Modo de interrogao espectral ou WIM (Wavelength Interrogation Mode): neste caso, a fonte de entrada policromtica (fonte halgena ou um diodo de luz branca, normalmente) e um espectrmetro detecta o sinal refletido. O comprimento de onda variado e o ngulo de incidncia mantido constante. A penetrao das ondas de plsmons de superfcie excitadas limitada a centenas de nanmetros, conforme o comprimento de onda da onda luminosa incidente [8]. Assim, modificaes nas propriedades fsico-qumicas do dieltrico alteram a quantidade de energia luminosa incidente que absorvida ou transmitida. Essa alta sensibilidade superficial um dos grandes atrativos do fenmeno SPR, especialmente para aplicaes biolgicas [7,9].

3.2.

Operao de um biosensor SPR

A operao de um biosensor semelhante a de um imunoensaio. A primeira etapa corresponde funcionalizao da superfcie metlica. Trata-se de uma nanocamada de 2 a 5 nm, normalmente, que funciona como uma "cola" em que o bioreceptor fica "grudado", ou melhor adsorvido. O elemento de funcionalizao da superfcie metlica ser diferente conforme o bioreceptor e o analito. Exemplos de elementos de funcionalizao so a albumina de soro bovino ou BSA (Bovin Serum Albumin), albumina de soro humano ou HSA (Human Serum Albumin), alkylthiol, entre outros [9]. Aps a funcionalizao da superfcie, h a circulao do analito pelo microcanal. Isso altera o ndice de refrao do dieltrico em contato com o filme fino metlico, o que facilmente registrado pelo detector ptico devido reduo da intensidade luminosa da imagem refletida na sada do dispositivo num determinado pixel (esse pixel associado a um comprimento de onda ou ngulo para os modos WIM ou AIM, respectivamente). A intensidade luminosa do sinal refletido (resposta SPR) no detector ptico representa o dado bruto (raw data), ou seja, no qual vrios efeitos, relacionados normalmente fonte luminosa e ao detector ptico, modificam a forma de onda desse sinal. Neste caso, a reconstruo do sinal SPR necessria e isso ocorre atravs de um processo denominado normalizao. Inicialmente, cada espectro do sinal subtrado da corrente escura (dark current), que uma corrente eltrica que circula pelo detector ptico na ausncia de feixe luminoso na entrada do biosensor SPR. Aps, um sinal de referncia coletado e armazenado, que a chamada clula seca ou dry cell. O dieltrico, neste caso, o ar. Estratgias para usar a clula seca com feixes p-polarizados ou s-polarizados de entrada so normalmente relatados na literatura [7,9]. Aps essas etapas iniciais, a soluo contendo o analito circula pelo microcanal e a normalizao do sinal SPR completada dividindo-se o espectro resultante da circulao desse analito com o espectro de referncia armazenado. A partir dos espectros normalizados, o valor do ngulo ou comprimento de onda de ressonncia e, consequentemente, as variaes de ndice de refrao, de concentrao ou outros parmetros necessrios da amostra em anlise podem ser computadas pelo elemento de processamento e controle. As variaes do sinal SPR (comprimento de onda ou ngulo de ressonncia), ndice de refrao ou concentrao, ao longo do tempo produzem grficos denominados sensorgramas. As variaes do ndice de refrao podem ser associadas variao da concentrao do dieltrico adsorvido na superfcie metlica, C, atravs da seguinte relao [7]:
dnS nS = dc C

(1)

onde dns/dc o incremento do ndice de refrao do dieltrico por volume. A variao da temperatura ambiente afeta sobremaneira a sensibilidade e o desempenho de biosensores SPR, conforme foi evidenciado em estudos tericos e experimentais recentes [10-12]. Alm disso, uma outra limitao dos biosensores
7

SPR a adsoro no-especfica [7]. Para ambos os casos, muita pesquisa tem vem sendo desenvolvida no intuito de reduzir seus efeitos na operao e desempenho de um biosensor SPR [7,9,12]. 4. BIOSENSORES SPR DISPONIVEIS BIOSENSORES DA UFCG NO LABORATORIO DE

