Vous êtes sur la page 1sur 76

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE D’ANTANANARIVO DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

MEMOIRE DE FIN D’ETUDES EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME D’INGENIEUR EN GENIE CHIMIQUE

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE D’ANTANANARIVO DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE MEMOIRE DE FIN D’ETUDES EN VUE DE

ISOLEMENT DE DEUX PRODUITS ANTIPALUDIQUES DE

Brachylaena ramiflora var.ramiflora

Présenté par RAZAFIMAHEFA Mirana Verohanitra

86

Promotion 2004

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE D’ANTANANARIVO DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE

MEMOIRE DE FIN D’ETUDES EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME D’INGENIEUR EN GENIE CHIMIQUE

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE POLYTECHNIQUE D’ANTANANARIVO DEPARTEMENT GENIE CHIMIQUE MEMOIRE DE FIN D’ETUDES EN VUE DE

ISOLEMENT DE DEUX PRODUITS ANTIPALUDIQUES DE

Brachylaena ramiflora var.ramiflora

Présenté par RAZAFIMAHEFA Mirana Verohanitra

Soutenu devant la commission d’examen :

Président

: Monsieur RANDRIANOELINA Benjamin

Rapporteur

: Madame RASOLONDRAMANITRA Jocelyne

Encadreur

: Monsieur RAZAFIMANDEFITRA André

Examinateurs

: Monsieur ANDRIANARY Philippe Monsieur RAFATRO Herintsoa

Date de soutenance : 18 Juillet 2005

86

86

REMERCIEMENTS

Au terme de ce travail, nous exprimons ici notre profonde et respectueuse gratitude à l’égard de toutes les personnes qui ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

A

Monsieur

Benjamin

RANDRIANOELINA,

Professeur titulaire,

Directeur de l’ESPA qui a bien voulu accepter la présidence du jury de ce mémoire.

  • A Monsieur Philippe ANDRIANARY, Maître de conférences, Chef du département Génie Chimique de l’ESPA, qui a bien voulu figurer parmi les membres de jury.

  • A Madame Jocelyne RASOLONDRAMANITRA, Professeur titulaire, Professeur à L’ESPA, Directeur de ce mémoire ; qui nous a prodigué ses précieux conseils et ses encouragements permanents tout au long de nos recherches.

  • A Monsieur Herintsoa RAFATRO, Docteur en Pharmacologie, Responsable de l’Unité de Recherche sur les Plantes Antipaludiques, Investigateur Principal de projet, qui nous a apporté toute son aide et accepté de faire partie des membres de jury.

  • A Monsieur André RAZAFIMANDEFITRA, Maître Assistant, Enseignant chercheur à l’ESPA pour sa disponibilité au laboratoire de l’ESPA, pour ses suggestions intéressantes.

  • A Madame Suzanne RATSIMAMANGA, Présidente de la Fondation Albert RAKOTO-RATSIMAMANGA qui nous a accordé l’accès au laboratoire de la fondation.

86

  • Nous adressons également nos sincères remerciements à tout le personnel du laboratoire de la Direction de la Protection des Végétaux de Nanisana, représenté par son Directeur Monsieur Julien RAKOTOARIMANANA, qui a mis à notre disposition les matériels nécessaires.

  • A tout le personnel du laboratoire de l’ESPA, pour les aides matérielles qu'ils nous ont accordées.

  • A tout le personnel de l’IMRA, pour la sympathie et la franche collaboration qu’ils ont manifestées durant la réalisation des travaux expérimentaux.

  • A mes parents , à ma famille

  • A tous ceux qui, de près ou de loin ont contribué à la meilleure réalisation de ce travail.

86

SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES

LISTE DES FIGURES

LISTE DES TABLEAUX

INTRODUCTION

PREMIERE PARTIE.....................................................................................................2

ETUDE PHYTOCHIMIQUE...........................................................................................2

Chapitre I : PRESENTATION DE LA PLANTE.......................................................3

A.CLASSIFICATION 3 B.DESCRIPTION BOTANIQUE 5 C.DONNEES ETHNOBOTANIQUES 6 Chapitre II : RAPPEL DES TRAVAUX ANTERIEURS............................................8 Chapitre
A.CLASSIFICATION
3
B.DESCRIPTION BOTANIQUE
5
C.DONNEES ETHNOBOTANIQUES
6
Chapitre II : RAPPEL DES TRAVAUX ANTERIEURS............................................8
Chapitre III : METHODES D’ANALYSE CHIMIQUE.............................................11
D.EXTRACTION
11
E.L’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE
14
1.La chromatographie sur colonne (CC)
16
a)Remplissage de la colonne
16
b)Dépôt de l’échantillon
16
2.La chromatographie sur couche mince (CCM)
17
a)CCM analytique
17
b)CCM préparative
17
Chapitre IV :ETUDE
19
F.EXTRACTION
19
G. SEPARATION DES CONSTITUANTS CHIMIQUES DE E
20
1.
Chromatographie sur colonne de E
21
a)Matériels
21
b)Mode opératoire
21
c)Résultats
22
2.
Chromatographie sur colonne de M7
26
a)
Matériels
26
b)Mode opératoire
27
c)Résultats
27
3.CCM préparative de M’5+M’6
31
a)
Matériels
31
b)Mode opératoire
31
c)Résultats
31
H.DISCUSSION
33

DEUXIEME PARTIE...................................................................................................35

ETUDE BIOLOGIQUE................................................................................................35

Chapitre I : LE PALUDISME .................................................................................36

I.GENERALITES

.............................................................................................

37

86

J.LE CYCLE DE DEVELOPPEMENT DE PLASMODIUM FALCIPARUM

.....

38

K.LES PRODUITS ANTIPALUDIQUES 39 1.Les antipaludiques de base 39 a)Antipaludiques naturels 40 b)Antipaludiques de synthèse 40
K.LES PRODUITS ANTIPALUDIQUES
39
1.Les antipaludiques de base
39
a)Antipaludiques naturels
40
b)Antipaludiques de synthèse
40
2.Les produits en association
40
40
L.LES TRAITEMENTS DU PALUDISME
42
1.Traitement préventif
42
a)Chimioprophylaxie ou prévention médicamenteuse
42
b) Lutte contre les vecteurs
43
c)Les moyens mécaniques
44
2.Traitement curatif
44
a)Les facteurs liés au traitement
44
b)Les traitements actuels
45
M.LES ORIENTATIONS ACTUELLES
47
Chapitre II : TESTS BIOLOGIQUES......................................................................49
N.GENERALITES
49
O.ETUDE IN VITRO
49
1.Matériel biologique
49
a)Préparation du milieu de culture
51
b)Culture in vitro des parasites
51
2.Evaluation de l’activité antipaludique
52
3.Déroulement du test
52
a)Collecte du contenu des puits
53
b)Lecture de la radioactivité
53
c)Expression des résultats
53
P.APPLICATION A L’ETUDE DE L’ACTIVITE DE BRACHYLAENA
RAMIFLORA L. (ASTERACEAE)
53
1.Protocole expérimental
53
a)Préparation de la solution RPMI
54
b)Préparation des échantillons
54
c)Préparation de la plaque
54
2.Résultats
54
a)Tests préliminaires sur E et M1 à M8
54
b)Détermination de CI50 sur M’1, M’2, M’4, M’6
55
c) Test préliminaire sur M’’1 à M’’6
56
d)Détermination de CI50 sur M’’1 , M’’2 et M’’6
57
Q.DISCUSSION
57

CONCLUSION GENERALE...................................................................................59

REFERENCES

ANNEXE

BIBLIOGRAPHIQUES..................................................................

60

86

LISTE DES ABREVIATIONS ET SIGLES

AE

: Acétate d’éthyle

ACT

: Artemisinin- based Combination therapy

CC

: Chromatographie sur colonne

CHCl 3

: Chloroforme

CI 50

: Concentration Inhibitrice

CH 2 Cl 2

: dichlorométhane

CCM

: Chromatographie sur Couche Mince

CPM

: Coup par minute

H 2 SO 4

: acide sulfurique

%I

: pourcentage d’inhibition

IMRA

: Institut Malgache de Recherches Appliquées

IM

: Indice de Multiplication

MeOH

: Méthanol

NaCl

: chlorure de sodium

NaHCO 3

: bicarbonate de sodium

OMS

: Organisation Mondiale de la Santé

R f

: Référence frontale

R

: rendement

RPMI

: Roswell Park Medium Institute

UV

: ultraviolet

86

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Arbre de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae)............4

Figure 2 : Branche de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae) face

supérieure (à gauche) ................................................................................................5

Figure 3 : Branche de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae) face

inférieure (à droite) ......................................................................................................5

Figure 4 : Palmitate de Kairatenyl.............................................................................8

Figure 5 : Palmitate de Hopenyl.................................................................................8

Figure 6 : Palmitate d’α-amyrin..................................................................................9

Figure7 : Palmitate de ß-amyrin.................................................................................9

Figure 8 :Acétate de ß-amyrin....................................................................................9

Figure 9 :Acétate de lupeyl......................................................................................10

Figure 10 : Lupeol.....................................................................................................10

Figure 12 : Classification des méthodes chromatographiques [25]....................15

Figure 13 : Protocole d’extraction chloroformique avec dégraissage................19

Figure 14 : CCM de l’extrait chloroformique brut E...............................................20

Figure 15 : CCM des tubes n°1 à 37........................................................................23

Figure 16 : CCM des tubes n°39 à 75......................................................................23

Figure 17 : CCM des tubes n°77 à 95......................................................................24

Figure 18 : CCM des tubes n°97 à 117....................................................................24

Figure 19 : CCM des fractions regroupées : séparation chromatographique de

E..................................................................................................................................25

Figure 20 : CCM des tubes n° 1 à 37.......................................................................28

Figure 21 : CCM des tubes n° 39 à 65.....................................................................28

Figure 22 : CCM des fractions regroupées : séparation chromatographique de

M7................................................................................................................................29

Figure 23 : CCM de M’5 et M’6.................................................................................30

Figure 24 : CCM des fractions 1 à 13 : séparation chromatographique de

M’5+M’6......................................................................................................................33

..............................................................................................................34

Figure 25 : Schéma de fractionnement chromatographique de l’extrait

chloroformique brut E...............................................................................................34

Figure 26 : Carte géographique des zones de paludisme endémique et les

zones de paludisme résistant à la chloroquine. [6]...............................................36

Figure 27 : Cycle biologique de Plasmodium falciparum

[6]...............................

