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DESENVOLVIMENTO DE MTODOS ANALTICOS DE HPLC NA INDSTRIA FARMACUTICA

Introduo A tcnica de HPLC largamente utilizada na indstria farmacutica. O uso de HPLC inclui acompanhamento de produo, controle de qualidade de matrias primas, testes de estabilidade e estudos de impurezas. O Centro de Avaliao e Pesquisa de Drogas (CDER) publicou um guia (3) que trata sobre assuntos relevantes prtica da tcnica de HPLC. O ICH publicou um documento que serve como guia para realizao de testes de especificao e critrios de aceitao para novas drogas. Esse documento classificou a tcnica de HPLC como Teste Universal (4).

Testes de Procedimentos Analticos Um procedimento analtico definido como: O procedimento analtico se refere maneira de realizar a anlise. Ele deve descrever em detalhes as etapas necessrias para efetuar cada teste analtico. Deve incluir, mas no est limitado a: a amostra, o padro de referncia e ao preparo dos reagentes, uso do equipamento, gerao da curva de calibrao, uso de frmulas para os clculos necessrios, etc. O procedimento analtico pode ser referido como Procedimento Operacional Padro (POP) ou mtodo analtico de HPLC. Os testes mostrados abaixo devem fazer parte do procedimento analtico como parmetros necessrios ao desenvolvimento e validao:

Testes de identificao Testes quantitativos para determinao de impurezas Testes de identificao e quantificao de enantimeros Testes de limites para controle de impurezas Testes quantitativos de umidade em matrias primas e produtos acabados

Um procedimento analtico deve sempre ser desenvolvido com propsitos bem claros em mente. Os quatro tipos de testes citados acima devem ser usados para diferentes propsitos. Para uso em anlise de matria prima, produtos acabados, substncias relacionadas e impurezas, o procedimento deve ser validado antes de ser usado. O objetivo da validao de procedimentos analticos visam demonstrar que o mtodo apropriado para seus propsitos (1). Se o mtodo no atender aos critrios de aceitao de um ou mais parmetros de validao, ele no apropriado para seus propsitos analticos.

Cinco etapas de desenvolvimento analtico

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Definir o problema Testes com variveis chave Avaliao Otimizao Resoluo de problemas

1. Definio de Problemas levantar a estrutura ou estruturas qumicas e dados fsico-qumicos das substncias que se deseja analisar; pesquisa bibliogrfica das substncias qumicas (referncias, farmacopias, etc); aquisio de padres primrios e/ou secundrios; tipo de metodologia a ser desenvolvida (teor matria-prima ou produto acabado, dissoluo, etc.).

2. Testes com variveis chave em caso de existirem metodologias j elaboradas descritas na literatura ou farmacopia, fazer testes de reproduo nas mesmas condies analticas descritas; no havendo dados em literatura, seguir os seguintes passos:

2.1. Testes para preparo de amostras e padres

. Definir solubilidade da(s) substncia qumica em funo de suas propriedades fsico-qumicas. Se possvel usar solventes que devam ser usados na composio da fase mvel. . Fazer ensaios de extrao do analito com o solvente (tempo de ultra-som, uso de temperatura, agitao, etc.). . Definir diluies de modo que a amostra tenha uma concentrao de analito ideal para a anlise.

2.2. Testes para definir modo de deteco

Aps definir o preparo de amostras e padres e suas concentraes, o modo de deteco deve ser estabelecido:

. Identificar na estrutura da substncia qumica a presena de cromforos. Caso existam, optar pela deteco de Ultra-Violeta. Em caso negativo, estudar possibilidades de detectores eletroqumicos, por ndice de difrao, fluorescncia, etc. . Em caso de opo pela deteco por Ultra-Violeta, fazer testes de absoro mxima para se definir o comprimento de onda onde sero feitas as leituras. Estes testes podem ser realizados com o uso de detectores DAD e visualizao de cromatogramas do tipo:

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Fig.1. Neste cromatograma 3D observa-se duas absores principais para uma dada substncia. No comprimento de onda 1 tem-se uma absoro mxima e de melhor definio, portanto esse comprimento de onda pode ser utilizado para essa substncia.

