Revista Eletrnica de Farmcia Vol 3 (2), 99-108, 2006

ISSN 1808-0804

MTODOS DE AVALIAO DA FRAAO DE FRMACO LIGADO (% B) A PROTEINAS DE FLUIDOS BIOLOGICOS

Methodology for assaying protein binding in biological samples Fabiana F. S. Silva1, Luiz C. da Cunha2, Knnia R. Rezende1*
Laboratrio de Biofarmcia e Farmacocintica de Produtos Naturais e Sintticos Bioativos (BIOPHARMAK), Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Gois, Goinia, GO, Brasil. 2 Ncleo de Estudos e Pesquisas Txico-Farmacolgicas (NEPET), Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Gois, Goinia, GO, Brasil. * Autor para correspondncia: kennia@farmacia.ufg.br
Recebido em 26-07-2006 - Aceito em 16/12/2006
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RESUMO: A avaliao farmacocintica compreende as etapas de absoro, distribuio, metabolismo e eliminao (ADME) com predomnio, na fase de distribuio, do frmaco em duas formas distintas: uma frao livre (fL) dissolvida no plasma, e outra, ligada s protenas plasmticas/teciduais. No entanto, a ao teraputica determinada somente pela concentrao da fL, essencial na determinao dos parmetros farmacocinticos das drogas. Para se avaliar a fL geralmente quantifica-se a extenso da ligao s protenas plasmticas de modo indireto empregando tcnicas bioanalticas, como equilbrio de dilise, ultrafiltrao e ultracentrifugao, dentre outras. Este trabalho de reviso tem por objetivo avaliar os trs principais mtodos aplicados na determinao de ligao de frmacos s protenas plasmticas (ultrafiltrao, ultracentrifugao e dilise) relativamente s caractersticas metodolgicas, aplicaes e indicaes, facilidades e inconvenientes de usos destas tcnicas. PALAVRAS-CHAVE: Ligao a protenas plasmticas, ultrafiltrao, ultracentrifugao, equilbrio de dilise, microdilise. ABSTRACT: Pharmacokinetics evaluation is assessed by means of absorption, distribution, metabolism and drug elimination. During distribution step, drug can be found dissolved in plasma as unbound fraction (fL), or bound to plasma/tissue proteins. Understanding drug distribution is important because therapeutic effects of many drugs are not well correlated to total plasma drug level but to free fraction (fL). Thus, assaying free fraction has a remarkable importance for accurate measurements of pharmacokinetics parameters, including therapeutics. Regarding analytical methods for assaying it, the most commonly used ones include equilibrium dialysis, ultrafiltration and ultracentrifugation. Therefore, the aim of this review is to present those methods showing important skills about them. KEYWORDS: Protein binding, ultrafiltration, ultracentrifugation, equilibrium dialysis, microdialysis. 1. INTRODUO O monitoramento clnico de drogas presentes em amostras complexas, como as matrizes biolgicas (plasma, soro, urina, smen, saliva, fluido crebro-espinhal, bile etc), necessrio na determinao dos parmetros farmacocinticos (BARR, et al., 1985). Estes por sua vez so importantes para se avaliar as diferenas inter-individuais em relao absoro, distribuio, metabolismo e eliminao de frmacos, especialmente daqueles com baixo ndice teraputico. Nestes casos, as concentraes plasmticas devem ser monitoradas dentro do intervalo teraputico, de forma a evitar o surgimento de toxicidade (LABAUNE, 1993). No entanto, as anlises de frmacos presentes em matrizes biolgicas so dificultadas pelas baixas concentraes freqentemente encontradas; p.e. frmacos altamente hidroflicos apresentam difcil extrao em amostras aquosas alcalinas; eles podem apresentar instabilidade frente a solventes orgnicos ou variaes de pH e ainda, ligar-se s protenas plasmticas (STEVENSON, et al., 2000). Aps administrao do medicamento por via intravascular, ocorrem os processos de absoro e distribuio do frmaco. No sangue, o frmaco se encontra em duas formas, constituindo duas fraes sob equilbrio dinmico: uma livre, dissolvida no plasma, e outra ligada s protenas plasmticas, especialmente albumina (SILVA, 2002). a frao livre ou no ligada da droga (fL), ao invs de sua concentrao total, que est