39

Figure 28 : Les molécules couramment utilisées dans le traitement

antipaludique .............................................................................................................47

Figure 29 : Cycle des plasmodies humaines [26] ..................................................50

Figure 30 : Dispositif expérimental de la collecte cellulaire.................................53

86

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Masse des fractions issues de la séparation chromatographique de

E..................................................................................................................................26

....................................................................................................................................26

Tableau 2: Masse des fractions issues de la séparation chromatographique de

M7 ...............................................................................................................................29

Tableau 3 : Masse des fractions issues de la CCM préparative de M’5+M’6......32

Tableau 4 : Valeurs de %I de M1 à M8 ....................................................................55

Tableau 5 : Valeurs de CI50 de M’1, M’2, M’4 , M’6 ..............................................56

Tableau 6 : Valeurs de %I de M’’1 à M’’6 ................................................................56

Tableau 7 : Valeurs de CI50 de M’’1, M’’2 , M’’6.....................................................57

86

INTRODUCTION

La découverte du produit pur de l’extrait de quinquina en 1820 et plus tard

celle de la codification de l‘utilisation de la quinine en 1834 ont permis les premiers

traitements thérapeutiques modernes du paludisme.

L’efficacité de la chloroquine a montré ses limites depuis que le parasite

Plasmodium falciparum du paludisme a manifesté une résistance aux produits

antipaludiques. La situation est d’autant plus grave que la chloroquine a toujours été

le médicament le moins cher et aussi le plus consommé jusqu’ à présent, dans la

gamme des produits antipaludiques.

De nouveaux médicaments sont indispensables pour pouvoir faire face à ce

phénomène de chimiorésistance.

Les recherches sur les plantes médicinales permettent d’identifier le maximum

de molécules antipaludiques dans de nouvelles plantes.

La pharmacopée traditionnelle malgache a déjà répertorié plusieurs plantes

antipaludiques. Citons en exemples Buraseria madagascariensis, Cinnamosma

madagascariensis, Strychnos myrtoîdes, Samadera indica, Brachylaena ramiflora,

….

La présente étude intitulée: « Isolement de deux produits antipaludiques de

Brachylaena ramiflora var. ramiflora » complète deux autres travaux de mémoire

déjà présentés à l‘Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, l’objectif commun

étant l’isolement des principes actifs de la plante.

Ce travail comporte deux grandes parties :

La première partie concerne l’étude phytochimique. Elle rappelle les travaux

des études antérieures sur Brachylaena ramiflora et décrit les différentes étapes de

l’analyse chromatographique de l’extrait.

La deuxième partie, relative à l’étude biologique, décrit le paludisme et les

différents traitements de la maladie, ainsi que les tests biologiques effectués sur

l’extrait de la plante.

1

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

PREMIERE PARTIE ETUDE PHYTOCHIMIQUE

86

2

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre I : PRESENTATION DE LA PLANTE

A.CLASSIFICATION

La plante Brachylaena ramiflora var. ramiflora qui fait l’objet de notre étude

appartient à la famille des Composés ou Asteraceae et au genre Brachylaena.

L’ethnobotaniste Humbert [11] lui a accordé la classification suivante :

Le genre Brachylaena comporte 5 espèces :

  • - ramiflora

  • - perrieri

  • - microphylla

  • - merana

  • - stelluliflera Il existe trois variétés de l'espèce ramiflora :

  • - ramiflora

  • - bernieri

  • - comorensis La

figure

1 présente

l’arbre

de

Brachylaena

ramiflora

var.

ramiflora L.

(Asteraceae), tandis que les figures 2 et 3 présentent les deux faces des branches.

86

3

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 1 : Arbre de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae)

86

4

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004
"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 2 : Branche de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae)

face supérieure (à gauche)

Figure 3 : Branche de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae)

face inférieure (à droite).

L’habitat privilégié de cet arbre dioïque est la région Ouest de Madagascar

ainsi que les Hautes Terres Centrales. En pays Merina, il pousse en solitaire près

des villages, pouvant atteindre une hauteur de 20 m. Cette caractéristique lui a valu

le nom vernaculaire de Hazotokana « arbre isolé ». [2,11]

Brachylaena ramiflora porte d’autres noms vernaculaires attribués par

d’autres ethnies tels que :

mananitra, mananotsa, sotromorona (région du Betsileo)

kisaka (Tsimihety)

kisahaka (région du Boina)…

B.DESCRIPTION BOTANIQUE

Appareil végétatif [2, 11]

Le tronc de la plante est un composé arborescent avec des fleurs en capitule.

Son écorce fendillée est subéreuse et résistante à la flamme.

86

5

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Les feuilles alternes sont simples à limbe entier. Elles sont sèches,

recouvertes d’un fin duvet sur le dessus et d’un velours roussâtre sur le dessous. Les

feuilles caduques tombent au début de la saison des pluies quand les nouvelles se

développent.

Appareil reproducteur [2 ,27]

Les fleurs sont en tube avec des corolles jaunâtres. Les capitules des fleurs

mâles sont plus petits que les capitules des fleurs femelles. Les bourgeons des fleurs

se forment en début d’hiver (mai - juin) pour s’épanouir aux premières chaleurs

humides (septembre - octobre). Les fruits apparaissent au mois d’Octobre et

Novembre. Ce sont des graines akènes typiquement recouvertes de petites glandes

sessiles.

C.DONNEES ETHNOBOTANIQUES

Les informations ethnobotaniques concernant l’espèce ramiflora sont encore

rares. La tradition orale et la pratique de la médecine traditionnelle confirment

l’intérêt médicinal de cette plante, qu’elle soit utilisée seule ou en association avec

d’autres plantes.

Les différentes parties de l’arbre préparées de diverses manières ont

différentes propriétés thérapeutiques : [17, 20]

  • - Les feuilles sont préparées en infusion ; la tisane obtenue calme les douleurs d’estomac, combat les nausées et la constipation, élimine les parasites intestinaux.

  • - Les tiges feuillées en application externe soignent la syphilis ; la tisane de tiges guérit la blennorragie ainsi que les conséquences de cette maladie vénérienne.

  • - Le bois transformé en cendre peut traiter les crises d’épilepsie. On reconnaît aussi à la plante des propriétés astringente, fébrifuge,

antitussive, diurétique, antirhumatismale et aphrodisiaque. [19]

Dans la présente étude, nous porterons un intérêt particulier sur la propriété

antipaludique de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae). [19]

86

6

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

L’usage artisanal de l’arbre est également remarquable car le bois est utilisé

non seulement pour fabriquer les manches d’outils mais aussi dans l’ébénisterie ou

dans la menuiserie fine. Il est également exploité pour les travaux de fer, les piliers

de ponts, les échafaudages ou les moyeux de charrettes. [27]

86

7

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre II : RAPPEL DES TRAVAUX ANTERIEURS

La littérature fait mention d’une étude chimique se rapportant à un extrait

hexanique des branches de la plante qui a fourni deux nouveaux esters

triterpéniques et cinq triterpénoïdes à activité anticancéreuse [4] :

le palmitate de Kairatenyl

le palmitate de Hopenyl

le palmitate d’α-amyrin

le palmitate de ß-amyrin

l’acétate de ß-amyrin

l’acétate de lupeyl

le lupeol

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 4 : Palmitate de Kairatenyl

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

86

Figure 5 : Palmitate de Hopenyl

8

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 6 : Palmitate d’α-amyrin

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure7 : Palmitate de ß-amyrin

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

86

Figure 8 :Acétate de ß-amyrin

9

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 9 :Acétate de lupeyl

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 10 : Lupeol

Par ailleurs, dans une étude de criblage phytochimique, RAFIDIARISON [19] a

pu mettre en évidence la présence de certaines familles chimiques dans les feuilles

de la plante ; ce sont : - les tanins catéchiques

  • - les stérols insaturés

  • - les 2-désoxysucre

L’auteur a noté que contrairement aux résultats obtenus par BOITEAU, les

feuilles de Brachylaena ramiflora var. ramiflora L. (Asteraceae) ne contiennent pas

de lactones, ce qui pourrait s’expliquer par la différence des lieux de récolte et aussi

de la saison de la récolte.

Les feuilles de la plante ont également fait l’objet d’extraction aux solvants

organiques, notamment au chloroforme et à l’éthanol [20]. L’extrait chloroformique

qui a subi un fractionnement successif sur colonnes de silice a été enrichi en

substances ayant une activité antipaludique. Cette activité semble dépendre de la

période de cueillette qui serait favorable entre les mois de Novembre et Février.