2.3. Testes de coluna Os tipos mais comuns de colunas utilizadas so do tipo:

Fig. 2. Colunas mais comuns utilizadas em HPLC

Sendo que as do tipo C18 e C8 so as mais difundidas. . A coluna pode ser escolhida levando-se em considerao a estrutura qumica do analito e de seus grupos funcionais. Com essas informaes pode-se consultar na literatura o uso de colunas para estruturas qumicas semelhantes. . O teste de coluna deve ser feito em conjunto com teste de fase mvel. Os solventes mais utilizados so: Metanol Acetonitrila Tampo
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Os menos comuns so: Isopropanol Etanol THF A distribuio relativa do soluto entre duas fases determinada pela interao que este tem com cada fase. A afinidade que um soluto tem por uma fase depende principalmente das foras intermoleculares como de Van der Waals, ligaes hidrognio e polaridade. Deve-se encontrar uma fase mvel que promova um equilbrio conveniente do soluto em relao fase estacionria e a fase mvel, de modo que o analito elua de modo satisfatrio. A composio da fase mvel define a pode mudar de maneira significativa a seletividade do mtodo e fora de eluio da fase. Na figura abaixo tem-se um exemplo de como a mudana de solvente na fase mvel pode alterar a seletividade e tempos de reteno:

Fig.3. O uso de Acetonitrila ao invs de metanol, resulta em um cromatograma com melhor resoluo e seletividade

. Na determinao da fase mvel deve-se fazer variaes do tipo: pH Composio fase mvel ACN/MeOH/H2O em vrias combinaes Usos de tampo de acordo com os pKas da(s) substncias de interesse Essas variaes podem ser realizadas de acordo com procedimentos estabelecidos (5). . Deve-se definir o modo de eluio (gradiente ou isocrtico)

2.4. Definio dos parmetros cromatogrficos Devem-se estabelecer condies cromatogrficas para o mtodo levando-se em considerao: . Dimenses da coluna

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. Fase mvel . Volume de injeo da amostra . Fluxo da fase mvel em (ml/min) . Detector (comprimento de onda para leitura) . Tempo de anlise . Temperatura (em caso de uso de forno) . Modo de eluio (isocrtico ou gradiente)

2.5. Testes para determinao de impurezas A presena de impurezas em produtos farmacuticos podem ter efeitos significativos na qualidade e eficincia. Dessa forma, a investigao de teores e tipos de impurezas em um produto e em matrias primas so de rgos como o ICH e FDA ( ) para desenvolvimento de novos frmacos. Vrias tcnicas de alta eficincia e sensibilidade tem sido utilizadas no estudo de impurezas com resultados satisfatrios. Dentre elas podemos citar: . Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) . Eletroforese capilar (CE) . Cromatografia de camada delgada (TLC) . Cromatografia de fluido supercrtico (SFC) Estas tcnicas podem ser combinadas com outros mtodos de deteco e identificao como: . Absoro por Ultra-violeta (UV) . Deteco com arranjo de fotodiodos (DAD) . Deteco por ndice de refrao (RI) . Espectrometria de massas (MS) Abaixo descrevem-se trs tcnicas comumente utilizadas no estudo de impurezas.

2.5.1. Usando a tcnica de HPLC com deteco UV Nesta etapa o mtodo j est praticamente desenvolvido. Deve-se ento verificar se o mtodo pode ser usado em estudos de estabilidade por exemplo, onde impurezas presentes so de interesse. Primeiro verifica-se a pureza cromatogrfica do pico principal. Pode-se fatiar o pico principal e obter espectros de UV de cada parte. Na figura abaixo tem-se o exemplo de dois picos puros onde todos os espectros tem mesmo perfil.