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correlacionada ao efeito clnico (SHARGEL & YU, 1999). As propriedades farmacocinticas das drogas podem ser modificadas pelo grau de ligao s protenas plasmticas, em funo da afinidade de ambos (frmaco e proteinas), da concentrao sangunea da droga e do tipo de protenas presentes no fluido em questo (STEVENSON, et al., 1994). As alteraes farmacocinticas decorrem da distribuio seletiva da droga apenas na forma livre (no ligada s protenas plasmticas) por mecanismo de difuso ou transporte atravs das clulas de parede de membranas de vasos sanguneos, que finalmente atingem os stios ativos, p.e. receptores, enzimas e DNA (BARREIRO & FRAGA, 2001). E mais, a fL apresenta estereosseletividade inerente quiralidade das protenas plasmticas como a albumina srica humana (carter cido) e -1-cido glicoprotenas (carter bsico). A ligao da droga s protenas plasmticas um processo saturvel e no linear (GOODMAN, 2001; RDMAN & LIMBIRD, 2003) e pode ocorrer devido s interaes intermoleculares do tipo hidrofbicas, entre nuvens , eletrostticas, foras de van der Waals e pontes de hidrognio (KUBINYI, 1993). Nos estados patolgicos, como na cirrose heptica, sndrome nefrtica e infarto do miocrdio observa-se uma diminuio nas concentraes de albumina (hipoalbuminemia), podendo acarretar no aumento dos nveis da fL,. Em oposio, em queimaduras, cncer e alguns processos crnicos onde h elevao dos nveis de -1-cido glicoprotenas, pode haver a diminuio da fL, com conseqente elevao da resposta farmacolgica frente s drogas (SVENSSON, et al., 1986). Sendo assim, a determinao das concentraes livres das drogas pode ser necessria quando so administrados frmacos altamente ligados s protenas plasmticas (mais de 75%) acarretando em diferena teraputica significativas (THEODORIDIS, 2006; LABAUNE, 1993). Informaes precisas em relao ao percentual de frao livre da droga (fL) so essenciais para o desenvolvimento e determinao da segurana clnica dos frmacos (SCHUMACHER, et al., 2000) relativamente ao farmacolgica, distribuio e eliminao. Na avaliao da fL geralmente quantifica-se a extenso da ligao s protenas plasmticas de maneira indireta empregando tcnicas bioanalticas, como microdilise, equilbrio de dilise, ultrafiltrao e ultracentrifugao, dentre outras. As fases para a quantificao da frao livre de frmacos em plasma esto sumarizadas na Figura 1 (ICH, 1996). Uma etapa importante para a confiabilidade dos resultados obtidos a realizao da avaliao da ligao no especfica. Ela deve ser realizada sob as mesmas condies empregadas na fase de separao, entretanto, a amostra biolgica substituda por uma soluo inerte, como um tampo, de modo a se verificar possveis interaes entre o frmaco e os materiais utilizados na tcnica bioanaltica. A definio pela escolha do mtodo bioanaltico deve levar em considerao alguns fatores como: a natureza qumica do frmaco; a complexidade da matriz biolgica; a concentrao da amostra; a probabilidade da presena de substncias com caractersticas qumicas similares ao analito de interesse; a estabilidade qumica e biolgica do frmaco; a especificidade; a sensibilidade e limites de deteco, preciso e exatido desejveis. Assim, o objetivo deste trabalho apresentar os mtodos bioanalticos mais comumente aplicados anlise de frmacos livres presentes em matrizes biolgicas, como a ultrafiltrao, ultracentrifugao e dilise e, ainda, estabelecer os usos, vantagens e desvantagens de cada um deles. Figura 1. Fases do procedimento bioanaltico para a quantificao de frmacos livres em plasma.
Plasma Fases 1. Separao Frao livre/frao ligada 2. Validao Etapa Analtica Ultrafiltrao, ultracentrifugao ou equilbrio de dilise

Ligao no-especfica, curva de calibrao, preciso, exatido, linearidade e limites de deteco e quantificao Doseamento Determinao quantitativa por mtodos cromatogrficos ou espectromtricos