86

10

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre III : METHODES D’ANALYSE CHIMIQUE

L’analyse des plantes se fait en 2 étapes :

  • - la première étape concerne l’extraction

  • - la seconde étape concerne l’analyse proprement dite D.EXTRACTION L’extraction d’une plante est l’opération qui permet d’extraire les constituants

reconnus dans la matière végétale. Citons entre autres les alcaloïdes, les

hétérosides, les enzymes etc…Un rendement optimal est obtenu en respectant

certaines conditions expérimentales d’extraction, à savoir :

  • - Le choix du solvant d’extraction

  • - Le temps de percolation

  • - La température d’extraction.

La méthode d’extraction couramment utilisée pour les plantes médicinales est

l’extraction par solvant de polarité croissante dont il existe deux procédés :

  • - la macération à chaud ou à froid

  • - l’extraction à l’aide d’un appareil du type soxhlet.

Ces deux techniques d’extraction suscitent les commentaires suivants :

La première technique, facile à mettre en œuvre opère en mode discontinu ; le

contact permanent du solvant avec la plante à extraire entraîne la saturation

progressive du solvant ; d’où la nécessité de répéter l’opération plusieurs fois pour

atteindre l’épuisement de la plante.

La deuxième technique, requiert un dispositif plus élaboré. L’extraction se fait

également à froid mais le solvant est constamment renouvelé, favorisant ainsi

l’efficacité de la macération. On peut cependant craindre une dégradation des

produits thermolabiles par l’ébullition permanente du solvant.

86

11

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

A coté de ces méthodes classiques, il existe des méthodes spécifiques si on vise

à isoler une famille chimique donnée. Citons en exemple l’isolement des alcaloïdes :

dans les plantes, les alcaloïdes existent le plus souvent sous forme de sels d’acides

minéraux ou organiques. Les alcaloïdes bases sont généralement insolubles dans

l’eau mais solubles dans les solvants organiques peu polaires (chloroforme, éther).

Les sels d’alcaloïdes sont au contraire, en général, solubles dans l’eau et dans les

alcools, et insolubles dans les solvants peu polaires. Ces propriétés sont mises à

profit dans les deux méthodes présentées dans la figure 11 ci-dessous.

86

12

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

1° Par un solvant non polaire en milieu alcalin :

2° Par l’alcool acide :

Drogue pulvérisée + alcali + solvant organique non polaire

Marc

Marc
Marc

Solution extractive organique (alcaloïdes, lipides, pigments liposolubles, etc.)

Solution extractive organique (alcaloïdes, lipides, pigments liposolubles, etc.)

Concentration Epuisement par acide dilué

Solvant épuisé

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004
"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Drogue pulvérisée + alcool acide

Marc Solution extractive (alcaloïdes, amines, résines, pigments etc.) Evaporation Reprise du résidu par acide dilué Filtration
Marc
Solution extractive
(alcaloïdes, amines, résines, pigments etc.)
Evaporation
Reprise du résidu par acide dilué
Filtration
Résidu d’impuretés

Filtrat acide Lavage par solvant organique non miscible

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004
"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Solution aqueuse acide (Sels d’alcaloïdes impurs)

Solvant de lavage

Alcalinisation

 

Epuisement par solvant organique non miscible

Solution aqueuse

Solution aqueuse
 
Solution aqueuse
 

épuisée

Solution organique d’alcaloïdes

Evaporation

Epuisement par solvant organique non miscible Solution aqueuse épuisée Solution organique d’alcaloïdes Evaporation Résidu d’alcaloïdes bruts

Résidu d’alcaloïdes bruts

 

Figure 11: Protocole d’extraction des alcaloïdes

83

13

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Pour

notre

étude,

l’extraction

par

solvant

de

polarité

croissante avec

macération à froid est la méthode suivie. Cette opération consiste à macérer à froid

pendant quelques heures et parfois quelques jours la matière végétale, dans un

solvant approprié. Après

filtration,

le

solvant

est

évaporé

sous

vide

à

une

température inférieure ou égale à 40°C afin d’obtenir l’extrait brut de la plante. Ce

dernier sera utilisé ultérieurement dans les travaux de fractionnement

chromatographique.

E.L’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE

Par définition, la chromatographie est une méthode de fractionnement aussi

bien qualitative que quantitative. Elle a pour but de séparer et de reconnaître les

différents constituants d’un mélange donné.

Les méthodes chromatographiques peuvent être classées en 3 catégories

différentes :

* Selon la nature des phases

  • - la chromatographie liquide-solide (CLS)

  • - la chromatographie liquide-liquide (CLL)

  • - la chromatographie liquide-gel (CLG)

  • - la chromatographie sur phases greffées (BPC Bonded Phase Chromatography)

* Selon la nature des phénomènes mis en jeu dans la séparation.

  • - la chromatographie d’adsorption

  • - la chromatographie de partage

  • - la chromatographie d’échange d’ions

  • - la chromatographie de paires d’ions

  • - la chromatographie d’échange de ligands

  • - la chromatographie d’exclusion

* Selon la technologie de la mise en œuvre de la méthode.

83

14

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

  • - la chromatographie sur colonne CC

  • - la chromatographie de surface (Chromatographie sur Couche Mince CCM et Chromatographie sur Papier CP) Ces méthodes chromatographiques sont résumées dans la figure 12 ci-après :

Chromatographie En phase gazeuse En phase liquide Sur colonne De surface CC CCM CP Echange Paire
Chromatographie
En phase gazeuse
En phase liquide
Sur colonne
De surface
CC
CCM
CP
Echange
Paire
Echange
Adsorption
Partage
Exclusion
d’ions
d’ions
de
ligands
CLL
CLS
CLG
BPC

Figure 12 : Classification des méthodes chromatographiques [25]

83

15

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

De plus amples détails

sont

donnés

sur la

CC et

sur

la

CCM qui

sont les

méthodes chromatographiques utilisées dans la présente étude.

1.La chromatographie sur colonne (CC)

La chromatographie sur colonne est une méthode préparative permettant de

séparer les constituants d’un mélange ainsi que leur isolement moyennant quelques

grammes d’échantillon.[25]

La réussite d’une séparation repose sur plusieurs facteurs qui sont à prendre

en considération : les caractéristiques de l’adsorbant, l’éluant, les dimensions de la

colonne (diamètre et hauteur) et la vitesse d’élution. Dans cette chromatographie, les

molécules sont entraînées par gravité vers le bas de la colonne à des vitesses

différentes suivant leur affinité pour l’adsorbant et leur solubilité dans l’éluant.

La chromatographie sur colonne présente des avantages appréciables :

  • - possibilité d’analyse quantitative précise

  • - rapidité de l’opération de séparation

a)Remplissage de la colonne

Le remplissage de la colonne peut s’effectuer par voie humide ou par voie

sèche. Le remplissage par voie humide a été adoptée pour notre étude en utilisant la

silice comme adsorbant. L’opération consiste à préparer dans un premier temps le

mélange adsorbant - éluant qui doit être homogène. Le mélange obtenu est ensuite

versé avec précaution dans la colonne avec le robinet ouvert de façon à éviter

l’apparition de bulles d’air. Le robinet de la colonne est fermé lorsque l’éluant affleure

avec la surface du gel de silice.

b)Dépôt de l’échantillon

Dans le cas idéal où l’échantillon à analyser est soluble dans une petite

quantité de l’éluant, il sera déposé sur la colonne sous forme de solution.

L’autre alternative consiste à préparer une poudre constituée d’un mélange

d’échantillon et d’une petite quantité de silice, et qui sera déposée sur la colonne. On

83

16

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

y ajoute également du sable d’une épaisseur de 1 cm afin d’éviter les turbulences

lors de l’introduction de l’éluant.

2.La chromatographie sur couche mince (CCM)

Le principe de séparation est le même que dans la CC sur silice, et repose sur

le phénomène d’adsorption. La silice est immobilisée soit sur une plaque de verre,

soit sur une feuille semi-rigide de matière plastique, soit sur une feuille d’aluminium.

L’éluant se déplace par capillarité le long de la plaque et entraîne la migration des

solutés du mélange au cours du développement.[23, 25, 29]

Dans cette technique de chromatographie sur couche mince, il est d’usage de

caractériser la migration d’un soluté par sa Référence frontale (R f ) ou (Rate factor)

définie par la relation :

R f

- Distance parcourue par le soluté

Distance parcourue par le front de solvant

Les avantages de la chromatographie sur couche mince sont multiples :

  • - excellente résolution

  • - grande sensibilité

  • - rapidité du développement

  • - possibilité de transposer les résultats à une chromatographie préparative sur colonne.

A la différence de la CC, la CCM peut être à la fois une méthode analytique et

une méthode préparative.

a)CCM analytique

Elle consiste à déposer la solution à chromatographier en un point

de la

plaque située à 1 cm environ de sa partie inférieure. Le développement se fait dans

une cuve chromatographique contenant le solvant de migration, et préalablement

saturée de vapeurs de ce solvant.

b)CCM préparative

Par cette méthode on passe du domaine de l’analytique à celui de l’isolement

et de la préparation des substances pures.