O Laboratrio de Biosensores (LBIO) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) vem desenvolvendo pesquisa na rea de Biosensores SPR desde o ano de 2005. Atualmente, o LBIO realiza pesquisas com dois biosensores comerciais e vm desenvolvendo novas propostas de biosensores SPR. Os itens a seguir iro apresentar os biosensores utilizados e aplicaes que vem sendo j realizadas. 4.1. Biosensor SPREETA

O biosensor SPREETA um dispositivo bionaltico comercial que tambm utiliza a configurao de Kretschmann-Raether. Ele foi proposto em 1996 pela Texas Instruments. Nele, os componentes eletro-pticos so encapsulados em um nico invlucro, conforme mostrado na Figura 3. O encapsulamento feito de material ptico, o que providencia proteo para os componentes e condies propicias para a construo da camada SPR, espelhos e arranjos pticos existentes. A camada sensora formada pela deposio de filme fino de ouro de 50 nm [13].

Figura 3 - Estrutura do biosensor SPREETA. Atualmente, a empresa Sensata fabrica e comercializa os biosensores SPREETA. Possui um menor volume e custo por biochip (em torno de U$ 100) em relao ao biochip (sensor CM5) do sistema BIACORE (em torno de U$ 200), que o mais utilizado biosensor SPR [7]. Todavia, sua utilizao ainda bem menor que o da BIACORE. Alm disso, a variao da temperatura ambiente afeta todos os elementos internos do SPREETA e a posio e a geometria dos componentes, o
8

que pode alterar a posio de ressonncia e, consequentemente, o desempenho do biosensor. 4.2. Biosensor VIR

Em 2003, a empresa dinamarquesa VIR props um biosensor SPR que operava no modo de interrogao angular e usava um substrato ptico fabricado com o polmero TOPAS COC. Esse biosensor dispensava o uso de sistemas mecnicos rotativos ou gonimetros para rotao da fonte luminosa ou do biosensor, como normalmente utilizado por biosensores que usam o modo AIM [7]. Alm disso, no foi utilizado leo ou gel para fixao da camada metlica no substrato tico [9], o que evitava servios de manuteno constantes. Essa caracterstica associada fabricao em massa e de baixo custo, propiciada pelo processo de moldagem por injeo, tornou este biosensor a primeira tentativa de um dispositivo SPR descartvel e adequado para aplicaes de testes laboratoriais remotos [14-16]. O biosensor VIR usa acoplamento ptico para os feixes luminosos de entrada. Esses feixes atingem a superfcie do biochip perpendicularmente, devido presena de elementos de acoplamento pticos difrativos ou DOCE (Diffractive Optical Coupling Elements), cujas dimenses so nanomtricas e utilizam tcnicas hologrficas em sua construo sobre a camada metlica (Figura 4). Eles possibilitam que os raios luminosos de entrada sejam refletidos em vrias direes, o que aumenta a probabilidade do acoplamento fton-plsmon na regio sensvel do biochip.

Figura 4 Estrutura do biosensor SPR VIR Embora possua vantagens em relao a outros biosensores propostos na literatura, a fabricao dos elementos DOCE requer um aparato de nano-tecnologia hologrfica complexa para a produo do molde inicial. Apenas um biosensor foi construdo. Esse biosensor foi doado ao laboratrio de Biosensores da UFCG, juntamente com componentes que permitiram a construo de outro biosensor, o CAMBIO.

10

4.3.

Biosensor CAMBIO

Usando componentes utilizados no biosensor VIR, o sistema CAMBIO foi proposto. Ele foi construdo numa estrutura modular de alumnio que a base para a fixao dos componentes ticos e eletrnicos necessrios para excitao do efeito SPR e aquisio do sinal de imagem, alm do biochip e da clula de fluxo que integram a configurao ilustrada na Figura 5 [17].