3. Quantificao % de frao livre

2. MTODOS DE DOSEAMENTO DA FRAO LIVRE DE FRMACOS EM PLASMA

Silva, F. F. S./ Revista Eletrnica de Farmcia Vol 3 (2), 99-108, 2006 2.1. ULTRAFILTRAO OU MTODO DA MEMBRANA FILTRANTE

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A ultrafiltrao um processo de separao de macromolculas em que o solvente e o soluto permeiam uma membrana imobilizada de porosidade especfica, atravs de um gradiente de presso positiva ou centrifugao, sob temperatura e perodo de tempo pr-determinados (Figura 2). A fora gravitacional aplicada para separar as molculas menores (analito livre), que so recuperadas no filtrado, das molculas maiores (analito ligado s protenas plasmticas), que permanecem retidas na membrana (THEODORIDIS, 2006). As membranas utilizadas na ultrafiltrao podem ser classificadas de acordo com o tamanho dos poros, sendo as de hiperfiltrao ou osmose reversa com poros entre 0,1-1 nm; as de ultrafiltrao, 1-100 nm, e as de microfiltrao, 100-1000 nm (QUEIROZ, et al., 2001).

Figura 2. Modelo de dispositivo acoplado membrana filtrante utilizado na tcnica de ultrafiltrao. (Capturado e adaptado de: http://www.millipore.com/publications.nsf/docs/pf002en00, em 06/07/06). A ultrafiltrao uma tcnica que apresenta vantagens como rapidez, inespecificidade e simples aplicao. Alm disto, existe grande disponibilidade comercial das membranas de naturezas qumicas variveis e no apresenta o inconveniente de diluio da amostra, precipitao de protenas e nem troca de solventes, como observado em tcnicas como o equilbrio de dilise. Quanto aos inconvenientes relacionados tcnica tm-se: a) o baixo volume do ultrafiltrado, o que pode limitar a anlise da amostra contendo a frao livre da droga, pois interfere na sensibilidade do mtodo; b) pode ocorrer a formao de uma camada gel, devido ao acmulo de resduos, se houver algum componente na amostra que no permeie pela membrana, representando assim, uma resistncia adicional transferncia de massa, acarretando baixa recuperao do analito; c) a constante de associao da droga protena pode ser alterada pela concentrao de protenas, ao longo do processo de filtrao e ainda, d) a ocorrncia de possveis interaes das molculas com a membrana, do tipo protena-protena ou protena-membrana (KOEHLER, et al., 1997). Estudos demonstram que o sucesso na utilizao da tcnica de ultrafiltrao para determinao da concentrao de frao livre da droga no plasma, depende da correta seleo do tamanho de poro de excluso da membrana (cut-off), a velocidade e tempo de centrifugao, conforme descritos na Tabela 1. Em relao tcnica de equilbrio de dilise, o mtodo de ultrafiltrao apresenta algumas vantagens, como por exemplo, menor tempo de anlise, disponibilidade comercial de materiais de variados tamanhos de poros moleculares e ainda, a eliminao dos efeitos da diluio existente na tcnica de dilise. Para a realizao da ultrafiltrao, pode ser necessria a aplicao de um ngulo fixo durante a centrifugao, para facilitar a filtrao, forando passagem das molculas mais densas atravs da membrana, resultando em uma maior obteno de filtrado. A maior desvantagem do mtodo de ultrafiltrao o fato deste no facilitar a automatizao, diferentemente da tcnica de equilbrio de dilise, que pode ser acoplada diretamente a um sistema cromatogrfico, eletroforese capilar ou espectrmetro de massas. 2.2. ULTRACENTRIFUGAO O mtodo de ultracentrifugao analtica uma variao da ultrafiltrao, entretanto, no h a utilizao de membrana filtrante para a separao de macromolculas. uma tcnica verstil e precisa na separao de protenas e outras macromolculas em solues que possibilita a avaliao da pureza de amostras, a caracterizao de complexos moleculares e a determinao de subunidades estequiomtricas (COLE & HANSEN, 1999). Este procedimento baseado nas propriedades termodinmicas e hidrodinmicas que ocorrem durante a sedimentao sem interao com uma matriz ou superfcie (LEBOWITZ, et al., 2002). Neste necessria a aplicao de fora rotacional que leva a um aumento gradual da concentrao das macromolculas que afeta, a constante de equilbrio entre o ligante (droga) e o stio de ligao (protenas plasmticas). Ao final do perodo de ultracentrifugao, h a sedimentao das protenas plasmticas e a formao do sobrenadante (fase aquosa do plasma) livre de protenas, onde se encontra a frao da droga livre (BOULTON, et al., 1998).