83

17

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Elle consiste à déposer la solution à chromatographier sous forme de bande

mince continue sur une ligne de départ tracée à 2 cm du bord inférieur de la plaque

et à 2 cm des côtes verticaux pour éviter les effets de bord. Celle-ci est ensuite

placée verticalement dans la cuve chromatographique contenant le solvant de

migration et préalablement saturée de vapeurs de ce solvant. [13, 23, 29]

83

18

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre IV :ETUDE EXPERIMENTALE

L’étude porte sur des feuilles qui ont été cueillies au mois de Novembre,

période où l’activité antipaludique de la plante est la plus prononcée. [20]

Les feuilles font partie du lot cueilli le 30 Novembre 2004 à Ambatofotsy. Le

protocole d’extraction adopté est celui préconisé par RAKOTOARIZAH [20] c'est-à-

dire avec dégraissage et sans dépigmentation.

F.EXTRACTION

On fait macérer 146 g de poudre dans 2 litres d’éther de pétrole. Après

  • 48 heures on procède à une filtration qui permet de récupérer le résidu. Il est mis à

sécher à l’ombre ; le séchage est assez rapide et ne demande que quelques heures.

La suite de l’opération consiste à macérer de nouveau la poudre asséchée dans un

litre de chloroforme en remuant périodiquement. Après 72 heures, on filtre le

mélange. La solution chloroformique obtenue est évaporée à sec sous vide et à une

température de 40°C. On obtient 5 g d’extrait chloroformique brut noté E.

Ce protocole est décrit à la figure 13 :

Feuille sèche broyée

Ether de pétrole Solution d’éther Poudre dégraissée de pétrole CHCl 3 Extrait Résidu chloroformique
Ether de pétrole
Solution d’éther
Poudre dégraissée
de pétrole
CHCl 3
Extrait
Résidu
chloroformique

Extrait chloroformique E

Evaporation sous pression réduite à 40°C(Rotavapor)

sec

Figure 13 : Protocole d’extraction chloroformique avec dégraissage

83

19

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Le rendement d’extraction est donné par la formule :

 

P E

R =

x 100

 

P t

où :

P E = poids de l’extrait sec (5 g)

P t = poids total de l’échantillon (146 g)

Le rendement obtenu est de 3,42 %.

G. SEPARATION DES CONSTITUANTS CHIMIQUES DE E

Le profil chromatographique de l’extrait chloroformique brut E est rapporté

dans la figure 14. Ce profil montre qu’il s’agit d’un mélange complexe de produits.

L’éluant utilisé ici (CH 2 Cl 2 /AE 98 :2) donne une indication sur les conditions

opératoires dans la transposition à la colonne chromatographique préparative.

Adsorbant

: gel de silice

Eluant : dichlorométhane/acétate

d’éthyle (98 :2)

Révélateurs : -UV (366 nm et 256 nm)

H 2 SO 4 50%

avec chauffage à 110°C

Figure 14 : CCM de l’extrait chloroformique brut E

83

20

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

1. Chromatographie sur colonne de E

Cette première étape consiste en un fractionnement grossier de l’extrait

chloroformique brut E sur une colonne chromatographique de silice.

a)Matériels

Colonne chromatographique en verre :

-

Longueur

= 590mm

  • - Diamètre intérieur = 21 mm

  • - Diamètre extérieur = 24 mm

Phase stationnaire :

  • - Gel de silice (KIESELGEL 60)

  • - Granulométrie 0,063 à 0,200 mm

-

Masse

: 70 g

  • - Hauteur de la silice : 460 mm

Tubes de récupération

Coton

Sable

Rotavapor

Phase mobile :

Gradient d’éluant : Chloroforme - acétate d’éthyle

99 :1

50

ml

97

:3

100 ml

96

:4

50

ml

95

:5

50 ml

90

:10

50 ml

AE

100 ml

MeOH

100 ml

83

b)Mode opératoire

21

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

La préparation de la colonne indiquée en page 17 est reproduite en

utilisant le chloroforme pour imprégner la silice. Une poudre constituée par un

mélange de 1 g de l’extrait E avec une petite quantité de silice est ensuite

déposée avec précaution en haut de la colonne. On procède à l’élution par

gradient d’éluant. Le robinet est réglé pour que le débit d’écoulement soit en

moyenne de 70 gouttes par minute.

Les éluats sont recueillis dans des tubes à essai à raison de 5 ml par

tube, soit 117 tubes au total.

.

 

c)Résultats

Le

contenu

de chaque

tube est identifié

au moyen

de

la

CCM ;

cette

démarche permet de rassembler les fractions similaires.

Les figures 15 à 18 donnent le profil chromatographique des 117 fractions.

83

22

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 15 : CCM des tubes n°1 à 37

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 16 : CCM des tubes n°39 à 75

83

23

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 17 : CCM des tubes n°77 à 95

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 18 : CCM des tubes n°97 à 117

83

24

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Le regroupement des fractions a été opéré en tenant compte du fait que

certains composés ont la même référence frontale R f . D’après les chromatogrammes

des figures 15 à 18, on procède au regroupement suivant : 1 à 12, 13 à 20, 21 à 30,

31 à 36, 37 à 54, 55 à 68, 69 à 77, 78 à 103, 104 à 117. Nous avons ainsi réalisé un

découpage par tranche de polarité, les fractions (104-117) renfermant les

composants très polaires.

A l’issue de cette opération, on dispose de 9 tubes dont on effectue une CCM

récapitulative à l’aide d’un éluant plus polaire constitué par le mélange

CHCl 3 /AE (96 :4), et ce, afin de mieux visualiser le contenu des 3 derniers tubes. Le

chromatogramme obtenu est représenté à la figure 19. Il montre un profil tout à fait

semblable entre les 2 fractions successives 69-77 et 78-103 qui seront regroupées

en une même fraction, réduisant ainsi le nombre final de tubes à 8.

Un bilan massique est aussi réalisé en procédant à l’évaporation à sec du

contenu de chaque tube. Ce bilan est reporté dans le tableau 1, et permet de

constater que la totalité de l’échantillon initialement déposé a été bien récupérée.

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Adsorbant : gel de silice

Eluant : CHCl 3 /AE (96 : 4)

Révélateur : UV et H 2 SO 4 50%

avec chauffage à 110°C

Figure 19 : CCM des fractions regroupées : séparation chromatographique de E

.

83

25

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Numéros des

Regroupement des

Masse (mg)

tubes et désignation

fractions

  • 1 M1

1-12

47

  • 2 M2

13-20

121,1

  • 3 M3

21-30

70,3

  • 4 M4

31-36

32,5

  • 5 M5

37-54

454,9

  • 6 M6

55-68

83,7

  • 7 M7

69-77 et 78-103

95

  • 8 M8

104-117

97

 

Total

1001,8

Tableau 1 : Masse des fractions issues de la séparation chromatographique de E

2. Chromatographie sur colonne de M7

La poursuite de la purification par chromatographie est à ce stade conditionnée par

les résultats des tests biologiques. En utilisant la fraction active isolée par

RAKOTOARIZAH [20] comme référence, nous avons sélectionné 6 des 8 tubes

précédemment obtenus à soumettre au test antipaludique. D’après les résultats

préliminaires dont les détails sont consignés dans la partie 2 du présent ouvrage qui

traite de l’aspect biologique, ce sont les fractions 69-103 et 104-117 respectivement

désignées par M7 et M8 qui ont manifesté les activités les plus remarquables.

La fraction M7 est donc soumise à une séparation chromatographique ultérieure

réalisée sur 50 mg d’échantillon.

a) Matériels

  • - Colonne en verre, diamètre extérieur : 15 mm

  • - Phase stationnaire gel de silice

: 0,040 à 0,063 mm

83

26

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

  • - Hauteur de la silice

: 100 mm

  • - Masse de la silice

: 6 g

Phase mobile :

Gradient d’éluant : dichlorométhane-acétate d’éthyle

93 : 3

24 ml

96

: 4

24 ml

95

: 5

24 ml

90

:10

24 ml

80

:20

24

ml

AE

24

ml

MeOH

24

ml

b)Mode opératoire

Le même protocole expérimental décrit en 1 est repris ici, la différence

essentielle réside dans l’utilisation d’une silice à granulométrie plus fine et plus

homogène nécessaire à la réalisation de séparations plus fines. Le robinet est réglé

pour que le débit d’écoulement soit en moyenne de 20 gouttes par minute.

Les éluats sont recueillis dans des tubes à essai à raison de 2 ml par tube, soit 65

tubes au total.

c)Résultats

Une analyse en CCM des fractions recueillies est effectuée en utilisant le

système d’éluant CHCl 3 /AE 95 :5. Les profils chromatographiques sont représentés

par les figures 20 et 21 :

83

27

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 20 : CCM des tubes n° 1 à 37

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 21 : CCM des tubes n° 39 à 65

En s’appuyant sur les similitudes de R f des produits, on peut procéder au

regroupement suivant : 1 à 9, 10 à 18, 19 à 25, 26 à 32, 33 à 36, 37à 44, 45 à 65, 55,

soit 8 tubes sur lesquels on effectue une CCM récapitulative donnant les

chromatogrammes de la figure 22.

83

28

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

De même, le bilan massique de la séparation chromatographique de M7 est

présenté dans le tableau 2.

.

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Adsorbant : gel de silice

Eluant : CH 2 Cl 2 / AE (95 : 5)

Révélateurs : UV et H 2 SO 4

50% avec chauffage à 110°C

Figure 22 : CCM des fractions regroupées : séparation chromatographique de M7

Numéros des

Regroupement des

Masse (mg)

tubes et désignation

fractions

 
  • 1 M’1

1-9

3,67

 
  • 2 M’2

10-18

2,23

 
  • 3 M’3

19-25

2,37

 
  • 4 M’4

26-32

6,66

 
  • 5 M’5

33-36

7,84

 
  • 6 M’6

37-44

6

 
  • 7 M’7

45-65

14

 
  • 8 M’8

55

2

 

Total

44,77

Tableau 2: Masse des fractions issues de la séparation chromatographique de M7

83

29

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Les fractions 1-9 (M’1), 10-18 (M’2), 26-32 (M’4) et 37-44 (M’6) sont

considérées comme représentatives de l’ensemble des constituants de M7, et sont

alors soumises aux tests antipaludiques.