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Fig. 4. Picos que boa pureza cromatogrfica em funo dos espectros de UV obtidos

Na figura abaixo, utilizando-se a mesma ferramenta de UV, verifica-se que o pico 1 apresenta uma impureza no tailing pois observam-se dois espectros diferentes de UV no incio e no final do pico.

Fig. 5. O pico 1 apresenta dois espectros distintos no incio e final

2.5.2. Usando a tcnica de LC/MS

Estudos de pureza de picos com LC/MS A especificidade (ou seletividade no caso de mtodos cromatogrficos) foram a base para uma caracterizao completa do perfil de impurezas de uma amostra. Um importante aspecto na especificidade a pureza do pico da substncia ativa de interesse. A tcnica de MS capaz de detectar pequenos percentuais de impurezas que podem co-eluir com a substncia ativa. Na figura 6 tem-se um exemplo de co-eluio.

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Fig. 6. Estudo de pureza de pico por LC/MS. A figura principal mostra um cromatograma obtido por deteco UV em 240nm. Os espectros de massa (a) e (b) mostram que existe uma impureza no final do pico principal em um percentual de 0,5%. A otimizao das condies cromatogrficas pode levar separao das duas substncias.

Essa identificao no seria possvel usado-se a tcnica de HPLC/UV no caso de duas substncias com espectros de UV semelhantes. Na figura abaixo tem-se um exemplo de quatro esterides de estruturas qumicas diferentes, que co-eluem em cromatografia lquida e apresentam espectros de UV iguais, o que impossibilita a sua diferenciao por HPLC/UV.

Fig. 7. esquerda o cromatograma de UV dos quatro esterides. direita os espectros de UV sobrepostos: no possvel identificar as substncias.

J pela tcnica de MS possvel a identificao e diferenciao das quatro substncias pelos seus pesos moleculares:

Fig.8. Quatro esterides que podem ser diferenciados de acordo com o espectro de massas.

Caracterizao do perfil de impurezas por LC/MS

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O perfil de impurezas deve ser baseado em um cromatograma de UV. O principal objetivo da tcnica LC/MS obter informaes de peso molecular dos picos identificados no cromatograma UV. O perfil de impurezas til no acompanhamento de produo, estudos de estabilidade e estudos de toxicidade. Na figura abaixo comparam-se os perfis de quatro lotes diferentes do mesmo produto. Por LC/MS pode-se acompanhar o aumento ou diminuio, deslocamento de tempos de reteno e degradao de impurezas.

Fig. 9. Comparao de perfil de impurezas. relevantes.

As massas e percentuais so indicados para os picos

2.5.3. Usando a tcnica de LC/NMR Em muitos casos de estudos de impurezas, o LC/MS utilizada por ser uma tcnica rpida e de grande sensibilidade (detecta impurezas em at 0,01%). H casos porm, que o MS no consegue diferenciar estruturas de mesmos pesos moleculares e funes qumicas diferentes, que caracterizam impurezas distintas. Nesses casos, o uso da tcnica de RMN se faz necessria para identificao de grupos funcionais e elucidao inequvoca das estruturas qumicas das impurezas (fig. 10),

Fig. 10. Duas impurezas com mesmo peso molecular que somente so diferenciadas com o auxlio da tcnica de RMN

2.5.4. Usando a tcnica de Eletroforese Capilar A tcnica de Eletroforese capilar tem sido usada com sucesso na identificao de impurezas em frmacos e separao de enantimeros. Essas separaes quirais so realizadas com um eletrlito de fundo que discrimina enantimeros. O enatiomerismo um fenmeno de alta relevncia j que um frmaco pode apresentar diferentes propriedades
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farmacolgicas e de toxicidade como conseqncia. O enantimero que possui atividade farmacolgica chamado de eutmero e o inativo de distmero. As recomendaes dos rgos fiscalizadores que se comercialize frmacos na forma de um s enantimero o que evita sub-dosagens e efeitos txicos do inativo. Dessa forma surgiu a necessidade das indstrias farmacuticas desenvolverem mtodos rpidos, sensveis e seletivos, como a eletroforese capilar, para o controle de pureza enantiomrica das substncias ativas.