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Esta tcnica possibilita a separao de molculas de elevado peso molecular presentes em pequenas amostras (20-120 L) e em baixas concentraes (0,01-1 g/L). No entanto, o mtodo requer equipamentos de custo relativamente elevados, como a ultracentrfuga refrigerada com rotor de ngulo fixo, e est sujeito a foras fsicas, como sedimentao, retrodifuso, viscosidade e ligao das lipoprotenas do plasma ao sobrenadante, fonte de erros na estimativa da concentrao livre da droga (BARR, et al., 1985). A principal vantagem do mtodo a rapidez relativa de execuo e as maiores desvantagens so a possibilidade da ligao da droga ao ultrafiltrado e dificuldades no controle da temperatura. Tabela 1. Relao de algumas drogas x parmetros bioanalticos para realizao de ultrafiltrao em amostras de plasma. Cut-off membrana (Da) 50.000 30.000 50.000 30.000 30.000 10.000 30.000 30.000 30.000 50.000 50.000 25.000 30.000 Velocidade (g) 2.000 2.000 14.000 1.500 2.000 6.000 1.500 2.000 2.000 14.000 14.000 2.000 1.450 Temperatura ( C) 37 ND ND Temp. ambiente 25 ND 37 21 25 ND ND 37 30 Tempo (min) 15 10 5 15 30 15 10 25 45 5 5 15 60 ngulo do rotor () ND ND ND ND 33 ND 35 ND ND ND ND ND ND Referncia bibliogrfica TSAI, 2003 ZUFIA et al, 2001 THEODORIDIS, 2006 MUSSON et al, 2003 ROBIEUX et al, 1996 BRUNT et al, 1990 COLUSSI et al, 1998 TASSO et al, 2005 KENNAWAY & VOULTSIOS, 1998 THEODORIDIS, 2006 THEODORIDIS, 2006 TSAI, 2003 WOOD et al, 1996

Droga Bupivacana Carboplatina Ciprofloxacino Entapenem Etoposideo Fleroxacino Iralukast LASSBIO-581 Melatonina Nortriptilina Quinidina Ropivacana Velnacrina

pKa 8,091 ND 8,802 ND ND ND 1,50 7,79 ND 9,731 8,602 8,16 9,50

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Legenda: Da = Daltons; rpm = rotaes por minuto; min = minutos; ND = no declarado na referncia bibliogrfica; pKa1: The Merck Index, 2001; pKa2: AHFS, 1996. 2.3. EQUILBRIO DE DILISE O equilbrio de dilise um mtodo que possibilita a separao de componentes de alto peso molecular daqueles de baixo peso molecular utilizando para isto o diferencial de permeao entre membranas seletivas, de espessura entre 10 e 200 m (Figura 3). A permeao das molculas atravs da membrana depende da concentrao do analito, do seu coeficiente de partio leo/gua e da rea de superfcie da membrana (TSAI, 2003). O plasma apresenta vrias molculas de alto peso molecular, como por exemplo, as protenas, e estas devem ser eliminadas da amostra previamente anlise cromatogrfica, a fim de se quantificar apenas a frao livre do frmaco e, ainda, minimizar os riscos de degradao das colunas analticas utilizadas em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). O processo de equilbrio de dilise controlado por difuso e requer a passagem do soluto (frmaco) do lado doador para o lado receptor da membrana como resultado de um gradiente de concentrao (QUEIROZ, et al., 2001). A separao obtida devido capacidade da membrana de transportar de maneira mais rpida alguns componentes, em relao a outros, da fase doadora para a receptora. Esta tcnica considerada o mtodo de referncia, especialmente para a avaliao de drogas que saturam as protenas plasmticas, ainda em concentraes teraputicas (KURZ, et al., 1977). J para drogas lipoflicas que se ligam fortemente s protenas plasmticas, este mtodo tem utilizao limitada (SCHUMACHER, et al, 2000). As membranas utilizadas em equilbrio de dilise podem ser planares ou na forma de bolsa (Figura 4) e se classificam quanto a sua estrutura (porosas ou no-porosas) e quanto simetria (simtricas ou assimtricas). Os materiais constituintes das membranas so polmeros hidroflicos, especialmente celulose regenerada e acetato de celulose. Estes materiais apresentam alta resistncia a modificadores orgnicos e podem ser utilizados na faixa de pH de 2 a 8. Entretanto, apresentam baixa estabilidade qumica e trmica e ainda, esto sujeitos contaminao microbiana. Alm disto, eles interagem com diversos solventes orgnicos em solues aquosas. As membranas podem ser classificadas por um parmetro chamado corte de massa molar nominal (cut-off), que representa a menor massa molar que retida em 90% ou mais na soluo doadora. O termo nominal usado, pois, a forma e a carga do soluto tambm interferem na velocidade de migrao das molculas.