D’après les résultats rapportés dans la partie 2 du présent ouvrage, seule la

fraction M’6 s’est révélée active.

Or en prospectant la CCM de la figure 22, on constate une certaine similitude

des constituants de M’6 avec ceux de la fraction M’5 qui la précède immédiatement.

Ceci est confirmé par une vérification qui consiste à comparer leur profil

chromatographique en utilisant un système d’éluant plus polaire, CH 2 Cl 2 /AE 80 :20.

La CCM correspondante est présentée à la figure 23.

Ainsi, M’5 et M’6 peuvent être regroupés, ce qui donne une masse globale de

14 mg qui sera déposée sur une plaque CCM préparative en vue d’une ultime

purification.

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 23 : CCM de M’5 et M’6

Adsorbant : gel de silice

Eluant : CH 2 Cl 2 /AE (80 : 20)

Révélateur : H 2 SO 4 50% avec

chauffage à 110°C

83

30

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

3.CCM préparative de M’5+M’6

a) Matériels

Plaque chromatographique en verre:

  • - Dimension

: 200mm X 200mm

  • - Épaisseur du gel de silice : 0,25mm

  • - Phase stationnaire

: gel de silice

Cuve chromatographique : marque CAMAG

Spatule métallique

Tube capillaire

Eluant : Mélange de solvants : CH 2 Cl 2 / MeOH (98 : 2)

b)Mode opératoire

La

description

suivantes :

donnée

en

B-2

b

est

reproduite ici avec les précisions

  • - l’échantillon est déposé à l’aide d’un tube capillaire.

  • - la saturation en vapeurs de solvant est réalisée en plaçant dans la cuve

contenant le solvant un papier Whatman (20cmx20cm) qui s’imprègne peu à peu de

ce solvant.

c)Résultats

La plaque développée est révélée à l’aide d’une lampe UV (254

nm

et

365 nm) ce qui a permis de délimiter 13 zones différentes que l’on prélève par

grattage de la silice à l’aide du spatule métallique.

La silice est trempée dans un mélange CH 2 Cl 2 MeOH, la suspension placée

dans un appareil à ultrasons, puis la solution surnageante lors de la centrifugation

est prélevée et évaporée à sec.

Un ensemble de 13 fractions est obtenu comme indiqué dans le tableau 3

auquel correspond la CCM récapitulative de la figure 24. Les résultats des tests

biologiques précédents nous suggèrent d’orienter la recherche de l’activité vers les

83

31

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

fractions les plus polaires, à

savoir

M’’1

à

M’’6

qui sont

ainsi

soumises à de

nouveaux tests.

Il s’avère que M’’1, M’’2, M’’5 et M’’6 sont actifs bien que les pourcentages

d’inhibition soient très différents les uns des autres. D’autres commentaires sont

données à ce sujet dans la partie 2 de l’ouvrage.

Numéros des tubes et désignation

Masse (mg)

 
  • 1 M’’1

5

 
  • 2 M’’2

0,4

 
  • 3 M’’3

0,8

 
  • 4 M’’4

0,9

 
  • 5 M’’5

0,8

 
  • 6 M’’6

1,5

 
  • 7 M’’7

0,8

 
  • 8 M’’8

1,5

 
  • 9 M’’9

0,8

 
  • 10 M’’10

0,1

 
  • 11 M’’11

0,9

 
  • 12 M’’12

0,8

 
  • 13 M’’13

0,3

Total

13,7

Tableau 3 : Masse des fractions issues de la CCM préparative de M’5+M’6

83

32

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Adsorbant : gel de silice

Eluant : CH 2 Cl 2 / Me OH (98 :2)

Révélateurs : UV et H 2 SO 4 50%

avec chauffage à 110°C

Figure 24 : CCM des fractions 1 à 13 : séparation chromatographique de

M’5+M’6

H.DISCUSSION

Le mélange complexe qui constitue l’extrait chloroformique des feuilles de

Brachylaena ramiflora a été soumis à une série de séparations chromatograpohiques

sur silice selon le schéma de fractionnement représenté à la figure 25.

Les résultats des tests antipaludiques qui ont guidé ces différentes étapes de

fractionnement ont montré que les fractions actives sont aussi les fractions les plus

polaires ; elles sont représentées par les fractions M7 et M8 issues de la première

colonne, et la fraction M’6 issue de la deuxième colonne. L’étape ultime de

purification qui est la CCM préparative a conduit à l’isolement de 4 produits actifs

dont M’’2 est parmi les plus polaires, et c’est aussi le plus actif.

83

33

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Extrait brut chloroform ique 1-12 13-20 21-30 31-36 37-54 55-68 69-77 78-103 104-117 M M M
Extrait
brut
chloroform
ique
1-12
13-20
21-30
31-36
37-54
55-68
69-77
78-103
104-117
M
M
M
M
M
M
M
1
2
3
4
5
6
8
M 7 CC Silice 0,40 – 0,063
M
7
CC
Silice 0,40 – 0,063
1-9 10-18 19-25 26-32 33-36 37-44 45-65 55 M’ M’ M’ M’ M’ M’ M’ M’
1-9
10-18
19-25
26-32
33-36
37-44
45-65
55
M’
M’
M’
M’
M’
M’
M’
M’
1
2
3
4
5
6
7
8
CCM Préparative
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
M ‘’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
M’’
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Figure 25 : Schéma de fractionnement chromatographique de l’extrait chloroformique

brut E

83

34

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

DEUXIEME PARTIE ETUDE BIOLOGIQUE

83

35

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre I : LE PALUDISME

Le paludisme est, avec le sida et la tuberculose, l’une des trois principales

causes de mortalité d’origine infectieuse dans les régions tropicales. L’Organisation

Mondiale de la Santé (OMS) estime qu’entre 300 à 500 millions de personnes sont

concernées par le paludisme dans le monde. Jusqu’à 90 % des cas se trouvent en

Afrique subsaharienne, le reste est réparti en Asie du Sud-Est et en Amérique du

Sud. A lui seul, le paludisme cause entre 1,5 et 2,7 millions de décès par an.

L’Afrique est particulièrement touchée : statistiquement, cette maladie tue un enfant

toutes les 30 secondes autrement dit, plus de 1 million de décès infantiles par an.

La carte géographique de la figure 26 représente les zones de paludisme

endémique et les zones de paludisme résistant à la chloroquine.

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 26 : Carte géographique des zones de paludisme endémique et les

zones de paludisme résistant à la chloroquine. [6]

  • : zone de paludisme endémique

  • : zone de paludisme résistant à la chloroquine

83

36

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Même

dans

les pays

exempts du paludisme il

existe un

paludisme dit

d’importation. Il touche les personnes au retour des voyages

dans les régions

d’endémie

I.GENERALITES

Le paludisme a toujours existé et son histoire est liée à celle de l’humanité.

Au 5è siècle avant Jésus-Christ, Hippocrate, père de la médecine définissait la

fièvre comme étant le principal symptôme de cette maladie. Les manifestations

périodiques de violents accès de cette fièvre lui valurent le nom de fièvre tierce

(3 jours) ou fièvre quarte (4 jours).

En 1880, Laveran [5] identifia l’espèce la plus redoutable des Plasmodium,

celle qui est responsable des accès pernicieux et mortels : Plasmodium falciparum.

En 1885,

Plasmodium :

Marchiafava et Celli [5] différencièrent 3 autres espèces de

  • - Plasmodium ovale

  • - Plasmodium vivax

  • - Plasmodium malariae.

En 1897, Ross [5] identifia le vecteur responsable de l’épidémie de fièvre.

C’est un moustique des pays tropicaux : l’anophèle femelle. Une fois inoculés chez

l’homme à la suite d’une piqûre d’un insecte infesté, les protozoaires, parasites du

genre Plasmodium falciparum deviennent mortels.

Le paludisme, dérivé du latin palus qui signifie marais, n’a pas épargné

Madagascar.

Les documents écrits relatent des épisodes sombres de l’histoire malgache

lorsque des épidémies d’origine inconnue ont envahi certaines régions de l’île. Selon

Flacourt [30], le paludisme a existé depuis des siècles à Madagascar. La fièvre est

connue sous le nom de « tazo » et plus tard « tazomoka» ce qui signifie, fièvre des

moustiques.

83

37

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

On peut citer quelques dates importantes se rapportant aux épidémies qui ont

marqué l’histoire du paludisme à Madagascar :

1870

: Le « ramanenjana », la fièvre convulsive terrorisant l’ensemble de la

population

1878

: Le « tazobe » ou « tazon’Avaradrano », la forte fièvre d‘Avaradrano

1897

: Le « rapo rapo » ou « safo-tany » apparaissant dans la région de

Fianarantsoa.

1905

: Une importante épidémie tuant des milliers de personnes sur les

Hautes-Terres.

1980

: Le « bemangovitra », fièvre à frissons, sévissant sur les Hauts-Plateaux

1994

: La dernière épidémie connue dans le sud de Madagascar ressemblant

au «bemangovitra ».