Fig. 5 Estrutura do biosensor CAMBIO Para compor a arquitetura de hardware apresentada foram propostas duas solues diferentes. A primeira soluo utilizou um computador pessoal como Unidade de Processamento. Na segunda soluo o PC substitudo pelo kit Innovator1510, o que torna o equipamento totalmente porttil. A Unidade de Aquisio e Controle composta por um controlador de corrente, um controlador de tenso e uma Interface para Cmera. A comunicao, entre a Unidade de Aquisio e Controle e a Unidade de processamento, feita atravs da porta serial. O microcontrolador ADuC841 foi escolhido para ser a CPU da Unidade de Aquisio e Controle pela facilidade de manipulao, mas o sistema permite que o DSP contido no OMAP1510 seja utilizado para esta finalidade. O CAMBIO foi aplicado para detectar as ligaes de protenas de BSA na superfcie do bio-filme de ouro, atravs da anlise da morfologia da curva de refletividade ou curva SPR [17,18]. Uma grade de reagentes analticos e solues de limpeza foram usadas durante os experimentos. O bloqueador BSA (1% soluo, Pierce Ltda.) em PBS foi usado para imobilizao a uma velocidade de escoamento de 0,5 ml/min. Para a regenerao da superfcie e remoo dos resduos, foi utilizada uma soluo de Hipoclorito de Sdio (NaClO) de concentrao 0,1 M. O ensaio completo da imobilizao e regenerao da superfcie est dividido em 5 etapas : 1. Admisso de gua pura para definir as condies iniciais; 2. Admisso de uma soluo de proteo com BSA, para imobilizao de protena;
10

11

3. Admisso de gua pura, para remover fraes de BSA fracamente ligadas (reversvel); 4. Soluo de limpeza NaClO para remover resduos de ligaes irreversveis de protenas; 5. Admisso de gua pura para regenerao final da superfcie A variao da refletividade normalizada em funo do ngulo mostrado na Figura 6b, juntamente com a curva SPR ilustrando a posio do mnimo de ressonncia.

Figura 6 (a) Curva SPR da imobilizao da protena BSA, mostrando o ngulo de ressonncia (RES); e (b) a variao do ndice de refrao no tempo (sensorgrama) 4.4. Biosensor PPBIO

Recentemente foi proposto um biosensor SPR, denominado PPBIO, destinado deteco rpida e possuindo as caractersticas de descartabilidade, baixo custo e aplicado a fontes monocromticas e policromticas [19]. As expectativas com esse novo biosensor foram a reduo dos custos e uma maior simplicidade de projeto e da fabricao em relao ao biosensor VIR [19]. O PPBIO foi o primeiro biochip SPR de fabricao nacional utilzando prisma ptico como substrato. O PPBIO usa lentes integradas externas ao substrato ptico, que um prisma ptico trapezoidal, no modo AIM e pode tambm ser aplicado ao modo WIM, diferentemente dos biosensores SPREETA, VIR e CAMBIO que operam apenas no modo AIM. Para operao no caso WIM, as lentes cilndricas externas devem ser removidas e, portanto, feixes colimados atingem a superfcie inclinada do prisma ptico. O prisma ptico trapezoidal (Figura 6) foi fabricado com o polmero COC TOPAS 5013, usando tcnicas de moldagem por injeo [20]. Sobre o prisma ptico, uma fina camada de ouro (50 nm de espessura) foi depositada. O TOPAS 5013 possibilita uma melhor adsoro de protenas e outras molculas (vrus e bactrias, por exemplo) do que a de outros polmeros [14,19].