DSC e Polimorfismo Sabe-se que substncias ativas para fabricao de medicamentos podem existir em diversas formas polimrficas. O polimorfismo inclui polimorfos, solvatos e amorfos, como definodo pelo protocolo Q6A do ICH. As formas polimrficas de uma substncia geralmente apresentam caractersticas distintas de solubilidade, em funo das diferenas de redes cristalinas. A figura 11 mostra as formas polimrficas que umka determinada substncia pode apresentar.

Fig. 11. Quatro formas polimrficas de uma mesma substncia ativa. As formas de maior estabilidade apresentaro solubilidades menores e conseqentemente biodisponibilidades menores.

As diferentes solubilidades dos polimorfos podem fazer com que mesmo medicamento varie, lote a lote, a biodisponibilidade da substncia ativa ocasionada por diferenas de rota de sntese no processo de fabricao. Dessa forma, necessrio que no desenvolvimento de um produto e no seu processo de fabricao, haja um controle do polimorfismo para asseguras biodisponibilidade e bioequivalncia entre os lotes produzidos. A tcnica analtica mais utilizada para avaliao de polimorfismo o DSC (Calorimetria Exploratria Diferencial). Na figura abaixo observam-se os termogramas de trs polimorfos. As diferenas de entalpias de fuso indicam diferentes solubilidades das formas polimrficas.

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Fig.12. Os polimorfos I, II e III apresentam entalpias de fuso diferentes, ocasionando solubilidades diferentes.

3. Avaliao, Otimizao e Resoluo de problemas

Nesta etapa avaliam-se os resultados obtidos. Segue-se a otimizao do mtodo em caso de obteno de dados satisfatrios. Caso alguns parmetros do mtodo no atendam aos critrios estabelecidos ou no resultem em dados satisfatrios, procura-se problemas por ajuste ou substituio de condies cromatogrficas. resolver os

VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS POR HPLC

necessrio que os laboratrios dsiponham de meios e critrios objetivos para demonstrar, atravs de validao, que os mtodos de ensaio que executam conduzem a resultados confiveis e adequados qualidade pretendida.

1. Planejamento da Validao Sugere-se uma seqncia de trabalho como a que se segue: Definir a aplicao, o objetivo e escopo do mtodo; Definir parmetros de desempenho e critrios de aceitao; Desenvolver um procedimento operacional para validao; Definir os experimentos de validao; Executar os experimentos preliminares de validao; Desenvolver e executar tratamento estatstico dos dados obtidos.

2. Parmetros e caractersticas de desempenho de mtodos

A validao de um mtodo deve conter os testes relacionados abaixo, bem como a documentao necessria (cromatogramas, certificados, tratamento estatstico, etc): Especificidade e Seletividade Linearidade
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Preciso Exatido Limites de quantificao e deteco Robustez

DESENVOLVIMENTO DE MTODOS DE DISSOLUO

Dissoluo uma tcnica qualitativa e quantitativa que fornece informaes sobre biodisponibilidade de um frmaco bem como desempenho e consistncia do processo de fabricao. Os resultados obtidos dos ensaios de dissoluo so ferramentas de grande importncia no desenvolvimento e avaliao de estabilidade de novas formulaes e nas correlaes in vivo in vitro. Na rea de produo e controle de qualidade, os resultados do teste de dissoluo podem ser utilizados para detectar desvios de fabricao, para assegurar uniformidade durante a produo de um lote e reprodutibilidade lote a lote. O desenvolvimento e validao dos mtodos de dissoluo devem seguir protocolos estabelecidos de acordo com as normas estabelecidas pelos rgos fiscalizadores.