J.LE CYCLE DE DEVELOPPEMENT DE PLASMODIUM FALCIPARUM

Le paludisme est provoqué par un protozoaire parasite du genre Plasmodium,

transmis à l'homme par la femelle d'un moustique appelé anophèle, et qui pénètre

dans l'organisme humain sous la forme de sporozoïtes au cours d'une piqûre par un

moustique infecté. Les sporozoïtes sont transportés par la circulation sanguine

jusqu'au foie, dans les cellules duquel ils se multiplient. Libérés dans le sang sous

forme de mérozoïtes, ils envahissent les globules rouges et deviennent des

schizontes. La multiplication de ces schizontes entraîne l'éclatement des globules

rouges : c'est ce qui provoque les accès de fièvre paludéenne. Les schizontes

peuvent alors infecter d'autres globules rouges ou se transformer en gamétocytes

mâles et femelles (cellules précurseurs des cellules sexuelles, ou gamètes).

Un moustique se contamine par piqûre, en absorbant du sang contenant des

gamétocytes. Dans le tube digestif de l'insecte, ceux-ci se transforment en gamètes.

La fécondation d'un gamète femelle par un gamète mâle produit un zygote (cellule-

œuf), qui se développe en sporozoïte. Les sporozoïtes migrent ensuite dans les

83

38

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

glandes salivaires du moustique, d'où ils pourront contaminer un nouvel individu lors

d'une piqûre.[6]

Le cycle de développement de Plasmodium falciparum présenté à la figure 27

permet de mieux cibler les stades de développement du parasite, où les

médicaments antipaludiques peuvent agir.

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 27 : Cycle biologique de Plasmodium falciparum [6]

K.LES PRODUITS ANTIPALUDIQUES

En 1630 a été découvert au Pérou l’arbre qui guérit la fièvre, le « fever

tree » ou le quinquina, introduit ensuite en Europe en 1679. Une préparation à base

de quinquina était considérée alors comme la « panacée universelle ». Une nouvelle

ère s’ouvre lorsque Pelletier et Caventou en 1820 [5] ont découvert la molécule

active du quinquina dénommée la quinine. Depuis, d’autres produits naturels ou de

synthèse ont été proposés pour soigner ou prévenir le paludisme.

1.Les antipaludiques de base

83

39

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

a)Antipaludiques naturels

Ce sont essentiellement d’une part les alcaloïdes du quinquina : quinine,

quinidine, cinchonine, cinchonidine, et d’autre part, les dérivés du Qinghaosu

(Armoise) : artémisinine, artémether, artésunate. [5]

b)Antipaludiques de synthèse

Ils appartiennent à différentes classes chimiques qui sont les suivantes :

  • - Amino-4-quinoléines

  • - Aryl-Amino-Alcools

: chloroquine, amodiaquine, amopyroquine

: méfloquine, halofantrine

  • - Antifoliques, Antifoliniques : sulfamides, sulfones, pyriméthamine, proguanil

  • - Antibiotiques et divers

hydroxynaphtoquinones

  • - Amino-8-quinoléines

: cyclines, macrolides, fluoroquinolones,

: primaquine

A l’exception des amino-8-quinoléines qui sont des gamétocytocides, ces

antipaludiques sont des schizontocides sanguins. Ces derniers suppriment les

signes cliniques en traitement curatif, ou les préviennent en prophylaxie. Les

gamétocytocides sont actifs sur les gamétocytes sanguins mais aussi sur les formes

intra-hépatiques.

2.Les produits en association

Les administrations simultanées de plusieurs antimalariques ont été étudiées

puis appliquées dès le début des années 1970. Ces associations permettent

d’améliorer l’efficacité du traitement des souches plasmodiales chimio-résistantes

par l’utilisation des dérivés à action synergique. Ces associations permettent aussi

d’éviter l’émergence de résistance.

En curatif, les associations font surtout appel aux antifoliniques et

antifoliques.[5]

83

40

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Citons en exemples les associations: pyriméthamine-sulfadoxine, ou

atovaquone-proguanil, cette dernière étant indiquée dans le traitement du paludisme

non compliqué à Plasmodium falciparum de l’adulte et de l’enfant à partir de 12 ans,

ou encore, l’association d’un dérivé de l’artémisinine et d’un antipaludique

« classique » pour le traitement du paludisme non compliqué. Cette association

accroît l’efficacité thérapeutique tout en diminuant le développement de souches

résistantes à l’antipaludique d’élimination lente. L’artémisinine et ses dérivés

possèdent des actions rapides sur la disparition des parasites du sang et ne

provoquent que peu d’effets secondaires. Leur effet est prolongé grâce à des

traitements longs ou des associations. [8, 21]

A l’heure actuelle, les combinaisons à base d’artémisinine appelées aussi

ACT (Artemisinin-based Combination Therapy) sont les plus prometteuses dans la

lutte contre le paludisme. L’ACT a été recommandé par l’Organisation Mondiale de la

Santé (OMS) depuis 2002 pour les pays touchés par la résistance aux médicaments

antipaludiques classiques. Il s’agit de l’association de l’artémisinine avec la

sulfadoxine-pyriméthamine, ou artémisinine-amodiaquine, ou artemisinine

-méfloquine. Le taux de parasitémie restant après l’action de l’artémisinine est

éliminé par le deuxième antipaludique d’action plus prolongée. [21]

Les options thérapeutiques de type ACT actuellement disponibles et pouvant

être mises en œuvre sont les suivantes [8, 21] :

  • - Artéméther-luméfantrine (Coartem )

  • - artésunate-amodiaquine

  • - artésunate-sulfadoxine-pyriméthamine (SP)

  • - SP-amodiaquine

  • - sulfadoxine -pyriméthamine-artésunate

  • - Chloroquine-artésunate

  • - pyronaridine-artésunate

83

41

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

L.LES TRAITEMENTS DU PALUDISME

Afin de maintenir le niveau du paludisme suffisamment bas et pour qu’il ne soit

plus un problème de santé publique, deux actions complémentaires doivent être

menées de front : la préventive et la curative.

Selon l’adage populaire « Prévenir vaut mieux que guérir », il est fortement

recommandé par l’OMS de favoriser le traitement préventif, le traitement curatif étant

très coûteux et encore incertain.

1.Traitement préventif

Le traitement préventif est basé sur la chimioprophylaxie et la lutte contre les

vecteurs qui sont les moustiques.

a)Chimioprophylaxie ou prévention médicamenteuse

Elle se définit comme la prise d’un médicament permettant de prévenir avant

tout l’infection, puis les différentes manifestations et enfin, leurs conséquences

graves.

La chimioprophylaxie agit sur les formes érythrocytaires du parasite et réalise

un traitement suppressif précoce. Les antipaludiques utilisés sont tous des

schizontocides sanguins. La prophylaxie peut être individuelle ou collective.[5]

(1)Prophylaxie individuelle

En zone d’endémie, la prophylaxie ne concerne que la population à risque,

c’est-à-dire les femmes enceintes, les nouveaux-nés, les enfants, les voyageurs

occasionnels et les sujets hospitalisés.

La Chloroquine seule ou en association avec le Proguanil ou des cures

systématiques de sulfadoxine-pyriméthamine sont préconisés en prévention au cours

de la grossesse.[3,8]

Concernant le voyageur occasionnel, en fonction du taux d’endémie du pays

de destination, différents traitements sont proposés :

83

42

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

  • - Pays du groupe I (non résistance à la Chloroquine) : Nivaquine seule

  • - Pays du groupe II (Chloroquinorésistance rare ou modérée) : Nivaquine en association avec la Paludrine , association chloroquine-proguanil (Savarine ).

  • - Pays du groupe III (cas révélé après un test parasitologique) : Lariam ou à défaut la Savarine ou la Doxycycline.

Dans les zones non endémiques, citons deux exemples de prescriptions d’usage :

  • - En France : méfloquine ou Doxycycline ou association atovaquone-proguanil (Malarone ) ou association chloroquine-proguanil.

  • - Aux USA : Amino-8- quinoléines ou Primaquine ou Tafénoquine .

(2)Prophylaxie collective

La prévention collective s’adresse à la population autochtone vivant en zone

d’endémie palustre. Elle a pour but de contrôler le paludisme par l’utilisation de

médicaments contre le Plasmodium et par la lutte contre les vecteurs.

b) Lutte contre les vecteurs

Elle

a

pour

but

de diminuer

la transmission du parasite afin de prévenir

l’infection des membres d’une communauté. Elle cible les anophèles soit au stade

larvaire soit au stade adulte.

(1)Les insecticides

Des milliers de produits ont été testés en laboratoire. Citons quelques

exemples de produits disponibles sur le marché :

  • - Les produits antipaludiques de type organo-phosphoré (malathion, fénitrothion, chlorvos)

  • - Les produits de type carbamate (propoxur)

  • - Les produits de type organo-phosphoré (dichlorvos)

  • - Les produits de type pyréthrinoïde dont la deltaméthrine considérée comme l’un des plus puissants insecticides disponibles avec la perméthrine.

83

43

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

(2)Les répulsifs des moustiques

Ils sont utilisés en application locale pour éloigner les moustiques ou les

dissuader de piquer, et sont surtout issues de végétaux :

  • - essence de citronnelle en Europe

  • - huile de Palme en Guinée

  • - fumée d’essences diverses en Inde.