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Os mecanismos envolvidos no processo de permeao do frmaco pela membrana baseiam-se em foras dirigidas como diferena de concentrao, de potencial eltrico e de presso. Dentre estes mecanismos, os que apresentam maiores aplicaes bioanalticas esto relacionado concentrao e presso (QUEIROZ, et al., 2001). Esta tcnica utiliza membranas de dilise com um tamanho de poro menor que o da protena e suas subunidades. O princpio da tcnica se baseia na passagem da fL pela membrana de dilise at o equilbrio, em temperatura constante. Aps o equilbrio de dilise a droga livre analisada. Esta tcnica, aparentemente simples, utiliza celas compartimentalizadas, separadas por membranas de dilise, termodinamicamente correta e livre de qualquer problema eltrico ou mecnico (VOLPE & FILHO, 1993). Para se obter elevados ndices de recuperao necessria a utilizao de uma membrana com grande rea superficial, de grande coeficiente de difuso, uma camada fina e de baixa tortuosidade (QUEIROZ, et al., 2001).

Ligante Protena

Ligante Protena

Figura 3: Representao esquemtica de tcnica de equilbrio de dilise (Capturado e adaptado de: www.hartwellcenter.org/.../ proteomics_image1.gif, em 06/07/2006).

(a) Incio da dilise

(b) No equilbrio

Membrana de dilise

Solvente

Soluo concentrada

Figura 4: Ilustrao da tcnica de equilbrio de dilise utilizando membrana na forma de bolsa. (Capturado e adaptado de: www.web.siumed.edu/.../ images/chapter6/F06-11.jpg, em 06/07/06) A tcnica de equilbrio de dilise apresenta a vantagem de oferecer a isoterma de interao e a variao de energia livre aparente de interao, medindo quantitativamente o grau de extenso da interao protena plasmtica-droga (frao livre, fL), possibilitar o controle de temperatura e ter aplicaes variadas. No entanto, esta tcnica somente pode ser aplicada a frmacos que se dissolvem no tampo, reduzindo o espectro de substncias passveis de serem estudadas (COLUSSI, et al., 1998). E ainda, a formao do equilbrio lenta, j que com o transcorrer do processo o gradiente de concentrao, e consequentemente o fluxo, diminui at se tornar nulo. Tambm pode ocorrer degradao das ligaes instveis s protenas; h a possibilidade de ligao da droga aos componentes da clula de dilise e ainda, ocorre a diluio das protenas plasmticas pela atrao da gua pela albumina (PACIFICI & VIANI, 1992). Um outro inconveniente relaciona-se as recuperaes so de somente 50% para volumes iguais de doador e receptor. Sendo assim, a tcnica indicada para matrizes biolgicas em que a concentrao do frmaco elevada ou quando a deteco no representa um problema. Para aperfeioar a tcnica pode-se optar pela dilise contnua, em que o soluto que atravessa a membrana retirado do compartimento receptor, mantendo o gradiente de alta concentrao e consequentemente, um fluxo maior alcanado. Esta variao do mtodo representa um processo mais rpido que o convencional e, em princpio, o