1. Condies de teste para desenvolvimento de metodologia de Dissoluo O meio de dissoluo e o equipamento escolhidos devem resultar em um mtodo discriminativo, exato, robusto e fcil de ser transferido a outros laboratrios. As condies de teste de dissoluo esto relacionadas com o mecanismo e os parmetros escolhidos. Abaixo est uma relao dos principais aspectos que devem ser abordados: Aparelho: Normalmente seleciona-se entre aparelhos de p ou cesta. Utiliza-se o cesto para cpsulas, com agitao de 50 a 100 rpm. O aparelho de p utilizado para comprimidos e cpsulas com agitao de 50 ou 75 rpm. Velocidade de Agitao: a velocidade deve ser mantida na faixa de 25 a 150 rpm. Velocidades abaixo de 25 rpm causam problemas hidrodinmicos e velocidades acima de 150 rpm causam turbulncia. Meio de Dissoluo: As caractersticas fsico-qumicas do princpio ativo devem ser determinadas antes da seleo do meio de dissoluo. A seleo do meio de dissoluo deve ser feita considerando-se, em parte, a solubilidade e a faixa de dosagem do frmaco. Os meios de dissoluo tpicos so: . HCl entre 0,1 e 0,001N . Tampo acetato pH entre 4,1 e 5,5 . Tampo fosfato pH entre 5,8 e 8,0 . gua purificada . Solues de polisorbatos 20, 40, 60 e 80 . Solues de lauril sulfato de sdio
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. Solues de sais biliares . Fluido gstrico simulado Para ps e cestos, o volume de meio de dissoluo de 500ml at 1000ml, sendo 900ml o volume mais utilizado. Especificaes: Para formas farmacuticas de liberao imediata, a durao do teste , de 30 a 60 minutos e a especificao de um nico ponto. Para formas de liberao prolongada, so escolhidos no mnimo 3 pontos para caracterizar o perfil de liberao in vitro do frmaco.

Durante o desenvolvimento de metodologia de dissoluo, devem-se observar ainda parmetros como temperatura, tempo total de dissoluo, quantidade e volume de alquotas coletadas, necessidade de reposio do meio, etc.

2. Validao de mtodos de dissoluo Segundo o captulo geral da USP <1225>, o teste de dissoluo considerado mtodo analtico utilizado para determinao de caractersticas de desempenho. Os parmetros exigidos para a validao deste tipo de teste esto listados a seguir: Especificidade: A interferncia do placebo pode ser determinada utilizando amostras da mistura de excipientes equivalente menor e maior dose presente na forma farmacutica. Faixa de linearidade: geralmente estabelecida utilizando-se cinco solues padro do frmaco, com concentrao variando de +/- 20% da concentrao mais baixa at +/- 20% da concentrao mais alta que pode ocorrer durante a liberao da dose da forma farmacutica. Exatido: Utiliza-se o frmaco na forma pura a +/- 20% da concentrao mais alta que esperada durante a liberao a partir da forma farmacutica em estudo. Mnimo de trs nveis de concentrao em triplicata. Preciso: Deve ser determinada fazendo-se rplicas das solues padro e seis injees de cada. Calcula-se o desvio padro que no deve ultrapassar a faixa de 2,0%. A preciso intermediria realiza-se com dois perfis de dissoluo executados por dois analistas. A diferena no valor mdio obtido por um analista em relao ao outro no deve ser maior que 10%.

REFERNCIAS

- Guideline for Industry, Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-2QA, March 1995. - Guidance for Industry, Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996.

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- Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), November 1994, CMC 3. - Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, International Conference on Harmonization; Guidance on Q6A Specifications; Test Procedures and Acceptance Criteria for New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances, Federal Register, Vol. 65, No. 251, Friday, December 29, 2000, Notices, page 83045. - Guidance for Industry, Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evalualtion and Research (CBER), August 1999, ICH, page 17. - 21 CFR Part 211 - Current Good Mannuracturing Practice for Finished Pharmaceuticals, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 4-0102 Edition, 211.194(a)(2), page 135. - Guidance for Industry, Q3A Impurities in New Drug Substances, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evalualtion and Research (CBER), February 2003, ICH, Revision 1.

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