IL existe également des produits répulsifs d’origine synthétique comme le

dibutylphtalate, l’isocinchoméronate, le diéthyltoluamide (D.E.E.T) …

c)Les moyens mécaniques

Généralement, l’utilisation de moustiquaires imprégnées d’insecticide

notamment de type pyréthrinoïde est recommandée dans les pays à risque. Ainsi, à

Madagascar, la Deltaméthrine est l’insecticide préconisé par l’Organisation Mondiale

de la Santé (OMS) pour une imprégnation durable des moustiquaires. Face à la

résistance des anophèles aux pyréthrinoïdes, la double imprégnation aux

pyréthrinoïdes et aux carbamates est désormais préconisée. [14]

2.Traitement curatif

Le but d’un traitement curatif est de parvenir à la guérison radicale du malade,

autrement dit à la destruction de toutes les formes parasitaires présentes dans son

organisme.[5]

a)Les facteurs liés au traitement

L’efficacité ou l’échec d’un traitement thérapeutique du paludisme dépend de

plusieurs facteurs qui sont :[3,5]

(1)-La gravité de la maladie qui peut se manifester soit sous la forme d’accès

de fièvre simple, soit sous la forme daccès de fièvre pernicieux à Plasmodium

falciparum sujet à des complications soit sous la forme de paludisme grave.

83

44

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

(2)-La manifestation en zone palustre ou non, en cas de primo-invasion ou de

rechute.

(3)-Les catégories de sujets à risque citées précédemment c'est-à-dire les

femmes enceintes, les nouveaux-nés, les enfants, les voyageurs occasionnels

et les sujets hospitalisés.

(4)-La résistance du Plasmodium falciparum à la chloroquine, à la sulfadoxine,

la multi-résistance médicamenteuse qui concerne uniquement le Plasmodium

falciparum.

L’OMS décrit la “chimiorésistance” comme “l’aptitude d’une souche de

parasites du paludisme à survivre ou à se reproduire malgré l’administration et

l’absorption d’un médicament employé à des doses égales ou supérieures aux doses

ordinairement recommandées mais comprises dans les limites de tolérance du

sujet”.

b)Les traitements actuels

Les traitements préconisés sont différents en cas d’accès simple, d’accès

grave ou d’accès grave d’emblée.

(1)Traitement en cas d’accès palustre simple

L’accès simple ne comporte pas de signe de malignité. Cependant, il peut

évoluer à tout moment vers un accès pernicieux.

Les molécules et médicaments correspondants au traitement d’accès palustre

simple sont les amino-4-quinoléines comme la chloroquine et l’amodiaquine.

Les produits disponibles sont les suivants :

  • - Chloroquine : Nivaquine , Aralen , Résochin

  • - amodiaquine : Flavoquine , Camoquin

Dans des cas particuliers, d’autres traitements spécifiques sont conseillés :

  • - en cas de chloroquino-résistance : amodiaquine.

  • - personnes non immunisées : méfloquine et halofantrine

  • - en cas de chimiorésistance : sulfadoxine-pyriméthamine

83

45

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

  • - en cas de zones de multirésistance : associations médicamenteuses artésunate-méfloquine.

(2)Traitement en cas d’accès grave

Il s’agit de traitement recommandé en cas d’échec clinique, c’est- à -dire une

persistance de la fièvre après 3, 4, 7 ou 14 jours de traitement de première intention.

Les Amino-alcools (quinine, méfloquine, halofantrine) sont les traitements prescrits

en cas d’accès grave. Cependant ils sont contre-indiqués chez les femmes enceintes

et les enfants de moins de 15 kg pour qui il convient de prescrire la quinine ou la

chloroquine.

La quinine existe sous forme injectable : Dichlorhydrate de quinine (Paluject ),

Formiate de quinine (Quiniforme ), Gluconate de quinine (Quinimax ) ou en

comprimé : chlorhydrate ou sulfate de quinine (quinine, Lafran , Quinimax ).

Il

peut

se présenter différents cas particuliers qui nécessitent aussi des

traitements particuliers:

  • - En cas de chloroquinorésistance : association SP (Fansidar

),

association méfloquine-Sulfadoxine –pyriméthamine, amino-4-

quinoléines autre que la chloroquine, méfloquine ou quinine.

  • - Résistance à la quinine : association quinine +antibiotique ou méfloquine ou halofantrine.

  • - Chimiorésistance au Plasmodium falciparum : méfloquine (Lariam

,

Méphaquine ) et halofantrine (Halfan )

(3) En cas d’accès palustre grave d’emblée

Dans

ce

cas,

une

association

sulfadoxine-pyriméthamine,

artésunate,

quinine, dérivés du Qinghaosu est alors immédiatement prescrite.

Les molécules couramment utilisées dans les traitements antipaludiques sont

présentées dans la figure 28 suivante :

83

46

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine
Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine

Chloroquine

Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine
 
Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine

méfloquine

amodiaquine

Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine
Chloroquine méfloquine amodiaquine halofantrine
 

halofantrine

Figure 28 : Les molécules couramment utilisées dans le traitement

antipaludique.

M.LES ORIENTATIONS ACTUELLES

Divers travaux de recherche fondamentale sont menés afin de répondre aux

préoccupations soulevées par la persistance du paludisme véhiculé notamment par

Plasmodium falciparum. Plusieurs aspects sont abordés :

- L’amélioration des connaissances sur la biologie des différents

-

Plasmodium.[12]

La recherche des produits capables de rétablir la sensibilité du Plasmodium

falciparum à la chloroquine.[12]

83

47

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

  • - La recherche de produits actifs à des stades de développement du parasite autres que les schizontes et les gamètes ou pouvant avoir d’autres mécanismes d’action.[12]

  • - La multiplication terrain.[12]

des recherches épidémiologiques cohérentes sur le

Parmi les découvertes les plus récentes, citons la phloeodictine A, molécule

isolée d’une éponge récifale Océanopania fistulosa et capable d’inhiber à faible dose

le parasite Plasmodium falciparum [7].

Mais on envisage parallèlement la mise sur le marché d’un vaccin [28] conçu

par le groupe pharmaceutique GlaxosmithKline, une des principales firmes

productrices de vaccin au monde.

Désormais, la démarche privilégiée est de mettre en étroite collaboration les

centres de recherche ainsi que diverses organisations oeuvrant dans la lutte contre

le paludisme afin de permettre des échanges d’expériences et d’informations.

83

48

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Chapitre II : TESTS BIOLOGIQUES

N.GENERALITES

L’évaluation de la chimiorésistance a été standardisée par l’OMS pour

l’espèce Plasmodium falciparum par l’évaluation de la chimiosensibilité selon 2

principaux modèles :[10]

  • - Le modèle in vitro

  • - Le modèle in vivo La méthode que nous avons utilisée pour cette étude est le modèle in vitro O.ETUDE IN VITRO L’étude in vitro consiste à mesurer l’inhibition de la maturation en schizontes

des parasites en culture, en présence d’une gamme de concentrations

d’antipaludique. L’expérimentation in vitro se fait dans des conditions de stérilité

absolue afin d’éviter tout risque éventuel de contamination entravant le déroulement

et le résultat de l’expérience.[18,24]

1.Matériel biologique

Le matériel biologique utilisé pour l’étude de l’activité antipaludique in vitro est

une souche plasmodiale venant du Cameroun : le FCM 29/C 1 .

C’est une souche chloroquino-résistante de Plasmodium falciparum qui est un

parasite intra-érythrocytaire et présentant un cycle de développement de 48 heures

(figure 29).

83

49

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Figure 29 : Cycle des plasmodies humaines [26].

83

50

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

a)Préparation du milieu de culture

Le milieu de culture exige une préparation au préalable.

Afin d’obtenir un milieu stérile, une solution de RPMI (milieu défini par

Rosewell Park Medium Institute) est passé à travers un filtre de porosité égale à

0,22 m. La solution de RPMI est conservée au réfrigérateur à +4°C pendant 1 mois

ou au congélateur à –30°C pendant six mois.

Au moment de l’emploi, 10% de sérum humain est ajouté à la solution de

RPMI pour avoir une solution de RPSH.

b)Culture in vitro des parasites

(1)Préparation de la souche

Les souches conservées dans de l’azote liquide à –196°C sont décongelées à

la température de +37°C. Elles sont centrifugées à 1800 tours par minute pendant 5

minutes. Le culot est recueilli puis mis dans du NaCl à 35‰. Le mélange ainsi

obtenu est centrifugé de nouveau à 1800 tours par minute pendant 5 minutes. C’est

le premier lavage. Deux derniers lavages se font avec du RPMI. Le culot obtenu lors

de la dernière centrifugation est utilisé pour les expériences ultérieures.[18,24]

(2)Mise en culture des parasites

La méthode utilisée pour mettre en culture la souche est celle de la culture

continue décrite en 1976 par Trager et Jensen.

Le culot obtenu après lavages est mis en culture dans des boîtes de Pétri

contenant du RPSH et des hématies saines venant de volontaires de groupe O+. Les

boîtes de Pétri sont incubées à +37°C dans une cloche hermétiquement fermée et

contenant le mélange gazeux : 90% N 2 , 5% O 2 , 5% CO 2 , obtenu par la méthode de

la bougie allumée (candle jar).[18, 24]

83

51

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

(3)Entretien de la culture parasitaire

Un renouvellement du milieu, un frottis sanguin de contrôle de parasitémie

ainsi que le calcul de l’indice de multiplication des parasites sont effectués

quotidiennement.

Ce contrôle de parasitémie consiste à évaluer le taux de croissance des

parasites dans les globules rouges. Ce taux est exprimé en pourcentage.