11

12

Figura 6 Estrutura do prisma ptico trapezoidal, que o substrato ptico do biosensor PPBIO. So mostrados tambm as dimenses e demais caractersticas utilizadas no projeto do prisma. Dois moldes de materiais diferentes, bronze e ao, foram construdos para a fabricao dos prismas polimricos SPR. Em ambos os moldes, o ngulo das superfcies inclinadas deveria ser precisamente 34. Todavia, uma pequena curvatura das bordas, algo normal em injeo de peas desse tipo, pode ocorrer sem prejuzo para a qualidade do prisma. O perfil do molde de bronze apresenta uma cavidade com 10 mm de largura, conforme ilustrado na Figura 7. O molde de bronze tem um furo para injeo, que localizado no meio da cavidade. A parte superior da cavidade foi construda de ao e pode ser destacada do molde, o que facilita o polimento e possveis reparos. As superfcies inclinadas na cavidade no so to fceis de serem polidas e so feitas em bronze. A placa de extrao que completa o molde, no mostrada na Figura 7, tambm foi construda de bronze. Os prismas pticos fabricados com o molde de bronze tm uma largura de 10 mm. A presena de apenas um furo de injeo produziu acmulo de material no momento da extrao da pea. Isso propiciou a presena de fissuras e bolhas em alguns prismas pticos fabricados. O molde de ao (Figura 8) possui trs cavidades, com 20 mm de largura cada. O aumento da largura, em relao ao molde de bronze, visou, principalmente, facilitar o acoplamento de uma clula de fluxo regio superior do prisma. Tambm, o aumento da quantidade de cavidades aumenta a quantidade de peas produzidas por ciclo de injeo. Furos adicionais para retirada do excesso de polmero tambm foram acrescentadas para cada cavidade, o que auxilia o controle da contrao das peas fabricadas. Um total de 100 prismas foram fabricados com cerca de 300 g de material. A foto desse prisma polido mostrado na Fig. 18b. No houve a presena de fissuras nem bolhas na estrutura superficial do prisma. Os prismas fabricados com os moldes de bronze e ao foram submetidos a um pr-tratamento mecnico e qumico antes da deposio do filme fino de ouro. Para a deposio (cobertura) do filme fino metlico no prisma ptico foi utilizado um sputtering. Um equipamento de cobertura (sputtering) foi utilizado para a deposio de 50 nm de ouro sobre os prismas pticos fabricados.

12

13

Fig. 7 (a) Molde de bronze com um ponto de injeo; (b) Ampliao da cavidade evidenciando o ponto de injeo. Os testes com os biochips pticos produzidos com ambos os moldes foram realizados com substncias no-biolgicas. Os objetivos nesses testes preliminares foi observar a ocorrncia do fenmeno SPR e verificar se a mudana do analito provocava a alterao do mnimo de refletividade, ou seja, o deslocamento da posio de ressonncia dos plsmons de superfcie. Portanto, uma gota de gua destilada foi depositada sobre o filme fino de ouro usando um dosador manual. A gota de gua foi posicionada na regio central do prisma. Os resultados de refletividade obtidos com os feixes p-polarizados e spolarizados so apresentados na Figura 10a. Confirmou-se por este experimento que no ocorre ressonncia para feixes com polarizao s, e sim apenas quando os feixes luminosos possuem polarizao tipo p [7,8]. Utilizando esse mesmo prisma, gua destilada e solues aquosas de etanol a 10 % e 0,2 M (molar) de hidrxido de sdio (NaOH) foram testadas. Usando a mesma referncia, gotas dessas substncias foram depositadas na camada sensvel e os resultados so apresentados na Figura 10b. Percebe-se claramente que h o deslocamento da posio de ressonncia com a mudana do analito, conforme esperado. O custo total estimado de fabricao e materiais dos biochips SPR fabricados aproximadamente de U$ 1,00. Aqui considerado o custo do processo de injeo e o de deposio do filme fino de ouro. Esse valor inferior ao estimado para o biosensor VIR que em torno de U$ 2,45. Comparativamente, o sensor SPREETA apresenta um valor comercial de U$ 100,00. claro que nesse sensor esto
13

14

inclusos os elementos pticos de acoplamento, o diodo laser e a matriz CCD. J o elemento sensor da BIACORE, o custo em torno de U$ 142,00 [20].

Figura 8 Bloco de ao da parte extratora, onde so apresentadas as trs cavidades e os pontos de injeo e retirada de excesso do polmero e ampliao de uma cavidade.

Figura 9 Fotos dos prismas fabricados com a (a) matriz de bronze e a de (b) ao.
14

15

Nos resultados dos testes apresentados no foram utilizados quaisquer mtodos de otimizao, como controle/regulao ou minimizao das limitaes operacionais presentes em um biosensor SPR (ver Captulo 2). Conforme supracitado, o objetivo aqui foi apenas verificar a excitao dos plsmons de superfcie para os valores de projeto de ambos os modos de interrogao e verificar o efeito da variao do ndice de refrao do analito ao desempenho do sistema. Neste sentido, as curvas SPR obtidas confirmam que o prisma ptico de baixo custo, descartvel e com fabricao nacional adequado para aplicaes de diagnstico [21-23].