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analito pode ser transferido quantitativamente para o sistema cromatogrfico. A desvantagem desta tcnica que o analito altamente diludo necessitando de uma coluna de pr-concentrao no sistema injetor de CLAE. 5. MICRODILISE Esta uma tcnica de amostragem, aplicada tanto a animais como em tecidos humanos in vivo, adequada ao monitoramento e quantificao das concentraes livres de frmacos, substncias endgenas e metablitos em fluidos biolgicos (DE LA PEN & DERENDORF, 2000; CLOUGH & NOBLE, 2004). O princpio da microdilise se baseia na difuso passiva de substncias atravs de um gradiente de concentrao (CLOUGH & NOBLE, 2004). A difuso obedece aos princpios da Lei de Fick e fatores como o coeficiente de partio, tamanho da partcula e rea superficial das substncias afetam a permeabilidade da membrana. Sendo assim, substncias de alto peso molecular, como as protenas, apresentam coeficientes de perfuso e recuperaes reduzidas. Perfil similar de recuperao esperado quando a tcnica empregada com molculas lipoflicas, j que a solubilidade destas no fluido de perfuso baixa, e ainda pode ocorrer ligao no especfica da droga sonda, como tambm, alta taxa de ligao s protenas plasmticas (SCHUCK, et al., 2004). A tcnica utiliza uma pequena sonda equipada com uma membrana semipermevel, que inserida no tecido humano ou orgo, com o auxlio de uma cnula (Figura 5). A sonda mimetiza a funo de um capilar sanguneo, permitindo a passagem de substncias de baixo peso molecular. Est conectada a uma bomba de microinfuso que perfunde o lquido a velocidade constante. Assim, um gradiente de concentrao gerado, provocando a difuso do analito de interesse (dialisado) do espao intersticial para o interior da sonda (Figura 6). O dialisado pode ento ser coletado continuamente e, quimicamente avaliado em tempo real (DE LA PEN & DERENDORF, 2000). O mtodo permite ainda, a injeo direta da amostra no sistema cromatogrfico j que a mesma isenta de macromolculas (GUNARATNA & KISSINGER, 1997). Para a execuo da tcnica preciso, previamente, avaliar o pH e isotonicidade do lquido de perfuso, evitando assim, alteraes extremas nos processos fisiolgicos locais. Geralmente, o fluxo ideal de 1 a 5 L/min (DAVIES, 1999).

Figura 5: Modelos de sondas http://www.bioanalytical.com/info/poster/chan.html

utilizadas

em

microdilise.

Capturado

de

Os experimentos que utilizam a microdilise podem ser desenvolvidos por um dos seguintes mtodos: Eficincia de Extrao (EE), Retrodilise (RD) ou No-Net-Flux (NNF). A EE representa a frao total do frmaco na soluo que pode ser extrada pela sonda. A tcnica mimetiza in vitro a situao in vivo, quando a microdilise utilizada na amostragem de drogas com stio de ao especfico. Neste caso, o frmaco est presente no tecido e difunde atravs da membrana da sonda. No mtodo de RD, o fluido de perfuso contm uma concentrao conhecida do frmaco ou de um anlogo (calibrador) e esta concentrao nula no fluido intersticial. Neste mtodo, considera-se a taxa de perda do frmaco igual taxa de ganho (ELMQUIST & SAWCHUK, 1997). Sendo assim, admite-se que a difuso bilateral e linear (STENKEN, 1999), e a determinao da taxa de recuperao realizada pela equao: RRper = (Cin Cdial) / Cin Onde: RRper a recuperao relativa por perda na sonda; Cin a concentrao do frmaco no fluido de perfuso e Cdial a concentrao do frmaco aps a passagem pelo meio (WEISS & LUNTE, 2000). Para o mtodo NNF a recuperao das sondas in vivo estimada atravs da perfuso do soluto de interesse em diversas concentraes, mantendo-se a concentrao extracelular in vivo constante. Esta situao alcanada pela administrao do frmaco sob a forma de infuso contnua, que garante concentraes constantes (steady state) no plasma e nos tecidos. Aps a obteno do steady state, a sonda perfundida por solues contendo diferentes concentraes do analito de interesse. No momento em que o fluxo de lquido for zero, ou seja, o transporte tiver cessado, a concentrao do perfundido ser igual a do dialisado, indicando a concentrao livre intersticial do frmaco. A estimativa do No-Net-Flux por regresso linear gera uma reta (concentrao recuperada menos concentrao no fluido de perfuso), cuja inclinao representa a recuperao relativa da membrana (PEDRONI, 2005).