La parasitémie doit être comprise entre 0,5 et 5%.

L’indice de multiplication (IM) des parasites est donné par la formule suivante :

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora " Génie Chimique - ESPA 2004

Un bon indice de multiplication des parasites doit être supérieur à 2 toutes les

48 heures.

2.Evaluation de l’activité antipaludique

Le test est réalisé au moment où les parasites sont au stade de trophozoïte

jeune où les formes d’anneau sont prédominantes dans la culture.

Le test de chimiosensibilité in vitro de l’activité antiplasmodiale est conduit

selon la technique du semi-microtest isotopique décrite par Desjardins et al. en 1979

et adaptée par Le Bras et Deloron en 1984 [10] . C’est un semi-microtest isotopique

qui consiste à évaluer l’inhibition de l’incorporation d’un élément radioactif. C’est ce

procédé qui est utilisé actuellement.

3.Déroulement du test

Le test est effectué dans des plaques de culture cellulaire et dure 42 heures

au total qui se répartissent en 18 heures d’incubation à +37°C de la suspension

parasitaire additionnée du produit à tester puis de 24 heures d’incubation

supplémentaires après ajout de l’hypoxanthine tritiée dans chaque puits des plaques.

A la fin du test, la plaque est congelée à -30°C pendant au moins 3 heures, puis

décongelée à 45°C pendant 15 minutes.

83

52

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

a)Collecte du contenu des puits

Au moment de la collecte,

le

contenu de la plaque décongelée est filtré à

travers un papier en fibre de verre. Une fois séché, chaque filtre est trempé dans 2

ml de liquide scintillant et la radioactivité est mesurée à l’aide d’un compteur à

scintillation. (Figure 30)

Figure 30 : Dispositif expérimental de la collecte cellulaire

b)Lecture de la radioactivité

Le corps radioactif est incorporé dans le noyau des parasites juste avant la

maturation des schizontes. La lecture de la radioactivité est exprimée en coups par

minute (cpm). La radioactivité enregistrée est proportionnelle à la multiplication des

parasites et permet ainsi d’évaluer leur taux de croissance ou d’inhibition.

c)Expression des résultats

Le pourcentage d’inhibition %I est donné par la relation :

%I = 100 - [_cpm témoin non traité - cpm extrait / cpm témoin non traité ] x 100

Les résultats

sont exprimés en concentration

inhibant

50%

(CI 50 )

de

la

croissance parasitaire par rapport au témoin non traité, et calculée par la droite de

régression linéaire de la courbe effet concentration( pourcentage d’inhibition en

fonction du logarithme des concentrations).

Si la valeur de CI 50 est inférieure à 10 g/ml, le produit testé est considéré

comme intéressant.

P.APPLICATION A L’ETUDE DE L’ACTIVITE DE BRACHYLAENA RAMIFLORA L. (ASTERACEAE)

1.Protocole expérimental

83

53

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

a)Préparation de la solution RPMI

La composition du milieu de culture utilisée est la suivante :

  • - 16,350 g de RPMI

  • - 2,06 g de bicarbonate NaHCO 3

  • - 1 l d’eau distillée déionisée

b)Préparation des échantillons

Les échantillons sont dissous dans du méthanol, puis la solution obtenue est

diluée avec de l’eau distillée stérile afin de préparer la solution mère de 500 µg/ml.

La solution mère subit ensuite une série de dilution afin d’obtenir une solution

à 10 µg/ml utilisée pour le test préliminaire ainsi qu ‘une gamme de concentrations

allant de 10 à 0,625 µg/ml pour la détermination des CI 50 (dose de la référence : 500

à 62,5 µg/ml).

La chloroquine est la référence utilisée pour évaluer le niveau de

résistance.de la souche utilisée. La Cinchona est la référence positive pour connaître

l’activité antipaludique de l’extrait.

c)Préparation de la plaque

Les tests sont effectués dans des plaques de culture cellulaire de 96 puits à

fond plat. Dans chaque puits, une solution totale de 200 µl constituée de 20 µl

d’échantillon extrait et 180 µl de suspension parasitaire est préparée là où le taux

d’hématocrite ainsi que la parasitémie ont été de 1%.

La plaque est soumise à une agitation pendant 10 mn avant d’être incubée à

+37°C dans une atmosphère micro aérophile.

L’hypoxanthine est ajoutée à raison de 10µl par puits après 18 heures

d’incubation pour évaluer le taux de croissance parasitaire.

A la fin du test, soit 42 heures plus tard, la plaque est congelée.

2.Résultats

a)Tests préliminaires sur E et M1 à M8

83

54

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Identification

Fractions

Pourcentage

Résultat

d’inhibition %I

M1

1-12

-

non testé

M2

13-20

4,71

inactif

M3

21-30

13,00

inactif

M4

31-36

-

non testé

M5

37-54

33,36

actif

M6

55-68

-

non testé

M7

69-77 et 78-103

97,12

actif

M8

104-117

98,97

actif

E

Extrait brut

98,67

actif

Tableau 4 : Valeurs de %I de M1 à M8

Les valeurs de pourcentage d’inhibition sont consignées dans le tableau 4.

Elles indiquent que les fractions M2 et M3 sont inactives, les valeurs

correspondantes étant inférieures à 20%.

Par contre,

l’extrait

brut

E

est

actif, et

cette

activité

se retrouve dans les

fractions M7 et M8 qui manifestent des valeurs d’inhibition très élevées,

respectivement de 97,12% et 98,97%.

En effet, on considère qu’un produit est inactif si %I est inférieur à 20%, actif si

%I est compris entre 20% et 80% et très actif si %I est supérieur à 80%.

b)Détermination de CI 50 sur M’1, M’2, M’4, M’6

83

55

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

Dans une détermination de CI 50, le produit à tester est considéré intéressant

quand la valeur de CI 50, est inférieure à 10 µg/ml. Les résultats de CI 50 de la

deuxième série de tests in vitro sont présentés dans le tableau 5 ci- après :

Identification

Fractions

Concentration

Résultats

inhibitrice (µg/ml)

M’1

1-9

ND

inactif

M’2

10-18

ND*

inactif

M’3

19-25

-

Non testé

M’4

26-32

ND

inactif

M’5

33-36

-

Non testé

M’6

37-44

3,525

actif

M’7

45-fin

-

Non testé

M’8

55

-

Non testé

(*) : Non déterminée

Tableau 5 :

Valeurs de CI 50 de M’1, M’2, M’4 , M’6

Les valeurs enregistrées indiquent que seule la fraction M’6 est intéressante

avec CI 50 égale à 3,53 µg/ml.

c) Test préliminaire sur M’’1 à M’’6

Identification

Références des

Pourcentage

Résultats

tubes

d’inhibition

M’’1

  • 1 54,04

actif

M’’2

 
  • 2 93,11

actif

M’’3

 
  • 3 10,90

inactif

M’’4

 
  • 4 13,11

inactif

M’’5

 
  • 5 27,75

actif

M’’6

 
  • 6 41,31

actif

Tableau 6 : Valeurs de %I de M’’1 à M’’6

Parmi les 6 fractions testées, M’’2 se distingue par un pourcentage d’inhibition

remarquablement élevé de 93,11 %. Les fractions M’’1 et M’’6 sont également

actives avec un pourcentage d’inhibition respectivement de 54 % et 41,31 %

(tableau 6). Par contre les autres fractions telles que M’’3 et M’’4 sont inactives car

les valeurs enregistrées sont inférieures à 20 %.

83

56

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique - ESPA 2004

d)Détermination de CI 50 sur M’’1 , M’’2 et M’’6

Identification

fraction

CI 50

M’’1

 
  • 1 ND*

M’’2

 
  • 2 1,45

M’’6

 
  • 6 6,79

(*) : non déterminée

Tableau 7 : Valeurs de CI 50 de M’’1, M’’2 , M’’6

Les fractions M’’1, M’’2 et M’’6 qui ont fourni les pourcentages d’inhibition les

plus élevés ont été soumises à une détermination de CI 50 . La valeur de 1,45 µg/ml

attribuée à M’’2 traduit une activité tout à fait intéressante. Mais M’’6 est aussi

considéré comme intéressant, car on trouve une CI 50 égale à 6,79 µg/ml.

Q.DISCUSSION

A Madagascar, sur quelques 5000 plantes médicinales recensées, la moitié

serait antipaludique.

L’efficacité des tests antipaludiques in vitro a permis de cerner les fractions où

sont concentrés les produits actifs de l’extrait végétal.

Dans la première étape de purification, 3 fractions, à savoir M5, M7 et M8 sur

les 8 fractions recueillies se sont révélées actives avec les valeurs de %I

respectivement de 33,36%, 97,12% et 98,97%. Les valeurs remarquablement

observées pour M7 et M8 les classent dans la catégorie des « produits très actifs ».

Une purification plus poussée réalisée sur M7 a fourni une seule fraction

active pour laquelle une détermination de CI 50 a donné la valeur de 3,53 µg/ml. C’est

une valeur bien inférieure à la valeur seuil de 10 µg/ml, et qui autorise à poursuivre

les investigations sur la fraction concernée.

L’ultime étape de purification de cette fraction a conduit à l’isolement de

produit quasiment purs parmi lesquels M’’2 et M’’6 sont les seuls a montré des

valeurs de CI 50 inférieures à 10µg/ml ; les valeurs enregistrées qui sont

83

57

"Isolement de deux produits antipaludiques de Brachylaena ramiflora var. ramiflora"

Génie Chimique -