Figura 10 Resultados para um prisma SPR (a) submetido as polarizaes tipo p e tipo s e (b) utilizando diferentes analitos (gua destiada, NaOH e Etanol)
15

16

5. CONCLUSO Este trabalho apresentou um resumo das principais caractersticas dos biosensores, que so ferramentas analticas importantes e muito pesquisadas e utilizadas atualmente nas mais diversas aplicaes. Isso deriva de suas caractersticas vantajosas face aos mtodos convencionais laboratoriais, ou seja: menor tempo de anlise (minutos a horas), possibilidade de miniaturizao e aplicao on-line e no campo de medio, portabilidade, menor custo operacional, de projeto e ao consumidor final. A pesquisa em Biosensores multidisciplinar e, portanto, para o desenvolvimento de uma determinada aplicao, profissionais da rea de Engenharia Eltrica, Qumica, Fsica e Biologia so necessrios. Todavia, um campo de pesquisa relativamente novo e com grandes prospeces, especialmente como tentativa de substituio na anlise e monitoramento de analitos em aplicaes que so questes de sade pblica, como o caso da deteco rpida de vrus e bactrias, como a Dengue, a AIDS, entre outros, e o monitoramento da gua destinada ao consumo. A busca de mtodos que sejam de baixo custo, descartveis, portteis e com aplicao on-line e no campo interesse de muitos pesquisadores em vrios pases. Algumas das tentativas foram apresentadas neste trabalho com os biosensores VIR, CAMBIO e PPBIO, que foram desenvolvidos com a participao de pesquisadores do Laboratrio de Biosensores da UFCG. O PPBIO o primeiro biochip, com tecnologia nacional, usando o principio SPR e um prisma ptico. O Laboratrio de Biosensores da UFCG vem desenvolvendo, afora o desenvolvimento de dispositivos pticos baseados no principio SPR, aplicaes para medio da difusidade em sistemas microcludicos, aplicaes biolgicas e outras [24-28] 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] Doglas A Skoog, F James Holler e Timothy A Nieman. Principios de Anlise Instrumental, Bookman, Porto Alegre, 2002. [2] Claire L Morgan, David J Newman e Christopher P Price. Immunosensors: Technology and Opportunities in Laboratory Medicine, Clinical Chemistry, vol. 42, pp. 193-209, 1996. [3] Brian T Cunningham. Label-free biosensors: an introduction, Cambridge University Press, vol. 5, 2008. [4] Rudolf M Lequin. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry, vol. 51, pp. 2415-2418m 2005. [5] Bansi D Malhotra e Anthony P F Turner. Advances in Biosensors, Elsevier Science, vol. 5, 2003. [6] Hideaki Nakamura e Isao Karube. Current research activity in Biosensors, Anal. Bional. Chem. vol. 377, pp. 446-468, 2003. [7] Jiri Homola. Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer, 2006. [8] Heinz Raether. Surface Plasmons: on Smooth and Rough Surfaces and on Gratings. Springer Tracts in Modern Physics 111, 1988. [9] R B M Schasfoort e Anna J Tudos. Handbook of surface plasmon resonance, RCS Publishing, 2008.