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Na maioria dos casos, o equilbrio entre o fluido extracelular e o meio de perfuso no completo, o que caracteriza a condio sink. Nestes casos, h a necessidade da realizao de calibrao para se verificar quanto do frmaco pode ser recuperado pela tcnica de microdilise. A calibrao do mtodo est baseada na adio do analito ao lquido de perfuso e a avaliao da razo em que ele desaparece da membrana. (MULLER, 2002).

Figura 6: Diagrama de uma sonda utilizada http://bmj.bmjjournals.com/cgi/content/full/324/7337/588/F2

em

Microdilise.

Capturado

de:

Esta tcnica tem merecido ateno especial nos estudos de farmacocintica, pois viabiliza o doseamento das fraes livres de frmacos e considerada uma tcnica de amostragem in vivo limpa, ou seja, possibilita a coleta do fluido extracelular com a excluso de macromolculas (WEISS & LUNTE, 2000). Desta forma, possvel a obteno de amostras livres de protenas sem a necessidade da aplicao de tcnicas de centrifugao e/ou extrao orgnica, que prolongam o tempo de anlise. Alm isto, considerada minimamente invasiva e de baixo custo (CLOUGH & NOBLE, 2004). Uma das desvantagens da tcnica determinao da capacidade de recuperao da membrana, uma vez que esta influenciada por muitos fatores como, por exemplo, o fluxo de perfuso, a rea superficial da membrana, a temperatura e as propriedades do lquido de perfuso e do analito de interesse (BENVENISTE & HUTTEMEIER, 1990). 3. CONCLUSES O doseamento da frao livre (fL) do frmaco em matrizes biolgicas representa uma etapa importante na definio de parmetros farmacocinticos, como a porcentagem de frmaco ligado as protenas (%B), envolvido na determinao da depurao plasmtica (clearance). Para tanto, necessria a utilizao de tcnicas bioanalticas que possibilitem a separao entre a fL do frmaco e frao ligada s macromolculas, principalmente s protenas presentes nestas amostras, e a manuteno do frgil equilbrio entre estas duas formas (livre e ligada), para a posterior quantificao da percentagem de ligao s protenas plasmticas. Existem vrias tcnicas aplicadas avaliao da fL, em que se quantifica a extenso da ligao s protenas plasmticas de maneira eficiente e indireta. As mais utilizadas so equilbrio de dilise, ultrafiltrao e ultracentrifugao. Estas tcnicas apresentam caractersticas e particularidades que estabelecem seus usos, indicaes, facilidades e inconvenientes de utilizao. Mesmo dispondo destas tcnicas de separao, onde se pode-se obter seletividade e sensibilidade de deteco, o mtodo de avaliao da ligao s protenas plasmticas representa uma etapa problemtica e de fundamental importncia para a quantificao, onde se aplicam os mesmos critrios de validao analtica de frmacos preconizados internacionalmente (ICH, 1996) Na escolha do mtodo mais adequado deve-se priorizar a escolha de uma tcnica que seja simples, de baixo custo, rpida execuo e que fornea subfraes da amostra original com baixos nveis de interferentes e alta recuperao para o analito de interesse. A associao destes fatores representaria uma opo acertada para a tcnica de doseamento de frmacos livres em matrizes biolgicas, assegurando preciso, exatido, reprodutibilidade, viabilidade e segurana. Entretanto, incomum a ocorrncia simultnea destas caractersticas em uma nica tcnica bioanaltica. Assim, necessrio meticuloso planejamento analtico levando em considerao as caractersticas do analito de interesse (e.g. pKa, polaridade e massa molecular), bem como da matriz biolgica a ser analisada, o mtodo de quantificao e a disponibilidade de materiais e de equipamentos na execuo destes procedimentos.

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