16

17

[10] C S Moreira, A M N Lima e H Neff. Influence of temperature effects on sensitivity of surface plasmon resonance sensors, Instrumentation and Measurement Technology Conference Proceedings, pp. 170-175, 2008. [11] C S Moreira, A M N Lima e H Neff. Sistema Reconfigurvel para Monitoramento de Temperatura Baseado na Ressonncia de Plsmons de Superfcie, Congresso Brasileiro de Automtica, 2008. [12] C S Moreira, A M N Lima, H Neff e C Thirstrup. Temperature dependent sensitivity of surface plasmon resonance sensors at the gold-water interface, Sensors and Actuators B, vol. 134, pp. 854-862, 2008. [13] Jose Melendez, Richard Carr, Dwigth U Bartholomew, Kari Kukanskis, Jerry Elkind, Sinclair Yee, Clement Furlong e Rick Woodbury. A Commercial Solution for Surface Plasmon Sensing", Sensors and Actuators B, vol. 35-36, pp. 212-216, 1996. [14] C Thirstrup, W Zong, M Borre, H Neff, H C Pedersen e G Holzhueter. Diffractive optical coupling element for surface plasmon resonance sensors, Sensors and Actuators B, vol. 100, pp. 298-308, 2004. [15] H Neff, W Zong, A M N Lima, M Borre e G Holzhter. Optical properties and instrumental performance of thin gold films near the surface plasmon resonance, Thin Solid Films, vol. 21, pp. 1745-1752, 2005. [16] H Neff, T Beeby, A M N Lima, M Borre, C Thirstrup, W Zong e L A L Almeida. dc-Sheet resistance as sensitive monitoring tool of protein immobilization on thin metal films, Biosensors and Biolectronics, vol. 21, 2006. [17] Carlos A Souza Filho. Desenvolvimento de um Sistema Eletrnico de Aquisio e Processamento para Biosensores, Dissertao de Mestrado, Universidade Federal de Campina Grande, 2006. [18] Carlos A Souza Filho, Antonio M N Lima, Cleumar S Moreira, Carsten Thirstrup e Helmut Neff. Line Shape Analysis and Extended Instrumental Operation of Surface Plasmon Resonance Sensors, Plasmonics, vol. 17, pp. 16505-16517, 2010. [19] Carsten Thirstrup, Weiyong Zong e Helmut Neff. Surface plasmon resonance sensor, Patent Application Publication, vol. 0018194 A1, 2005. [20] Cleumar S Moreira. Projeto e realizao de um biochip ptico baseado no principio de ressonancia de plsmons de superficie para aplicaes biolgicas, Tese de Doutorado, Universidade Federal de Campina Grande, 2010. [21] C S Moreira, A G S Barreto Junior, A M N Lima, C Thirstrup e H Neff. Exchangeable Low Cost Polymer Biosensor Chip for Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, EUROSENSORS 2009, Procedia Chemistry, vol. 1, 2009. [22] Cleumar S Moreira, Antonio M N Lima, Carsten Thirstrup e Helmut Neff. A disposable, low cost prism-based surface plasmon resonance (SPR) biosensor, World Congress on Biosensors 2010: Biosensors 2010, 2010. [23] A G S Barreto Neto, C S Moreira, F C C L Loureiro, A M N Lima e H Neff. Studying molecular diffusivity by using SPR spectrometry: experiment and simulations, First Bio-sensing Technology Conference, 2009. [24] C S Moreira, A G S Barreto Junior, A M N Lima e H Neff. A surface plasmon resonance biosensor platform using a microcontroller-drive autosampler, VIII Semetro, 2009. [25] C S Moreira, A G S Barreto Junior, A M N Lima e H Neff. A low-cost autosampler for surface plasmon resonance biosensor platforms, XIX IMEKO World Congress Fundamental and Applied Metrology, 2009. [26] C S Moreira, A G S Barreto Junior, A M N Lima, C Thirstrup e H Neff. Molecular Transport and Mutual Diffusion Measurement Method in a Micro-Fluidic System, Based on Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, EUROSENSORS 2009, Procedia Chemistry, 2009.

17

18

[27] H Neff, A M N Lima, F C C L Loureiro e L A L de Almeida. Transient response analysis and modeling of near wall flow conditions in a micro channel: evidence of slip flow, Microfluidics and Nanofluidics, vol. 3, pp. 591-602, 2007. [28] Fernanda C C L Loureiro, Arlingo G S Barreto Neto, Cleumar S Moreira, Antonio M N Lima e Helmut Neff. A method for determining the mutual diffusion coeficcient of molecular solutes based on surface plasmon resonance spectroscopy, Sensors and Actuators B, Chemical, vol. 1, pp. 1-8, 2010.

18